CN103893831A - 一种器官型人工皮肤、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种器官型人工皮肤及其制备方法。本发明的器官型人工皮肤由成纤维细胞、脱细胞羊膜、基质材料及角质形成细胞或由成纤维细胞、羊水干细胞、基质材料和角质形成细胞构建而成。本发明的人工皮肤具有接近于正常皮肤结构的表皮层和真皮层结构，表达正常皮肤的蛋白标志物，角质层、棘层、基底层和真皮层的分布与正常皮肤一致，可用作皮肤替代物、皮肤临时覆盖物和仿皮肤模型。

Description

一种器官型人工皮肤、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于人工器官组织工程技术领域，具体地涉及一种新型器官型人工皮肤及其构建方法。

背景技术

近年来，构建具有表皮和真皮双层结构的器官型人工皮肤一直是研究的重点。体外构建的人工皮肤要求结构与功能与正常皮肤相似，否则只是一层细胞，无法满足实际的研究和应用需要。如美国Advanced TissueSciences公司开发的SKIN2 ^TM皮肤，是将成纤维细胞种植于尼龙网中形成真皮组织，再将角质形成细胞种植于真皮上形成表皮部分。但是现有的人工皮肤模型大多数只有角质形成和成纤维两种细胞，引入皮肤其它细胞的模型研究还不多见，由于细胞种类有限，难以发挥多种细胞间的协同作用，并不能完全用于复制皮肤的正常功能；另一方面，由于角质形成细胞是瞬间放大细胞，自我更新能力有限，易退出细胞周期进入终末分化。这是阻碍器官型人工皮肤进入实际应用的主要瓶颈问题之一。

人工皮肤走过了单层细胞培养、人工表皮立体培养和器官型人工皮肤构建的发展过程。早期开发的所谓人工皮肤仅是单层培养的细胞膜片，后来，滤孔嵌套技术得到应用，人们将表皮细胞移植于胶原凝胶、纤维素海绵等支架上三维培养，构建复层表皮，如商品化的Episkin、EpiDerm和SkinEthic产品。2003年欧莱雅公司的科学家将KC、MC、LC细胞共培养构建新型表皮，使表皮的组成更接近正常皮肤。但它们都属于表皮的组织型培养，还不是真正意义上的器官型人工皮肤。

因此，本领域中存在着对其组成接近于哺乳动物正常皮肤结构的器官型人工皮肤的需求，其在需要皮肤替代物、临时覆盖物和仿皮肤模型等的临床应用、毒理学分析、药理学研究和分析中具有重大的应用意义并提供重要的治疗手段和研究工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够解决现有技术中的上述问题的新型器官型人工皮肤。本发明通过将成纤维细胞种植在脱细胞的羊膜上构建好真皮层，上面覆盖一层基质材料，再将角质形成细胞接种于基质材料上；其次，本发明还将羊水干细胞与重组人胶原蛋白复合成膜后再分别种植成纤维细胞和角质形成细胞，通过气液交界培养形成角质化上皮结构，得到兼具真皮层和表皮层结构的器官型人工皮肤。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种器官型人工皮肤(下面有时简称“本发明的人工皮肤”)，其由包括以下成分的生物材料构建而成：成纤维细胞、脱细胞羊膜、基质材料及角质形成细胞。

本发明的器官型人工皮肤还可以由包括以下成分的生物材料构建而成：成纤维细胞、羊水干细胞、基质材料及角质形成细胞。

在本发明的器官型人工皮肤中，主要由成纤维细胞和脱细胞羊膜构成类似于哺乳动物皮肤真皮层的仿真皮层结构，所述角质形成细胞形成类似于哺乳动物皮肤表皮层的仿表皮层结构，所述基质材料形成类似于哺乳动物皮肤基底层的仿基底层结构，由此获得与哺乳动物正常皮肤解剖结构非常相似的人工皮肤。

在本发明的器官型人工皮肤的一个优选实施方案中，成纤维细胞为分离自下述细胞的体外培养物：哺乳动物皮肤的成纤维细胞，优选人源成纤维细胞，包括分离的原代幼儿皮肤成纤维细胞、成人皮肤成纤维细胞和幼儿包皮成纤维细胞，最优选幼儿包皮成纤维细胞的体外培养物。

在本发明的器官型人工皮肤的另一个优选实施方案中，基质材料为亲水性高分子材料，所述亲水性高分子材料优选地由天然的或合成的细胞外基质蛋白形成。细胞外基质蛋白优选地选自纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、玻璃粘连蛋白或其组合，更优选是合成的细胞外基质蛋白，最优选人重组III型胶原蛋白或人重组IV型胶原蛋白。

在本发明的器官型人工皮肤的另一个优选实施方案中，羊水干细胞分离自哺乳动物孕期羊水，优选哺乳动物孕中期的羊水，经体外培养而得。在本发明中，羊水干细胞在体外培养的代数不受限制，只要其表达干细胞特定基因(例如，ssea-4、oct-4，如通过免疫组化测定)即可。优选使用体外培养3～10代的羊水干细胞，这样可以保留羊水干细胞较大的定向诱导和分化能力。

在第二个方面，本发明提供了一种器官型人工皮肤的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将体外培养的成纤维细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度种植在分离自哺乳动物胎盘的脱细胞羊膜上加入培养基培养2～4天构建成仿真皮层；

2)在所述仿真皮层上面覆盖一层厚度约1mm的基质材料；

3)待基质材料凝固后，将角质形成细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度接种于基质材料上，通过气液交界培养直至角质形成细胞角质化。

在第三个方面，本发明提供了另一种器官型人工皮肤的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)收集雌性哺乳动物的孕期羊水，优选哺乳动物孕中期羊水，分离羊水干细胞，选择生长状态良好且细胞表面上干细胞基因标志物表达阳性的羊水干细胞与胶原蛋白液混合形成膜状凝胶；

2)将体外培养的成纤维细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度种植在步骤1)获得的膜状凝胶上加入培养基培养2～4天构建成仿真皮层；

3)在所述仿真皮层上面覆盖一层厚度约1mm的基质材料；

4)待基质材料凝固后，将角质形成细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度接种于基质材料上，通过气液交界培养直至角质形成细胞角质化。

在本发明的上述制备方法中，脱细胞羊膜、羊水干细胞、基质材料、成纤维细胞、角质形成细胞等生物材料的选择与上述本发明的器官型人工皮肤中所述的各实施方案相同。

在本发明中，哺乳动物优选选自猪、牛、马、灵长类动物或人等，更优选猪(因猪皮与人皮肤结构非常类似)和人，最优选人。

通过本发明的方法构建的器官型人工皮肤能表达皮肤相关的特异性蛋白，包括角质层的involucrin(套膜蛋白)、棘层的CK10、基底层的CK14、真皮层的vimentin(波形蛋白)和基底层表皮干细胞的CK19，具备正常皮肤的生理学功能，且可在-4℃下临时保存，也可以在-80℃下冷冻保存，甚至可以在超低温(例如，液氮)下长期保存。

羊水干细胞(AFSC)是较成体干细胞更原始的一类细胞，更接近胚胎干细胞的全能性，与成人骨髓或脂肪来源的干细胞相比较，其具备更强的体外增殖分化能力。AFSC多次倍增后仍可保持长端粒和正常核型，体外诱导后可分化为三个全部胚层组织，包括成骨细胞、内皮细胞、肝细胞、脂肪细胞和平滑肌细胞等，符合全能干细胞的特点。本发明构建的含有羊水干细胞的人工皮肤，可以定向诱导AFSC分化为神经细胞，获得具备神经触感功能的人工皮肤。

另一方面，在临床治疗当中，当皮肤的开放性创面达到直径1-2cm以上时，尤其是深达真皮层以下的创面，难以在短时间内自行愈合。并且由于皮肤是人体与外界接触面积最大的器官，如果不尽早封闭创面，特别是在大面积烧伤时，水分会从开放性创面处大量蒸发，造成人体脱水以及电解质紊乱。因此，临床上往往需要临时性的外科敷料(或称覆盖物)覆盖创面，一方面减少水分蒸发，另外可以保护创面中残存细胞的修复和再生。而对于临时皮肤覆盖物来说，又以由以生物组织细胞为主的生物材料构成的生物敷料为佳，因为这样的生物敷料的生物相容性好，且可以与人体和外界交换气体、液体和电解质等。

烧伤临床实践已经证明，在异体皮肤移植后，保存良好的异体皮肤可以在皮肤创面上成活1个月左右甚至更长时间，甚至可以建立血运。在其保护下，如果结合自体微粒皮移植，自体微粒皮的生长可以得到良好的保护，异体皮肤下方的微粒皮形成皮岛进而汇合从而基本封闭创面。然而，由于异体皮肤供源的紧张，迫切需要一种结构与正常皮肤类似的由生物材料构建的人工皮肤作为皮肤代用品或外科敷料(即，临时覆盖物)。尽管现有技术中已经存在许多种由生物组织和/或细胞构建的人工皮肤，但如前面所述，大部分实际上仅为复层表皮片，缺少真皮层，机械性能和抗感染性极差，甚至无法有效固定，根本无法满足临床移植的基本要求，且临床换药要求极高。此外，即使这样的表皮膜片可以生长成表皮，但由于缺乏结构类似于正常皮肤的真皮层，最终的结局只能是形成瘢痕，无法恢复或接近正常皮肤的功能和外观。

因此，在第四个方面，本发明提供了本发明的器官型人工皮肤在制备开放性创面用皮肤替代物或皮肤临时覆盖物的用途，所述开放性创面优选是烧伤创面，或因创伤或手术引起的皮肤缺损创面。由于本发明的器官型人工皮肤中由正常皮肤真皮层含量丰富的细胞外基质蛋白，特别是胶原蛋白构成仿真皮层，因此可以减少移植成功后的瘢痕形成。此外，由于羊水干细胞可以被定向诱导为各种细胞，尤其是神经细胞，因此可以使本发明的器官型人工皮肤在移植成功后可以获得一定的神经触感功能。而且本发明的器官型人工皮肤可以通过常规的组织保存方法冷冻保存(例如，液氮保存，包括通过玻璃化速冻法保存)，因此方便临床使用和工业化大规模生产。本发明具有以下优点：

1.将ASC(羊水干细胞)、、KC(角质形成细胞)和成纤维细胞等多种细胞共同构建于器官型组织工程模型，使其更接近于真正意义上的人工皮肤。

2.本发明构建的人工皮肤具有接近于正常皮肤结构的表皮层和真皮层结构。

3.本发明的器官型人工皮肤表达正常人体皮肤的相应蛋白标记involucrin(套膜蛋白)、CK10、CK14、vimentin(波形蛋白)和CK19，角质层、棘层、基底层和真皮层的分布与之一致。

4.本发明的器官型人工皮肤内生长的成纤维细胞和角质形成细胞能够保持良好的细胞活性。

5.羊水干细胞的加入使得能够控制诱导条件，从而使其分化成所需的细胞类型以发挥相应的生物学功能。

附图说明

图1图示了脱细胞羊膜上的成纤维细胞。

图2图示了角质细胞的气液交界培养。

图3图示了实施例1制备的器官型人工皮肤切片的HE染色照片。

图4-A图示了在实施例1制备的器官型人工皮肤中外皮蛋白的表达；

图4-B图示了在实施例1制备的器官型人工皮肤中角质蛋白-10的表达；

图4-C图示了在实施例1制备的器官型人工皮肤中角质蛋白-14的表达；

图4-D图示了在实施例1制备的器官型人工皮肤中波形蛋白的表达；图4-E图示了在实施例1制备的器官型人工皮肤中角质蛋白-19的表达。

图5图示了通过台盼蓝染色检测细胞活性。

图6图示了羊水干细胞培养后的形态(×200)。

图7图示了第3代羊水干细胞流式细胞仪表面抗原鉴定图。

图8图示了羊水干细胞标记物免疫组化结果。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。要说明且本领域技术人员可以理解的是，在发明内容部分和权利要求的描述中，在制备方法中未详细说明的各种步骤、材料和试剂均可以采用本领域中用于分离、培养类似的细胞或组织所需的常用设备、步骤、材料或试剂，例如超净台、低温高速离心机、荧光显微镜、洗涤步骤、离心步骤、培养基、促生长用血清或生长因子、消化酶、抗生素、稀释液和洗涤液等。下面实施例中所述的具体材料和试剂仅为优选的实施方式，并不表明本发明仅可以以此来实现。本领域技术人员可以根据本发明的公开内容并参照下面的具体实施例，采用本领域中熟知的其他类似的、合适的步骤、试剂和材料，或者做出合理的改动和改进从而更好地实现本发明的目的。

实施例1 人工皮肤的构建

1.材料

角质形成细胞和成纤维细胞取自儿童包皮环切术后的正常皮肤，羊膜取自健康产妇的胎盘，脱细胞处理后冻存备用。BD Matrigel^TM BasementMembrane Matrix获自BD Biosciences，人胎盘IV型胶原获自Sigma。

2.方法

1)人真皮成纤维细胞的培养方法

将表皮从真皮上撕下后，将真皮组织用含抗生素的PBS清洗3～5次。用眼科剪将真皮组织剪成糊状，用眼科镊取其中约0.5mm³体积大小的组织接种于10cm培养皿中，各组织块之间间隔约10mm，将皿倒置于37℃培养箱内1h，待组织块牢固贴附于皿底后加入少量含10％胎牛血清的DMEM培养基。24h后补加培养基，以后每3d换液一次。约5～10d组织块周围即有大量成纤维细胞游离出来，常规传代培养，用于后续实验。

2)脱细胞羊膜的制备

羊膜取自健康自然分娩产妇的胎盘。无菌操作分离胎盘羊膜面，自羊膜与绒毛膜之间的潜在空隙钝性剥离，使其与绒毛膜分离。含抗生素(100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、100μg/ml庆大霉素)的PBS冲洗数次，剪成约5cm×5cm大小，置于1％Triton X-100溶液中，恒温振荡24h，含抗生素PBS清洗3次后于0.125％胰酶-0.02％EDTA中浸泡，置于37℃培养箱消化2h。用细胞刮刮除羊膜上皮细胞，显微镜下观察刮除干净后，PBS漂洗数次，将羊膜剪成圆形，上皮面朝上放入直径30mm的嵌入式培养皿(Millipore)内，铺平，超净台内晾干，无菌包装好放入-80℃，反复冻融3次备用。

3)角质形成细胞角质化

将脱细胞羊膜从-80℃取出后，人胎盘IV型胶原包被2h，吸出多余胶原溶液，晾干。用前PBS清洗1次，放入6孔板内，将CM-Dil标记的人成纤维细胞(P2～5)按5×10⁵个/ml密度，接种200μl于脱细胞羊膜上。待细胞贴附于羊膜上后，每孔内加培养基2ml，次日更换培养基去除未贴壁的细胞。第3天，吸干成纤维细胞上培养基，将BD Matrigel^TM Basement MembraneMatrix(BD Biosciences)与人胎盘IV型胶原按1∶1，共200μl，混匀后铺于成纤维细胞上，37℃培养箱放置30min，待基质凝固后，将用CM-DiI(3μg/ml)标记过的角质形成细胞按1×10⁶个/ml接种于均匀其上，待细胞贴附后，更换培养基为K-SFM(Gibco，U.S.)，浸没培养3d后，移至气液界面，更换培养基为含1mmol/L Ca²⁺的K-SFM，培养7～15d，隔天半量换液，期间用荧光显微镜观察角质形成细胞生长情况。

图1显示的是种植在羊膜上培养的成纤维细胞，A是CM-Dil标记的细胞，B是扫描电镜的图片。可以看到，细胞密集生长，形态呈现典型的梭形。电镜下观察到细胞分泌颗粒，提示细胞状态良好。图2是气液交界面培养的角质形成细胞。其中A是普通光镜下的照片，B是标记了CM-Dil的照片，C是贴壁培养的角质形成细胞。镜下显示气液交界面培养的角质形成细胞呈小圆形密集，与贴壁培养的细胞形态迥异。对构建成功的人工皮肤进行HE染色，观察到明显伊红染色的角质化层(图3)。

实施例2本发明的器官型人工皮肤中正常皮肤特异性蛋白的表达

免疫组化检测结果发现，实施例1制备的器官型人工皮肤表达正常人体皮肤的相应蛋白标记，包括角质层的involucrin(套膜蛋白)、棘层的CK10、基底层的CK14、真皮层vimentin(波形蛋白)和基底层表皮干细胞的CK19(图4A-E)。其中，表皮层和真皮层的分层清晰，蛋白在各层的分布位点基本一致，表皮干细胞位于表皮层靠近基底层的位置上。套膜蛋白和CK10的阳性细胞较正常皮肤少，提示可以按照该方案继续优化，取得更佳效果。

实施例3皮肤的细胞活力测定

台盼蓝染色检测细胞活力的结果显示，实施例1制备的器官型人工皮肤内生长的成纤维细胞和角质形成细胞能够保持良好的细胞活性，活细胞数达到98％(图5)。

实施例4含有羊水干细胞(AFS)的人工皮肤的制备

1)羊水干细胞的分离培养

从医院妇产科收集孕中期羊水，4℃保存带回实验室。先用200目滤纱过滤，以除去较大的组织碎片，然后1000r/min，离心6min，弃上清，收集细胞。再加入含有1％双抗的PBS溶液，混匀，置37℃处理10min，然后离心，收集细胞，重复用1％双抗PBS溶液处理3次。最后加入AFS细胞培养液(ACM)，于37℃5％CO₂培养箱中培养，7d后换液去除未贴壁细胞，以后每周换液2次。待集落中心细胞密集时以1.25g/L胰酶-EDTA消化传代。以后待细胞生长至80％汇合时(见图6)按1∶3～1∶5传代。

2)流式细胞仪检测细胞表面标志

对第4～6代细胞进行流式细胞仪分析。细胞达到90％以上汇合时以1.25g/L胰酶-EDTA消化成细胞悬液，PBS洗涤细胞，异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗人HLA-ABC，HLA-DR、CD105、CD90、CD29、CD44及藻红蛋白(PE)标记的鼠抗人CD34、CD45(BioLegend产品)与细胞悬液4℃冰箱内孵育1h，PBS洗涤3次后检测，以FITC或PE标记的小鼠同型免疫球蛋白为阴性对照。FACS Calibur流式细胞仪检测，CELL Quest软件分析。

3)免疫荧光检测干细胞特定基因表达

取第4～6代细胞接种在96孔板，至70％汇合时40g/L多聚甲醛固定，PBS冲洗后1g/L Triton-X-100透膜处理，分别与鼠抗人ssea-4、oct-4抗体孵育过夜，洗去一抗后加入FITC标记的羊抗鼠IgG，荧光显微镜下观察干细胞特定基因表达(见图8)。

4)人工皮肤的构建

选择生长状态良好的第3代AFS，流式细胞术结果(见图7)表明所选择的AFS的表面分子标志物CD44、CD90和CD29阳性率99％，纯度较好。用胰酶和EDTA消化成细胞悬液，以5×10⁶个细胞与胶原蛋白蛋白胶主体液(在4℃条件下，将胶原蛋白用0.05％醋酸溶解，浓度范围1mg/ml～10mg/ml，冰浴下紫外线照射，以8∶2体积比加入羊水干细胞专用培养液ACM，调pH至7.2～7.4制备而成)0.15m l混合后，静置于37℃恒温培养箱内一小时，即形成膜状凝胶。

将制备好的膜状凝胶平铺培养皿中，CO₂饱和湿度恒温培养箱中4h后，将培养的成纤维细胞和角质形成细胞(详见实施例1)分别接种于膜上，气-液交界培养7～15天即可。

Claims (10)

1.一种器官型人工皮肤，其由包括以下成分的生物材料构建而成：成纤维细胞、脱细胞羊膜、基质材料及角质形成细胞。

2.一种器官型人工皮肤，其由包括以下成分的生物材料构建而成：成纤维细胞、羊水干细胞、基质材料及角质形成细胞。

3.根据权利要求1或2所述的人工皮肤，其特征在于其中所述成纤维细胞为分离自哺乳动物皮肤的成纤维细胞，优选人源成纤维细胞，包括分离的原代幼儿皮肤成纤维细胞、成人皮肤成纤维细胞和幼儿包皮成纤维细胞，最优选幼儿包皮成纤维细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的人工皮肤，其特征在于其中所述基质材料为亲水性高分子材料，所述亲水性高分子材料优选地由天然的或合成的细胞外基质蛋白形成。

5.根据权利要求4所述的人工皮肤，其特征在于所述细胞外基质蛋白选自纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、玻璃粘连蛋白或其组合，优选是合成的细胞外基质蛋白，更优选是人重组III型胶原蛋白或人重组IV型胶原蛋白。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的人工皮肤，其特征在于所述羊水干细胞分离自哺乳动物孕期羊水，优选哺乳动物孕中期的羊水，经体外培养而得。

7.一种器官型人工皮肤的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将体外培养的成纤维细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度种植在分离自哺乳动物胎盘的脱细胞羊膜上加入培养基培养2～4天构建成仿真皮层；

2)在所述仿真皮层上面覆盖一层厚度约1mm的基质材料；

3)待基质材料凝固后，将角质形成细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度接种于基质材料上，通过气液交界培养直至角质形成细胞角质化。

8.一种器官型人工皮肤的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)收集雌性哺乳动物的孕期羊水，优选哺乳动物孕中期羊水，分离羊水干细胞，选择生长状态良好且细胞表面上干细胞基因标志物表达阳性的羊水干细胞与胶原蛋白液混合形成膜状凝胶；

2)将体外培养的成纤维细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度种植在步骤1)获得的膜状凝胶上，并加入培养基培养2～4天构建成仿真皮层；

3)在所述仿真皮层上面覆盖一层厚度约1mm的基质材料；

4)待基质材料凝固后，将角质形成细胞按照1×10⁵～5×10⁵个细胞/cm³的密度接种于基质材料上，通过气液交界培养直至角质形成细胞角质化。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于所述基质材料为亲水性高分子材料，所述亲水性高分子材料优选地由天然的或合成的细胞外基质蛋白形成，所述细胞外基质蛋白优选地选自纤维连接蛋白、层粘连蛋白、I型胶原蛋白、III型胶原蛋白、IV型胶原蛋白、玻璃粘连蛋白或其组合，更优选是合成的细胞外基质蛋白，最优选人重组III型胶原蛋白或人重组IV型胶原蛋白。

10.根据权利要求1-6中任一项所述的器官型人工皮肤在制备开放性创面用皮肤替代物或临时覆盖物的用途，所述开放性创面优选是烧伤创面，或因创伤或手术引起的皮肤缺损创面。

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