CN1630715A

CN1630715A - 一种用于治疗皮肤缺损的可移植性产品的制备方法

Info

Publication number: CN1630715A
Application number: CNA03803624XA
Authority: CN
Inventors: 王正品
Original assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Current assignee: NCPC New Drug Research and Development Co Ltd
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2003-08-22
Publication date: 2005-06-22
Anticipated expiration: 2023-08-22
Also published as: EP1660642A1; CN100503814C; US20060228339A1; EP1660642A4; WO2005007835A1

Abstract

以来源于胎膜的生物载体膜为支架，用组织细胞工程的方法，将具有活性的功能细胞、基质细胞和组织基质成分构建成机体组织替代物，用于治疗人体组织缺损性疾病。

Description

一种用于治疗皮肤缺损的可移植性产品的制备方法

技术领域

本发明是关于一种治疗皮肤缺损的可移植性产品的制备方法，其产品为皮肤替代物，含有来源于胎膜的生物支架膜和皮肤活细胞。本发明要求6/16/03提交的临时申请US60/478,427的权益。

背景技术

术语：

皮肤替代物(skin equivalent graft)：是在特定的环境或实验室中，将表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞按一定比例种植在铺有胶原蛋白的载体膜上培养，构成一皮肤类似结构的替代物。

组织培养支架(tissue culture insert)：制造一个具有三维结构的支架，人为地将组织细胞种植在支架的不同层面上，使得细胞能够得到充分营养供应和形成具有三维构象的组织替代物。

胎膜(extraembryonic membrane)：由羊膜和绒毛膜组成。绒毛膜指的是胎膜的外层，其外表面与母体蜕膜接触。羊膜指的是胎膜的内层，包括羊膜上皮和基底层，羊膜可以轻易地从绒毛膜上剥离得到。(R.N.Matthews et al.Obstet Gynaecol Annu.1982，11：31-58.)。

外根鞘(ORS)细胞：来源于人体毛囊外根鞘部位。ORS细胞通过扩增可不断生成表皮角质形成细胞，这样就可以避免采用手术或吸泡方式获取皮肤或粘膜角质形成细胞。而且，ORS细胞可来自患者自身并通过体外细胞培养产生患者自身的角质形成细胞(M.A.Pham et al.J Invest Dermatol.1990，94(6)：749-52.；A.Limat et al.Cell Tissue Res.1994，275(1)：169-76.)。

表皮细胞：来自于人体皮肤最外层的表皮层，至少含有两种细胞类型，大多数细胞属于角质细胞，少数细胞属于黑素细胞。

真皮细胞：来自于表皮下的真皮层，真皮细胞的主要类型是成纤维细胞。

美国专利4,304,866公开了一种可移植的具有生物活性的角质组织膜。美国专利4,485,096公开了一种组织替代物及其制备方法。美国专利5,106,949公开了一种胶原蛋白组分及其制造方法。美国专利5,536,656公开了一种通过成层胶原蛋白胶状膜来构建皮肤替代物。美国专利6,326,019公开了一种由羊膜制成的移植物，及其分离、保存的方法，并在外科手术中得到应用。

从解剖学和功能学上来讲，皮肤可分为表皮层和真皮层。表面的表皮层是抵抗感染和防止水分流失的屏障，表皮细胞多数属于角质细胞，表皮干细胞位于基底层，通过不断增殖、分化，由里向外依次形成短暂扩充细胞，即角质形成细胞，和有丝分裂期后分化细胞，以及角质化细胞(E.Christophers，J Invest Dermatol 1971，56：165-169.；J.R.Bickenbach et al.Cell Tissue Kinet 1986，19：325-333.)。表皮干细胞和角质形成细胞是表皮细胞增殖源。干细胞终生具有不断增殖和自我更新的能力。(L.G..Lajtha Differentiation.1979，14：23-34.；F.M.Watt.Curr OpinGenet Dev 2001，11(4)：410-7.；G.Cotsarelis et al.Exp Dermatol，1999，8：80-88.)。位于深层的真皮层使皮肤具有弹性，并保持其结构的完整，并且真皮内还有为表皮层提供营养的血管。毛囊、汗腺等附属器跨越真皮层和表皮层。皮肤感觉神经通过真皮组织进入表皮层。表皮的再生主要是位于基底层的表皮干细胞不断增殖分化的结果。在创伤恢复过程中，新生成的表皮组织从创伤的边缘开始生长，如果伤口宽度超过几厘米时创面就不能够充分愈合。这时就需要利用皮肤替代物来帮助伤口愈合。

创面覆盖需要一种可以恢复表皮屏障功能的材料，并在修复过程中能与创面融合为一体的材料(R.G.Tompkins et al.Alternative Wound Coverings.In Herndon D，ed.Total Burn Care，1^st ed.Philadelphia：W.B.Saunders Company Ltd，1996：164_72.)。创面修复分为暂时性修复和永久性修复两类。暂时性修复可以通过同种异体移植和异种移植来实现。人羊膜和其它多种人造生物膜作为暂时性创面覆盖物(I.Jones et al.British Journal of Plastic Surgery.2002，55：185-193.)已经被广泛应用于临床，用于治疗皮肤损伤。暂时性创面覆盖物用于浅表性烧伤效果最佳。虽然它可以形成抵抗感染和控制水分流失的屏障，从而为表皮再生提供有利的生长环境，但在皮肤永久性移植方面却没有什么作用。这种利用人羊膜作为暂时性创面覆盖物的方法早在1910年就已经有了记载，之后Matthews等在1982年就此作了回顾性综述。在皮肤缺损修复过程中，将表皮细胞移种到创伤区域，所移种的表皮细胞可以不断产生新细胞，可以实现永久性创面愈合。为了达到这一目的，皮肤替代物便由此而产生。目前临床所使用的皮肤替代物是在人工膜上载有来源于同种异体皮肤的表皮细胞，但同种异体细胞对皮肤损伤往往没有永久性修复的功能；同时，目前人工皮的供应有限，临床需要支付很高的治疗费用。另外，目前市场上还没有用于修复皮肤缺损和损伤的真正的皮肤替代物。

人羊膜来自胎膜，由单层立方形羊膜细胞附着在富含胶原蛋白的基底膜上所形成的内羊膜和疏松地附着在绒毛膜上的外层结缔组织构成。它可以分为三层：单层的上皮层、较厚的基底膜、和无血管的结缔组织层(R.N.Matthews et al.Obstet GynaecolAnnu.1982，11：31-58.)。研究发现人羊膜含有III型和V型胶原蛋白。它还含有类似角膜上皮基底膜的IV型和VII型胶原蛋白，以及纤维结合蛋白和层粘蛋白。另外，它还含有成纤维细胞，在冷冻保存的羊膜中还发现了其它种类的生长因子(S.C.G.Tseng，et al.Medical and Surgical Management Ed.E.J.Holland et al.in press，2001.)。研究发现，羊膜有助于上皮的形成、正常表皮型的维持，并且可以防止感染、抑制疤痕形成、促进血管形成和组织的附着。另外，人们还认为羊膜具有非免疫原性。有关羊膜抗体或细胞介导的免疫反应未见报道，这表明羊膜具有较低的免疫原性。因而，羊膜移植中不需要使用全身性免疫抑制剂。绒毛膜的表面由滋养细胞构成。其表面和母体蜕膜融合在一起。在滋养层之下有假基底层和“结缔组织”层。

本发明设计一种方法，来制备一种利用胎膜进行细胞培养的支架。从而可以将同种异体或自体的表皮细胞和真皮细胞移种在支架固定的胎膜上，构建与人体皮肤组织学构造相似，而且可以永久性修复皮肤缺损的皮肤替代物。

发明内容

本发明提供一种可以用作修复皮肤缺损的皮肤替代物的制备方法。

本发明提供一种特殊支架的制作方法，支架是由母环、插环和固定在其上的胎膜三部分构成，主要用于皮肤替代物的构建。

本发明提供一种载有同种异体皮肤细胞与胎膜构建异体皮肤替代物的制备方法。

本发明提供一种利用载有自体同源表皮细胞或毛囊细胞与胎膜构建自体皮肤替代物的制备方法。

本发明提供一种根据人体皮肤组织学结构构建皮肤替代物的制备方法。

本发明提供一种制备胎膜并将其用于皮肤替代物构建的制备方法。

本发明提供一种制备表皮细胞并用于皮肤替代物构建的方法。

本发明提供一种获得真皮细胞并用于皮肤替代物构建的方法。

本发明提供一种利用患者自体毛囊获得ORS细胞，用于自体皮肤替代物构建的方法。

本发明提供一种制备、储藏和运输皮肤和毛囊标本的方法，用于皮肤替代物构建时所需种子细胞的方法。

本发明提供一种制备、储藏和运输用于皮肤替代物构建所需胎膜的方法。

本发明提供一种制备、储藏皮肤替代物的方法。

本发明提供一种特殊培养液的配制方法，用于刺激皮肤替代物中的角质细胞增殖，减缓角质细胞分化。

本发明提供一种检测皮肤替代物中角质形成细胞的方法，角质形成细胞对于皮肤缺损修复起着至关重要的作用。

本发明提供一种利用表皮细胞生长因子促进表皮细胞在皮肤创面不断增殖的方法。

本发明的其它目的可以通过附图和实施例详细描述看出。

附图说明

图1载体膜的组织结构图，其中A)所示为胎膜的解剖学结构，它可以从“分界层”分为羊膜和绒毛膜两部分；B)所示为羊膜的解剖学结构，它含有表皮细胞层(1)、基底膜(2)、致密层(3)、成纤维细胞层(4)、以及部分海绵层(5)；和C)所示为绒毛膜的解剖学结构，它含有部分海绵层(5)、细胞层(6)、网状层(7)、假基底膜(8)、滋养层(9)和母体蜕膜(10)。

图2载体膜的制备图，其中A)和B)所示为羊膜的去上皮层的方法；和C)和D)所示为绒毛膜的去滋养层方法。

图3所示为构建皮肤替代物所用支架的制备，其中A、B、C代表的是该支架的基本组件，包括母环(A)，插环(C)和载体膜(B)；D所示为便于培养液进出的小孔；E和F所示为两个培养室，支架组装后分别为A培养室和B培养室，G代表的是从支架上剪下的多余的膜。

图4所示为利用支架构建皮肤替代物；其中A)所示为一组装好的支架，含有一个母环、一个插环和一张载体膜；B)、C)和D)所示为在A培养室中培养的真皮细胞B与表皮细胞C；D)所示在B培养室培养的真皮细胞；和E)所示为支架上已经构建好的皮肤替代物。

图5所示为从支架上取下的构建好的皮肤替代物；其中A)所示为仍在支架上的皮肤替代物，B)所示为从支架上取下的皮肤替代物；和C)所示在400倍相差显微镜下观察到的已构建好的皮肤替代物。构建好的皮肤替代物包括表皮层(1)、载体膜(2)和真皮细胞层(3)。

图6所示为载体膜和饲养细胞的显微形态；其中A)所示人羊膜的表皮层(EP)(150×)和去表皮层后的羊膜(BM)；B)所示人绒毛膜的滋养层(TB)(150×)和去滋养层后的绒毛膜(150×)；C)和D)所示饲养细胞即3T3细胞C和大鼠胚胎成纤维细胞D的形态(225×)。

图7所示为人毛囊的一部分(100×)，它是自体皮肤替代物的角质形成细胞源。人毛囊分为毛干(HS)、外根鞘(ORS)和内根鞘(IRS)。

图8所示体外培养扩增的人毛囊细胞；其中A)、B)和C)所示(400×)培养皿中饲养层细胞上的ORS细胞(A)、贴壁(B)和伸展生长(C)；D)所示(225×)外根鞘细胞不断增殖分化，所形成的角质细胞克隆。

图9所示体外扩增培养的人表皮细胞。其中A)、B)和C)所示(225×)为生长在饲养层上的表皮细胞(A)(400×)以及贴壁(B)和伸展生长(C)；D)所示(225×)去除成纤维细胞后的纯表皮细胞。

图10所示为利用载体膜构建皮肤替代物。其中A)所示(225×)去除表皮层后的裸露羊膜；B)所示(225×)生长有真皮细胞的羊膜；C)所示(225×)生长有真皮细胞的绒毛膜；和D)所示(225×)生长有表皮细胞的羊膜。

图11所示为皮肤替代物；其中A)所示(225×)经胰酶-EDTA消化后的载体膜上的表皮细胞；B所示(225×)在移种皮肤细胞前人为在羊膜上造成一孔洞修复后的状态；C)所示从支架上取下的一张皮肤替代物(约8cm.sup.2)；和D)所示为一张构建好的皮肤替代物(约80cm.sup.2)。

图12所示为从皮肤替代物上消化得到的表皮细胞特征；其中A所示(225×)从皮肤替代物上消化得到的表皮细胞传代培养；B)所示(945×)从皮肤替代物上消化得到的角质蛋白19呈阳性的表皮细胞；C所示(945×)从皮肤替代物上消化得到的整合素β-1呈阳性的表皮细胞；D)所示为从皮肤替代物上消化得到的表皮细胞正常核型。

发明内容

根据本发明所述，皮肤替代物由三层基本结构构成，其中包括：由角质形成细胞构成的表皮层；由成纤维细胞构成的真皮层；和由来源于胎膜的载体膜。角质形成细胞可以通过同种异体或自体皮肤或毛囊获得。

皮肤替代物中的角质细胞由三类基本细胞组成，干细胞、短暂扩充细胞和有丝分裂期后细胞。干细胞和短暂扩充细胞是表皮细胞的增殖源。干细胞终生具有不断增殖和自我更新的能力。通过本发明的方法可以检测到干细胞群，这可以作为皮肤替代物的质量监控指标。

为生产此移植物特别设计了一种新型的细胞培养支架，这种支架可以根据需要进行组装和拆卸。应用此支架可以固定如胎膜等载体膜。可以使载体膜的两个面分别暴露于两个不同的培养室中。两个面上都可以移种细胞。

本发明中的方法已经被应用于皮肤替代物的制备，组织工程构建好的皮肤替代物具有与正常人体皮肤类似的结构。在不同的培养阶段于支架的不同培养室移种不同的细胞，从而形成了该移植物不同层次的结构。

本发明中的这种新型细胞培养支架是为生产皮肤替代物而特别设计的。此支架由三部分组成，包括一套可以自由组装拆卸的母环、插环，和一张载体膜。一个完整的支架有两个培养室，中间由载体膜隔开。载体膜的两个面直接暴露在两个培养室中。然后将细胞移种到不同培养室的载体膜上进行培养。

I、通过附图将制备皮肤替代物基本工艺的简要说明：

生物载体膜的制备

图1说明了载体膜的组织结构，其中A)所示为胎膜的解剖学结构，它可以从“分界层”分为羊膜和绒毛膜两部分。B)所示为羊膜的解剖学结构，它含有表皮细胞层(1)、基底膜(2)、致密层(3)、成纤维细胞层(4)、以及部分海绵层(5)。C)所示为绒毛膜的解剖学结构，它含有部分海绵层(5)、细胞层(6)、网状层(7)、假基底膜(8)、滋养层(9)和母体蜕膜(10)。

图2所示为载体膜的制备，其中A)和B)所示为羊膜去上皮层的方法，C)和D)所示为绒毛膜去滋养层方法。

特殊组织培养支架的制备和皮肤替代物的构建

图3所示构建皮肤替代物所用支架的制备，其中A、B、C代表的是该支架的基本组件，包括母环(A)，插环(C)和载体膜(B)；D所示为便于培养液进出的小孔；E和F所示为两个培养室，支架组装后分别为A培养室和B培养室；G代表的是从支架上剪下的多余的膜。

图4所示为利用支架构建皮肤替代物；其中A)所示为一组装好的支架，含有一个母环、一个插环和一张载体膜；B)、C)和D)所示为在A培养室中培养的真皮细胞B与表皮细胞C；D)所示在B培养室培养的真皮细胞；E)所示为支架上已经构建好的皮肤替代物。

图5所示为从支架上取下的构建好的皮肤替代物；其中A)所示为仍在支架上的皮肤替代物，B)所示为从支架上取下的皮肤替代物；C)所示在400倍相差显微镜下观察到的已构建好的皮肤替代物。构建好的皮肤替代物包括表皮层(1)、载体膜(2)’和真皮细胞层(3)。

载体膜和饲养细胞的制备

图6所示为载体膜和饲养细胞的显微形态；其中A)所示人羊膜的表皮层(EP)(150×)和去表皮层后的羊膜(BM)；B)所示人绒毛膜的滋养层(TB)(150×)和去滋养层后的绒毛膜(150×)；C)和D)所示饲养细胞、3T3细胞(C)和大鼠胚胎成纤维细胞(D)的形态(225×)。

种子细胞的获得及其质量控制

图8所示体外培养扩增人毛囊细胞；其中A)、B)和C)所示(400×)培养皿中饲养层细胞上的ORS细胞(A)、贴壁(B)和伸展生长(C)；D)所示(225×)外根鞘细胞不断增殖分化，所形成的角质细胞克隆。

图9所示体外扩增培养的人表皮细胞。其中A)、B)和C)所示(225×)为生长在饲养层上的表皮细胞(A)以及(400×)贴壁(B)和伸展生长(C)；D)所示(225×)去除成纤维细胞后的纯表皮细胞。

图10所示体外利用载体膜构建皮肤替代物。其中A)所示(225×)去除表皮层后的裸露羊膜；B)所示(225×)生长有真皮细胞的羊膜；C)所示(225×)生长有真皮细胞的绒毛膜；D)所示(225×)生长有表皮细胞的羊膜。

图11所示为皮肤替代物；其中A)所示(225×)经胰酶-EDTA消化后的载体膜上的表皮细胞；B所示(225×)在移种皮肤细胞前人为在羊膜上造成一孔洞修复后的状态；C)所示从支架上取下的一张皮肤替代物(约8cm.sup.2)；D)所示为一张构建好的皮肤替代物(约80cm.sup.2)。

图12所示为从皮肤替代物上消化得到的表皮细胞特征。其中A所示(225×)从皮肤替代物上消化得到的表皮细胞传代培养；B)所示(945×)从皮肤替代物上消化得到的角质蛋白19呈阳性的表皮细胞；C所示(945×)从皮肤替代物上消化得到的整合素β-1呈阳性的表皮细胞；D)所示为从皮肤替代物上消化得到的表皮细胞正常核型。

II、用于皮肤替代物构建支架的制备

该支架的生产设计是基于所使用的细胞培养皿的结构，以及皮肤替代物组织构建的需要，并对本发明中制备的移植物进行“组织”构造工程设计而获得的。市场所售的细胞培养皿根据直径的大小可分为35mm、60mm、100mm和150mm等几种。支架也可以根据细胞培养板(6孔、12孔、24孔、48孔)的大小进行设计和制造。

该支架是为生产含有至少一层活细胞的可移植物而特殊设计的。它包括3个部分(见图3)：一个母环C、一个插环A和一张载体膜B。根据细胞培养皿或培养孔的大小，可以制造不同大小规格的支架。母环可制成5mm到200mm高、直径5mm到150mm。母环底壁上留有小孔或V形切口，便于培养皿中的培养液从外部流入支架中的培养室中。

插环的高度为母环的一半。插环一端口颈的宽度为1到2mm粗，可以插入母环中。插环的外壁上有纵嵴。组装后支架的纵嵴与母环的内壁紧密接触。两条纵嵴之间以及母环内表面和插环外表面之间都有狭小的间隙。

母环的顶端被一张载体膜所覆盖。然后，用插环将载体膜插入并固定在母环上。用眼科剪将多余的载体膜剪去。将载体膜的边缘伸展，夹在母环和插环之间。载体膜将支架分为两个培养室，上面的A培养室以载体膜上表面为底以插环内面为壁，下面的B培养室以载体膜的反面为顶以母环内面为壁。

组装好后完整的支架通过上述三部分构成了两个细胞培养室(A培养室和B培养室)，载体膜的两个面分别暴露在A、B培养室中。

III、载体膜——胎膜的制备

获取标本

为了避免感染血液性传染病，选择预先进行HIV-1、HIV-2、HTLV-1、乙肝病毒、丙肝病毒和梅毒检查，血清反应阴性的健康者作为胎膜捐献者。剖腹产时所获得的胎膜最为理想。在生产(正常产或剖腹产)时将胎膜从胎盘上剪下。在无菌生理盐水中清洗干净，除去母血、胎便以及其它污染物，然后尽快转移到盛有无菌生理盐水的无菌塑料袋中，放入冰桶送往实验室。

膜的保存和运输

将胎膜从生理盐水中取出，沥干膜上生理盐水。然后，每张胎膜需用经过滤除菌的85％的乙醇300mL，固定24到48小时。除去乙醇，移入300ml无菌生理盐水中漂洗10分钟，至少重复漂洗3次，操作必须在无菌条件下进行。将胎膜剪成所需大小，浸泡于装有冻存液的聚乙烯试管中。冻存液含有50％的甘油(Sigma)和50％的DMEM培养液(ATCC)。本发明中应用的另一种冻存液含有20(5-50)％的DMSO(Sigma)和80％的DMEM培养液，可以将膜保存1年以上。在冻存液中，胎膜可在4℃条件下保存1个月，或在-20℃条件下保存1年以上。

新鲜使用时，仅需将裁剪好的胎膜浸泡在添加了250U/ml青霉素、250μg/ml链霉素、100μg/ml卡那霉素或50μg/ml庆大霉素、和2.5μg/ml两性霉素的DMEM培养液中，于4℃可保存48小时。

羊膜和绒毛膜的制备

将盛有冻存膜的试管放置在4℃条件下过夜。然后在无菌条件下将膜转移到DMEM培养液中，至少洗涤3次，准备分离羊膜和绒毛膜。

无菌镊子和眼科剪各两把。在超净台中准备一火焰灯，用于操作过程中仪器受到污染时的快速灭菌。

利用两把镊子可以轻易将浸在DMEM培养液中的胎膜从海绵层部位分离为羊膜和绒毛膜两部分(见图1；分离)。随后将分离后的羊膜按上述方法固定在支架中。羊膜的上皮层朝向A培养室，结缔组织一面朝向B培养室。将分离后的绒毛膜再次进行修剪，除去母体蜕膜，固定到另一个支架上。滋养层一面朝向A培养室，结缔组织一面朝向B培养室。

利用羊膜制备载体膜

如上所述，选择羊膜作为载体膜，并将其固定到支架上。羊膜的上皮表面朝向A培养室，反面结缔组织面朝向B培养室。支架组装好后，在37℃条件下，用0.25％胰酶和EDTA(乙二胺四醋酸盐)(Sigma)消化10到30分钟，然后用橡胶细胞刮去羊膜的上皮层。除去附着在羊膜上的细胞碎片，并用DMEM培养液冲洗干净。在除去上皮层的操作中，要避免严重损伤上皮层下的基底膜部分。完成上述操作后就可以进行细胞移种或进一步再处理(见图2中A和B)。

利用绒毛膜制备载体膜

分离开的绒毛膜也可以用作载体膜，固定到支架上。制备绒毛膜支架的方法和制备羊膜支架的方法相同。滋养层面朝向A培养室，结缔组织面朝向B培养室。A培养室在37℃条件下，用0.25％的胰酶和EDTA消化10到30分钟，然后用橡胶刮去滋养层。此时暴露在A培养室中的是假基底膜，暴露在B培养室中的是结缔组织层。之后就可以在膜上移种和培养皮肤细胞(见图2中C和D)。

通过胰酶消化和机械刮擦除去上皮层或滋养层后，基底膜很容易受到损伤，膜的损伤可以影响到细胞在载体膜上的粘附和生长。因此需要对膜进行进一步加工处理。

IV.载体膜的加工处理

制备粗制胶原蛋白溶液

所用胶原蛋白是大鼠尾腱和小牛跟腱胶原蛋白。但也曾应用过其它种类的胶原蛋白，包括人胎儿皮肤胶原蛋白，而其它多种胶原蛋白也可能适用于本发明需要。制备胶原蛋白溶液并使其保持弱酸性。胶原蛋白的制备方法如下。将冷冻的450g大鼠的尾巴在70％乙醇中解冻20分钟，在无菌条件下，在70％乙醇中将肌腱束切割开。将单个的肌腱从肌腱鞘中抽出，切碎，置于0.1M醋酸中，每条尾巴用250ml。将此溶液于4℃下静置48小时，切碎的肌腱已经膨胀并充满容器。将此胶粘溶液在Sorvall离心机上以15krpm的转速离心半小时。弃上清液，用0.1M氢氧化钠以4∶1比例混合中和醋酸，此时胶原蛋白沉淀。将此溶液以3000rpm转速离心15分钟。弃上清液，加入等体积的新鲜0.01M的醋酸使胶原蛋白重新凝固，4℃保存。溶液中蛋白质的含量约为3mg/ml。

细胞生长培养液的配制

在DMEM细胞培养液中添加了多种成分，各添加成分的最终浓度分别为：胎牛血清10％、CaCl₂0.1mM、L-谷氨酸4mM、青霉素100U/mL、链霉素硫酸盐100.umg/mL、两性霉素B0.25μg/mL、氢化可的松0.4μg/mL、霍乱毒素10^-10M、转铁蛋白5μg/mL、T3 2×10^-11M、腺嘌呤1.8×10^-4M、胰岛素5μg/mL、表皮生长因子10ng/mL。将此溶液浓缩3倍，等分后保存于-80℃冰箱。

基底膜成分补充液

基底膜成分补充液含有0.4mg/ml IV型胶原蛋白(Life Technology公司提供)、1.0mg/ml fibronactin(Life Technology公司提供)、1.0mg/ml粘蛋白(LifeTechnology公司提供)。

修复液

修复载体膜10cm的区域需要100μL(从20到150μL)修复液，其中包括40μL胶原蛋白溶液、30μL细胞生长促进液和30μL新鲜制备的基底膜成分补充液。

基底膜的修复

为了增强细胞在膜上的附着，并促进其生长，对膜的两面按如下方法进行修复和处理。将固定有载体膜的支架用DMEM培养液洗涤两次。洗完后将支架放入一个空培养皿中。在37℃无菌条件下，风干至少2小时，使膜完全干燥。

膜完全干燥后，将修复液(培养室表面积为0.2ml/10cm²)添加到A培养室一面，即基底膜表面。膜表面完全湿润后，将膜表面剩余的修复液吸出，接着将支架倒置使另一个培养室或B培养室向上，在B培养室一面重复A培养室面的操作。将载体膜置于生物安全柜中风干1到2小时。制备好的支架准备进行细胞移种和培养。

V.饲养细胞的制备

取材

皮肤取材

皮肤标本来源于同种异体和自体同源。通常可以利用外科手术收集新生儿以及青少年包皮标本。为了获得大量的皮肤标本，可从尸体(48小时以内)腹部进行取材。皮肤标本也可以从流产胎儿获得。皮下组织的厚度随活检部位不同而不同。包皮标本皮下组织特别疏松因而易于剥离，而背部皮肤皮下组织非常致密，不容易剥离。对于从背部所取皮肤标本要尽可能除去附着的结缔组织。皮肤经常有细菌或酵母或真菌污染。将皮肤标本在乙醇中浸泡可以杀死大部分污染物。但滞留在汗孔或皮脂腺孔中的细菌可能仍然存在。包皮最容易出现闭塞孔。值得庆幸的是，把皮肤倒置平铺在培养皿中很容易看到是否存在闭塞孔。然后小心地将被感染区域切割并弃去，特别注意不要切到闭塞孔上。

为了避免培养物污染，应将皮肤标本用含有抗生素(250U/ml青霉素、250μg/ml链霉素、100μg/ml卡那霉素或50μg/ml庆大霉素、2.5μg/ml两性霉素)的DMEM培养液漂洗5到10次。然后将皮肤标本置于运输培养液(如下文所述)中转移到试验室。

毛囊取样

角质细胞可以由毛囊外根鞘(ORS)细胞扩增获得。毛囊的外根鞘主要由未分化角质细胞组成的多层组织，在表皮再生中起到一定作用。

毛囊获得的最佳部位是在头部的枕骨区，但也可以从胡须、腿和生殖器区分离得到。所选区域先用75％的酒精喷洒消毒，消毒5分钟后，拔取毛囊。拔取毛囊时，先将相邻毛发拨开，露出所要拔取的毛发。用无菌的镊子夹住几根毛发(最多8到10根)，夹得尽量靠近头皮表面。沿着与皮肤表面垂直的方向迅速拔取。然后用无菌的眼科剪直接将毛囊部分收集到加有5ml漂洗培养液的60-mm平皿内。弃去剪下的末端毛发。每毫升最终培养液至少需一根毛囊。在体视显微镜下，选择处于毛发生长初期的毛囊，并将其转移到一个新的加有5mL漂洗培养液的60-mm培养皿中。毛发球根部分和相当于漏斗部的末端约占毛囊1/5长的部分，可用眼科剪剪去，这样可以保证毛囊所剩余的活细胞群仅由外根鞘细胞构成。将制备好的毛囊移入含有5mL漂洗培养液的60-mm培养皿中连续转移漂洗4次。漂洗培养液中含有PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)以及250U/ml青霉素、250μg/ml链霉素、100μg/ml卡那霉素或50μg/ml庆大霉素、和2.5μg/ml两性霉素。

人毛囊的运输

将按上述方法获取的毛囊放在一种冻存液中，这种冻存液中含30％FBS、65％含有抗生素的DMEM培养液和5％DMSO。标本在-80℃干冰中逐渐冷冻，在运输过程中始终保持-80℃。

VI.细胞培养液的配制

运输培养液

运输皮肤或毛囊时，使用运输培养液。其组成是在DMEM中添加10％FCS、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.25μg/mL两性霉素B、50μg/mL庆大霉素。此培养液于4℃保存，培养液组成成分需在-20℃浓缩保存。

表皮细胞原代培养液(EPM)

表皮细胞原代培养液是在Minimum Essential Medium Eagle(Sigma提供)中添加了10％胎牛血清、0.1mM CaCl₂、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100.umg/mL链霉素硫酸盐、0.25μg/mL两性霉素B、0.4μg/mL氢化可的松、10^-10M霍乱毒素、5μg/mL转铁蛋白、2×10^-11M碘赛罗宁、1.8×10^-4M腺嘌呤、5μg/mL胰岛素和10ng/mL表皮生长因子。此培养液尽可能新鲜使用，其储存期约为1星期。培养液的添加成分在-20℃浓缩保存。

角质细胞生长培养液(KGM)

角质细胞生长培养液由Ham F12培养液和DMEM培养液(Sigma提供)以1∶3(体积比)的比例组成，并添加了10％胎牛血清、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100.umg/mL链霉素硫酸盐、0.25μg/mL两性霉素B、0.4μg/mL氢化可的松、10^-10M霍乱毒素、5μg/mL转铁蛋白、2×10^-11M碘赛罗宁、1.8×10^-4M腺嘌呤、5μg/mL胰岛素和10ng/mL表皮生长因子。此培养液尽可能新鲜使用，但其储存期约为1星期。添加剂-20℃浓缩保存。

ORS细胞主培养液(ORSM)

ORS细胞主培养液由Ham F12培养液和DMEM培养液(Sigma提供)以25∶75(体积比)的比例组成，并添加了10％胎牛血清、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100umg/mL链霉素硫酸盐、0.25μg/mL两性霉素B、0.4μg/mL氢化可的松、10^-10M霍乱毒素、5μg/mL转铁蛋白、2×10^-11M碘赛罗宁、1.8×10^-4M腺嘌呤、5μg/mL胰岛素和10ng/mL表皮生长因子。此培养液尽可能新鲜使用，但其储存期约为1星期。添加剂-20℃浓缩保存。

饲养细胞培养液

饲养细胞培养液DMEM培养液(Sigma提供)，添加了10％胎牛血清、4mM L-谷氨酸、100U/mL青霉素、100.umg/mL链霉素硫酸盐、0.25μg/mL两性霉素B。

VII.饲养细胞的培养和扩增

饲养细胞层的制备

在此之前，已有研究人员详细报道了角质细胞的体外培养技术((Y.Barrandon etal.Cell Size As A Determinant Of The Clone-Forming Ability Of HumanKeratinocytes.Proc Natl Acad Sci U S A.1985，82(16)：5390-4.；Y.Barrandonet al.Three Clonal Types Of Keratinocyte With Different Capacities ForMultiplication.Proc Natl Acad Sci U S A.1987，84(8)：2302-6.；M.B.Mathoret al.Clonal Analysis Of Stably Transduced Human Epidermal Stem Cells InCulture.Proc Natl Acad Sci U S A.1996，93(19)：10371-6.；A.Rochat et al.Cell.Location Of Stem Cells Of Human Hair Dollicles By Clonal Analysis.CellLocation Of Stem Cells Of Human Hair Follicles By Clonal Analysis.Cell.1994，76(6)：1063-73.；F.M.Watt et al.Epidermal Stem Cells：Markers，Patterning AndThe Control Of Stem Cell Fate.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 1998，353(1370)：831-7)

本发明中使用了两种饲养细胞，人成纤维细胞和3T3细胞系(ATCC提供)。3T3细胞属于贴壁细胞，37℃在饲养细胞培养液中生长直至接近融合(约70％)，然后更换新鲜的培养液并加入1～10μ.g/mL丝裂霉素-C，继续培养5到12小时。用丝裂霉素-C处理过的细胞可以用胰蛋白酶消化，得到的细胞悬液按2.5×10⁴细胞/cm²的密度移种到铺有胶原蛋白的培养皿中。3T3细胞贴壁后，此培养皿即可用来培养角质细胞。

利用外科手术所采集的皮肤标本或流产胎儿皮肤标本，制备人的成纤维细胞。成纤维细胞通过消化获得，并可多次传代。然后利用处理后成纤维细胞作为滋养层，提供皮肤细胞生长的环境。本发明中优先选择人真皮成纤维细胞作为滋养细胞。人真皮成纤维细胞在添加了10％FCS的EMEM培养液中增殖，每周分裂比率为1∶2，在100-mm培养皿中效果最好。37℃条件下，在无钙离子和镁离子，含有0.05％胰酶-0.02％EDTA的PBS中消化约5分钟。加入3.5mL添加了10％FCS的DMEM终止消化。制备饲养细胞层时，对培养物以1∶4的比例而不是通常的1∶2的比例进行传代培养，并放入37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养。第二天，在37℃时条件下用含有8μg/mL丝裂霉素-C并添加了10％FCS的DMEM对这些成纤维细胞处理5小时，使其处于有丝分裂后状态。处理5小时后，将细胞用含有钙和镁离子的PBS至少洗涤4次，然后用不含钙和镁离子的PBS漂洗一次。37℃条件下，用无钙、镁离子并含有0.05％胰酶-0.02％EDTA的PBS消化约3分钟，轻轻晃动培养皿，加速细胞脱壁。加入4.5mL含有10％FCS/100-mm的DMEM终止消化。对此悬浮液进行细胞计数。并用含有10％FCS的DMEM将细胞悬浮液进行稀释，得到密度为2×10⁴细胞/mL的细胞悬浮液。将此悬浮液分别移入培养皿(通常是35-mm的培养皿)中培养。每星期更换一次培养液，饲养细胞在使用之前，可以在37℃的CO₂培养箱中生长20-30天。也可将饲养细胞移入液氮中冻存。冻存方法是将密度为1×10⁶细胞/ml经丝裂霉素-C处理过的成纤维细胞，悬浮在1mL含有10％FCS和10％二甲基亚砜(Sigma提供)的DMEM中，并转移到一个1.8-mL的冻存管中，在-80℃条件下冻存24小时，最后转移到液氮罐中。复苏后的细胞可以达到50％的存活率，此结果具有可重复性。制备饲养细胞层时，将成纤维细胞以4×10⁴细胞/mL的密度在培养液中悬浮。

细胞培养皿的包被

Fibrenestin、luminin和胶原蛋白都可以用来包被细胞培养皿。本发明中优先选择IV型胶原蛋白。

利用皮肤标本获得种子细胞

首先将皮肤从运输培养液中取出，用PBS洗涤，在70％的乙醇中浸泡3次，无菌条件下风干。然后将皮肤放置到一个浅的无菌容器中(10-cm的Petri培养皿对小片皮肤标本正好)。用镊子和虹膜剪刀将皮下组织除去，剩下皮肤为相对致密的真皮。将皮肤标本平展，表皮放在Petri培养皿表面，用一把无菌解剖刀将皮肤标本切成2到3mm的皮条。将标本放在统一的容器中，容器中至少含有能够覆盖量的0.25％胰酶-EDTA(Sigma提供)，4℃条件下过夜培养12到48小时。然后，除去消化液，并加入含有10％FCS的DMEM培养液终止消化。用移液管吹打，将皮肤细胞分散开。用100目细胞筛网过滤，获得单细胞悬浮液。在显微镜下利用血球计进行细胞计数。300g离心5分钟，然后按2.0-5.0×10⁶细胞/mL的密度用冻存液重新悬浮。-80℃冻存。

表皮细胞和真皮细胞的获得和培养

表皮细胞和真皮细胞的获得方法与从完整皮肤中获得皮肤细胞的过程相似。在冷胰酶-EDTA消化之前，将皮肤平展把真皮朝向Petri培养皿表面，用无菌解剖刀将皮肤切割成细长的条。冷胰酶消化过夜，将皮条从消化液中取出，在10-cm Petri培养皿盖子内将多余的培养液轻轻擦除，将皮条放在Petri培养皿中。在皮肤标本边缘可以看到表皮和真皮分离时，将其放在(真皮一面朝下)完全培养液中。用两个弯钳轻轻地将表皮剥掉，并放入到一个含有20ml完全培养液的50-ml离心管中。用吸管用力抽吸吹打，将有附着的角质细胞从表皮部分分离，然后用尼龙纱布(100μm筛目)过筛。用弯钳轻轻地刮擦真皮部分的上表面，获得松散附着的基底细胞。将获得的基底细胞和角质细胞混合，过尼龙纱布筛(100μm筛目)，100g离心10分钟，PBS洗涤两次，进行总细胞计数和活细胞(台盼蓝着色法)计数。刮擦真皮表面可以得到更多的基底细胞。而在37℃用胰酶消化时，刮真皮上表面并不能显着增加基底细胞收率，因为基底细胞主要位于真皮和表皮结合处。300g离心5分钟后，按2.0-5.0×10⁶细胞/ml的密度用冻存液将其重新悬浮，-80℃冻存。复苏后可用于在载体膜移种。

分离得到的真皮层可以进一步在37℃条件下用胰酶-EDTA溶液消化10到15分钟。然后将真皮转到完全培养液中，用Pasteru吸管不断吹打，将细胞分散开。从真皮中分离得到的细胞用尼龙纱布(100μm筛目)过滤，100g离心10分钟，用培养液洗涤两次，进行总细胞计数和活细胞(台盼蓝着色法)计数。300g离心5分钟后，按2.0-5.0×10⁶细胞/ml的密度用冻存液将其重新悬浮，-80℃冻存。用于皮肤替代物的构建。

利用毛囊获得种子细胞

从毛囊中分离外根鞘细胞

将毛囊置于一个空的35-mm培养皿中，使毛囊与培养皿贴近，但又彼此分开，这样可以保证胰酶与毛囊充分接触。用巴斯德吸管吸去残余的培养液。滴加最少量的0.1％胰岛素-EDTA溶液(50或50多根毛囊滴加的消化液的体积应小于5mL)。然后在37℃条件下消化，直到在毛囊周围可以看见最外层的ORS细胞脱落。消化时间约15-20分钟，但具体时间的确定需在显微镜下观察。如果外根鞘组织变得疏松，毛囊附近可以看到单个ORS细胞，则可判断胰酶消化完全。

加入5倍的完全培养液(1mL胰酶用5mL培养液)终止胰酶消化。用巴斯德吸管将毛囊吹吸几次，注意不要形成泡沫。然后将含有毛囊的细胞悬浮液转到一只50mL的试管中。用1mL培养液将该35-mm培养皿冲洗两次，冲洗液一并移入到上述50mL试管中。

将上述50mL试管中的培养液补足7mL。然后用一个5mL吸管用力吹吸至少50次，使仍附着在毛囊上的细胞脱落。然后用培养液将细胞悬浮液稀释，使得最终体积的毫升数与所消化的毛囊数相符。如果只消化几个毛囊，最好在该过程中减少添加的培养液的体积，避免再次离心。

外根鞘细胞的原代培养

将外根鞘细胞悬浮液移入预先铺有饲养细胞层(3T3或成纤维细胞)的培养皿中，将剩余的毛囊部分用镊子夹去。

放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。由1根毛囊获得的外根鞘细胞移入加有1ml培养液的10cm²的培养皿中培养，细胞密度约为1×10³细胞/cm²，所以在饲养细胞层上只能看到几个圆形细胞。培养2-4天后，主要分布在饲养细胞之间的外根鞘细胞开始扩增。此时，外根鞘细胞表现出典型的上皮样细胞形态，有一个易于辨认的核和一个大的细胞质。随着培养时间的延长，外根鞘细胞克隆逐渐增大，不断将饲养细胞推到一边。4天后，向培养皿中添加1ml新鲜培养液。培养前7天不需更换培养液。之后，每星期更换3次培养液。更换培养液可以去除了已脱落的饲养细胞。随着克隆的不断增大，外根鞘细胞排列越来越紧密，看上去细胞个体减小，细胞质也不再显着。培养初期，细胞增殖较慢，细胞生长一旦进入指数生长期，细胞数量便会迅速递增。培养12-14天，细胞生长达到80％到100％融合。

外根鞘细胞的传代培养

外根鞘细胞传代培养前，首先在37℃用含有0.02％EDTA无钙、镁离子的PBS消化2-3分钟，选择性地除去残余的饲养细胞。用吸管用力吹吸，可有效地加速饲养细胞的去除速度。然后将EDTA溶液吸去，用不含有钙和镁离子的PBS冲洗外根鞘细胞3次，除去残余的饲养细胞。37℃条件下，加入含有0.1％胰酶-0.02％EDTA(无钙和镁离子)的PBS消化外根鞘细胞，例如35-mm培养皿中加入0.5mL消化液，消化时间约为8-10分钟，但具体消化时间需在倒置显微镜观察后确定。在每只35-mm培养皿中加入1.5mL培养液终止消化。用一个5mL吸管用力吹吸，获得单细胞悬浮液。使用血细胞计数器进行细胞计数。室温下，250g离心8分钟。弃去上清液，选用合适的培养液重新悬浮细胞。

外根鞘细胞的传代培养，最好选用低钙培养液，并在铺有饲养细胞塑料培养皿中进行。这样可以得到1.0×10⁴cells/cm²的低细胞培养密度，但可以3-5倍的传代。根据移植物制备的需要，可以继续进行外根鞘细胞的传代培养。扩增后的外根鞘细胞于-80℃冻存，复苏后用作载体膜上种子细胞。

外根鞘细胞获得和扩增的其它方法

另一种获得和扩增角质细胞的方法是从生长在胶原蛋白胶上的人整根毛囊的周围消化分离，获得角质细胞。通过一种无菌技术拔取人毛囊，然后浸入含有抗生素的DMEM培养液中。剩余的皮脂腺腺管是所被拔出组织的上限，因而总是缺少漏斗处的外根鞘部分。用剪刀除去毛囊球体部分，因为它的软端会妨碍毛囊在胶原蛋白胶上的移种。将毛囊切开(通常切两半)减少其体积，以保证毛囊的竖直方向。

将修剪好的毛囊正向移到新鲜胶原蛋白胶上。使得毛囊的一部分竖直插到胶原蛋白胶中。每个35-mm培养皿中，移入5个半片毛囊，添加人毛囊细胞原代培养液，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养。培养8-14天后，移种的毛囊扩增得到的角质细胞一般可以达到70％到80％融合。培养可以至少维持2个月。外根鞘细胞的次级培养如上文所述。

表皮细胞的其它来源

口腔表皮细胞

人体口腔黏膜由不同种类的表皮细胞构成，一般分为衬里(非角质化表皮细胞)、咀嚼(正角质化或角质化旁表皮细胞)和特殊类型细胞(舌背脊部)。齿龈黏膜(咀嚼表皮细胞)和表皮无论在形态学方面，还是生物化学方面，都非常相似。培养的表皮细胞可作为种子细胞，用于构建治疗口腔黏膜缺损或皮肤缺损用的皮肤替代物。

尿道表皮细胞

尿道表皮细胞可以从尿道活检时分离得到。培养的表皮细胞可作为种子细胞，用于构建治疗如尿道下裂等先天性病变的尿道黏膜的皮肤替代物。

结膜和角膜细胞

眼球前表面覆盖有高度特殊化的结膜和角膜表皮细胞。结膜富含血管，上皮层由角质细胞和分泌粘液素的杯状细胞组成。角膜表皮细胞为复层上皮，没有杯状细胞以及其它细胞。在没有血管的角膜基质上有一个立体状的基底层。视觉的敏锐程度取决于角膜上皮的透明度，从干细胞来源出的短暂扩充细胞向里不断增殖、迁移来维持其结构和功能的完整性。利用外科手术中去除的角膜边缘，可以获得角膜细胞，体外培养、扩增后，用于人工角膜移植物的构建，用于治疗角膜疾病或损伤。

VIII.皮肤替代物的构建

表皮层的构建

准备一个带有载体膜，羊膜或绒毛膜的支架，将A培养室朝上，置于培养皿中。载体膜已除去表皮细胞或滋养层细胞，可以直接移种皮肤细胞。将由皮肤或毛囊中获得的原代角质形成细胞，扩增培养，然后与真皮细胞按一定比例混合，将得到的细胞混悬液移种到羊膜或绒毛膜A培养室的基底膜面，并添加表皮细胞原代培养液。培养前3天，使用条件培养液和新鲜培养液的混合液。培养3天后，每隔3天更换一次培养液。在载体膜上，皮肤替代物的构建时间一般需要10-14天。

真皮层的构建

表皮细胞生长7-10天后，用无菌镊子将支架翻转180°，使B培养室朝上。复苏冻存的真皮细胞，并移种到B培养室中载体膜的结缔组织一面。向B培养室中添加用于表皮细胞培养的培养液。细胞培养3-4天后，用无菌镊子翻转支架180°，使A培养室朝上。继续培养5-7天。此时，皮肤替代物已经构建完成，可以用于损伤皮肤的移植。

根据不同的细胞源构建不同的皮肤替代物

自体同源移植物：从接受手术的患者自身皮肤或毛囊，获得表皮细胞，从其自身结缔组织中获得真皮细胞。

半自体同源移植物：从接受手术的患者自身毛囊或皮肤获得表皮细胞，从同种异体结缔组织中获得真皮细胞。

同种异体移植物：表皮细胞和真皮细胞都从同种异体获得。

成纤维细胞移植物：载体膜上移种的细胞为成纤维细胞。

其它组织替代物的构建

人体口腔黏膜替代物：用人体口腔黏膜细胞作为支架中的种子细胞构建人体口腔黏膜替代物。

人体尿道黏膜替代物：用人体尿道黏膜细胞作为支架中的种子细胞构建人体尿道黏膜替代物。

人体角膜替代物：用人体角膜细胞作为支架中的种子细胞构建人体角膜替代物。

IX.移植物上角质形成细胞的生长潜力的检测

使用表皮细胞原代培养液进行原代表皮细胞培养时，形成角质细胞克隆。培养14天后，一个克隆约含有1-2×10⁵个细胞，且克隆边缘清晰。传代后，克隆可以产生大而平滑的子克隆，生成率为100％。产生全克隆的细胞可以生成多达1×10⁴⁰后代(超过140倍)，一个成年人的皮肤细胞数约为8×10¹⁰。这样，一个细胞可以产生足以覆盖成年人全身几次的表皮细胞。因此，能产生全克隆的角质形成细胞具有干细胞的本质特征，即巨大的自我更新的潜能。下文所述检测方法是用来检测细胞存活率、再生能力，和干细胞样的细胞标志(Y.Barrandon et al.Cell Size as A DeterminantOf The Clone-Forming Ability 0f Human Keratinocytes，Proc Natl Acad Sci U SA.1985，82(16)：5390-4.；Y.Barrandon，et al.Three Colnal Types OfKeratinocyte With Different Capacities For Multiplication.Proc Natl Acad SciU S A.1987，84(8)：2302-6.；M.B.Mathor et al.Clonal Analysis Of StablyTransduced Human Epidermal Stem Cells In Culture.Proc Natl Acad Sci U S A.1996，93(19)：10371-6.；A.Rochat et al.Location Of Stem Cells Of Human HairFollicles By Clonal Analysis.Cell.1994，76(6)：1063-73.；Barrandon and Green，1985，1987；Mathor et al，1996；Rochat et al.，1994)。

整合素β-1阳性细胞的检测

整合素β-1被可作为表皮干细胞的标志物(F.M.Watt.Stem Cell Fate AndPatterning In Mammalian Epidermis.Curr Opin Genet Dev 2001，11(4)：410-7.；F.M.Watt.Role Of Integrins In Regulating Epidermal Adhesion，Growth AndDifferentiation.EMBO J 2002，21(15)：3919-26.；C.Bagutti et al.DermalFibroblast-Derived Growth Factors Restore The Ability Of Beta(1)Integrin-Deficient Embtyonal Stem Cells To Differentiate intoKeratinocytes.Dev Biol 2001，231(2)：321-33.)。本发明中抗整合素β-1抗体(Upstate Biotechnology提供)被用来检测表皮干细胞中整合素β-1。利用载玻片培养皮肤替代物所使用的角质细胞。当细胞在载玻片上生长3天后，用PBS洗涤3次，共15分钟，然后用95％乙醇/5％乙酸4℃下固定1分钟。固定后的细胞用1％牛血清白蛋白室温孵育1-2小时，后用PBS洗涤2次，共15分钟。加入用1％牛血清白蛋白稀释至10μg/ml的抗人整合素β-1抗体，置于4℃过夜。用PBS洗涤3次后，置于1％牛血清白蛋白稀释的连接荧光标记的抗鼠IgG的二抗中，室温放置1.5小时，用PBS洗涤3次，共15分钟。荧光显微镜下检测阳性细胞(Watt，1998，2001，2002；Bagutti et al.，2001；Cotsarelis et al.，1999)。

用抗角质蛋白19抗体检测表皮干细胞

角质蛋白19也被看作是表皮干细胞的另一种标志物(M.Michel et al.Keratin19 As a Biochemical marker Of Skin Cells In Vivo And In Vitro：keratin 19Expressing Cells Are Differentially Localized In Function Of Anatomic Sites，And Their Number Varies With Donor Age And Culture Stage.J Cell Sci.1996.109：1017~1028.)。在本发明中，利用角质蛋白19抗体(DAKO提供)检测表皮干细胞中角质蛋白19。利用载玻片培养皮肤替代物所使用的角质细胞。当细胞在载玻片上生长3天后，用PBS洗涤细胞3次，共15分钟，然后用4％多聚甲醛4℃下固定15分钟，用PBS洗涤2次，共15分钟。将固定好细胞的载玻片置于1％皂角苷溶液中，室温放置1-2小时。然后加入抗人细胞角质蛋白19抗体，4℃过夜。将载玻片上的细胞浸于1％牛血清白蛋白稀释的连接荧光标记的抗鼠IgG的二抗中，室温放置1.5小时，用PBS洗涤3次，共15分钟。荧光显微镜下检测阳性细胞。

使用台盼蓝染色法检测细胞的存活率

首先用0.25％ trypsin-EDTA溶液从皮肤替代物上消化得到纯角质细胞，然后用0.04％台盼蓝(Sigma提供)对细胞进行染色，并在显微镜下细胞计数。根据未染色细胞和已染色细胞的数目，计算二者的比例。本发明中的实验结果，得到的角质细胞(未染色)存活率约为85％(80％到95％)(如表1所示)

表1：台盼蓝染色检测细胞的存活率

支架号所统计角质细胞数被染色细胞％(死细胞/活细胞)

168 250 27 10.8

169 310 35 11.2

176 300 28 9.3

177 300 31 10.3

178 300 29 9.6

179 300 36 12.0

移植物细胞染色体组型分析

移植物上载有的表皮细胞和真皮细胞具有正常的染色体组型，这是移植物成功构建的标志。XY和XX细胞是遗传的。为了证实移植物中所载有的细胞是否具有正常的染色体组型，对按所述方法培养的细胞进行检测。检查细胞染色体结构和数目异常，从所培养的细胞中检测出约10-20个分裂中期染色体组型。在种子细胞移种前，对来源于人毛囊ORS的细胞进行了染色体组型检查，分别为正常的46，XY或46，XX。

当细胞在培养皿中达到40％到50％融合时，加入0.02μg/ml秋水仙素(GIBCO BRL)，37℃、5％CO₂，95％空气的培养箱中过夜培养；细胞用PBS冲洗数次；然后，用0.25％胰酶-EDTA 37℃条件下消化10-15分钟；加细胞培养液，悬浮细胞；800g离心5分钟；加冷Carnoy固定剂(无水甲醇和冰醋酸，体积比3∶1)固定5分钟；用PBS洗涤，按上述方法离心；重新悬浮在0.5ml的Carnoy固定剂中；用吸管吸取1滴细胞悬浮液，转移到用Carnoy固定液处理过的载玻片上；将玻片风干，用Giemsa染色(GIBCO，BRL)，并用自来水漂洗；再次风干后，盖上盖玻片，使用400×油镜镜检。

所检查的角质细胞和成纤维细胞有染色体组型正常(例如44条常染色体和2条性别染色体)。另外，未发现染色体断裂、缺失、添加或其它形状或数目异常。

X.皮肤替代物的运输

本发明中采用了两种方法来运输和/或装运此移植物。第一种方法是将载有移植物的支架放在一个装满培养液，并用封口膜封口的无菌容器中。这种方法适合在4℃-10℃条件下运输。为了在运输过程中减小震荡和摇晃，避免移植物受损，容器的大小应该在装满培养液后，正好能放入支架。当支架和移植物送到目的地后，将移植物有移入新的培养皿中，并且使用同样的培养液，培养1-2天后，即可使用。

本发明中运输移植物的第二种方法，需要将制成的皮肤移植替代物完全浸泡在一种冻存溶液中，浸泡时间为1-2小时，但最佳时间为1小时。这种冻存方法可以使移植物被慢慢冷冻，然后，在-70℃或更低的温度下保存。用这种方法保存的组织，当温度在-70℃到-196℃间波动时，冻存组织的各种理化性质，能够基本保持稳定。短期保存可以在-76℃(干冰的温度)条件下进行，用于运输。在-120℃或-140℃(接近液氮温度)条件下保存效果很好，但最佳冻存温度是-196℃(液氮温度)。本发明中所用冻存液为含2M甘油的DMEM培养液。

移植物复苏时采取快速升温法，使组织在约1-3分钟内解冻。快速升温法包括水浴加热或感应加热。用直接往冻存的移植物表面上滴加预热到37℃培养液的方法，解冻效果最佳。

因为冷冻保护试剂有毒性，解冻后15分钟之内应将冷冻保护剂去除，最好在解冻后尽快去除，以避免损害组织或组织替代物的细胞的生存能力。移植物解冻后，用pH约为6.8到7.4的培养液替换冷冻保护溶液。

XI.动物试验和临床应用

动物试验

用苯巴比妥钠将体重约为250-300g的SD大鼠麻醉。根据皮肤替代物的大小，在大鼠背部剪去整层皮肤(包括表皮和真皮)。将移植物平铺在创面上后，边缘缝合固定。然后，用涂满凡士林的纱布垫和浸泡Earle’s盐溶液的纱布垫覆盖伤口，并用弹性绷带加以固定。在移植后的9天-13个月期间，需要重新麻醉大鼠，并剪下整个移植物。剪下的移植物一半用福尔马林磷酸盐缓冲液固定，乙醇脱水，石蜡包埋；除去另一半中间部分下面的脂肪组织后，将其剪成2-3mm³的皮粒，利用组织块法培养成纤维细胞。

临床应用

此处所述的皮肤替代物适合用于人体或其它哺乳动物皮肤创伤或缺损的治疗。它尤其适用于治疗大面积烧伤等皮肤损伤或溃疡。

用于烧伤治疗。皮肤替代物的移植应充分考虑到移植的位置，以及烧伤的程度，如部分皮肤损伤，还是全层皮肤损伤。

用于腿部溃疡治疗。大多数的腿部溃疡都源于静脉。移植前，需要对伤口进行处理。

用于皮肤外伤和慢性皮肤溃疡治疗。本发明中制备的皮肤替代物修复伤口效果显着。

用于医源性创伤和溃疡的治疗。瘢痕形成的原因多种多样，可能由于常规手术造成的，也可能是偶然形成的。在这种情况下，表面容易形成颗粒，并且进一步表皮化(例如切除藏毛窦之后)。而在其它一些情况下，可能考虑适当地推迟移植。这两种情况时都可以使用皮肤替代物，能使创面迅速愈合，或为移植提供一个无感染创面。

用于外科手术所致皮肤缺损的治疗。

在妇产科方面的应用。本发明所制备的皮肤替代物可以用来构建人造阴道，以及修复阴道缺损。

用于白癜风治疗。研究显示，本发明所制备的皮肤替代物含有可以在与角质细胞相同的培养条件下迅速增生的黑素细胞。白癜风患者热切期望能够得到长久、有效地治疗。

XII.工业生产

相关技术人员通过一些常规实验，就可识别或确定发明中所述特殊试剂、催化剂、实验步骤和操作技术等的等效物或过程。所有这些都被包括在本发明权利要求之内。

Claims

1、一种可移植的组织替代物的制备方法，此组织替代物可用于人体组织缺损的修复，包括：

a)制备一种用于构建载有活细胞的皮肤替代物的组织培养支架，支架可以自由装配，所述支架包括以下部分：

i)母环：为一圆筒状结构，底壁四周有孔洞，当将支架放入培养容器中时，培养液可自由通过孔洞进出支架腔；

ii)插环：为一圆环状结构，可插入母环内。用插环将一生物载体膜固定在上述母环内，从而生物载体膜和插环环壁形成上培养室；和

iii)生物载体膜来源于胎膜，将母环分隔成上下两个独立的培养空间；

b)种子细胞的制备，包括功能细胞和基质细胞的制备；

c)将上述种子细胞通过支架内不同的培养腔室移种到制备好的生物载体膜上进行细胞培养，和组织替代物的构建；

d)从支架上将构建好的组织替代物取下，用于组织缺损的修复。

2、权利要求1所述的方法，其中所述的组织替代物包括以下之一：

a)皮肤替代物；

b)粘膜替代物；

c)角膜替代物；和

d)其它人体膜性组织替代物。

3、权利要求1所述的方法，其中所述的组织替代物用于以下目的之一：

a)皮肤缺损的修复；

b)粘膜缺损的修复；

c)眼结合膜缺损的修复；

d)人工角膜缺损的修复；

e)人体其它膜性组织缺损的修复。

4、权利要求1所述的方法，其中a)所述的组织替代物是一种组织工程皮肤替代物，用于皮肤缺损的修复。

5、权利要求4所述的方法，其中所述的组织工程皮肤替代物的组织结构与正常皮肤相似，即表皮层由表皮细胞构成，真皮层由结缔组织细胞和组织基质构成。

6、权利要求4所述的方法，其中所述的组织工程皮肤替代物是以下所述之一：

a)自体皮肤替代物含有所述的生物载体膜、自体表皮细胞和自体真皮细胞；

b)半自体皮肤替代物含有所述的生物载体膜、自体表皮细胞和异体真皮细胞；

c)异体皮肤替代物含有所述的生物载体膜、异体表皮细胞和异体真皮细胞；

d)皮肤替代物含有所述的生物载体膜和成纤维细胞。

7、权利要求5所述的方法，其中所述的表皮细胞源于皮肤表皮层的活的角质形成细胞。

8、权利要求5所述的方法，其中所述的表皮细胞源于毛囊外根鞘层活的角质形成细胞。

9、权利要求5所述的方法，其中所述的结缔组织细胞源于皮肤真皮层活的成纤维细胞。

10、权利要求5所述的方法，其中所述的组织基质由结缔组织纤维构成。

11、权利要求4所述的方法，其中所述的皮肤缺损是指由各种慢性疾病所引起的皮肤溃疡。

12、权利要求4所述的方法，其中所述的皮肤缺损是指由各种不同皮肤损伤所导致。

13、权利要求4所述的方法，其中所述的皮肤缺损是由外科手术所导致。

14、权利要求1所述的方法，其中所述的生物载体膜是去掉上皮层、保留基底膜和结缔组织层的羊膜。

15、权利要求1所述的方法，其中所述的生物载体膜是去掉滋养层细胞、保留假基底膜和结缔组织层的绒毛膜。

16、权利要求1所述的方法，其中所述的细胞培养容器指的是细胞培养皿或细胞培养板。

17、权利要求1所述的方法，其中所述的组织替代物构建过程包括：

a)安装支架，并放置在上述培养容器内；

b)将羊膜上皮去掉，暴露基底膜；

c)将活细胞分别移种到支架两面的不同培养室内的基底膜面和结缔组织面上；

d)加入培养液，进行细胞培养；和

e)拆卸支架，取下组织替代物。

18、权利要求1所述的方法，其中所述的组织替代物构建过程包括：

a)安装支架，并放置在上述培养容器内；

b)将绒毛膜去掉滋养层细胞，暴露假基底膜；

c)将种子细胞分别移种到支架两面的不同培养腔室内的假基底膜面和结缔组织面上；

d)加入培养液，进行细胞培养；和

e)拆卸支架，取下组织替代物。

19、权利要求1所述的方法，其中活细胞在生物载体膜上/内通过以下方法进行增殖：

a)配制胶原蛋白的酸性溶液；

b)将上述的胶原蛋白酸性溶液滴加到支架培养室内的胎膜表面，调节溶液PH值，使胶原蛋白沉积到生物载体膜的表面；

c)在移种细胞前，将上述胶原蛋白溶液和载体膜进行孵育；和

d)配制添加多种因子的细胞培养液。

20、一种抑制角质形成细胞的细胞分化的方法，包括：

a)配制低钙浓度的角质形成细胞培养基，和

b)用所述培养基培养角质形成细胞。