CN117551604A - 搭载子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官的脱细胞羊膜支架复合体修复子宫内膜损伤 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种搭载子宫内膜间充质干细胞和上皮类器官脱细胞羊膜支架复合体的制备方法及在修复子宫内膜损伤中的应用。具体地，分别对人子宫内膜来源间充质干细胞和正常子宫内膜上皮类器官进行提取、分离与培养，然后将间充质干细胞和子宫上皮类器官混合的细胞悬液接种在制备的脱细胞羊膜支架上构建复合体。所述复合体能够补充局部干细胞的数量，分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，促进受损子宫内膜的生长修复。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及搭载子宫内膜间充质干细胞和上皮类器官脱细胞羊膜支架复合体的制备方法及在修复子宫内膜损伤中的应用。
背景技术
子宫内膜由内膜表面2/3的功能层和底部1/3的基底层组成。功能层可以随性激素变化而发生周期性脱落。基底层由腺体的基底部、致密基质细胞和血管构成，不发生周期性的变化。手术、感染、缺血等原因可以引起子宫内膜损伤，当损伤未达到基底层时，在雌激素作用下，基底层腺体断端处上皮细胞增生形成新的功能层，覆盖子宫体腔达到修复创面的作用。当基底层受到损伤后，内膜的再生能力受到限制，就可能形成宫腔粘连(intrauterine adhesion，IUA)或者薄型子宫内膜，临床上可表现为月经减少，闭经，不孕，习惯性流产，早产和胎盘异常等。
因此，目前对于子宫内膜基底层损伤引起的宫腔粘连和薄型子宫内膜的治疗是一个有待解决的问题，解决上述问题的关键在于有效防止粘连的同时，还要同时促进受损内膜的再生和修复。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
近年来，随着细胞治疗技术的发展，间充质干细胞已被广泛的研究用于子宫内膜的再生和修复。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)具有多分化、无限增殖和免疫调节能力等特点，根据细胞来源的不同，MSCs可分为骨髓源性、脂肪源性、子宫内膜源性和脐带源性。由于与子宫组织同源性高、易获得、安全性更高等原因，子宫内膜来源的间充质干细胞更适用于子宫内膜的修复。但在应用上也存在缺陷，如干细胞悬液移植后干细胞存活率低，需要控制干细胞的异常增殖和分化，分化后存在致癌衍生物。
类器官是一种3D细胞结构，可以来源于各种器官的多能性(胚胎或诱导)或成体干细胞，在特定培养条件下能够模拟人体内器官的关键结构和功能特征，因此被广泛用于研究发育生物学和组织再生机制。与传统的2D原代干细胞培养不同，类器官表现出更高的扩增能力，可以克服自体组织有限的可用性和可扩展性，重塑受损组织的特征。迄今为止，已经建立了许多组织特异性类器官培养模型，包括子宫内膜上皮类器官模型。然而，目前对子宫内膜上皮类器官潜在的组织修复能力的研究较少。同时子宫内膜上皮类器官的体外培养需要依赖特定的小分子化合物及生长因子的支持，我们研究显示将间充质干细胞及类器官共培养可减少部分生长因子的添加，表明间充质干细胞可以提供一部分的生长因子维持类器官的生长，因此子宫内膜修复时同时给予子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官可能起到更好的修复效果。
由于间充质干细胞及类器官的移植存在定植及存活率低的问题，生物支架材料的支撑起到重要的作用。支架材料作为种子细胞的人工细胞外基质，担负了种子细胞生长、繁殖及形成新组织的重要责任，理想的支架材料应具有以下优点：①低免疫原性，在体内无排斥反应；②良好的生物相容性，在体内无炎症反应和毒性反应；③分泌细胞生长因子，为种子细胞生长繁殖提供保障；④有三维立体空间结构，表面的微结构有利于细胞的黏附和生长；⑤可塑性，能够适用于不同的周围环境，保持特定的弹性。人脱细胞羊膜支架是经过特定处理后得到的一种具有良好空间结构的天然支架材料。其内含有丰富的胶原蛋白、生长因子和细胞外基质等，具有良好的生物相容性、天然三维结构、低免疫原性、排异反应小及取材容易等优点，目前成为组织工程的研究热点。
因此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种复合体。根据本发明的实施例，所述复合体包括：羊膜支架、细胞和类器官，所述细胞和类器官设置于所述羊膜支架的上表面。发明人经过大量的实验研究，构建了一种搭载细胞和类器官的羊膜支架复合体，其中细胞和类器官可作为治疗中重度宫腔粘连的活性成分，能够补充局部干细胞的数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，促进受损子宫内膜的生长修复。
根据本发明的实施例，所述复合体进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述羊膜支架为脱细胞羊膜支架。所述脱细胞羊膜支架含有丰富的胶原蛋白、生长因子和细胞外基质等，具有良好的生物相容性、天然三维结构、低免疫原性、排异反应小及取材容易等优点。
根据本发明的实施例，所述细胞选自间充质干细胞、骨髓基质细胞、脐带血干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞的至少之一。
根据本发明的实施例，所述细胞选自间充质干细胞。因此，能够促进损伤部位生长，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，从而保持共培养类器官的干性及其增殖效能，达到修复和再生的作用。
根据本发明的实施例，所述类器官选自上皮类器官、内皮类器官、神经胶质类器官或卫星类器官的至少之一。
根据本发明的实施例，所述类器官选自上皮类器官。因此，能够提供损伤部位生长所需干细胞，促进损伤部位再生，从而达到修复和再生的作用。
根据本发明的实施例，所述上皮类器官是通过从子宫内膜原代组织中提取获得的。
根据本发明的实施例，所述细胞与类器官的细胞数量比为1:1。在此配比下，细胞和类器官同时作为治疗子宫严重损伤后的重要手段，更好的补充局部干细胞的数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，促进受损子宫内膜的生长修复。
根据本发明的实施例，所述细胞和类器官在所述羊膜支架的上表面的密度为1×105～1×106。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种制备第一方面所述的复合体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将细胞和类器官接种在羊膜支架上，以便获得所述复合体。发明人经过经过大量的实验研究发现，将子宫内膜间充质干细胞和上皮类器官搭建在脱细胞羊膜支架复合体上能够有效促进子宫内膜受损部位的干细胞生长，可以防止宫腔粘连分离术后的再粘连，促进受损子宫内膜的生长修复。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，将所述细胞和类器官接种在羊膜支架上前进一步包括：将羊膜支架进行紫外照射处理。通过紫外照射处理能有效杀死羊膜支架中存在的细菌、病毒菌等微生物，避免影响其之后接种的细胞和类器官的生长。
根据本发明的实施例，所述紫外照射处理的时间为20～40min。
根据本发明的实施例，所述细胞和所述类器官的细胞数量比为1：1。在此配比下，细胞和类器官同时作为治疗子宫严重损伤后的重要手段，更好的补充局部干细胞的数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，促进受损子宫内膜的生长修复。
根据本发明的实施例，所述羊膜支架为脱细胞羊膜支架。所述脱细胞羊膜支架含有丰富的胶原蛋白、生长因子和细胞外基质等，具有良好的生物相容性、天然三维结构、低免疫原性、排异反应小及取材容易等优点。
根据本发明的具体实施例，所述脱细胞羊膜支架是通过如下方法制备得到的：从胎盘中分离羊膜，将所述羊膜进行消化处理，将消化处理后的羊膜再进行脱细胞处理，以便获得所述脱细胞羊膜支架。
根据本发明的具体实施例，所述消化处理使用的消化液为1％Triton X-100。
根据本发明的具体实施例，所述消化处理的时间为24h。
根据本发明的具体实施例，所述消化处理是在摇床中进行的。
根据本发明的具体实施例，所述摇床的温度为35～40℃，转速为110～130rpm。
根据本发明的具体实施例，所述摇床的温度为37℃，转速为120rpm。
根据本发明的具体实施例，所述脱细胞处理是指采用0.25％胰蛋白酶和0.02％EDTA对所述消化处理后的羊膜进行处理。
根据本发明的具体实施例，所述脱细胞处理的温度为35～40℃。
根据本发明的具体实施例，所述脱细胞处理的温度为37℃。
根据本发明的具体实施例，所述脱细胞处理的时间为4h。
根据本发明的实施例，所述细胞选自间充质干细胞、骨髓基质细胞、脐带血干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞的至少之一。
根据本发明的实施例，所述细胞选自间充质干细胞。因此，能够促进损伤部位生长，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，从而保持共培养类器官的干性及其增殖效能，达到修复和再生的作用。
根据本发明的实施例，所述类器官选自上皮类器官、内皮类器官、神经胶质类器官或卫星类器官的至少之一。
根据本发明的实施例，所述类器官选自上皮类器官。因此，能够提供损伤部位生长所需干细胞，促进损伤部位再生，从而达到修复和再生的作用。
根据本发明的具体实施例，所述上皮类器官是通过如下方法获得的：将子宫内膜原代组织进行消化处理和过滤处理，得到所述上皮类器官。
根据本发明的具体实施例，所述消化处理是在摇床中进行的。
根据本发明的具体实施例，所述消化处理的时间为50min。
根据本发明的具体实施例，所述摇床的温度为35～40℃，转速为210～230rpm。
根据本发明的具体实施例，所述摇床的温度为37℃，转速为220rpm。
根据本发明的具体实施例，所述过滤处理是通过滤网进行的。
根据本发明的具体实施例，所述滤网的孔径为90～110μm和30～50μm。
根据本发明的具体实施例，所述滤网的孔径为100μm和40μm。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：将接种有所述细胞和类器官的羊膜支架进行培养处理。
根据本发明的实施例，所述培养处理是在37℃，5％CO2条件下进行的。
需要说明的是，接种有所述细胞和类器官的羊膜支架是在子宫内膜上皮类器官培养基中进行培养的。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种复合体，所述复合体是通过第二方面所述的方法制备得到的。通过采用第二方面所述的方法制备得到的复合体能够补充局部干细胞的数量，分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节，促进子宫内膜损伤的内膜再生、血管再生、改善妊娠结局。
在本发明的第四方面，本发明提出了第一方面或第三方面所述的复合体在制备药物中的用途，所述药物用于修复子宫内膜损伤、提高妊娠成功率或改善妊娠结局质量。
在本发明的第五方面，本发明提出了第一方面或第三方面所述的复合体在提高妊娠成功率或改善妊娠结局质量中的用途。
有益效果：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种搭载子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官的脱细胞羊膜支架复合体的制备方法，以解决现有技术中子宫内膜损伤修复困难的技术问题。对于治疗中重度宫腔粘连上，与以往治疗方法相比，本发明的复合体具有以下优点：子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官共培养可作为治疗中重度宫腔粘连的活性成分，补充局部干细胞的数量，并分泌生长因子改善局部微环境及免疫调节等作用。脱细胞羊膜载体具有抗粘连能力、可降解性及良好的生物相容性，可以防治宫腔粘连分离术后的再粘连，为子宫内膜间充质干细胞和上皮类器官提供支持位点，提高局部作用浓度，延长作用时间，促进受损子宫内膜的生长修复。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例人子宫内膜来源间充质干细胞与上皮类器官的共培养图；其中，
图1A为模式图；
图1B为4倍显微镜下的拍摄图；
图1C为子宫内膜来源间充质干细胞与上皮类器官培养后，通过流式分析结果显示更高的干性基因表达；
图2是根据本发明实施例复合体用于大鼠子宫内膜损伤修复促进内膜再生图；其中，
图2A为大鼠宫腔损伤修复及疗效评估示意图；
图2B为治疗60天后，取各处理组子宫内膜组织进行Masson染色，40倍显微镜观察拍照；
图3是根据本发明实施例构建多细胞谱系的HAAM补片复合体以及用于大鼠子宫内膜损伤修复改善妊娠结局图；其中，
图3A为搭载子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官的脱细胞羊膜支架复合体的构建模式图；
图3B为复合体的HE染色切片图；
图3C为脱细胞羊膜支架及复合体的扫描电镜图；
图3D为不同处理组妊娠后宫腔内种植胚胎的拍摄照片；
图3E为量化不同处理组妊娠宫腔内胚胎个数的柱状图。
注：control对照组；endometrial mesenchymal stem cells(eMSC)子宫内膜间充质干细胞；endometrial epithelial organoids(EEO)子宫上皮类器官；human acellularamniotic membrane(HAAM)人脱细胞羊膜；multi-lineage endometrial organoids-HAAM(MLEO-HAAM)多谱系子宫内膜类器官脱细胞羊膜支架复合体；model损伤模型组
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明中发明人将人子宫内膜来源间充质干细胞和正常子宫内膜上皮类器官进行原代提取、分离与培养，然后将间充质干细胞和子宫上皮类器官混合后的细胞悬液接种在制备的脱细胞羊膜支架上构建复合体，并将复合体应用于大鼠子宫内膜损伤修复，该复合体系可以显著促进子宫内膜损伤大鼠内膜再生、血管再生、改善妊娠结局，修复损伤。
下面将对实施例作具体介绍，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂、序列、软件及仪器，都是常规市售产品或者开源的。
实施例1搭载子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官的脱细胞羊膜支架复合体的制备
1、人子宫内膜来源间充质干细胞的分离、培养
表1子宫内膜间充质干细胞的提取和培养相关试剂
1.1子宫内膜间质细胞的提取
1)提前使用高压蒸汽灭菌器121℃，20min将眼科剪和眼科镊灭菌；
2)取无菌条件下采集的正常子宫内膜组织，PBS清洗去除血液，使用眼科剪和眼科镊剪成1mm大小的碎块；
3)取15mL离心管加入5mL不含血清的DMEM/F12培养基，加入62.5μL组织消化液(表1所示)，装入组织碎块；
4)用封口膜密封离心管，在37℃摇床中220rpm消化50min，用1ml胎牛血清(FBS)终止消化。
5)充分吹打消化后的细胞悬液，逐滴滴加至100μm孔径的滤网中，将未消化完全的组织碎块过滤掉，得到滤液；
6)取上一步得到的滤液，逐滴滴加至40μm孔径的滤网中，此时体积较大的上皮细胞留在滤网上方，下方滤液即为间充质干细胞悬液；
7)将上一步得到的间充质干细胞悬液收集至15mL离心管中，450g离心5min，得到细胞沉淀；
8)用DMEM/F12完全培养基(表1所示)重悬细胞沉淀，接种在10cm培养皿中，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养。
1.2流式细胞术分选子宫内膜间充质干细胞
1)取培养扩增后的P0代间充质干细胞，吸净上清培养基，加入3mL PBS清洗；
2)然后加入1mL 0.25％含EDTA的胰蛋白酶，37℃消化3min，收集细胞悬液；
3)将细胞悬液1000rpm离心3min，用1mL PBS重悬细胞沉淀；
4)加入5μL的PE-SUSD2流式抗体，避光孵育30min；
5)孵育完成后，1000rpm离心3min，加入1mL PBS清洗细胞，重复两次；
6)清洗完后的细胞中再加入1mL PBS，将细胞吹打成悬液，将悬液的细胞浓度调整为1×107个/mL，送至复旦大学生命科学院流式细胞分选平台由专员进行分选，得到SUSD2+细胞群，即为子宫内膜间充质干细胞；
2、正常子宫内膜上皮类器官的提取和培养
表2正常子宫内膜上皮类器官培养基
2.1正常子宫内膜上皮类器官的提取
1)将新鲜的正常子宫内膜原代组织用眼科剪剪成1mm左右的组织碎块；
2)取15mL离心管，加入5mL不含血清的DMEM/F12培养基和62.5μL组织消化液(如表1)，装入组织碎块；
3)用封口膜密封离心管，在37℃摇床中220rpm消化50min；
4)消化完成后加入1mL FBS，混匀后静置2-3分钟，得到组织悬液；
5)取100μm滤网放置于50mL离心管内，1mL PBS湿润尼龙滤网，然后将组织悬液进行过滤，得到滤液1；
6)取40μm滤网放置于50mL离心管内，1mL PBS湿润尼龙滤网，将滤液1再次进行过滤(留取滤网未滤过细胞团块)，得到滤液2；
7)倒扣滤网，移液枪吸取PBS，反向冲洗滤网，得到滤液3，未过滤细胞团块收集到6cm皿内，观察滤网，直至无明显残余细胞团块；
8)将滤液3收集在15ml离心管内，300g离心5分钟，将PBS吸去，取适量红细胞裂解液重悬细胞沉淀，室温静置3分钟；
12)300g离心3分钟，弃去上清，此时无红色沉淀，如若仍存在红色沉淀，则重悬后再次静置2-3分钟；
13)加入1mL DMEM/F12培养基重悬细胞沉淀，300g离心3分钟，弃去上清；
14)使用PBS再次洗涤，300g离心3分钟，弃去上清，得到细胞沉淀；
15)依据细胞沉淀中细胞量的多少，加入适量基质胶重悬细胞沉淀，每个24孔铺40μL基质胶，培养皿边缘采用PBS补齐，放置37℃细胞培养箱30分钟；
2.2类器官的传代
1)将2.1步骤中培养好的细胞的上清培养基吸走，加入1mL DMEM/F12培养基，用枪头尽量将基质胶刮碎、打散，用DMEM/F12培养基重悬，加入EP管中；
2)然后300g离心3min；
3)去上清，再次加入1mLDMEM/F12培养基，反复吹打，将基质胶吹散；
4)再次300g离心3min，去上清。
5)用适量基质胶重悬类器官沉淀，按照1：3的比例传代。
3、人脱细胞羊膜支架的制备
收集术前四项阴性的剖宫产产妇的胎盘组织，无菌操作下，冲洗胎盘上的血迹及污物，在羊膜与绒毛膜之间钝性分离；在无菌条件下从胎盘中分离羊膜，用含P/S溶液的无菌PBS冲洗，浸泡在1％Triton X-100中，将离心管置于37℃、120rpm中振荡消化24h，以去除羊膜组织的海绵层。然后用0.25％胰蛋白酶+0.02％EDTA在37℃处理羊膜4h，完全去除上皮单层和成纤维细胞层，消化完成后，重复用PBS清洗羊膜，然后将切片重新剪成约1*1cm2大小的片状。干热灭菌，置于50ml离心管中备用，保存在-80℃冰箱。
4、搭载子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官的脱细胞羊膜支架复合体的制备
1)将1*1cm2大小的脱细胞羊膜支架置于培养皿中于紫外线照射0.5小时消毒。
2)将消毒后的脱细胞羊膜支架置入24孔板中。
3)将培养的类器官进行传代消化为单细胞，计数细胞数目，与间充质干细胞按1：1混合，离心后得到混合细胞沉淀。
4)根据细胞量估计铺24孔板的个数，每孔细胞加入40μl正常子宫内膜上皮类器官培养基(如表2)。
5)将混合的细胞悬液加入24孔板内的脱细胞羊膜支架上。
人子宫内膜来源间充质干细胞与上皮类器官的共培养图如图1所示，将子宫内膜来源间充质干细胞与上皮类器官培养后，通过流式分析说明子宫内膜间充质干细胞能够提供类器官增殖的活性以及干性(SSEA代表干性基因)。
实施例2复合体系用于治疗大鼠子宫内膜损伤
1、大鼠子宫内膜机械性损伤模型
1)使用6-8周龄的已性成熟的雌性SD大鼠，饲养1周后进行实验；腹腔注射2％戊巴比妥钠，50mg/kg；以仰卧位固定在手台，腹部切口部位剃毛，用75％乙醇消毒皮肤；
2)暴露双侧宫角：用无菌手术刀片在大鼠双侧髋关节连线中点上方做1cm纵切口，用眼科剪逐层分离腹部各层，将大网膜轻柔拨开，直至暴露大鼠“Y”形子宫的两侧子宫角，将其余组织还纳至腹腔内，将双侧宫角牵拉至切口外；
3)制作刮宫器：取50mL无菌注射器的针头，剪掉最尖端部分，将断端弯折成小勾，用剪刀修剪成锯齿状；
4)刮宫：在右侧宫角的近阴道端5mm处用眼科剪做3mm纵切口，用眼科镊拎起宫角两端使其保持一定张力，将刮宫器伸入宫腔，损伤范围为切口上方3cm以内的宫角。宫腔的前、左、后、右壁各刮20次，操作时手感粗糙、有摩擦感为宜，代表刮宫器有效损伤了子宫内膜。若感觉摩擦力不足，则清理刮宫器尖端蓄积的组织碎片，并修剪刮宫器尖端使其保持锐利。刮宫结束后若见血液从宫腔内流出、刮宫器上见组织碎片、宫角外观肿胀菲薄，即认为刮宫操作有效；左侧宫角不作任何损伤处理，即假手术组；
5)用6-0可吸收缝线缝合宫角切口，检查无活动性出血，将双侧宫角还纳腹腔，确保腹腔内无手术造成的其他损伤；
6)4-0丝线全层间断缝合腹膜、肌层和腹壁脂肪，4-0丝线间断缝合皮肤，75％酒精消毒皮肤，观察至大鼠苏醒；
7)45天后，处死大鼠，观察两侧宫角外观，并通过组织学方法评估造模效果。
8)按照上述方法刮宫后，轻轻挤压宫角，排出宫腔内积血。根据不同治疗方式将大鼠宫角分为六组，每只大鼠的右侧宫角为治疗组(子宫内膜间充质干细胞组A、上皮类器官组B、间充质干细胞+上皮类器官组C、间充质干细胞+上皮类器官+脱细胞羊膜支架组D)，左侧宫角为对照组(D&C组E或Sham组F)，以形成自身对照。
A.子宫内膜间充质干细胞组(eMSC组)：刮宫损伤后，宫腔注射100μL含2×106个子宫内膜间充质干细胞(eMSCs)细胞的混悬细胞液，用镊子夹闭宫角切口，予以缝合；
B.上皮类器官组(EEO组)：刮宫损伤后，宫腔注射100μL含2×106个单细胞构建的子宫内膜上皮类器官的混悬细胞液，用镊子夹闭宫角切口，予以缝合；
C.间充质干细胞+上皮类器官组(MLEO组)：刮宫损伤后，宫腔注射100μL 1×106个eMSCs及1×106个单细胞构建的子宫内膜上皮类器官混合后的细胞悬液，用镊子夹闭宫角切口，予以缝合；
D.间充质干细胞+上皮类器官+脱细胞羊膜支架组(MLEO-HAAM组)：刮宫损伤后，将搭载100μL1×106个eMSCs及1×106个单细胞构建的子宫内膜上皮类器官混合后的细胞悬液的脱细胞羊膜支架置入损伤部位，用镊子夹闭宫角切口，予以缝合；
E.D&C组(损伤model组)：刮宫损伤后，宫腔注射100μL PBS，用镊子夹闭宫角切口，予以缝合；
F.Sham组(假手术control组)；不做任何损伤处理。
9)手术60天后，处死大鼠，观察两侧宫角外观，并通过组织学方法评估不同治疗方式的内膜修复效果；
10)手术90天后，将雌鼠与同周龄的SD雄鼠合笼，合笼比例为雌鼠：雄鼠＝2：1。在雌鼠阴道口观察到阴道栓代表交配成功，在观察到阴道栓后15-19天处死雌鼠，观察计数两侧宫角的胚胎数。
2、大鼠组织石蜡包埋和HE染色
1)取材固定：大鼠处死后立即解剖，取适量大小的新鲜子宫/肝/肾/肺组织，投入4％多聚甲醛固定液，固定至少48h；
2)固定完成后进行梯度脱水；
3)将脱水后的组织进行包埋机包埋：除宫角组织的横切面为包埋面，其余组织无特殊要求；
4)将包埋后的组织进行切片：以5μm切片厚度连续切片，60℃烘箱烤片；
5)石蜡组织切片脱蜡；
6)将脱蜡后的组织切片进行苏木素染色+分化+返蓝；
7)然后进行伊红染色，冲洗；
8)染色后进行梯度脱水，封片；
9)在显微镜下观察子宫/肝/肾/肺组织是否有形态异常或异型性细胞团；在40倍镜下，利用与显微镜相连的测量软件测量子宫内膜厚度；在100倍镜下统计子宫内膜腺体数量。
3、免疫组织化学法染色(CD31)
1)重复步骤2中的石蜡组织切片脱蜡；
2)将脱蜡后的组织切片放在0.01M柠檬酸盐缓冲液中，用高压锅煮沸5min进行抗原修复，冷却；
3)冷却完毕后使用PBS洗5min，共3次；
4)然后用防水的组化笔在组织切片周围画圈，加入3％H2O2溶液，室温避光15min；
5)用山羊血清封闭组织切片，在湿盒内室温封闭30min，PBS洗5min，共3次；
6)在封闭好的组织切片中滴加一抗，湿盒内4℃孵育过夜；
7)孵育完毕后进行复温：将组织切片放在室温中，复温1h，PBS洗5min，重复3次；
8)然后再组织切片中滴加二抗，室温孵育1h PBS洗5min，共3次；
9)滴加DAB工作液，控制染色时间不超过5min，显微镜下观察，自来水冲洗15min；
10)将组织切片进行苏木素复染+分化+返蓝；
11)然后进行梯度脱水，封片；
12)CD31阳性区域占总视野区域的百分比反映了损伤后子宫内膜组织的血管密度。
4、Masson染色
1)重复步骤2中的石蜡组织切片脱蜡；
2)将脱蜡后的组织切片在Masson A液过夜孵育切片；
3)将Masson B液、Masson C等比例混合，放入组织切片染色1min，冲洗；加入分化液，冲洗；
4)然后使用Masson E液染色1min+Masson F液染色2-30s，漂洗、脱水、封片。
5、免疫荧光染色
1)重复步骤2中的石蜡组织切片脱蜡；
2)将脱蜡后的组织切片放在0.01M柠檬酸盐缓冲液中，用高压锅煮沸5min进行抗原修复，冷却；
3)然后使用PBS洗5min，共3次；
4)将清洗完毕后的组织切片用山羊血清封闭30min；
5)在封闭后的组织切片中滴加一抗，湿盒内4℃孵育过夜，PBS洗5min，共3次；
6)随后滴加二抗，室温孵育1h；
7)然后使用DAPI染胞核：将组织切片先试用PBS洗5min，共3次；之后滴加DAPI染液，在室温下避光10min；
8)将染色完毕后的组织切片使用PBS洗5min，重复3次，加入自发荧光淬灭剂5min，冲洗10min，封片；
9)荧光显微镜下观察。
大鼠宫腔损伤修复及疗效评估示意图如图2A所示，治疗60天后，取各处理组子宫内膜组织进行Masson染色，各处理组子宫内膜组织Masson染色如图2B所示，从图中可以看出与其他处理组相比，多谱系的子宫内膜类器官脱羊膜支架复合体能够更好抑制子宫内膜的纤维化，实现子宫内膜的更好修复。
脱细胞羊膜支架的模式图如图3所示，复合体的HE染色切片图如图3B所示，说明类器官及间充质干细胞从复合体矢状面能够看到其很好地粘附在脱羊膜支架上；脱细胞羊膜支架及复合体的扫描电镜图如图3C所示，说明类器官及间充质干细胞能够呈簇状粘附并且在脱羊膜支架上伸展阔增开；不同处理组妊娠后宫腔内种植胚胎的拍摄照片如图3D所示，通过种植的胚胎个数说明不同处理组对妊娠结局的影响；量化不同处理组妊娠宫腔内胚胎个数的柱状图如图3E所示，说明与其他处理组相比，多谱系子宫内膜类器官脱羊膜支架处理过后的子宫内受损模型大鼠的妊娠结局比其他处理组的胚胎种植个数要多，妊娠结局更好。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种复合体，其特征在于，包括：羊膜支架、细胞和类器官，所述细胞和类器官设置于所述羊膜支架的上表面。
2.根据权利要求1所述的复合体，其特征在于，所述羊膜支架为脱细胞羊膜支架；
任选地，所述细胞选自间充质干细胞、骨髓基质细胞、脐带血干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞的至少之一；
优选地，所述细胞选自间充质干细胞；
任选地，所述类器官选自上皮类器官、内皮类器官、神经胶质类器官或卫星类器官的至少之一；
优选地，所述类器官选自上皮类器官；
任选地，所述上皮类器官是通过从子宫内膜原代组织中提取获得的。
3.根据权利要求1所述的复合体，其特征在于，所述细胞与类器官的细胞数量比为1:1。
4.根据权利要求1所述的复合体，其特征在于，所述细胞和类器官在所述羊膜支架的上表面的密度为1×105～1×106。
5.一种制备权利要求1～4任一项所述复合体的方法，其特征在于，包括：将细胞和类器官接种在羊膜支架上，以便获得所述复合体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，将所述细胞和类器官接种在羊膜支架上前进一步包括：将羊膜支架进行紫外照射处理；
任选的，所述紫外照射处理的时间为20～40min；
任选地，所述细胞和所述类器官的细胞数量比为1：1。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羊膜支架为脱细胞羊膜支架；
任选地，所述细胞选自间充质干细胞、骨髓基质细胞、脐带血干细胞、脂肪干细胞或胚胎干细胞的至少之一；
优选地，所述细胞选自间充质干细胞；
任选地，所述类器官选自上皮类器官、内皮类器官、神经胶质类器官或卫星类器官的至少之一；
优选地，所述类器官选自上皮类器官；
任选地，所述上皮类器官是通过如下方法获得的：将子宫内膜原代组织进行消化处理和过滤处理，得到所述上皮类器官。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，进一步包括：将接种有所述细胞和类器官的羊膜支架进行培养处理；
任选地，所述培养处理是在37℃，5％CO2的条件下进行的。
9.一种复合体，其特征在于，由权利要求5～7任一项所述方法制备得到。
10.权利要求1或7所述复合体在制备药物中的用途，所述药物用于修复子宫内膜损伤、提高妊娠成功率或改善妊娠结局质量。
11.权利要求1或7所述复合体在提高妊娠成功率或改善妊娠结局质量中的用途。
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| CN202310787860.3A CN117551604A (zh) | 2023-06-29 | 2023-06-29 | 搭载子宫内膜间充质干细胞及上皮类器官的脱细胞羊膜支架复合体修复子宫内膜损伤 |
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