WO2011023843A2 - Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa - Google Patents

Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina y agarosa Download PDF

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José Ignacio MUÑOZ ÁVILA
Miguel GONZÁLEZ ANDRADES
Antonio MUÑOZ CAMPOS
Ingrid Johanna GARZÓN BELLO
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Definitions

  • the present invention falls within the field of biomedicine and, more specifically, of tissue engineering. Specifically, it refers to an in vitro method of preparing an artificial tissue, the artificial tissue obtainable by said method and the use of this artificial tissue to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a damaged tissue or organ.
  • Tissue engineering constitutes a set of techniques and disciplines that allow to design and generate in the laboratory artificial tissues from stem cells from tissue samples obtained from biopsies and, therefore, represents an enormous advance in organ transplantation and in regenerative medicine.
  • Tissue engineering is one of the areas of biotechnology that has been most developed in recent years, due to its potential utility for the in vitro manufacture of tissues and organs for implantation in patients in need of these tissues.
  • the artificial tissues described to date have numerous problems and complications; some of which are set forth below, using as an example, artificial tissues of skin, cornea, bladder and urethra.
  • the urinary bladder is the organ responsible for the reception and storage of urine. Located on the pelvic floor, the urinary bladder is characterized by its capacity and its distensibility, which allows it to store and retain urine.
  • the continence is the result of the contraction of the urinary sphincter, which closes the urethra and the bladder neck avoiding the leakage of urine, as well as the relaxation and expansion of the bladder to store the urine that accumulates in it.
  • Numerous congenital or acquired pathologies can affect the integrity of the bladder, altering its continental function. On the one hand, bladder malformations are usually associated with serious defects of The bladder wall that requires urgent surgical repair.
  • bladder enlargements are currently performed using bowel (in te roc i sto pla st ia), est m ag o (ga stroc i sto pla st ia) ou rote l io (ureterocistoplasty), complications being very frequent associated with these techniques.
  • the urethra fulfills a reproductive function in man, to allow the passage of seminal content from the seminal vesicles during ejaculation.
  • congenital conditions mainly hypospadias and epispadias
  • acquired to be replaced to a greater or lesser extent, in order to restore their normal function
  • collagen is a product that tends to shrinkage and loss of volume when used in tissue engineering, its consistency and, therefore, its surgical manipulability being scarce.
  • the use of autologous skin has not yet sufficiently demonstrated its ability to adapt to the conditions of the urethra, it being very difficult to recelularize fragments of decellularized dermis.
  • the cornea is a transparent and lacking vessel structure, through which the light penetrates the eye, constituting the main barrier of the eyeball with the outside environment. For that reason, the integrity and proper functioning of it are essential for proper visual function.
  • the congenital or acquired pathology of the cornea constitutes one of the most frequent problems in ophthalmology, being numerous the causes that cause a severe alteration of physiology and corneal structure. In these cases, it is usually necessary to resort to aggressive treatments and not without complications, such as amniotic membrane implants, different types of keratoprosthesis and even heterologous corneal transplantation (keratoplasty).
  • corneal transplantation is a technique highly dependent on the availability of corneas from dead donors, which makes a large number of people remain on the waiting list for transplantation for very long periods of time.
  • transplantation of organs from the donor is subject to the possibility of immunological rejection when these organs are implanted, forcing the patient to undergo immunosuppressive therapy throughout his life.
  • transplantation of any type of organ or tissue, including the cornea is a technique subject to the possibility of transmission of all types of infectious diseases from the donor to the recipient, including HIV, hepatitis, herpes, bacterial and fungal diseases, etc. All these problems and complications derived from the corneal implant, make it necessary to find therapeutic alternatives to heterologous transplantation.
  • corneal substitute corneal construct or artificial cornea
  • the laboratory manufacturing of a corneal substitute is one of the areas that is experiencing the greatest boom within tissue engineering, being numerous laboratories that are currently trying without much success to get a quality corneal substitute that can be used in the human clinic or for the evaluation of pharmacological and chemical products (Griffith et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999; 286 (5447): 2169-72; Orwin et al. Tissue Eng. 2000 ; 6 (4): 307-19; Reichl et al. Lnt J Pharm. 2003; 250: 191-201). In this sense, artificial corneas of animal and human origin have been developed.
  • Type I collagen corneas have a tendency to volume loss and retraction thereof, with the added disadvantage of the animal origin of the collagen used.
  • Fibroin and chitosan are products generated from invertebrate animals, which generates significant problems in relation to biocompatibility.
  • the developed fibrin and agarose corneas have the advantage that they contain fibrin from the blood of the same patient, while the agarose constitutes an inert product from the immunological point of view.
  • the skin is the most extensive organ of the human body, and plays a fundamental role in maintaining the internal balance, forming the main protective barrier of the organism against any type of external aggression.
  • There are numerous pathologies that affect the skin highlighting its frequency wounds, pressure ulcers and burns.
  • Current treatments based on the use of skin flaps or grafts or even a donor skin implant, are associated with numerous problems. The need to solve these problems necessitates the search for alternatives based on the generation of human artificial skin products generated by tissue engineering (Horch et al. Burns. 2005 Aug; 31 (5): 597-602).
  • tissue engineering Hach et al. Burns. 2005 Aug; 31 (5): 597-602
  • synthetic dermal coverings consist of non-absorbable biomaterials and free of living cells that can be used as temporary covers or as inducing agents for guided tissue repair. These artificial and inert tissues have very little biological activity, so they cannot be used in deep or extensive lesions.
  • biological coverage consists in the use of artificial human skin in which there are living cells and extracellular matrices that try to reproduce the structure of normal human skin. So far, the artificial human skin that offers the best results is the artificial skin generated by tissue engineering from stem cells of the skin using fibrin from human plasma as a biomaterial (Meana et al. Burns 1998; 24: 621-630 ; Del Rio et al. Hum Gene Ther.
  • the invention relates to an in vitro method of preparing an artificial tissue comprising:
  • step (a) adding a composition comprising fibrinogen to a sample of isolated cells, b) add an antifibhnolytic agent to the product resulting from step (a),
  • step (b) add at least one coagulation factor, a source of calcium, thrombin, or any combination of the above to the product resulting from step (b),
  • step (c) adding a composition of a polysaccharide to the product resulting from step (c),
  • the invention relates to an artificial tissue obtainable by the method of the invention.
  • the invention relates to the use of the artificial tissue of the invention in medicine.
  • the invention relates to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention.
  • Figure 1 Shows a scheme of the procedure used for the nanostructuring of artificial tissue.
  • Figure 2. Shows the evaluation of the artificial human skin product.
  • Figure 3. Shows the evaluation of the artificial human skin product with Wharton's jelly cells.
  • C Immunohistochemical analysis of the following proteins: pancytokeratin (PANC), keratin 1 (KRT1), keratin 10 (KRT10), implicacrine (INVOL) and phylagrin (FI LAG).
  • FIG. 4 Shows the evaluation of the corneal products.
  • B Rheological quality control.
  • Figure 5 Shows the evaluation of the artificial human urethra product.
  • Figure 6. Shows the evaluation of the artificial urinary bladder product.
  • Figure 7. Shows the evaluation of artificial human oral mucosa products.
  • Figure 9 It shows the viscous module G "of the samples subjected to nanostructuring and of the nanostructured samples (data in Paséales).
  • Figure 10 It shows the elastic modulus G 'of the nanostructured tissues and of the non-nanostructured native biomatehales.
  • Figure 11 Shows the transparency of the tissues subjected to 0.1% fibrin-agarose nanostructuring, and the 0.1% non-nanostructured fibrin-agarose biomaterials.
  • the data is given as a percentage of transmittance of the spectrum of visible light (approximately, from 400 to 700 nm).
  • Tissue engineering is one of the areas of biotechnology that has been most developed in recent years, due to its usefulness for the in vitro manufacture of tissues and organs for implantation in patients in need of these tissues
  • the present invention provides an in vitro method of preparing an artificial tissue, the artificial tissue obtainable by said method and the use of this artificial tissue to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a damaged tissue or organ.
  • a first aspect of the invention relates to an in vitro method of preparing an artificial tissue (hereinafter, method of the invention) comprising:
  • step (b) add an antifibrinolytic agent to the product resulting from step (a),
  • step (b) add at least one coagulation factor, a source of calcium, thrombin, or any combination of the above to the product resulting from step (b),
  • step (c) adding a composition of a polysaccharide to the product resulting from step (c),
  • step (e) culturing isolated cells in or on the product resulting from step (d), and f) induce the nanostructuring of the product resulting from step (e).
  • a composition comprising fibrinogen is added to cells isolated, preferably, from a mammal.
  • Said cells can be obtained by different procedures described in the state of the art, which may depend on the particular cell type in question. Some of these procedures are, for example, but not limited to, biopsy, mechanical processing, enzymatic treatment (for example, but not limited to, with trypsin or collagenase type I), centrifugation, erythrocyte lysis, filtration, culture in media or media that favor the selective proliferation of said cell type or immunocytometry. Some of these procedures are described in detail in the Examples herein.
  • the cells of step (a) can be differentiated cells, such as, but not limited to, fibroblasts, keratocytes or smooth muscle cells, or undifferentiated cells with the ability to differentiate into said cells, such as adult stem cells.
  • the cells of step (a) are fibroblasts or undifferentiated cells with the ability to differentiate into fibroblasts.
  • the fibroblasts can be obtained from any tissue or organ, however, preferably, the fibroblasts in step (a) are derived from the tissue or organ in which the artificial tissue is to be used as a substitute.
  • the fibroblasts when used to prepare a skin substitute fabric or an artificial skin, the fibroblasts preferably come from skin (dermal fibroblasts); when used to prepare a bladder substitute tissue or an artificial bladder, the fibroblasts preferably come from bladder; when used to prepare a urethral replacement tissue or an artificial urethra, the fibroblasts preferably come from the urethra; or when used to prepare an oral mucosa substitute tissue or an artificial oral mucosa, fibroblasts preferably come from oral mucosa.
  • fibroblasts can be obtained from any other tissue or organ, such as, for example, Ia oral mucosa, the abdominal wall or any connective tissue.
  • fibroblasts obtained from oral mucosa can be used to prepare a skin substitute tissue or artificial skin, a bladder or artificial bladder replacement tissue, a urethra or artificial urethra replacement tissue, or a tissue replacement tissue. cornea or an artificial cornea.
  • the cells of step (a) are keratocytes or undifferentiated cells with the ability to differentiate into keratocytes.
  • the method of the invention is used to prepare a corneal replacement tissue or an artificial cornea, preferably, corneal stromal keratocytes are used.
  • the components of the artificial tissue are of autologous origin allows that the transplantation of said tissue can be performed without the need for immunosuppression of the transplanted subject.
  • the components of the artificial tissue can also be of allogeneic origin, that is, they can come from an individual other than the one to which the artificial tissue is to be transplanted. Even the species from which said components come can be different; in which case it is said that its origin is xenogeneic. This opens the possibility that the artificial tissue is prepared beforehand when it is urgently needed, although in this case it would be advisable to proceed with the immunosuppression of the subject to which the artificial tissue is transplanted.
  • the cells of step (a) of the invention are of autologous origin.
  • the cells of step (a) can also be of allogeneic or xenogenic origin.
  • Fibrinogen is a high molecular weight protein that is present in blood plasma.
  • Thrombin is a proteolytic enzyme that causes the breakdown of the fibrinogen molecule in low molecular weight polypeptides and fibrin monomers.
  • Said monomers polymerize in dimers and subsequently join together by covalent bonds, by the action of factor XIII, previously activated by thrombin, and in the presence of calcium ions.
  • the composition comprising fibrinogen of step (a) can be, for example, but not limited to, blood plasma.
  • the composition of step (a) can also be prepared from a plasma derivative, such as, for example, but without limiting a cryoprecipitate or a fibrinogen concentrate.
  • the composition of step (a) may contain other coagulation factors.
  • the concentration of fibrinogen in the product resulting from step (c) is between 0.5 and 10 g / L, optionally between 1 and 10 g / L. In a more preferred embodiment, the concentration in the product resulting from step (d) is between 1 and 4 g / L, optionally between 2 and 4 g / L. However, a lower or higher concentration could also be used.
  • the fibrinogen of the composition of step (a) or the composition comprising fibrinogen of step (a) is of autologous origin.
  • the fibrinogen of the composition of step (a) or the composition comprising fibrinogen of step (a) can also be of allogeneic or xenogenic origin.
  • the fibrinogen-containing composition of step (a) is blood plasma.
  • the polymerization of fibrinogen can be induced by the addition in step (c) of a calcium source.
  • the calcium source of step (c) is a calcium salt, for example, but not limited to, calcium chloride, calcium gluconate or a combination of both.
  • the concentration of the calcium salt should be sufficient to induce the polymerization of the fibrinogen.
  • the calcium salt is calcium chloride.
  • the concentration of calcium chloride in the product resulting from step (e) is between 0.25 and 3 g / L, optionally between 0.5 and 4 g / L. However, a lower or higher concentration could also be used.
  • coagulation factor refers to a component, generally, a protein, present in the blood plasma and which is involved in the chain reaction that makes coagulation possible.
  • I fibrinogen
  • I I prothrombin
  • I I I Tisu la r or thromboplastin factor
  • IV calcium
  • V proacelerin
  • Vl inactive or cymogen factor
  • VII proconvertin
  • VIII antihemophilic factor A or von Willebrand factor
  • IX antihemophilic factor B or Christmas factor
  • X Stuart-Prower factor
  • Xl antihemophilic factor C
  • XII Hageman Factor
  • XIII Fibrin stabilizing factor
  • XIV Fitzgerald
  • XV Fletcher
  • XVI platelets
  • XVI I Somocu rcio.
  • the fibrin polymer can be degraded by the process called fibrinolysis.
  • fibrinolysis the plasminogen is converted into the active enzyme plasmin, by the tissue activator of the plasminogen;
  • the plasmin binds to
  • an antifibrinolytic agent is added, for example, but not limited to, aminocaproic epsilon acid, tranexamic acid or aprotinin.
  • Tranexamic acid is a synthetic product derived from the amino acid lysine with great affinity for the lysine binding sites of the plasminogen; It blocks these sites and prevents the binding of the activated plasminogen to the fibrin surface, exerting an antifibrinolytic effect.
  • Tranexamic acid has the advantage, compared to other antifibrinolytic agents of animal origin, that it does not transmit diseases. Therefore, in a preferred embodiment, the antifibrinolytic agent is tranexamic acid. In an even more preferred embodiment, the concentration of tranexamic acid in the product resulting from step (e) is between 0.5 and 2 g / L, preferably between 1 and 2 g / L. However, a lower or higher concentration could also be used.
  • step (d) of the method of the invention a polysaccharide is added.
  • said polysaccharide is used to provide resistance and consistency to the tissue, and it is convenient that it be soluble therein.
  • Examples of polysaccharides that can be used in step (d) of the method of the present invention are but not limited to agar-agar, agarose, alginate, chitosan or carrageenan, or any combination of the foregoing.
  • Agarose is a polysaccharide formed by alpha and beta galactose that is extracted from algae of genera such as Gellidium or Graduar ⁇ a.
  • the agarose compared to other polysaccharides that can be used in step (d) of the present invention, has the advantage that it forms an inert matrix from the immunological point of view. Therefore, in a preferred embodiment, the polysaccharide of step (d) of the method of the invention is agarose.
  • agarose There are different types of agarose that vary in their physical and chemical properties such as, for example, the temperature of the ification, the strength of the gel and / or I to pores.
  • the agarose step (d) of the method of the invention is an agarose with low melting point, ie, one agarose which solidify repolimerice and at a temperature, preferably less than 65 0 C , and more preferably, less than 4O 0 C; in this way it can be used to prepare the tissue at very low temperatures, minimizing the probability of cell death.
  • the agarose used in step (d) of the method of the invention is of type VII.
  • the agarose, preferably, type VII agarose, in the product resulting from step (e) is advantageously between 0.1 and 6 g / L, optionally between 0.2 and 6 g / L, preferably, between 0.15 and 3 g / L, optionally between 0.3 and 3 g / L and more preferably, between 0.25 and 2 g / L, optionally between 0.5 and 2 g / L.
  • a lower or higher concentration could also be used.
  • the method of the invention comprises an additional step between step (b) and step (c) (step (b2)) in which a protein is added.
  • a protein is added.
  • proteins that can be used in step (b2) of the method of the present invention are, but not limited to, fibronectin, laminin, type VII collagen or entactin, or any combination of the foregoing. These proteins are part of the extracellular matrix of the connective tissue naturally in the tissues, so that the cells embedded in an artificial tissue obtained by the method of the invention, find a micro-environment more similar to the physiological one, improving adhesion, The differentiation and / or the survival of said cells.
  • the protein added in step (b2) is fibronectin.
  • Fibronectin is a glycoprotein present in the extracellular matrix (M EC) of most of the anal cell tissues, playing an important role in the adhesion of the cells to the matrix.
  • the protein added between step (b) and step (c) of the method of the invention is fibronectin. The purpose of this addition is to favor the adhesion of the cells of step (e) to the product resulting from step (d).
  • the addition of fibronectin minimizes the shedding of the corneal epithelial cells added in step (e) which is an important advantage with about other methods described in the state of the art.
  • the concentration of fibronectin in the product resulting from step (d) is between 0.25 and 1 g / L, optionally between 0.5 and 1 g / L.
  • the method of the invention comprises an additional step (step d2) between steps (d) and (e) comprising the addition of a composition comprising a protein to the product resulting from step (d).
  • the addition of a protein between step (d) and step (e) results in tissues that have a higher fibrillar density at the stroma level, better viscoelastic behavior and increasing threshold effort.
  • the protein added in step (d2) is collagen.
  • the addition of said proteins in step (d2) of the method of the invention improves the physical properties (rheological, mechanical or biomechanical) of the artificial tissue obtained. In the examples herein, it is shown that in artificial tissues comprising fibrin, agarose and collagen, using increasing concentrations of collagen improves viscoelastic behavior, which is evidenced by an increase in the threshold effort dependent on the concentration of collagen.
  • the main rheological properties of a solid or semi-solid material are viscosity and elasticity.
  • the viscosity is the resistance offered by a fluid to the tangential deformation, and would be equivalent to the consistency or stiffness.
  • Elasticity is the mechanical property of certain materials to suffer reversible deformations when they are subject to the action of external forces, and to recover the original form when these external forces cease.
  • the analysis of these parameters is performed by rheometry, a physical technique that uses instruments called rheometers.
  • the threshold stress is the energy necessary to cause irreversible deformation in a solid or a fluid. Normally, all materials have an elastic region, in which the applied stress causes a completely reversible deformation when the stress ceases. If this effort exceeds a limit (elastic modulus), the deformation becomes irreversible, entering a plastic region. Finally, if the stress exceeds the plastic module, the material breaks (fracture point).
  • Collagen is an easily available protein in nature and that is biologically characterized by its low immunity and high tissue activity. Collagen forms collagen fibers, which are flexible, but offer great tensile strength. In the present invention it is demonstrated that artificial fibrin, agarose and collagen tissues have a higher fibrillar density at the stroma level, a better visco-elastic behavior and an increasing threshold effort as the collagen concentration is increased, and higher than artificial tissues. of collagen Therefore, in a preferred embodiment, the protein added in step (e) is collagen.
  • the collagen added in step (d2) is selected from the list comprising: type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, type V collagen, type Vl collagen, type VII collagen, Type VIII collagen, type IX collagen, type X collagen, type Xl collagen, type XII collagen, type XIII collagen or any combination of the above.
  • the collagen added in step (e) is selected from the list comprising: type I collagen, type II collagen, type III collagen, type IV collagen, type V collagen, type IX collagen or any combination of the above.
  • the selection of a particular type of collagen in step (e) of the method of the invention depends on the artificial tissue that is desired to be prepared and is performed according to the characteristics of each collagen that are known in the state of the art.
  • the main function of type I collagen is that of stretching resistance, and is abundantly found in the dermis, bone, tendon and cornea.
  • the addition of Type I collagen in step (e) gives excellent properties to artificial tissue when it is desired to prepare, for example, but without limiting a corneal tissue or an artificial cornea. Therefore, in a preferred embodiment the collagen is type I collagen.
  • the collagen, preferably, type I collagen, in the product resulting from step (d) is advantageously between 0, 5 and 5 g / L, preferably, between 1, 8 and 3.7 g / L, and more preferably, between 2.5 and 3 g / L.
  • a lower or higher concentration could also be used.
  • the collagen used is an atelocollagen, that is, a collagen from which the terminal regions of non-helical structure called telopeptides have been removed. These telopeptides can make the collagen insoluble and are carriers of the main antigenic determinants of collagen.
  • Atelocollagen is obtained, for example, by protease treatment with pepsin.
  • the concentration of polysaccharide used in stage (d) and, in the case that a step (d2) is applied, the concentration of collagen that is used in stage (d2), the artificial tissue resulting from stage (e) may comprise varying concentrations of the two / three components.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose preferably, type VII agarose
  • the concentration of collagen is between 0.5 and 5 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.15 and 3 g / L. If it has including a step (d2), the concentration of collagen, preferably, type I collagen, is between 0.5 and 5 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose preferably, type VII agarose
  • the concentration of collagen is between 0.5 and 5 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose preferably, type VII agarose
  • the concentration of collagen is between 1, 8 and 3.7 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.15 and 3 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 1, 8 and 3.7 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.25 and 2 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 1, 8 and 3.7 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.1 and 6 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 2.5 and 3 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.15 and 3 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 2.5 and 3 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 0.5 and 10 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.25 and 2 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 2.5 and 3 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.1 and 6 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 0.5 and 5 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.15 and 3 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 0.5 and 5 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.25 and 2 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 0.5 and 5 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L, the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose, is between 0.1 and 6 g / L. If a step (d2) has been included, the concentration of collagen, preferably type I collagen, is between 1, 8 and 3.7 g / L. In another preferred embodiment, in the product resulting from step (e), the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L, the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose, is between 0.15 and 3 g / L. If a step (d2) has been included, the concentration of collagen, preferably type I collagen, is between 1, 8 and 3.7 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.25 and 2 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 1, 8 and 3.7 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.1 and 6 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 2.5 and 3 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.15 and 3 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 2.5 and 3 g / L.
  • the fibrinogen concentration is between 1 and 4 g / L
  • the concentration of the agarose, preferably, type VII agarose is between 0.25 and 2 g / L.
  • the concentration of collagen, preferably type I collagen is between 2.5 and 3 g / L.
  • step (a) By adding to the cells of step (a) of the different components described in Once steps (a) - (d) of the method of the invention have been carried out, and after allowing the product resulting from step (e) to stand on a support , the formation of a matrix comprising fibrin, the polysaccharide and, in the case that the stage (d2), the protein added in said step, has been included in which said cells are embedded and on which and / or within which they can grow.
  • the cells of step (a) grow inside said matrix.
  • step (d) the product resulting from step (d) is allowed to stand on a support so that the formation of the matrix comprising the fibrin, the polysaccharide and, depending on whether a step (b2) has been carried out, of the protein added in said step, and that the cells of step (a) are embedded.
  • Stands that can be used are, for example, but not limited to, tissue culture plates or porous cell culture inserts.
  • said supports will be in sterile conditions.
  • Step (e) of the method of the invention consists in culturing cells isolated, preferably, from a mammal, in or on the product resulting from step (e).
  • Said cells can be obtained by different procedures described in the state of the art and that may depend on the particular cell type in question. Some of these procedures are, for example, but not limited to, biopsy, mechanical processing, enzymatic treatment (for example, but not limited to, with trypsin or collagenase type I), centrifugation, erythrocyte lysis, filtration, culture in media or media that favor the selective proliferation of said cell type or immunocytometry. Some of these procedures are described in detail in the Examples of this invention.
  • the cells of step (e) can be differentiated cells, such as, but not limited to, epithelial cells, or undifferentiated cells with the ability to differentiate into said cells, such as adult stem cells.
  • the differentiated cells of step (e) are epithelial cells, such as, but not limited to, keratinocytes, cells of the Oral mucosa epithelium, bladder epithelium cells, urethra epithelial cells, corneal epithelial cells or vascular endothelial cells.
  • epithelial cells such as, but not limited to, keratinocytes, cells of the Oral mucosa epithelium, bladder epithelium cells, urethra epithelial cells, corneal epithelial cells or vascular endothelial cells.
  • the epithelial cells of step (e) come from the tissue or organ in which the artificial tissue is to be used as a substitute.
  • the epithelial cells preferably come from the epidermis of the skin, that is, they are keratinocytes; when it is used to prepare a bladder substitute tissue or an artificial bladder, the epithelial cells preferably come from the epithelium of the bladder or urothelium; when it is used to prepare a urethral substitute tissue or an artificial urethra, the epithelial cells preferably come from the epithelium of the urethra; when used to prepare a corneal replacement tissue or an artificial cornea preferably, the epithelial cells are corneal epithelial cells; when it is used to prepare an oral mucosa substitute tissue, preferably, the epithelial cells preferably come from the epithelium of the oral mucosa.
  • the epithelial cells of step (e) can also be obtained from a tissue or organ other than the tissue or organ in which artificial tissue is to be used as a substitute.
  • a tissue or organ other than the tissue or organ in which artificial tissue is to be used as a substitute.
  • the epithelial cells of step (e) can be epithelial cells of the oral mucosa.
  • the epithelial cells can be keratinocytes.
  • stem cell that which has a high capacity to divide and differentiate morphologically and functionally into different types of more specialized cells.
  • an undifferentiated cell modifies its phenotype and morphology to become a differentiated cell, with a specialized structure and function.
  • Stem cells can be classified according to their potential, that is, their ability to differentiate into different cell types in: (a) totipotentials: capable of differentiating both embryonic tissue and extraembryonic tissue; (b) pluripotential with the ability to differentiate to any of the tissues from the three embryonic layers (endoderm, mesoderm and ectoderm); (c) multipotential: capable of differentiating different cell types derived from the same embryonic layer (endoderm, mesoderm or ectoderm); and (d) unipotential: ability to form a single cell lineage.
  • the stem cells have been divided into: (a) embryonic: of the internal cell mass of the blastocyst in the stage of the preimplantatoho embryo or of the gonadal crest, and which are totipotential or pluripotential; and (b) adults: in the adult, the fetus and the umbilical cord, and which are multipotential or unipotential.
  • embryonic of the internal cell mass of the blastocyst in the stage of the preimplantatoho embryo or of the gonadal crest, and which are totipotential or pluripotential
  • adults in the adult, the fetus and the umbilical cord, and which are multipotential or unipotential.
  • mesenchymal stem cells which are distributed in the connective tissue of various organs, such as, but not limited to, bone marrow, peripheral blood, adipose tissue or cord umbilical
  • the adult stem cells are adult stem cells of the bone marrow, adipose tissue or um
  • the umbilical cord is an interesting source of adult stem cells, because, unlike adult stem cells obtained from other sources; (a) its method of obtaining is not invasive or painful; and (b) its proliferative capacity and its differentiation potential does not diminish as a consequence of the aging process.
  • the so-called Wharton jelly stem cells of the umbilical cord stand out, due to: (a) their great capacity to proliferation and its rapid expansion in cultivation; and (b) the low expression of the Major Histocompatibility Complex of class I and absence of expression of the Major Histocompatibility Complex of class II, which makes them good candidates for allogeneic cell therapy.
  • the cells of step (e) are Wharton's jelly stem cells of the umbilical cord. These cells express on their surface various characteristic markers of mesenchymal cells, such as SH2, SH3, CD10, CD13, CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, CD105 or CD166, and are negative for markers of the hematopoietic lineage, such as for example, CD31, CD34, CD38, CD40 or CD45.
  • the stem cells of the Wharton's jelly of the umbilical cord can be differentiated, for example, from chondroblasts, osteoblasts, adipocytes, neural precursors, cardiomyocytes, skeletal muscle cells, endothelial cells or hepatocytes.
  • Adult stem cells can be characterized by the identification of surface and / or intracellular proteins, genes, and / or other markers indicative of their undifferentiated state, by different procedures that are known in the state of the art, for example, but without limitation, immunocytometry, immunocytochemical analysis, analysis by northern blot, R T-PCR, analysis of gene expression in microarrays, proteomic studies or differential display analysis.
  • Stem cells can be induced to differentiate in vitro to give rise to cells that express at least one or more characteristics of differentiated cells.
  • differentiated cells to which stem cells can be differentiated are fibroblast, keratinocyte, urothelial cell, epithelial cell of the urethra, corneal epithelium cell, epithelial cell of oral mucosa, chondroblast , osteoblast, adipocyte or neuron.
  • the differentiated cell from the multipotent stem cell of the invention expresses one or more characteristics of a differentiated cell selected from the list comprising: fibroblast, keratinocyte, urothelial cell, cell of the epithelium of the urethra, cell of the corneal epithelium, cell of the epithelium of the oral mucosa, chondroblast, osteoblast, adipocyte or neuron.
  • the differentiated cells can be characterized by the identification of surface and / or intracellular proteins, genes, and / or other markers indicative of their differentiated state, by different procedures that are known in the state of the art, for example, but without limited, immunocytometry, immunocytochemical analysis, analysis by northern blot, R T-PCR, analysis of gene expression in microarrays, proteomic studies or differential display analysis.
  • the cells of step (e) of the invention are of autologous origin.
  • the cells of step (e) can also be of allogeneic or xenogenic origin.
  • step (e) On the product resulting from step (d) and / or inside the cells of step (e) are able to proliferate.
  • the cells of step (e) proliferate on the surface of the product resulting from step (d).
  • the cells in step (e) are allowed to proliferate until they reach an adequate number until they typically reach at least 70% confluence, advantageously at least 80% confluence, preferably at least 90% of confluence, more preferably, at least 95% confluence and, even more preferably, at least 100% confluence.
  • the culture medium in which they are found can be partially or totally replaced by new means to replace depleted ingredients and eliminate potentially harmful metabolites and catabolites.
  • an additional step may be necessary.
  • the keratinocytes or the cells of the corneal epithelium it may be necessary to expose the epithelial surface to the air to promote the correct stratification and maturation of the epithelium maintaining the matrix comprising the cells of step (a) submerged in culture medium (liquid air technique).
  • the method of the invention in addition to the steps (a) - (f) described above, comprises an additional step in which the product resulting from step (e) is exposed to air.
  • the method of the invention includes this step when it is used to obtain an artificial tissue that serves to replace a natural tissue whose epithelium is normally exposed to contact with the air, for example, but not limited to, the skin, The cornea, the oral mucosa, the urethra or the vagina.
  • this step is performed when a skin substitute tissue or an artificial skin is prepared, or when a cornea substitute tissue or an artificial cornea is prepared, or when an oral mucosa substitute tissue or an artificial oral mucosa is prepared.
  • nanostructuring refers to a structural modification consisting of the generation of bonds smaller than one size between the fibrin fibers and between them and the agarose molecules. This nanostructuring process allows to obtain artificial tissues that unexpectedly show advantageous properties with respect to unstructured biomaterials.
  • the biomaterials subjected to a nanostructuring process according to the present invention have (i) a significant improvement of the biomechanical properties of the tissue, which allows the manipulation of the nanostructured tissue and represents a substantial and unexpected improvement of the rheological properties of the biomaterial, characterized as greater resistance (see figure 8) and greater elasticity (see figures 9 and 10); (ii) a substantial improvement in the manipulability of the nanostructured tissue, which allowed its surgical manipulation, the suture to the recipient bed and the implant in experimental animals, (iii) a significant improvement in the transparency of the nanostructured tissues (see figure 11), What is not at all predictable since nanostructured tissues are denser and poorer in water content than nanostructured tissues and (iv) a better clinical outcome once implanted in laboratory animals related, on the one hand, to the greater efficacy of the clinical implant due to the adequate biomechanical properties of the biomaterial and, on the other hand, with the fact that the biomaterials subjected to nanostructuring have a higher fiber density per mm 2
  • the induction of the nanostructuring of the step (f) comprises the dehydration and / or the mechanical compression of the product resulting from the step (e).
  • the objective of step (f) is to generate a structural modification between fibrin fibers and agarose molecules of artificial tissue to achieve optimum levels of consistency and elasticity, which are not obtained by other methods described in the state of the art.
  • the final result is an irreversible modification of the fibers that generates very favorable biomechanical qualities for the surgical manipulation and the clinical implant.
  • dehydration refers to a partial and / or total removal of interstitial fluid from the product resulting from step (e).
  • the amount of interstitial fluid removed from the product resulting from step (e) can be at least 50%, at least 60%, at least 70%, at least 80%, at less, 90% or at least 99% of the interstitial fluid originally contained in the product resulting from step (e).
  • Dehydration of the product resulting from step (e) can be achieved by any physical or chemical procedure.
  • the dehydration of the product resulting from step (e) comprises a procedure selected from the list comprising: drainage, evaporation, suction, capillary pressure, osmosis or electro-osmosis.
  • the interstitial liquid can be eliminated by means of the inclination of the product resulting from step (e); The interstitial fluid is then drained due to the effect of gravity and the gradient.
  • the liquid can be removed by suction, for example, by applying a vacuum by means of a mechanical pump to the surface where the product resulting from step (e) is located.
  • the interstitial liquid can be removed by evaporation, for example, by incubating the product resulting from step (e) under conditions that promote evaporation, for example, at a pressure lower than atmospheric pressure and / or at a temperature greater than room temperature.
  • the interstitial liquid can also be removed using an osmotic agent with a tendency to absorb water, such as, but not limited to, a solution of hyperosmolar sodium chloride, separating the product resulting from step (e) of this solution by means of a semipermeable membrane. , a sponge or other drying material.
  • an osmotic agent with a tendency to absorb water such as, but not limited to, a solution of hyperosmolar sodium chloride, separating the product resulting from step (e) of this solution by means of a semipermeable membrane. , a sponge or other drying material.
  • the interstitial liquid can be removed by capillary pressure, for example, by applying an absorbent material to the product resulting from step (e).
  • absorbent material that could be used in step (f) of the invention, but not limited to, are filter paper, 3M paper from the Whatman commercial house, cellulose fiber, or absorbent fabric.
  • the absorbent material will be sterilized.
  • the time required for dehydration will depend on the procedure or procedures used, and can be easily determined by an expert in the field.
  • the suitability of the artificial tissue obtained by means of the application of a certain dehydration procedure during a certain period of time can be verified by various evaluation methods known in the state of the art, such as, but not limited to, those described in the examples of this memory
  • the interstitial fluid can also be removed by means of the mechanical compression of the product resulting from step (e).
  • the mechanical compression of the product resulting from step (e) can also serve to give the product resulting from step (e) a desired defined shape. Compression of the product resulting from step (e) can be carried out by any procedure described in the state of the art.
  • a "static” compression procedure can be used, where the product resulting from step (e) remains stationary, for example, but not limited to, the application of a static load (for example, a dead weight), a hydraulic or a cam .
  • a "dynamic" compression procedure can also be used, where the product resulting from step (e) moves during compression, for example, by applying one or more rollers or by extrusion through a constrictor hole.
  • the mechanical compression of the product resulting from step (e) can be carried out by extrusion, for example, by passing the product resulting from step (e) through an orifice that constricts it, for example, a conical chamber.
  • the conical chamber may have porous walls, so that it would allow the removal of the interstitial fluid from the product resulting from step (e) while it passes through it.
  • Compression of the product resulting from step (e) can be performed by centrifuging the product resulting from step (e).
  • the product resulting from step (e) can be placed on a tube with the porous bottom, so that, in addition to mechanical compression, the elimination of the interstitial liquid from the product resulting from step (e) would occur.
  • Compression of the product resulting from step (e) can be performed by applying a balloon inside it to compress the product resulting from step (e) against a solid surface.
  • the solid surface can, for example, form a tube around the product resulting from the passage (e, allowing the formation of a tubular artificial tissue.
  • the compression of the product resulting from step (e) comprises the application of a weight on the product resulting from step (e), so that a mechanical pressure action is exerted on the tissue. It is evident that the greater the weight, the less time will be required to obtain an artificial fabric with the appropriate characteristics.
  • the weight used for compression can have a flat surface or can be placed on a material that has a flat surface, for example, plastic, ceramic, metal or wood.
  • Figure 1 of this report shows a non-limiting scheme of how the nanostructuring of the product resulting from the step can be carried out.
  • the nanostructuring can be obtained by placing the product resulting from the passage (e) between two sterile filter papers, and placing on it a weight of approximately 250 g (equivalent to approximately 2,000 N / m 2 ) on a surface flat sterile glass for about 10 minutes; a porous material can be arranged between the tissue and the filter paper on which the weight is placed to prevent the product resulting from step (e) from adhering to the filter paper.
  • the material used to prevent adhesion must be porous to allow water to flow from the tissue to the dehydrating agent: said porous material used to prevent adhesion can be, for example, but not limited to, a polycarbonate membrane, nylon, glass , ceramic or perforated metal.
  • the compression of the product resulting from step (e) comprises the application of a pressure on it.
  • the magnitude of the pressure is between 1,000 and 5,000 N / m2, more preferably between 1,500 and 2,500 N / m 2 and even more preferably about 2,000 N / m 2.
  • the application of said pressure can be done manually, automatically or semi-automatically.
  • the time it takes to exert the pressure depends on the magnitude of the pressure applied and can be easily determined by a person skilled in the art. It is evident that the higher the pressure, the less time will be required to obtain an artificial tissue with the appropriate features.
  • the suitability of the artificial tissue obtained by applying a certain magnitude of pressure over a certain period of time can be verified by various evaluation methods known in the state of the art, such as, but not limited to, those described in the examples of this memory
  • one or more procedures can be used, sequentially or simultaneously.
  • the time required for nanostructuring can be less than 12 hours, less than 6 hours, less than 3 hours, less than 1 hour, less than 30 minutes, less than 10 minutes, less than 2 minutes or less than 1 minute.
  • the time required for nanostructuring will depend on the procedure or procedures used, and can be easily determined by an expert in the field.
  • the suitability of the artificial tissue obtained by applying a certain procedure for a certain period of time can be verified by various evaluation methods known in the state of the art such as, for example, but not limited to, those described in the examples herein. .
  • a second aspect of the present invention refers to an artificial tissue obtainable by the method of the invention described above (hereinafter, artificial tissue of the invention).
  • the artificial tissue of the invention is a skin substitute fabric or an artificial skin.
  • it is a bladder replacement tissue or an artificial bladder.
  • the artificial tissue of the invention is a urethral replacement tissue or an artificial urethra.
  • the artificial tissue of the invention is a corneal replacement tissue or an artificial cornea.
  • the artificial tissue of the invention is a substitute tissue of a mucosa or an artificial mucosa.
  • the artificial tissue obtainable by the method of the invention can be cut to the desired size and / or arranged in a conformation suitable for use.
  • the suitability of the artificial tissue of the invention can be evaluated to perform its function, for example, but not limited, by any of the procedures described in the examples of the present description.
  • a third aspect of the invention refers to the use of the artificial tissue of the invention for the evaluation of a pharmacological and / or chemical product.
  • tissue or an organ An infectious, inflammatory, genetic or degenerative disease, physical or chemical damage, or a disruption of blood flow, can result in a loss of cells from a tissue or an organ.
  • This cellular loss would entail an alteration of the normal function of said tissue or organ; and therefore, it would lead to the development of physical illnesses or sequelae that reduce the quality of life of the person. Therefore, it is important to try to regenerate or restore the normal function of said tissues or organs.
  • the damaged tissue or organ may be replaced by a new tissue or organ that has been manufactured in the laboratory by tissue engineering techniques.
  • the objective of tissue engineering is the construction of artificial biological tissues and the use thereof for medical purposes to restore, replace or increase the functional activities of diseased tissues and organs.
  • the therapeutic utility of this type of techniques is practically unlimited with applications in all fields.
  • tissue engineering techniques makes it possible to reduce the waiting lists of tissues and organs, with the consequent decrease in the morbidity and mortality of the disease in the recipient. Logically, it also results in a decrease in morbidity and mortality in organ donors.
  • tissue engineering techniques highlighting: (a) a significant reduction in the number of donor infections to the recipient by infectious agents; and (b) the absence of graft versus host immune rejection, so that the patient does not need to take immunosuppressive treatment, avoiding side effects and problems associated with immunosuppression.
  • a fourth aspect of the invention refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged tissue or organ.
  • the artificial tissue of the invention can be used to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of any diseased or damaged tissue or organ of a living organism.
  • the tissue or organ may be internal, such as, but not limited to, the urethra or bladder, or external, such as, but not limited to, the cornea or the skin.
  • the damaged tissue or organ is selected from the list comprising: skin, bladder, urethra, cornea, mucosa, conjunctiva, abdominal wall, conjunctiva, eardrum, pharynx, larynx, larynx, intestine, peritoneum, ligament, tendon, bone, meninge or vagina.
  • the tissue or organ may be diseased or damaged as a result of a dysfunction, an injury or a disease, for example, but not limited to, an infectious, inflammatory, genetic or degenerative disease; physical damage such as trauma or surgical intervention, chemical damage or interruption of blood flow.
  • a preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a skin.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged skin as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list comprising: a wound, an ulcer, a burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication or a congenital malformation.
  • a preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a bladder.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged bladder as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list comprising: a benign or malignant neoplasia, an infection, a trauma, a congenital malformation (such as, but not limited to, a bladder exstrophy, a sewer exstrophy or a micro bladder), a neurogenic bladder, a urinary incontinence, a bladder dysfunction, an infection or a bladder lithiasis.
  • a preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a urethra.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged urethra as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list comprising: a benign or malignant neoplasia, an infection, a trauma, a congenital malformation (such as, but not limited to, a hysspadias or an epispadias) or a stenosis.
  • a preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a cornea.
  • a more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged cornea as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list comprising: a corneal ulcer, a keratoconus, a keratoglobus, a descematocele, a trauma, a causticization, an imbic limb, an atrophic keratitis, a corneal dystrophy, a primary or secondary keratopathy, an infection, a leucoma, a bullous keratopathy, an endothelial failure corneal or a benign or malignant neoplasm.
  • a preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a mucosa, preferably of an oral mucosa.
  • An even more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged oral mucosa as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list that includes: a wound, an ulcer, a burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication, a congenital malformation, a loss of substance or a periodontal disease.
  • the tissue used to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a mucosa is a tissue that has been subjected to a step (d2) of adding a protein between the step (d ) and step (e).
  • said step is carried out by adding a composition comprising collagen to the material obtained in step (d) as indicated in detail above.
  • a fifth aspect of the present invention refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament.
  • somatic cell therapy means the use of living, autologous, allogeneic or xenogenic somatic cells, whose biological characteristics have been substantially altered as a result of their manipulation, to obtain a therapeutic, diagnostic or preventive effect, by metabolic, pharmacological means or immunological
  • somatic cell therapy drugs are, for example, but not limited to: cells manipulated to modify their immunological, metabolic or other functional properties in qualitative or quantitative aspects; classified cells, selected and manipulated, which are subsequently subjected to a manufacturing process in order to obtain the finished product; cells manipulated and combined with non-cellular components (for example, matrices or biological or inert medical devices) that exert the intended action in principle on the finished product; autologous cell derivatives expressed ex vivo (in vitro) under specific culture conditions; or cells genetically modified or subjected to another type of manipulation to express homologous or non-homologous functional properties previously not expressed.
  • non-cellular components for example, matrices or biological or inert medical devices
  • a fifth aspect of the present invention refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a tissue or an organ.
  • the damaged tissue or organ is selected from the list comprising: skin, bladder, urethra, cornea, mucosa, conjunctiva, abdominal wall, conjunctiva, eardrum, pharynx, larynx, intestine, intestine, peritoneum, ligament, tendon , bone, meninge or vagina.
  • a preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased tissue or a diseased or damaged organ as a result of a infectious, inflammatory, genetic or degenerative disease, physical or chemical damage or a disruption of blood flow.
  • a more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the elaboration of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a skin.
  • An even more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged skin as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list comprising: a wound, an ulcer, a burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication or a congenital malformation.
  • a more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a bladder.
  • An even more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged bladder as a result of a dysfunction, a lesion or a disease selected from the islet comprising: a benign or malignant neoplasm, an infection, a trauma, a congenital malformation (such as, but not limited to, a bladder exstrophy, a exstrophy of cloaca or a micro bladder), a neurogenic bladder, a urinary incontinence, a bladder dysfunction, an infection or a bladder lithiasis.
  • a more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a urethra.
  • An even more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged urethra as a result of a dysfunction, a lesion or disease selected from the list comprising: a benign or malignant neoplasm, an infection, a trauma, a congenital malformation (such as, but not limited to, a hysspadias or an epispadias) or a stenosis.
  • a more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a cornea.
  • An even more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged cornea as a result of a dysfunction, a injury or a disease selected from the list comprising: a corneal ulcer, a keratoconus, a keratoglobus, a descematocele, a trauma, a caustication, a limbic insufficiency, an atrophic keratitis, a corneal dystrophy, a primary or secondary keratopathy, an infection , a leucoma, a bullous keratopathy, a corneal endothelial failure or a benign or malignant neoplasm.
  • a more preferred embodiment of this fifth aspect refers to the use of the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a mucosa, preferably an oral mucosa.
  • An even more preferred embodiment refers to the use of the artificial tissue of the invention for the elaboration of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged oral mucosa as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the list comprising: a wound, an ulcer, a Burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication, a congenital malformation, a loss of substance or a periodontal disease.
  • the tissue that stops the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a mucosa is a tissue that has been subjected to a step (d2) of adding a protein between step (d) and step (e).
  • said step is carried out by adding a composition comprising collagen to the material obtained in step (d) as indicated in detail above.
  • a sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention.
  • a preferred embodiment of this sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention for use in somatic cell therapy.
  • a more preferred embodiment of this sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a tissue or an organ.
  • a preferred embodiment of this sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased tissue or a diseased or damaged organ as a result of a infectious, inflammatory, genetic or degenerative disease, physical or chemical damage or a disruption of blood flow.
  • a more preferred embodiment of this sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a skin.
  • An even more preferred embodiment refers to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged skin as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from The list comprising: a wound, an ulcer, a burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication or a congenital malformation.
  • a more preferred embodiment of this sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a bladder.
  • An even more preferred embodiment refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to partially or totally increase, restore or replace the functional activity of a diseased or damaged bladder as a result of a selected function, injury or disease. of the list comprising: a benign or malignant neoplasm, an infection, a trauma, a congenital malformation (such as, but not limited to, a bladder exstrophy, a sewer exstrophy or a micro bladder), a neurogenic bladder, an incontinence urinary tract, bladder dysfunction, infection or bladder lithiasis.
  • a more preferred embodiment of this sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a urethra.
  • An even more preferred embodiment refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged urethra as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from the islet that comprises: a benign or malignant neoplasm, an infection, a trauma, a congenital malformation (such as, but not limited to, a hysspadias or an epispadias) or a stenosis.
  • a more preferred embodiment of this sixth aspect of the invention refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a cornea.
  • An even more preferred embodiment refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged cornea as a result of a dysfunction, an injury or a disease selected from The list comprising: a corneal ulcer, a keratoconus, a keratoglobus, a descematocele, a trauma, a caustication, a limbic insufficiency, an atrophic keratitis, a corneal dystrophy, a primary or secondary keratopathy, an infection, a leucoma, a keratopathy bullous, a corneal endothelial failure or a benign or malignant neoplasm.
  • a more preferred embodiment of this fifth aspect refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a mucosa, preferably an oral mucosa.
  • An even more preferred embodiment refers to a pharmaceutical composition comprising the artificial fabric of the invention to increase, restore or partially or totally replace the functional activity of a diseased or damaged oral mucosa as a result of a dysfunction, a lesion or a selected disease. from the list comprising: a wound, an ulcer, a burn, a benign or malignant neoplasm, an infection, a bruise, a trauma, a caustication, a congenital malformation, a loss of substance or a periodontal disease.
  • the pharmaceutical composition comprising the artificial tissue of the invention for the preparation of a medicament to increase, restore or replace partially or totally the functional activity of a mucosa or an oral mucosa is a tissue that has been subjected to a step (d2) of adding a protein between step (d) and step (e).
  • said step is carried out by adding a composition comprising collagen to the material obtained in step (d) as indicated in detail above.
  • the pharmaceutical composition comprises the artificial tissue of the invention, and also a pharmaceutically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition comprises the artificial tissue of the invention, and also another active ingredient.
  • the pharmaceutical composition comprises the artificial tissue of the invention and, in addition, together with a pharmaceutically acceptable carrier, another active ingredient.
  • active substance means any component that potentially provides a pharmacological activity or other relevant effect on the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • compositions of the present invention can be used in a treatment method in isolation or in conjunction with other pharmaceutical compounds.
  • EXAMPLE 1 ELABORATION PROTOCOL OF AN ARTIFICIAL HUMAN SKIN PRODUCT. A. - Obtaining samples of human skin.
  • the samples were incubated at 37 0 C in a sterile solution with dispase Il to 2mg / ml in PBS. In this way, it is possible to disintegrate the basement membrane on which the ep itel io a la d erm is, therefore, after that, the epithelium will be mechanically separated on one side and the dermis on the other.
  • the epithelium corresponding to the epidermis is fragmented with scissors until small fragments are obtained and subsequently incubated in a trypsin-EDTA solution.
  • this epithelium is transferred to a bottle with a previously sterilized magnetic stirrer.
  • trypsin containing the individualized keratinocytes is collected in a 50 ml conical tube with the help of a pipette, trying not to drag with it epithelial fragments. Neutralize with equal amount of culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum and centrifuge for 10 minutes at 1000 rpm. The resulting pellet containing a large number of individualized keratinocytes is resuspended in 2-3 ml of keratinocyte culture medium, which preferably favors the growth of epithelial cells over fibroblasts.
  • This medium is composed of 3 parts of DMEM medium rich in glucose and one part of Ham F-12 medium, all supplemented with 10% fetal bovine serum, anti biotic-anti-motic (100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B), 24 ⁇ g / ml adenine and various growth factors: 0.4 ⁇ g / ml hydrocortisone, 5 ⁇ g / ml insulin, 10 ng / ml of epithelial growth factor (EGF), 1.3 ng / ml of triiodothyronine and 8 ng / ml of cholera toxin.
  • fetal bovine serum 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B
  • the samples To perform the digestion of the extracellular matrix of the dermis of the skin and achieve the separation of stromal fibroblasts included in said matrix, the samples must be incubated at 37 0 C in a sterile solution of type I collagenase from Clostridium hystoliticum to 2mg / ml in culture medium
  • DMEM without fetal bovine serum for 6 hours.
  • This solution is able to digest the collagen of the dermis and release the stromal fibroblasts.
  • the digestion solution containing the cells should be centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes.
  • Disintegrated stromals of the dermis and the cell pellet corresponding to the fibroblasts are grown in culture bottles of 15 cm 2 of surface.
  • glucose-enriched DMEM supplemented with antibiotics and antifungals (1 00 U / ml penicill ina G, 1 00 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B) and fetal bovine serum ( SBF) at 10%.
  • antibiotics and antifungals (1 00 U / ml penicill ina G, 1 00 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B
  • SBF fetal bovine serum
  • the trypsin used is inactivated by adding 10 ml of fibroblast culture medium.
  • the presence of abundant serum proteins is capable of inactivating the proteolytic action of trypsin.
  • the keratinocyte culture medium is used.
  • the keratinocyte and fibroblast solutions in which the detached cells are located are centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to obtain a pellet or cell button with the cells of interest, discarding the supernatant with trypsin.
  • the cell pellet is carefully resuspended in 5 ml of culture medium and these cells are grown in culture bottles of 15, 25 or 75 cm 2 surface.
  • keratinocyte cultures expand up to about five times in new culture bottles.
  • cytokeratins pancytokeratin, cytokeratin 1 and cytokeratin 10
  • filagrin implicacrine of normal human skin controls and skin products obtained in the laboratory, allowed us to determine a specific pattern of expression of these proteins for each type of sample, demonstrating that artificial human skin is capable of expressing the same surface proteins as normal human skin.
  • EXAMPLE 2 PREPARATION OF AN ARTIFICIAL HUMAN SKIN PRODUCT USING WHARTON GELATINE MOTHER CELLS.
  • A. - Obtaining samples of skin and human umbilical cord. Full thickness skin samples obtained from donors under local and locoregional anesthesia are used. Once the sample is obtained in a sterile way, with the help of scissors, the subcutaneous fatty tissue will be removed until the dermis layer is exposed. Subsequently, the extracted tissues will be immediately introduced into sterile transport medium consisting of Dulbecco-modified Eagle (DM EM) supplemented with antibiotics (500 U / ml of penicillin G and 500 ⁇ g / ml of streptomycin) and antifungals (1 , 25 ⁇ g / ml of amphotericin B) to avoid eventual contamination of the sample.
  • DM EM Dulbecco-modified Eagle
  • the umbilical cords used are obtained from cesarean deliveries of full-term pregnant women. After each birth, a 10-15 cm fragment of the umbilical cord is obtained, which is immediately taken to the laboratory by means of transport similar to that used for the skin.
  • the samples To perform the digestion of the extracellular matrix of the dermis of the skin and achieve the separation of stromal fibroblasts included in said matrix, the samples must be incubated at 37 0 C in a sterile solution of type I collagenase from Clostridium hystoliticum to 2mg / ml in DMEM culture medium without fetal bovine serum for 6 hours. This solution is able to digest the collagen of the dermis and release the stromal fibroblasts. To obtain primary fibroblast cultures, the digestion solution containing the stromal cells disintegrated from the dermis should be centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes and the fibroblast cell pellet is grown in 15 cm culture bottles 2 surface.
  • glucose-enriched DMEM supplemented with antibiotics and antifungals (100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B) and fetal bovine serum (SBF) are used at 10%
  • antibiotics and antifungals 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B
  • SBF fetal bovine serum
  • the samples are sectioned lengthwise through the umbilical vein.
  • the arteries and the um bilical vein will be carefully removed to separate the Wharton jelly.
  • the gelatin is fragmented until it becomes very small tissue fragments.
  • These fragments Wharton 's jelly are incubated in 30 ml collagenase type I (Gibco BRL Life Technologies, Düsseldorf, Germany) at 37 0 C under stirring for about 4-6 hours, and then examining the dissociated cells by centrifugation for 7 min at 1050 revolutions per minute (rpm).
  • the cell pellet is resuspended in 5-10 ml of prediluted trypsin (Sigma-Aldrich). Again, incubated at 37 0 C in a shaking bath for 30 minutes. Then, the effects of trypsin were neutralized by adding 10-20 ml of culture medium supplemented with 10% fetal bovine serum, centrifuged again at 1000 rpm for 10 minutes to obtain the isolated cells. Finally, these cells are resuspended in Amniomax culture medium in a 25 cm 2 culture flask.
  • trypsin Sigma-Aldrich
  • the different cell cultures of fibroblasts or stem cells of Wharton's jelly should be washed with sterile PBS and incubated in 1 -3 ml of a 0.5 g / l trypsin solution and 0.2 g EDTA / the 37 0 C for 10 minutes.
  • the trypsin used is inactivated by adding 10 ml of fibroblast culture medium.
  • the presence of abundant serum proteins is capable of inactivating the proteolytic action of trypsin.
  • the solutions in which the detached cells are located are centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to obtain a pellet or cell button with the cells of interest, discarding the supernatant with trypsin.
  • the cell pellet is carefully resuspended in 5 ml of culture medium and these cells are grown in culture bottles of 15, 25 or 75 cm 2 surface.
  • the quantum of querati nocitos expand up to about five times in new culture jars.
  • the concentrations of the elements Na, Mg, P, Cl, S, K, and Ca in mmol / kg dry weight are quantified by a modification of the Hall method (Hall et al., 1973; Staham and Pawley , 1978).
  • standard salts of Na, Mg, P, Cl, K, S and Ca dissolved in 20% dextran (300,000 Dalton) are used, obtaining a standard curve or straight. These salts are treated in the same way as the specimens to be analyzed.
  • the concentrations of each of the analyzed elements are calculated using the linear regression method from the standard curves.
  • the protocol described below is similar in the human and animal corneal product, with the exception of the incorporation of the endothelial stratum in the animal corneal product.
  • composition of this medium is the following: 3 parts of DMEM medium and one part of Ham F-12 medium, all supplemented with 10% fetal bovine serum, anti biotic-anti-motic, 24 ⁇ g / ml of adenine and different growth factors: 0.4 ⁇ g / ml of hydrocortisone, 5 ⁇ g / ml insulin, 1.3 ng / ml triiodothyronine and 8 ng / ml cholera toxin.
  • keratocytes corneal stroma
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • the culture medium to be used is composed of 3 parts of DMEM medium and one part of Ham F-12 medium, all supplemented with 10% fetal bovine serum, anti biotic-anti-icotic, 24 ⁇ g / ml of adenine and different growth factors: 0.4 ⁇ g / ml of hydrocortisone, 5 ⁇ g / ml of insulin, 1.3 ng / ml of triiodothyronine, 8 ng / ml of cholera toxin and 10 ng / ml of factor of epithelial growth (EGF).
  • epithelial growth epithelial growth
  • the object is to favor the adhesion of the cells of the surface epithelium to the stromal substitute, eliminating the risk of detachment existing in the corneal products currently developed.
  • agarose concentrations that allows viable corneal products ranges from 0.025% to 0.3% and should be established in relation to the patient being used.
  • corneal products generated by tissue engineering were structurally analogous to the native corneas used as control. Specifically, a well-formed corneal epithelium was observed, with abundant intercellular junctions and a stroma composed of numerous fibrin fibers, including keratocytes. All this suggests that bi or artificial corneal products Trilaminers constructed based on the protocol described above, are compatible with human corneas and orthotypic animals.
  • epithelium of the corneal products it is noteworthy that all epithelial cells expressed high levels of cytokeratins typical and exclusive of the corneal epithelium
  • CK3 and CK1 2 which suggests that these cells could be functional in vitro.
  • the analysis of proteins related to intercellular junctions revealed the sequential expression of various components of the desmosomes (placoglobin, desmoglein 3 and desmoplachin), the narrow junctions (ZO-1 and ZO-2) and the gap (connexin) communicating junctions. 37) at the epithelial level, all of which is similar to the normal native cornea.
  • Optical quality control (Figure 4C).
  • the optical properties of the artificial corneal products were suitable for a tissue that has to fulfill the functions of the human or animal cornea. Specifically, spectral transmittance analyzes showed that corneal products tended to show very adequate levels of transparency, comparable to those of normal human cornea, with very similar scattehng levels. In addition, the absorption, dispersion and extinction coefficients of fibrin and agarose products were higher than those obtained with fibrin tissues. However, the absorbance for small wavelengths (range of ultraviolet) was lower in bi-trilaminar artificial corneal products than in controls, which suggests the need to use filters for ultraviolet light in this type of products. In sum, the translucency of the corneal products was acceptable, especially in those products whose thickness did not exceed 0.7 mm. 4) Genetic quality control ( Figure 4C and 4D).
  • artificial corneal products expressed a large number of genes whose function was focused on the establishment of intercellular junctions (connexins, integrins, desmoplaquine, placoglobin, etc.), epithelial development (Sema3A, RUNX2, TBX1), cell differentiation (PLXNA4A , FLG, DKK4, DCN), basement membrane (laminae, collagen IV), extracellular matrix (collagen, decorin, biglican, MMP, fibronectin), etc.
  • intercellular junctions connexins, integrins, desmoplaquine, placoglobin, etc.
  • epithelial development Sema3A, RUNX2, TBX1
  • cell differentiation PLXNA4A , FLG, DKK4, DCN
  • basement membrane laminae, collagen IV
  • extracellular matrix extracellular matrix
  • urethra small biopsies of normal human urethra obtained by endoscopy of patients or normal donors are used. Once the sample is obtained in a sterile way, the extracted tissues will be immediately introduced in sterile transport constituted by means of Eag modified by Dul becco (DM EM) supplemented with antibiotics (500 U / ml of penicillin G and 500 ⁇ g / ml of streptomycin) and antifungals (1.25 ⁇ g / ml of amphotericin B) to avoid eventual contamination of the sample.
  • DM EM Eag modified by Dul becco
  • antibiotics 500 U / ml of penicillin G and 500 ⁇ g / ml of streptomycin
  • antifungals (1.25 ⁇ g / ml of amphotericin B
  • samples of oral or skin mucosa can be used for the generation of urethral substitutes.
  • the samples are incubated at 37 0 C in a sterile solution with trypsin 0.5 g / l EDTA 0.2 g / l in PBS, collecting the supernatant with cells after 30 minutes by centrifugation. This process is repeated up to 5 times adding new trypsin-EDTA solution each time. In this way, an appreciable amount of epithelial cells of the urethra is achieved, which are cultured in culture medium of epithelial cells, which preferably favors the growth of epithelial cells over fibroblasts.
  • This medium is composed of 3 parts of DMEM medium rich in glucose and one part of Ham F-12 medium, all supplemented with 10% fetal bovine serum, anti biotic-anti-motic (100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B), 24 ⁇ g / ml adenine and various growth factors: 0.4 ⁇ g / ml hydrocortisone, 5 ⁇ g / ml insulin, 10 ng / ml of epithelial growth factor (EGF), 1.3 ng / ml of triiodothyronine and 8 ng / ml of cholera toxin.
  • fetal bovine serum 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B
  • the samples To perform the digestion of the extracellular matrix of the urethral stroma and achieve the separation of stromal fibroblasts included in said matrix, the samples must be incubated at 37 0 C in a sterile solution of collagenase type I Clost ⁇ dium hystoliticum 2mg / ml in DMEM culture medium without fetal bovine serum for 6 hours. This solution is able to digest the collagen of the dermis and release the stromal fibroblasts. To obtain primary fibroblast cultures, the digestion solution containing the stromal cells disintegrated from the dermis should be centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes and the fibroblast cell pellet is grown in 15 cm culture bottles 2 surface.
  • glucose-enriched DMEM supplemented with antibiotics and antimycotics (1 00 U / ml penicill ina G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B) and fetal bovine serum is used ( SBF) at 10%.
  • SBF fetal bovine serum
  • I mean fibroblast media. In all cases, cells are incubated at 37 0 C with 5% carbon dioxide in standard cell culture conditions. Culture media is renewed every three days.
  • stromal substitutes with fibroblasts immersed in their thickness using extracellular matrices of fibrin and agarose. These stromal substitutes will be generated directly on Petri dishes for cell culture. To prepare 10 ml of stromal substitute, proceed as follows:
  • stromal substitutes were obtained very similar to those obtained from urethral cells.
  • DMEM Eagle modified by Dulbecco
  • antibiotics 500 U / ml of penicillin G and 500 ⁇ g / ml of streptomycin
  • antifungals (1.25 ⁇ g / ml of amphotericin B
  • samples of oral or skin mucosa can be used for the generation of bladder substitutes.
  • the samples are incubated at 37 0 C in a sterile solution with trypsin 0.5 g / l EDTA 0.2 g / l in PBS, collecting the supernatant with cells after 30 minutes by centrifugation. This process is repeated up to 5 times adding new trypsin-EDTA solution each time. In this way, an appreciable amount of epithelial cells of the bladder is achieved, which are grown in culture medium of epithelial cells, which preferentially favors the growth of epithelial cells over fibroblasts.
  • This medium is composed of 3 parts of DMEM medium rich in glucose and one part of Ham F-12 medium, all supplemented with 10% fetal bovine serum, anti biotic-anti-motic (100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B), 24 ⁇ g / ml adenine and various growth factors: 0.4 ⁇ g / ml hydrocortisone, 5 ⁇ g / ml insulin, 10 ng / ml of epithelial growth factor (EGF), 1.3 ng / ml of triiodothyronine and 8 ng / ml of cholera toxin.
  • fetal bovine serum 100 U / ml penicillin G, 100 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B
  • the samples To perform the digestion of the extracellular matrix and bladder stroma achieve the separation of stromal fibroblasts included in said matrix, the samples must be incubated at 37 0 C in a sterile solution of Type I collagenase of Clostridium hystoliticum at 2 mg / ml in DMEM culture medium without fetal bovine serum for 6 hours. This solution is able to digest the stroma collagen and release the fibroblasts immersed in it. In order to obtain primary cultures of fibroblasts, the digestion solution containing the disintegrated stromal cells must be centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes and the cell pellet corresponding to the fibroblasts is grown in culture bottles of 15 cm 2 surface .
  • glucose-enriched DMEM supplemented with antibiotics and antifungals (1 00 U / ml penicill ina G, 1 00 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B) and fetal bovine serum ( SBF) at 10%.
  • antibiotics and antifungals (1 00 U / ml penicill ina G, 1 00 ⁇ g / ml streptomycin and 0.25 ⁇ g / ml amphotericin B) and fetal bovine serum ( SBF) at 10%.
  • SBF fetal bovine serum
  • stromal substitutes with fibroblasts immersed in their thickness using extracellular matrices of fibrin and agarose. These stromal substitutes will be generated directly on Petri dishes for cell culture. To prepare 10 ml of stromal substitute, proceed as follows:
  • the objective of this process is to significantly reduce the hydration levels of the product to achieve optimum levels of consistency and elasticity.
  • stromal substitutes were obtained very similar to those obtained from bladder cells.
  • PRODUCTION PROTOCOL OF ARTIFICIAL HUMAN ORAL MUCOSA PRODUCTS A. Generation of primary cultures of epithelial and stromal cells.
  • biopsies of normal oral mucosa from human donors or laboratory animals are used, using the following methods and protocols:
  • product B (3.8 g / L of collagen, 0.6 g / L of fibrin and 0.25 g / L of agarose).
  • the objective of this process is to significantly reduce the hydration levels of the product to achieve optimum levels of consistency and elasticity. 6- Once the tissue is dehydrated, cut it to size giving it the desired shape, using monofilament surgical suture thread. We must emphasize that the Dehydration of the tissue results in adequate levels of consistency and elasticity, allowing the suture to be carried out without any difficulty.
  • A.- fibrin (1.25 g / L), agarose (0.5 g / L) and collagen (2.8 g / L).
  • B.- fibrin (0.6 g / L), agarose (0.25 g / L) and collagen (3.8 g / L).
  • the application of nanostructuring techniques is capable of substantially modifying the structure and behavior of the biomaterials subjected to this process.
  • the main effects of the nanostructuring on the fibrin and agarose biomaterial at 0.1% (preferred final concentration of the patent application) are the following: - Significant improvement of the biomechanical properties of the tissue. This increase allows the manipulation of the nanostructured tissue and supposes a substantial and unexpected improvement of the rheological properties of the biomaterial. As shown in Figure 8, the threshold effort was 3.8 times higher in nanostructured tissues compared to nanostructured (16.2 and 4.23 Paséales, respectively).
  • the elastic modulus G 'of nanostructured tissues was 5.55 times higher (figure 10) compared to non-nanostructured native biomaterials (152 and 27.4 Pa, respectively), which means that these tissues have levels significantly Higher elasticity.

Abstract

La presente invención proporciona un método in vitro de preparación de un tejido artificial, el tejido artificial obtenible por dicho método, la composición farmacéutica que lo comprende y el uso de este tejido o de esta composición para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente la actividad funcional de un tejido o un órgano dañado, preferiblemente piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa oral, conjuntiva, pared abdominal, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina. El método de la invención comprende los pasos de añadir fibrinógeno a células aisladas, preferiblemente, a fibroblastos o queratocitos, añadir un agente antifibrinolítico a la mezcla, añadir además un factor de coagulación, una fuente de calcio y trombina, añadir un polisacárido, preferiblemente agarosa, cultivar células, preferiblemente células epiteliales o células madre del cordón umbilical, en o sobre el producto resultante e inducir la nanoestructuracion de dicho producto. El método contempla también un paso intermedio que consiste en la adición de fibronectina tras el agente fibrinolítico, y otro paso en el que se añade colágeno después de la agarosa.

Description

Elaboración de tejidos artificiales mediante ingeniería tisular utilizando biomateriales de fibrina v aqarosa
La presente invención se encuadra en el campo de Ia biomedicina y, más específicamente, de Ia ingeniería tisular. Específicamente, se refiere a un método in vitro de preparación de un tejido artificial, al tejido artificial obtenible por dicho método y al uso de este tejido artificial para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tejido o un órgano dañado.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La ingeniería tisular constituye un conjunto de técnicas y disciplinas que permite diseñar y generar en laboratorio tejidos artificiales a partir de células madre procedentes de muestras tisulares obtenidas de biopsias y, por tanto, supone un enorme avance en el trasplante de órganos y en Ia medicina regenerativa. La ingeniería tisular es una de las áreas de Ia biotecnología que más se ha desarrollado en los últimos años, debido a su utilidad potencial para Ia fabricación in vitro de tejidos y órganos para su implante en pacientes necesitados de estos tejidos. No obstante, los tejidos artificiales descritos hasta Ia fecha presentan numerosos problemas y complicaciones; algunos de los cuales se exponen a continuación, empleando como ejemplo, los tejidos artificiales de piel, córnea, vejiga y uretra.
La vejiga urinaria es el órgano encargado de Ia recepción y el almacenamiento de Ia orina. Situada en el suelo pélvico, Ia vejiga urinaria se caracteriza por su capacidad y su distensibilidad, Io cual permite a ésta almacenar y retener Ia orina. La continencia es resultado de Ia contracción del esfínter urinario, que cierra Ia uretra y el cuello vesical evitando Ia salida de orina, así como de Ia relajación y d istensión de Ia vej iga para almacenar Ia orina que se va acumulando en ella. Numerosas patologías congénitas o adquiridas pueden afectar a Ia integridad de Ia vejiga, alterando Ia función continente de ésta. Por un lado, las malformaciones de Ia vejiga suelen asociarse a defectos graves de Ia pared vesical que requieren reparación quirúrgica urgente. Por otro lado, los traumatismos pélvicos, el cáncer vesical y las lesiones traumáticas de Ia médula espinal constituyen patologías de gran frecuencia que requieren el uso de tejidos extravesicales para reparar Ia vejiga dañada. En este contexto, actualmente se llevan a cabo ampliaciones vesicales utilizando intestino (e n te roc i sto p l a st i a ) , estó m ag o (g a stroc i sto p l a st i a ) o u rote l io (ureterocistoplastia), siendo muy frecuentes las complicaciones asociadas a estas técnicas.
Hasta el momento, se han descrito muy pocos modelos de sustitutos de Ia vejiga urinaria que presenten utilidad clínica. Recientemente (Átala et al. Lancet. 2006 Apr 15;367(9518):1241-6), investigadores del Children's Hospital de Boston lograron implantar un sustituto de vejiga artificial generado a partir de colágeno y ácido poliglicólico en siete pacientes con daño vesical grave. Sin embargo, los modelos de vejiga artificial disponibles para el tratamiento de los pacientes necesitados de ello, son muy escasos y presentan multitud de inconvenientes, incluyendo Ia mala calidad y Ia escasa manipulabilidad de los tejidos generados. Además, el colágeno es un producto que tiende a Ia contracción y a Ia pérdida de volumen cuando se usa en ingeniería tisular, siendo escasa su consistencia y, por tanto, su manipulabilidad quirúrgica. La uretra es el conducto por el que se elimina hacia el exterior Ia orina almacenada en Ia vejiga urinaria. Además de su función excretora en ambos sexos, Ia uretra cumple una función reproductiva en el hombre, a permitir el paso del contenido seminal desde las vesículas seminales durante Ia eyaculación. Son múltiples las afecciones congénitas (hipospadias y epispadias principalmente) o adquiridas (traumatismos, estenosis, etc.) que afectan a su integridad funcional y que precisan que sea sustituida en mayor o menor extensión, para conseguir restablecer su función normal (Baird et al. J Urol. 2005;174:1421-4; Persichetti et al. Plast Reconstr Surg. 2006; 117:708-10).
Tradicionalmente, Ia reparación de tejidos lesionados se ha venido haciendo con elementos protésicos artificiales o tejidos tomados de una parte del propio paciente (autoinjerto o autotransplante) o de otro individuo (transplante heterólogo). Actualmente, para Ia corrección de Ia mayor parte de las patologías uretrales, se recurre a colgajos autólogos de tejidos adyacentes o a injertos libres, principalmente de mucosa oral o vesical. Sin embargo, Ia obtención de colgajos locales no siempre es factible, y Ia extracción de mucosa oral o vesical no está exenta de complicaciones y efectos secundarios tanto en Ia zona donante como en Ia zona receptora (Corvin et al. Urologe A. 2004;43(10):1213-6; Schultheiss et al. World J Urol. 2000;18:84-90). Por otro lado, Ia utilización de tejidos heterólogos ha arrojado resultados bastante pobres en Ia sustitución de uretra, siendo muy frecuente Ia aparición de rechazos inmunológicos del tejido trasplantado.
Hasta Ia fecha, se han descrito muy pocos modelos de sustitutos de uretra con probable utilidad clínica, siendo muy escasos los casos descritos en Ia literatura en los que un sustituto uretral ha sido implantado en pacientes. La mayoría de los modelos descritos hasta Ia fecha se basan en biomateriales de colágeno (De Filippo et al. J Urol. 2002 Oct;168(4 Pt 2):1789-92; El-Kassaby et al. J Urol. 2003 Jan;169(1 ):170-3; discussion 173) o en piel del propio paciente (Lin et al. Zhonghua Yi Xue Za Zhi. 2005 Apr 20;85(15):1057-9). Sin embargo, todos estos modelos presentan numerosos problemas y complicaciones, y aún no se ha desarrollado ningún sustituto uretral exento de estos problemas. Por un lado, el colágeno es un producto que tiende a Ia contracción y a Ia pérdida de volumen cuando se usa en ingeniería tisular, siendo escasa su consistencia y, por tanto, su manipulabilidad quirúrgica. Por otro, el uso de piel autóloga aún no ha demostrado suficientemente su capacidad para adaptarse a las condiciones de Ia uretra, siendo muy difícil recelularizar fragmentos de dermis descelularizados.
La córnea es una estructura transparente y carente de vasos, a través de Ia cual Ia luz penetra en el ojo, constituyendo Ia principal barrera del globo ocular con el medio exterior. Por ese motivo, Ia integridad y el correcto funcionamiento de Ia misma son imprescindibles para una correcta función visual. La patología congénita o adquirida de Ia córnea constituye uno de los problemas más frecuentes en oftalmología, siendo numerosas las causas que provocan una alteración grave de Ia fisiología y Ia estructura corneal. En estos casos, suele ser necesario recurrir a tratamientos agresivos y no exentos de complicaciones, como son los implantes de membrana amniótica, los diferentes tipos de queratoprótesis e incluso el trasplante heterólogo de córnea (queratoplastia). Sin embargo, el trasplante corneal es una técnica altamente dependiente de Ia disponibilidad de córneas procedentes de donantes cadáveres, Io cual hace que un gran número de personas permanezcan en lista de espera para trasplante durante periodos de tiempo muy elevados. Por otro lado, es bien sabido que el trasplante de órganos procedentes de donante está sujeto a Ia posibilidad de rechazo inmunológico cuando estos órganos son implantados, obligando al paciente a someterse a terapia inmunosupresora durante toda su vida. Finalmente, el trasplante de cualquier tipo de órgano o tejido, incluida Ia córnea, es una técnica sujeta a Ia posibilidad de transmisión de todo tipo de enfermedades infecciosas desde el donante hasta el receptor, incluyendo VIH, hepatitis, herpes, enfermedades bacterianas y fúngicas, etc. Todos estos problemas y complicaciones derivadas del implante corneal, hacen necesaria Ia búsqueda de alternativas terapéuticas al trasplante heterólogo.
La fabricación en laboratorio de un sustituto corneal (constructo corneal o córnea artificial) es una de las áreas que está experimentando mayor auge dentro de Ia ingeniería tisular, siendo numerosos los laboratorios que actualmente están intentando sin demasiado éxito conseguir un sustituto corneal de calidad que pueda ser utilizado en Ia clínica humana o para Ia evaluación de productos farmacológicos y químicos (Griffith et al. Functional human corneal equivalents constructed from cell lines. Science. 1999;286(5447):2169-72; Orwin et al. Tissue Eng. 2000;6(4):307-19; Reichl et al. lnt J Pharm. 2003;250: 191-201 ). En tal sentido, se han desarrollado córneas artificiales de origen animal y humano. En ambos casos, los modelos desarrollados han utilizado biomateriales diversos como el colágeno tipo I, fibroína procedente de Ia seda (Higa y Shimazaki. Cornea. 2008 Sep;27 Suppl 1 :S41 -7), quitosán (Gao et al. J Mater Sci Mater Med. 2008 Dec;19(12):361 1 - 9), ácido poliglicólico (Hu et al. Tissue Eng. 2005 Nov-Dec;11 (11 -12):1710-7) y fibrina con agarosa (Alaminos et al. Invest Ophthalmol Vis Sci (IOVS). 2006; 47: 3311 -3317; González-Andrades et al. J Tissue Eng Regen Med. 2009 May 5). De todos estos biomateriales, los mejores resultados obtenidos hasta ahora son los que tienen por base Ia fibrina y Ia agarosa. Las córneas de colágeno tipo I presentan tendencia a Ia pérdida de volumen y a Ia retracción de las mismas, con el inconveniente añadido del origen animal del colágeno utilizado. La fibroína y el quitosán son productos generados a partir de animales invertebrados, Io cual genera problemas significativos en relación con Ia biocompatibilidad. Las córneas de fibrina y agarosa desarrolladas, por el contrario, tienen Ia ventaja de que contienen fibrina procedente de Ia sangre del mismo paciente, mientras que Ia agarosa constituye un producto inerte desde el punto de vista inmunológico.
La piel es el órgano más extenso del cuerpo humano, y juega un papel fundamental en el mantenimiento del equilibrio interno, formando Ia principal barrera protectora del organismo frente a cualquier tipo de agresión externa. Existen numerosas patologías que afectan a Ia piel, destacando por su frecuencia las heridas, las úlceras por presión y las quemaduras. Los tratamientos actuales, basados en el uso de colgajos o injertos de piel o incluso en el implante de piel procedente de donante, están asociados a numerosos problemas. La necesidad de solucionar estos problemas hace necesaria Ia búsqueda de alternativas basadas en Ia generación de productos de piel artificial humana generados mediante ingeniería tisular (Horch et al. Burns. 2005 Aug;31 (5):597- 602). En concreto, hasta el momento se han diseñado distintos tipos de piel artificial, incluyendo coberturas cutáneas sintéticas y biológicas, aunque ninguno de ellos ha logrado reproducir fielmente Ia estructura y las funciones de Ia piel humana nativa. Por un lado, las coberturas dérmicas sintéticas consisten en biomateriales no reabsorbibles y exentos de células vivas que se pueden utilizar como cubiertas temporales o como agentes inductores de Ia reparación tisular guiada. Estos tejidos artificiales e inertes poseen muy poca actividad biológica, por Io que no pueden ser empleados en lesiones profundas o extensas. Por otro lado, las coberturas biológicas consisten en Ia utilización de piel humana artificial en Ia que existen células vivas y matrices extracelulares que tratan de reproducir Ia estructura de Ia piel humana normal. Hasta el momento, Ia piel humana artificial que mejores resultados está ofreciendo es Ia piel artificial generada mediante ingeniería tisular a partir de células madre de Ia piel utilizando fibrina procedente del plasma humano como biomaterial (Meana et al. Burns 1998; 24: 621 -630; Del Rio et al. Hum Gene Ther. 2002 May 20;13(8):959-68; Llames et al. Transplantation. 2004 Feb 15;77(3):350-5; Llames et al. CeII Tissue Bank 2006; 7: 4753.). Aunque estas técnicas supusieron un gran avance, su utilización clínica es limitada debido al hecho, fundamentalmente, de su escasa consistencia, su difícil manipulación y su enorme fragilidad. Uno de los sustitutos de tejido más consistentes es aquel que combina el uso de fibrina con Ia agarosa. Hasta el momento, Ia agarosa ha sido utilizada para Ia generación de sustitutos del cartílago (Miyata et al. J Biomech Eng. 2008 Oct;130(5):051016), Ia córnea (Alaminos et al. Invest Ophthalmol Vis Sci (IOVS). 2006; 47: 331 1-3317) y Ia mucosa oral humana (Alaminos et al. J Tissue Eng Regen Med. 2007 Sep-Oct;1 (5):350-9; Sánchez- Quevedo et al . Histol Histopathol. 2007 Jun;22(6):631-40), pero no existe experiencia previa en el uso de este biomaterial para Ia fabricación de piel artificial. La ingeniería tisular es una de las áreas que está experimentando mayor auge dentro de Ia biotecnolog ía. Sin embargo, las desventajas de los tejidos artificiales hasta ahora existentes hacen necesario el desarrollo de nuevas técnicas que permitan Ia obtención de tejidos artificiales que puedan ser util izados en Ia cl ín ica h u mana o para Ia eval uación de prod uctos farmacológicos y químicos, superando las limitaciones hasta ahora detectadas.
COMPENDIO DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, Ia invención se relaciona con un método in vitro de preparación de un tejido artificial que comprende:
a) añadir una composición que comprende fibrinógeno a una muestra de células aisladas, b) añadir un agente antifibhnolítico al producto resultante del paso (a),
c) añadir, al menos, un factor de coagulación, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinación de los anteriores al producto resultante del paso (b),
d) añadir una composición de un polisacárido al producto resultante del paso (c),
e) cultivar células aisladas en o sobre el producto resultante del paso (d), y
f) inducir Ia nanoestructuración del producto resultante del paso
(e).
En un segundo aspecto, Ia invención se relaciona con un tejido artificial obtenible por el método de Ia invención.
En un tercer aspecto, Ia invención se relaciona con el uso del tejido artificial de Ia invención en medicina.
En un cuarto aspecto, Ia invención se relaciona con el uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado. En un quinto aspecto, Ia invención se relaciona con una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención.
BREVE EXPLICACIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra un esquema del procedimiento empleado para Ia nanoestructuración del tejido artificial. Figura 2. Muestra Ia evaluación del producto de piel humana artificial. A. Análisis microscópico in vitro. B. Análisis macro y microscópico de Ia piel humana artificial evaluada in vivo. C. Análisis inmunohistoquímico. Figura 3. Muestra Ia evaluación del producto de piel humana artificial con células de Ia gelatina de Wharton. A. Determinación de Ia viabilidad de las células madre de Ia gelatina de Wharton. B. Análisis microscópico. C. Análisis inmunohistoquímico de las siguientes proteínas: pancitoqueratina (PANC), queratina 1 (KRT1 ), queratina 10 (KRT10), involucrina (INVOL) y filagrina (F I LAG).
Figura 4. Muestra Ia evaluación de los productos corneales. A. Análisis microscópico e inmunohistoqu ímico: inmunofluorescencia de diferentes proteínas relacionadas con uniones intercelulares en el epitelio de las córneas humanas control (C) y de los productos corneales mantenidos in vitro en diferentes estadios de maduración y desarrollo (1 : córnea con una única capa de epitelio, 2: córnea con 2-3 capas, 3: córnea con epitelio estratificado, 4: córnea con epitelio estratificado y sometido a técnica aire-líquido). B. Control de calidad reológico. C. Control de calidad óptica. D. Control genético: Principales funciones génicas expresadas por los constructos corneales artificiales generados mediante ingeniería tisular. E. Evaluación in vivo del comportamiento clínico de los productos corneales artificiales en un modelo animal. A: tras eliminar Ia hemicórnea anterior, se sitúa el constructo corneal sobre Ia superficie del estroma; B: aspecto final una vez suturado; C: evolución a las 3 semanas; D: evolución a las 6 semanas.
Figura 5. Muestra Ia evaluación del producto de uretra humana artificial. A. Anál isis microscópico. B. Análisis inmunoh istoqu ímico (expresión de integ riñas).
Figura 6. Muestra Ia evaluación del producto de vejiga urinaria artificial. A. Análisis microscópico: Vejiga humana artificial fabricada en laboratorio y mantenida en cultivo durante 1 y 3 semanas, respectivamente. B. Análisis inmunohistoquímico: Análisis mediante inmunofluorescencia de Ia vejiga artificial humana generada mediante ingeniería tisular y de Ia vejiga humana control normal para las citoqueratinas (CK) 7, 8, 4, 13 y pancitoqueratina. Figura 7. Muestra Ia evaluación de los productos de mucosa oral humana artificial. A. Análisis mediante el microscópico óptico de los tejidos de fibrina, agarosa y colágeno (este último a una concentración final de 2,8 g/L) teñidos con hematoxilina y eosina tras 1 , 2, 3 y 4 semanas de desarrollo en cultivo y del estroma de Ia mucosa oral humana utilizada como control. B. Análisis mediante el microscopio electrónico de barrido de los tejidos artificiales basados en fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final preferida de colágeno de 2,8 g/L (A) en comparación con los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final de colágeno de 3,8 g/L (B), de fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final de colágeno de 1 ,9 g/L (C), o de colágeno a una concentración final de 5,6 g/L en ausencia de fibrina y agarosa (D) y del estroma de Ia mucosa oral humana normal utilizada como control (E). C. Esfuerzo umbral de los tejidos artificiales basados en fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final preferida de colágeno de 2,8 g/L (A) en comparación con los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final de colágeno de 3,8 g/L (B), de fibrina, agarosa y colágeno con una concentración final de colágeno de 1 ,9 g/L (C), o de colágeno a una concentración final de 5,6 g/L en ausencia de fibrina y agarosa (D). Figura 8. - Muestra Ia mejora del esfuerzo umbral (en Paséales) de los tejidos nanoestructurados con respecto a los no nanoestructurados.
Figura 9. Muestra el módulo viscoso G" de las muestras sometidas a nanoestructuración y d e l a s muestras no nanoestructuradas (datos en Paséales). Figura 10. Muestra el modulo elástico G' de los tejidos nanoestructurados y de los biomatehales nativos no nanoestructurados.
Figura 11. Muestra Ia transparencia d e los tej idos sometidos a nanoestructuración de fibrina-agarosa 0,1 %, y de los biomateriales no nanoestructurados de fibrina-agarosa 0,1 %. Los datos se dan como porcentaje de transmitancia del espectro de Ia luz visible (aproximadamente, de 400 a 700 nm).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DELA INVENCIÓN
La ingeniería tisular es una de las áreas de Ia biotecnología que más se ha desarrollado en los últimos años, debido a su utilidad para Ia fabricación in vitro de tejidos y órganos para su implante en pacientes necesitados de estos tejidos
Sin embargo, las limitaciones de los tejidos artificiales hasta ahora existentes hacen necesario el desarrollo de nuevas técnicas que permitan Ia obtención de tejidos artificiales que puedan ser utilizados en Ia clínica humana o para Ia evaluación de productos farmacológicos y químicos.
Método de Ia invención
La presente invención proporciona un método in vitro de preparación de un tejido artificial, al tejido artificial obtenible por dicho método y al uso de este tejido artificial para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tejido o un órgano dañado.
Un primer aspecto de Ia invención se refiere a un método in vitro de preparación de un tejido artificial (de aquí en adelante, método de Ia invención) que comprende:
a) añadir una composición que comprende fibrinógeno a una muestra de células aisladas,
b) añadir un agente antifibrinolítico al producto resultante del paso (a),
c) añadir, al menos, un factor de coagulación, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinación de los anteriores al producto resultante del paso (b),
d) añadir una composición de un polisacárido al producto resultante del paso (c),
e) cultivar células aisladas en o sobre el producto resultante del paso (d), y f) inducir Ia nanoestructuración del producto resultante del paso (e).
En el paso (a) del método de Ia invención se añade una composición que comprende fibrinógeno a células aisladas, preferiblemente, de un mamífero. Dichas células pueden obtenerse mediante diferentes procedimientos descritos en el estado de Ia técnica, que pueden depender del tipo celular particular del que se trate. Algunos de estos procedimientos son, por ejemplo, pero sin limitarse, biopsia, procesado mecánico, tratamiento enzimático (por ejemplo, pero sin limitarse, con tripsina o colagenasa de tipo I), centrifugación, lisis eritrocitaha, filtración, cultivo en soportes o medios que favorezcan Ia proliferación selectiva de dicho tipo celular o inmunocitometría. Algunos de estos procedimientos se describen en detalle en los Ejemplos de esta memoria.
Las células del paso (a) pueden ser células diferenciadas como, por ejemplo, pero sin limitarse, fibroblastos, queratocitos o células musculares lisas, o células no diferenciadas con Ia capacidad para diferenciarse en dichas células como, por ejemplo, células madre adultas.
En una realización preferida del método de Ia invención, las células del paso (a) son fibroblastos o células no diferenciadas con Ia capacidad para diferenciarse en fibroblastos. Los fibroblastos pueden obtenerse a partir de cualquier tejido u órgano, sin embargo, preferiblemente, los fibroblastos del paso (a) proceden del tejido o del órgano en el que va a emplearse como sustituto el tejido artificial . Por ejemplo, cuando el método de Ia invención se emplea para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, los fibroblastos proceden, preferiblemente, de piel (fibroblásticos dérmicos); cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, los fibroblastos proceden, preferiblemente, de vejiga; cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial los fibroblastos proceden, preferiblemente, de uretra; o cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de mucosa oral o una mucosa oral artificial los fibroblastos proceden preferiblemente, de mucosa oral. No obstante, los fibroblastos pueden obtenerse a partir de cualquier otro tejido u órgano, como por ejemplo, Ia mucosa oral, Ia pared abdominal o cualquier tejido conjuntivo. Por ejemplo, los fibroblastos obtenidos a partir de mucosa oral pueden emplearse para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial, o un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial.
En otra realización preferida del método de Ia invención, las células del paso (a) son queratocitos o células no diferenciadas con Ia capacidad para diferenciarse en queratocitos. Por ejemplo, cuando el método de Ia invención se emplea para preparar un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial, preferiblemente, se emplean queratocitos del estroma corneal.
La posibilidad de que todos los componentes del tejido artificial sean de origen autólogo permite que el transplante de dicho tejido pueda realizarse sin que sea necesaria Ia inmunosupresión del sujeto transplantado. Sin embargo, los componentes del tejido artificial también puedan ser de origen alogénico, es decir, pueden proceder de un individuo diferente a aquel al que se Ie va a transplantar el tejido artificial. Incluso Ia especie de Ia cual proceden dichos componentes, puede ser diferente; en cuyo caso se dice que su origen es xenogénico. Esto abre Ia posibilidad de que el tejido artificial esté preparado de antemano cuando se necesite con urgencia, aunque en este caso sí sería recomendable proceder a Ia inmunosupresión del sujeto al que se transplante el tejido artificial.
Por Io tanto, en una realización preferida, las células del paso (a) de Ia invención son de origen autólogo. No obstante, las células del paso (a) también pueden ser de origen alogénico o xenogénico. Mediante Ia adición a las células del paso (a) de los diferentes componentes descritos en los pasos (a)-(d) del método de Ia invención, y tras dejar reposar el producto resultante del paso (e) en un soporte, se produce Ia formación de una matriz que comprende fibrina, el polisacárido y, en el caso correspondiente, Ia proteína añadida en el paso (d2) si se ha aplicado dicho paso, en Ia que quedan embebidas dichas células y sobre Ia cual y/o en cuyo interior éstas pueden crecer. Preferiblemente, las células del paso (a) crecen en el interior de dicha matriz.
La formación de una matriz de fibrina tiene lugar por Ia polimerización del fibrinógeno inducida por trombina. El fibrinógeno es una proteína de elevado peso molecular que se encuentra presente en el plasma sangu íneo. La trombina es una enzima proteolítica que provoca Ia ruptura de Ia molécula de fibrinógeno en polipéptidos de bajo peso molecular y en monómeros de fibrina.
Dichos monómeros polimerizan en dímeros y posteriormente se unen entre sí mediante enlaces covalentes, por acción del factor XIII, previamente activado por Ia trombina, y en presencia de iones de calcio.
La composición que comprende fibrinógeno del paso (a) puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, plasma sanguíneo. La composición del paso (a) puede asimismo prepararse a partir de un derivado plasmático, como, por ejemplo, pero sin limitarse un crioprecipitado o un concentrado de fibrinógeno. Además de fibrinógeno, Ia composición del paso (a) puede contener otros factores de coagulación.
En una realización preferida, Ia concentración de fibrinógeno en el producto resultante del paso (c) es de entre 0,5 y 10 g/L, opcionalmente entre 1 y 10 g/L. En una realización más preferida, Ia concentración en el producto resultante del paso (d) es de entre 1 y 4 g/L, opcionalmente entre 2 y 4 g/L. No obstante, una concentración menor o mayor también podría emplearse.
En una realización preferida, el fibrinógeno de Ia composición del paso (a) o Ia composición que comprende fibrinógeno del paso (a) es de origen autólogo. No obstante, el fibrinógeno de Ia composición del paso (a) o Ia composición que comprende fibrinógeno del paso (a) también puede ser de origen alogénico o xenogénico.
En una realización preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia composición que contiene fibrinógeno del paso (a) es plasma sanguíneo. En este caso, Ia polimerización del fibrinógeno puede inducirse mediante Ia adición en el paso (c) de una fuente de calcio.
En una realización más preferida de este primer aspecto de Ia invención, Ia fuente de calcio del paso (c) es una sal de calcio como, por ejemplo, pero sin limitarse, cloruro calcico, gluconato calcico o una combinación de ambas. La concentración de Ia sal de calcio deberá ser suficiente para inducir Ia polimerización del fibrinógeno. En una realización más preferida, Ia sal de calcio es cloruro calcico. En una realización aún más preferida, Ia concentración de cloruro de calcio en el producto resultante del paso (e) es de entre 0,25 y 3 g/L, opcionalmente entre 0,5 y 4 g/L. No obstante, una concentración menor o mayor también podría emplearse.
El término "factor de coagulación", tal y como se util iza en Ia presente descripción, se refiere a un componente, generalmente, una proteína, presente en el plasma sanguíneo y que interviene en Ia reacción en cadena que hace posible Ia coagulación. Son trece los factores de coagulación, nombrados con números romanos: I : fibrinógeno; I I : protrombina ; I I I : factor tisu la r o tromboplastina; IV: calcio; V: proacelerina; Vl: factor inactivo o cimógeno; VII: proconvertina; VIII: factor antihemofílico A o factor von Willebrand; IX: factor antihemofílico B o factor de Christmas; X: factor de Stuart-Prower; Xl: factor antihemofílico C; XII: Factor Hageman; XIII: Factor estabilizante de Ia fibrina; XIV: Fitzgerald ; XV: Fletcher; XVI : plaquetas; y XVI I : Somocu rcio . Preferiblemente, el otro factor de coagulación añadido en el paso (c) del método de Ia presente invención es el factor XIII.
El polímero de fibrina puede degradarse mediante el proceso denominado fibrinólisis. Durante Ia fibrinólisis, el plasminógeno es convertido en Ia enzima activa plasmina, por el activador tisular del plasminógeno; Ia plasmina se une a
Ia superficie de Ia fibrina a través de sus sitios de unión, para producir Ia degradación del polímero de fibrina. Para evitar Ia fibrinólisis de Ia matriz de fibrina, en el paso (b) de Ia presente invención se añade un agente antifibrinolítico como, por ejemplo, pero sin limitarse, ácido épsilon aminocaproico, ácido tranexámico o aprotinina. El ácido tranexámico es un producto sintético derivado del aminoácido lisina con gran afinidad por los sitios de unión de lisina del plasminógeno; bloquea estos sitios y previene Ia unión del plasminógeno activado a Ia superficie de fibrina, ejerciendo un efecto antifibrinolítico. El ácido tranexámico tiene Ia ventaja, frente a otros agentes antifibrinolíticos de origen animal, de que no transmite enfermedades. Por tanto, en una realización preferida, el agente antifibrinolítico es el ácido tranexámico. En una realización aún más preferida, Ia concentración de ácido tranexámico en el producto resultante del paso (e) es de entre 0,5 y 2 g/L, preferiblemente entre 1 y 2 g/L. No obstante, una concentración menor o mayor también podría emplearse.
Las matrices de fibrina son muy versátiles, por Io que se han empleado para Ia elaboración de diferentes tejidos artificiales, sin embargo, Ia utilización clínica de las mismas se ha visto limitada debido al hecho, fundamentalmente, de su escasa consistencia, su difícil manipulación y su enorme fragilidad. Por ese motivo, en el paso (d) del método de Ia invención se añade un polisacárido. En general, dicho polisacárido se emplea para aportar resistencia y consistencia al tejido, y es conveniente que sea soluble en el mismo. Ejemplos de polisacáridos que pueden emplearse en el paso (d) del método de Ia presente invención son pero, sin limitarse, agar-agar, agarosa, alginato, quitosano o carragenatos, o cualquier combinación de los anteriores.
La agarosa es un polisacárido formado por galactosas alfa y beta que se extrae de algas de géneros como Gellidium o Graduaría. La agarosa, frente a otros polisacáridos que pueden ser empleados en el paso (d) de Ia presente invención, tiene Ia ventaja de que forma una matriz inerte desde el punto de vista inmunológico. Por tanto, en una realización preferida, el polisacárido del paso (d) del método de Ia invención es agarosa. Existen diferentes tipos de agarosa que varían en sus propiedades físicas y químicas como, por ejemplo, Ia tem peratu ra de g el ificación , Ia fuerza del gel y/o I a poros idad . Preferiblemente, Ia agarosa del paso (d) del método de Ia invención es una agarosa con un punto de fusión bajo, es decir, una agarosa que se repolimerice y solidifique a una temperatura, preferiblemente, menor de 65 0C y, más preferiblemente, menor de 4O0C; de esta manera puede emplearse para preparar el tejido a temperaturas muy bajas, minimizando Ia probabilidad de muerte celular. En una realización más preferida, Ia agarosa empleada en el paso (d) del método de Ia invención es de tipo VII. En una realización aún más preferida, Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, en el producto resultante del paso (e) está a una concentración, ventajosamente, de entre 0,1 y 6 g/L, opcionalmente entre 0,2 y 6 g/L, preferiblemente, de entre 0,15 y 3 g/L, opcionalmente entre 0,3 y 3 g/L y más preferiblemente, de entre 0,25 y 2 g/L, opcionalmente entre 0,5 y 2 g/L. No obstante, una concentración menor o mayor también podría emplearse.
En una realización preferida, el método de Ia invención comprende un paso adicional entre el paso (b) y el paso (c) (paso (b2)) en el que se añade una proteína. Ejemplos de proteínas que pueden emplearse en el paso (b2) del método de Ia presente invención son pero, sin limitarse, fibronectina, laminina, colágeno tipo VII o entactina, o cualquier combinación de los anteriores. Estas proteínas forman parte de Ia matriz extracelular del tejido conjuntivo de manera natural en los tejidos, por Io que las células embebidas en un tejido artificial obtenido mediante el método de Ia invención, encuentran un micro-ambiente más parecido al fisiológico, mejorando Ia adhesión, Ia diferenciación y/o Ia supervivencia de dichas células.
En una forma preferida de realización, Ia proteína que se añade en el paso (b2) es Ia fibronectina. La fibronectina es una glicoproteína presente en Ia matriz extracel ular (M EC) de Ia mayoría de los tej idos celu lares an imales desempeñando un importante papel en Ia adhesión de las células a Ia matriz. En una realización más preferida, Ia proteína añadida entre el paso (b) y el paso (c) del método de Ia invención es fibronectina. El objeto de esta adición es Ia de favorecer Ia adhesión de las células del paso (e) al producto resultante del paso (d). Por ejemplo, cuando el método de Ia invención se emplea para preparar un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial, Ia adición de fibronectina minimiza el desprendimiento de las células del epitelio corneal añadidas en el paso (e) Io que supone una importante ventaja con respecto a otros métodos descritos en el estado de Ia técnica. En una realización aún más preferida, Ia concentración de fibronectina en el producto resultante del paso (d) es de entre 0,25 y 1 g/L, opcionalmente entre 0,5 y 1 g/L. No obstante, una concentración menor o mayor también podría emplearse. En una forma preferida de realización, el método de Ia invención comprende un paso adicional (paso d2) entre los pasos (d) y (e) que comprende Ia adición de una composición que comprende una proteína al producto resultante del paso (d). Ejemplos de proteínas que pueden emplearse en el paso (e) del método de Ia presente invención son pero, sin limitarse, colágeno, reticulina o elastina. La adición de una proteína entre el paso (d) y el paso (e) da lugar a tejidos que presentan una mayor densidad fibrilar a n ivel del estroma, un mejor comportamiento viscolástico y un esfuerzo umbral creciente. En una forma de realización aún más preferida, Ia proteína que se añade en el paso (d2) es colágeno. Además, Ia adición de dichas proteínas en el paso (d2) del método de Ia invención mejora las propiedades físicas (reológicas, mecánicas o biomecánicas) del tejido artificial obtenido. En los ejemplos de esta memoria se demuestra que en tejidos artificiales que comprenden fibrina, agarosa y colágeno, empleando concentraciones crecientes de colágeno mejora el comportamiento viscoelástico, Io que se pone de manifiesto por un aumento del esfuerzo umbral dependiente de Ia concentración de colágeno.
Las principales propiedades reológicas de un material sólido o semisólido son Ia viscosidad y Ia elasticidad. La viscosidad es Ia resistencia que ofrece un fluido a Ia deformación tangencial, y sería equivalente a Ia consistencia o Ia rigidez. La elasticidad es Ia propiedad mecánica de ciertos materiales de sufrir deformaciones reversibles cuando se encuentran sujetos a Ia acción de fuerzas exteriores, y de recuperar Ia forma original cuando cesan estas fuerzas exteriores. El análisis de estos parámetros se realiza mediante reometría, técnica física que utiliza instrumentos denominados reómetros. El esfuerzo umbral es Ia energía necesaria para provocar una deformación irreversible en un sólido o un fluido. Normalmente, todos los materiales presentan una región elástica, en Ia que el esfuerzo aplicado provoca una deformación totalmente reversible cuando cesa el esfuerzo. Si ese esfuerzo supera un límite (módulo elástico), Ia deformación pasa a ser irreversible, entrando en una región plástica. Finalmente, si el esfuerzo supera el módulo plástico, el material se rompe (punto de fractura).
El colágeno es una proteína de fácil disponibilidad en Ia naturaleza y que biológicamente se caracteriza por su baja inmunicidad y elevada actividad tisular. El colágeno forma las fibras colágenas, que son flexibles, pero ofrecen gran resistencia a Ia tracción. En Ia presente invención se demuestra que los tejidos artificiales de fibrina, agarosa y colágeno presentan una mayor densidad fibrilar a nivel del estroma, un mejor comportamiento viscolástico y un esfuerzo umbral creciente según se aumenta Ia concentración de colágeno, y más elevado que los tejidos artificiales de colágeno. Por tanto, en una realización preferida Ia proteína añadida en el paso (e) es colágeno.
En una realización preferida, el colágeno añadido en el paso (d2) se selecciona de Ia lista que comprende: colágeno tipo I, colágeno tipo II, colágeno tipo III, colágeno tipo IV, colágeno tipo V, colágeno tipo Vl, colágeno tipo VII, colágeno tipo VIII, colágeno tipo IX, colágeno tipo X, colágeno tipo Xl, colágeno tipo XII, colágeno tipo XIII o cualquier combinación de los anteriores. En una realización más preferida, el colágeno añadido en el paso (e) se selecciona de Ia lista que comprende: colágeno tipo I, colágeno tipo II, colágeno tipo III, colágeno tipo IV, colágeno tipo V, colágeno tipo IX o cualquier combinación de los anteriores. La selección de un tipo particular de colágeno en el paso (e) del método de Ia invención depende del tejido artificial que se desee preparar y se realiza en función de las características de cada colágeno que son conocidas en el estado de Ia técnica.
Por ejemplo, Ia función principal del colágeno tipo I es Ia de resistencia al estiramiento, y se encuentra abundantemente en Ia dermis, el hueso, el tendón y Ia córnea. Así, en Ia presente invención se demuestra que Ia adición de colágeno tipo I en el paso (e) otorga excelentes propiedades al tejido artificial cuando se quiere preparar, por ejemplo, pero sin limitarnos un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial. Por tanto, en una realización preferida el colágeno es colágeno tipo I. En una realización aún más preferida, el colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, en el producto resultante del paso (d) está a una concentración, ventajosamente, de entre 0,5 y 5 g/L, preferiblemente, de entre 1 ,8 y 3,7 g/L, y más preferiblemente, de entre 2,5 y 3 g/L. No obstante, una concentración menor o mayor también podría emplearse. En una realización particular, el colágeno utilizado es un atelocolágeno, es decir un colágeno del cual se han eliminado las regiones terminales de estructura no helicoidal denominadas telopéptidos. Estos telopéptidos pueden hacer que el colágeno que sea insoluble y son portadores de los principales determinantes antigénicos del colágeno. El atelocolágeno se obtiene, por ejemplo, mediante tratamiento proteásico con pepsina.
Dependiendo de las concentraciones de fibrinógeno que se use en Ia etapa (a), de Ia concentración de polisacárido que se use en Ia etapa (d) y, en el caso de que es aplique un paso (d2), de Ia concentración de colágeno que se use en Ia etapa (d2), el tejido artificial resultante de Ia etapa (e) puede comprender concentraciones variables de los dos/tres componentes.
En una realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1 ,8 y 3,7 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1 ,8 y 3,7 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1 ,8 y 3,7 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 0,5 y 10 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 0,5 y 5 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1 ,8 y 3,7 g/L. En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1 ,8 y 3,7 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 1 ,8 y 3,7 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,1 y 6 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,15 y 3 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/L.
En otra realización preferida, en el producto resultante del paso (e), Ia concentración de fibrinógeno es de entre 1 y 4 g/L, Ia concentración de Ia agarosa, preferiblemente, agarosa de tipo VII, es de entre 0,25 y 2 g/L. Si se ha incluido un paso (d2), Ia concentración del colágeno, preferiblemente, colágeno tipo I, es de entre 2,5 y 3 g/L.
Mediante Ia adición a las células del paso (a) de los diferentes componentes descritos en Una vez realizados los pasos (a)-(d) del método de Ia invención, y tras dejar reposar el producto resultante del paso (e) en un soporte, se produce Ia formación de una matriz que comprende fibrina, el polisacárido y, en el caso de que se haya incluido Ia etapa (d2), Ia proteína añadida en dicho paso, en Ia que quedan embebidas dichas células y sobre Ia cual y/o en cuyo interior éstas pueden crecer. Preferiblemente, las células del paso (a) crecen en el interior de dicha matriz. Una vez realizados los pasos (a)-(d) del método de Ia invención, el producto resultante del paso (d) se deja reposar en un soporte para que se produzca Ia formación de Ia matriz que comprende Ia fibrina, el polisacárido y, dependiendo de si se ha llevado a cabo un paso (b2), de Ia proteína añadida en dicho paso, y que tiene embebidas las células del paso (a). Soportes que pueden ser empleados son, por ejemplo, pero sin limitarse, placas de cultivo tisular o insertos porosos de cultivo celular. Preferiblemente, dichos soportes estarán en condiciones de esterilidad.
El paso (e) del método de Ia invención consiste en cultivar células aisladas, preferiblemente, de un mamífero, en o sobre el producto resultante del paso (e). Dichas células pueden obtenerse mediante diferentes procedimientos descritos en el estado de Ia técnica y que pueden depender del tipo celular particular del que se trate. Algunos de estos procedimientos son, por ejemplo, pero sin limitarse, biopsia, procesado mecánico, tratamiento enzimático (por ejemplo, pero sin limitarse, con tripsina o colagenasa de tipo I), centrifugación, lisis eritrocitaha, filtración, cultivo en soportes o medios que favorezcan Ia proliferación selectiva de dicho tipo celular o inmunocitometría. Algunos de estos procedimientos se describen en detalle en los Ejemplos de esta invención.
Las células del paso (e) pueden ser células diferenciadas como, por ejemplo, pero sin limitarse, células epiteliales, o células no diferenciadas con Ia capacidad para diferenciarse en dichas células como, por ejemplo, células madre adultas.
En una realización preferida, las células diferenciadas del paso (e) son células epiteliales, como, por ejemplo, pero sin limitarse, queratinocitos, células del epitelio de Ia mucosa oral, células del epitelio de Ia vejiga, células del epitelio de Ia uretra, células del epitelio corneal o células endoteliales vasculares.
Preferiblemente, los células epiteliales del paso (e) proceden del tejido o del órgano en el que va a emplearse como sustituto el tejido artificial . Por ejemplo, cuando el método de Ia invención se emplea para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial , las células epitel iales proceden, preferiblemente, de Ia epidermis de Ia piel, es decir, son queratinocitos; cuando se emplea para preparar una tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, las células epiteliales proceden, preferiblemente, del epitelio de Ia vejiga o urotelio; cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial las células epiteliales proceden, preferiblemente, del epitelio de Ia uretra; cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial preferiblemente, las células epiteliales son células del epitelio corneal; cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de mucosa oral, preferiblemente, las células epiteliales proceden, preferiblemente, del epitelio de Ia mucosa oral.
Sin embargo, las células epiteliales del paso (e) también pueden obtenerse a partir de un tejido u órgano distinto del tejido o del órgano en el que va a emplearse como sustituto el tejido artificial. Por ejemplo, cuando el método de Ia invención se emplea para preparar un tejido sustituto de piel o una piel artificial, un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial, o un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial las células epiteliales del paso (e) pueden ser células del epitelio de Ia mucosa oral. O, por ejemplo, cuando el método de Ia invención se emplea para preparar un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial, o cuando se emplea para preparar un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial, las células epiteliales pueden ser queratinocitos.
Uno de los problemas que se asocian a Ia generación de tejido artificial en laboratorio es Ia obtención de un número significativo de células diferenciadas, por Io que con frecuencia, se considera como una fuente alternativa el uso de células madre, con capacidad para diferenciarse a dichas células. Se entiende por "célula madre" aquella que tiene una elevada capacidad para dividirse y diferenciarse morfológica y funcionalmente en distintos tipos de células más especializadas. Durante el proceso de diferenciación, una célula indiferenciada modifica su fenotipo y morfología para convertirse en una célula diferenciada, con una estructura y función especializada.
Las células madre se pueden clasificar atendiendo a su potencialidad, es decir, a su capacidad para diferenciarse en distintos tipos celulares en: (a) totipotenciales: capaces de diferenciarse tanto en tejido embrionario como en tejido extraembrionaho; (b) pluripotenciales con capacidad para diferenciarse a cualquiera de los tejidos procedentes de las tres capas embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo); (c) multipotenciales: capaces de diferenciarse a distintos tipos celulares derivados de una misma capa embrionaria (endodermo, mesodermo o ectodermo); y (d) unipotenciales: capacidad para formar un único linaje celular. Según su origen, las células madre se han dividido en: (a) embrionarias: de Ia masa celular interna del blastocisto en el estadio del embrión preimplantatoho o de Ia cresta gonadal, y que son totipotenciales o pluripotenciales; y (b) adultas: en el adulto, el feto y el cordón umbilical, y que son multipotenciales o unipotenciales. Dentro de las células madre adultas, nos encontramos con las células madre mesenquimales, que se encuentran repartidas en el tejido conectivo de diversos órganos, como, por ejemplo, pero sin limitarse, Ia médula ósea, Ia sangre periférica, el tejido adiposo o el cordón umbilical . En una realización preferida, las células madre adultas son células madre adultas de Ia médula ósea, del tejido adiposo o del cordón umbilical. El cordón umbilical constituye una interesante fuente de células madre adultas, debido a que, a diferencia de las células madre adultas obtenidas de otras fuentes; (a) su método de obtención no es invasivo ni doloroso; y (b) su capacidad proliferativa y su potencial de diferenciación no disminuye como consecuencia del proceso de envejecimiento. Entre las diferentes fuentes de células madre del cordón umbilical destacan las llamadas células madre de Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical, por: (a) su gran capacidad de proliferación y a su rapidez de expansión en cultivo; y (b) Ia baja expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase I y ausencia de expresión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad de clase II, Io que las convierte en buenas candidatas para Ia terapia celular alogénica. Por tanto, en otra realización preferida, las células del paso (e) son células madre de Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical. Estas células expresan en su superficie diversos marcadores característicos de las células mesenquimales como, por ejemplo, SH2, SH3, CD10, CD13, CD29, CD44, CD54, CD73, CD90, CD105 o CD166, y son negativos para marcadores del linaje hematopoyético, como por ejemplo, CD31 , CD34, CD38, CD40 o CD45. Las células madre de Ia gelatina de Wharton del cordón umbilical pueden diferenciarse, por ejemplo, a condroblastos, osteoblastos, adipocitos, precursores neurales, cardiomiocitos, células del músculo esquelético, células endoteliales o hepatocitos. Las células madre adultas pueden ser caracterizadas mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su estado indiferenciado, mediante diferentes procedimientos que son conocidos en el estado de Ia técnica como, por ejemplo, pero sin limitarse, inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, R T-PCR, anál isis de expresión gén ica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display.
Las células madre pueden ser inducidas a diferenciarse in vitro para dar lugar a células que expresen, al menos, una o más características propias de células d iferenciadas . Ejemplos de cél ulas d iferenciadas a las que pueden d iferenciarse las células madre, pero sin limitarse, son fibroblasto, queratinocito, célula del urotelio, célula del epitelio de Ia uretra, célula del epitelio corneal, célula del epitelio de Ia mucosa oral, condroblasto, osteoblasto, adipocito o neurona. En una realización preferida de Ia invención, Ia célula diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención expresa una o más características propias de una célula diferenciada seleccionada de Ia lista que comprende: fibroblasto, queratinocito, célula del urotelio, célula del epitelio de Ia uretra, célula del epitelio corneal, célula del epitelio de Ia mucosa oral, condroblasto, osteoblasto, adipocito o neurona.
Las células diferenciadas pueden ser caracterizadas mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su estado diferenciado, mediante diferentes procedimientos que son conocidos en el estado de Ia técnica como, por ejemplo, pero sin limitarse, inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, R T-PCR, anál isis de expresión gén ica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display. En una realización preferida, las células del paso (e) de Ia invención son de origen autólogo. No obstante, las células del paso (e) también pueden ser de origen alogénico o xenogénico.
Sobre el producto resultante del paso (d) y/o en su interior las células del paso (e) son capaces de proliferar. Preferiblemente, las células del paso (e) proliferan sobre Ia superficie del producto resultante del paso (d).
Las células del paso (e) se dejan proliferar hasta que alcanzan un número adecuado hasta que alcanzan, típicamente, al menos, un 70% de confluencia, ventajosamente, al menos, un 80% de confluencia, preferiblemente, al menos, un 90% de confluencia, más preferiblemente, al menos, un 95% de confluencia y, aún más preferiblemente, al menos, un 100% de confluencia. Durante el tiempo que las células se mantienen en cultivo, el medio de cultivo en el que se encuentran puede ser parcial o totalmente reemplazado por medio nuevo para reemplazar ingredientes agotados y eliminar metabolitos y catabol itos potencialmente dañinos. Para Ia correcta diferenciación de algunos tipos celulares puede ser necesario un paso adicional. Por ejemplo, en el caso de las células del epitelio de Ia mucosa oral, los queratinocitos o las células del epitelio corneal, puede ser necesario exponer Ia superficie epitelial al aire para promover Ia correcta estratificación y maduración del epitelio manteniendo Ia matriz que comprende las células del paso (a) sumergida en medio de cultivo (técnica aire líquido).
Por tanto, en una realización preferida, el método de Ia invención, además de los pasos (a)-(f) descritos anteriormente comprende un paso adicional en el que el producto resultante del paso (e) se expone al aire. En general, el método de Ia invención incluye este paso cuando se emplea para obtener un tejido artificial que sirva para reemplazar a un tejido natural cuyo epitelio se encuentra expuesto normalmente al contacto con el aire como, por ejemplo, pero sin limitarnos, Ia piel, Ia córnea, Ia mucosa oral, Ia uretra o Ia vagina. Preferiblemente, este paso se realiza cuando se prepara un tejido sustituto de piel o una piel artificial, o cuando se prepara un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial, o cuando se prepara un tejido sustituto de mucosa oral o una mucosa oral artificial.
Una de las innovaciones más importantes del método de Ia invención consiste en Ia existencia de un paso (f) en el que se induce Ia nanoestructuración del producto resultante del paso (e). La expresión "nanoestructuración", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a una modificación estructural consistente en Ia generación de enlaces de tamaño inferior a una miera entre las fibras de fibrina y entre éstas y las moléculas de agarosa. Este proceso de nanoestructuración permite obtener tejidos artificiales que muestran de forma inesperada propiedades ventajosas con respecto a los biomateriales no estructurados. En concreto, los biomateriales sometidos a un proceso de nanoestructuración según Ia presente invención presentan (i ) u na mejora significativa de las propiedades biomecánicas del tejido, Io que permite Ia manipulación del tejido nanoestructurado y supone una mejora sustancial y no esperada de las propiedades reológicas del biomaterial, caracteizada como una mayor resistencia (véase figura 8) y una mayor elasticicidad (véanse figuras 9 y 10); (ii) una mejora sustancial de Ia manipulabilidad del tejido nanoestructurado, Io cual permitió su manipulación quirúrgica, Ia sutura al lecho receptor y el implante en animales de experimentación, (iii) una mejora significativa de Ia transparencia de los tejidos sometidos a nanoestructuración (véase figura 11 ), Io que no es en absoluto previsible puesto que los tejidos nanoestructurados son más densos y más pobres en contenido de agua que los tejidos no nanoestructurados y (iv) una mejor resultado clínico una vez implantados en animales de laboratorio relacionado, por un lado, con Ia mayor eficacia del implante clínico debido a las adecuadas propiedades biomecánicas del biomaterial y, por otro lado, con el hecho de que los biomateriales sometidos a nanoestructuración presentan una mayor densidad de fibras por mm2 y, por tanto, presentan más lenta remodelación por parte del organismo receptor.
En una realización preferida, Ia inducción de Ia nanoestructuración del paso (f) comprende Ia deshidratación y/o Ia compresión mecánica del producto resultante del paso (e). El objetivo del paso (f) es generar una modificación estructural entre las fibras de fibrina y las moléculas de agarosa del tejido artificial para alcanzar niveles óptimos de consistencia y elasticidad, que no se obtienen mediante otros métodos descritos en el estado de Ia técnica. El resultado final es una modificación irreversible de las fibras que genera unas cualidades biomecánicas muy favorables para Ia manipulación quirúrgica y el implante clínico.
El término "deshidratación" se refiere a una eliminación parcial y/o total del fluido intersticial del producto resultante del paso (e). Por ejemplo, Ia cantidad de fluido intersticial eliminado del producto resultante del paso (e) puede ser de, al menos, un 50%, al menos, un 60%, al menos, un 70%, al menos, un 80%, al menos, un 90% o, al menos, un 99% del fluido intersticial contenido originalmente en el producto resultante del paso (e).
La deshidratación del producto resultante del paso (e) puede conseguirse por medio de cualquier procedimiento físico o qu ímico. En una realización preferida, Ia deshidratación del producto resultante del paso (e) comprende un procedimiento seleccionado de Ia lista que comprende: drenaje, evaporación, succión, presión capilar, osmosis o electro-osmosis. El líquido intersticial puede ser eliminado mediante Ia inclinación del producto resultante del paso (e); el líquido intersticial es entonces drenado debido al efecto de Ia gravedad y el gradiente.
El líquido puede ser eliminado mediante succión, Por ejemplo, aplicando vacío mediante una bomba mecánica a Ia superficie donde se encuentra el producto resultante del paso (e).
El líquido intersticial puede ser eliminado mediante evaporación, por ejemplo, incubando el producto resultante del paso (e) en condiciones que promueven Ia evaporación, por ejemplo, a una presión menor que Ia presión atmosférica y/o a una temperatura mayor que Ia temperatura ambiente.
El liquido intersticial también puede ser eliminado empleando un agente osmótico con tendencia a absorber agua como, por ejemplo, pero sin limitarse, una solución de cloruro sódico hiperosmolar, separando al producto resultante del paso (e) de esta solución med iante u na membrana semipermeable, una esponja u otro material secante.
En una realización preferida, el líquido intersticial puede ser eliminado mediante presión capilar, por ejemplo, mediante Ia aplicación de un material absorbente al producto resultante del paso (e). Algunos ejemplos de material absorbente que podrían ser empleados en el paso (f) de Ia invención, pero sin limitarse, son papel de filtro, papel 3M de Ia casa comercial Whatman, fibra de celulosa, o tela absorbente. Preferiblemente, el material absorbente estará esterilizado.
El tiempo requerido para Ia deshidratación dependerá del procedimiento o procedimientos empleados, y puede ser determinado con facilidad por un experto en Ia materia. La idoneidad del tejido artificial obtenido mediante Ia aplicación de un determinado procedimiento de deshidratación durante un determinado periodo de tiempo puede comprobarse mediante diversos métodos de evaluación conocidos en el estado de Ia técnica como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos en los ejemplos de esta memoria. El líquido intersticial también puede ser eliminado mediante Ia compresión mecánica del producto resultante del paso (e). La compresión mecánica del producto resultante del paso (e) además puede servir para dar al producto resultante del paso (e) una forma definida deseada. La compresión del producto resultante del paso (e) puede realizarse mediante cualquier procedimiento descrito en el estado de Ia técnica. Puede emplearse un procedimiento de compresión "estático", donde el producto resultante del paso (e) permanece estacionario como, por ejemplo, pero sin limitarse, Ia aplicación de una carga estática (por ejemplo, un peso muerto), un hidráulico o una leva. También puede emplearse un procedimiento de compresión "dinámico", donde el producto resultante del paso (e) se mueve durante Ia compresión como, por ejemplo, mediante Ia aplicación de uno o más rodillos o mediante Ia extrusión a través de un orificio constrictor.
La compresión mecánica del producto resultante del paso (e) puede realizarse mediante extrusión, por ejemplo, mediante el paso del producto resultante del paso (e) a través de un orificio que Io constriña, por ejemplo, una cámara cónica. La cámara cónica puede tener paredes porosas, de manera que permitiría Ia eliminación del fluido intersticial del producto resultante del paso (e) mientras éste pasa a su través. La compresión del producto resultante del paso (e) puede realizarse mediante Ia centrifugación del producto resultante del paso (e). Por ejemplo, el producto resultante del paso (e) puede colocarse sobre un tubo con el fondo poroso, de manera que, además de Ia compresión mecánica, se produciría Ia eliminación del líquido intersticial del producto resultante del paso (e). La compresión del producto resultante del paso (e) puede realizarse mediante Ia aplicación de un globo en su interior para comprimir el producto resultante del paso (e) contra una superficie sólida. La superficie sólida puede, por ejemplo, formar un tubo alrededor del producto resultante del paso (e, permitiendo Ia formación de un tejido artificial tubular. En una realización preferida, Ia compresión del producto resultante del paso (e) comprende Ia aplicación de un peso encima del producto resultante del paso (e), de manera que se ejerce una acción mecánica de presión sobre el tejido. Resulta evidente que cuanto mayor sea el peso menor será el tiempo necesario para obtener un tejido artificial con las características apropiadas. El peso empleado para Ia compresión puede tener una superficie plana o puede colocarse sobre un material que tenga una superficie plana, por ejemplo, plástico, cerámica, metal o madera.
En Ia figura 1 de Ia presente memoria se muestra un esquema no limitativo de cómo puede realizarse Ia nanoestructuración del producto resultante del paso
(e) mediante su deshidratación y compresión. En dicho esquema puede observarse como Ia nanoestructuración puede obtenerse situando el producto resultante del paso (e) entre dos papeles de filtro estéril, y colocando sobre el mismo un peso de aproximadamente 250 g (equivalente a aproximadamente 2.000 N/m2) sobre una superficie plana de vidrio estéril durante aproximadamente 10 minutos; entre el tejido y el papel de filtro sobre el que se coloca el peso se puede disponer un material poroso para evitar que el producto resultante del paso (e) se adhiera al papel de filtro. El material empleado para evitar Ia adherencia debe ser poroso para permitir Ia salida de agua desde el tejido hacia el agente deshidratante: dicho material poroso empleado para evitar Ia adherencia puede ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una membrana de policarbonato, nylon, vidrio, cerámica o metal perforado.
En una realización preferida, Ia compresión del producto resultante del paso (e) comprende Ia aplicación de una presión sobre el mismo. Preferiblemente, Ia magnitud de Ia presión es de entre 1.000 y 5.000 N/m2, más preferiblemente, de entre 1.500 y 2.500 N/m2 y, aún más preferiblemente, de aproximadamente 2.000 N/m2. La aplicación de dicha presión puede hacerse manual, automática o semi-automáticamente. El tiempo que se necesita ejercer Ia presión depende de Ia magnitud de Ia presión aplicada y puede ser determinado con facilidad por un experto en Ia materia. Resulta evidente que cuanto mayor sea Ia presión menor será el tiempo necesario para obtener un tejido artificial con las características apropiadas. La idoneidad del tejido artificial obtenido mediante Ia aplicación de una determinada magnitud de presión durante un determinado periodo de tiempo puede comprobarse mediante diversos métodos de evaluación conocidos en el estado de Ia técnica como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos en los ejemplos de esta memoria.
Para inducir Ia nanoestructuración del producto resultante del paso (e) pueden emplearse uno o más procedimientos, de manera secuencial o simultánea. El tiempo requerido para Ia nanoestructuración puede ser menor de 12 horas, menor de 6 horas, menor de 3 horas, menor de 1 hora, menor de 30 minutos, menor de 10 minutos, menor de 2 minutos o menor de 1 minuto. El tiempo requerido para Ia nanoestructuración dependerá del procedim iento o procedimientos empleados, y puede ser determinado con facilidad por un experto en Ia materia. La idoneidad del tejido artificial obtenido mediante Ia aplicación de un determinado procedimiento durante un determinado periodo de tiempo puede comprobarse mediante diversos métodos de evaluación conocidos en el estado de Ia técnica como, por ejemplo, pero sin limitarse, los descritos en los ejemplos de esta memoria.
Tejido artificial de Ia invención
Un segundo aspecto de Ia presente invención, se refiere a un tejido artificial obtenible por el método de Ia invención anteriormente descrito (de ahora en adelante, tejido artificial de Ia invención).
En una realización preferida de este segundo aspecto de Ia invención, el tejido artificial de Ia invención es un tejido sustituto de piel o una piel artificial.
En otra realización preferida de este segundo aspecto de Ia invención, es un tejido sustituto de vejiga o una vejiga artificial.
En otra realización preferida de este segundo aspecto de Ia invención, el tejido artificial de Ia invención es un tejido sustituto de uretra o una uretra artificial. En otra realización preferida de este segundo aspecto de Ia invención, el tejido artificial de Ia invención es un tejido sustituto de córnea o una córnea artificial.
En otra realización preferida de este segundo aspecto de Ia invención, el tejido artificial de Ia invención es un tejido sustituto de una mucosa o una mucosa artificial.
El tejido artificial obtenible por el método de Ia invención se puede cortar en el tamaño deseado y/o disponer en una conformación adecuada para su uso.
Previamente a su uso, puede evaluarse Ia idoneidad del tejido artificial de Ia invención para ejercer su función, por ejemplo, pero sin limitarse, mediante cualquiera de los procedimientos descritos en los ejemplos de Ia presente descripción.
Usos del tejido artificial de Ia invención en Ia evaluación de productos farmacológicos o químicos
Los fármacos y productos químicos deben ser evaluados antes de su comercialización en animales de experimentación. A este respecto, son varios los informes y directivas aprobados por Ia Unión Europea que tratan de restringir o incluso prohibir Ia experimentación con animales en el sector de los productos cosméticos (Directiva 76/768/CEE del Consejo Europeo relativa a Ia aproximación de las legislaciones de los Estados Miembros en materia de productos cosméticos), y es de esperar que Ia prohibición total sea efectiva durante los próximos años. La Unión Europea apoya todas las medidas cuyo objetivo principal sea el bienestar de los animales util izados con fines experimentales y para lograr métodos científicos de sustitución para reducir al m ínimo el número de animales util izados en experimentación (Decisión 1999/575/CE del Consejo, de 23 de marzo de 1998, relativa a Ia celebración por Ia Comunidad del Convenio Europeo sobre Ia protección de los animales vertebrados utilizados para experimentación y otros fines científicos - Diario Oficial L 222 de 24.08.1999). Por tanto, un tercer aspecto de Ia invención se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia evaluación de un producto farmacológico y/o químico.
Usos terapéuticos de los tejidos artificiales de Ia invención
Una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa, un daño físico o químico, o una interrupción del flujo sanguíneo, pueden dar lugar a una pérdida de células de un tejido o un órgano. Esta pérdida celular conllevaría una alteración de Ia función normal de dicho tejido u órgano; y por consiguiente, conduciría al desarrollo de enfermedades o secuelas físicas que merman Ia calidad de vida de Ia persona. Por tanto, es importante tratar de regenerar o y restablecer Ia función normal de dichos tejidos u órganos. El tejido o el órgano dañado pueden ser sustituidos por un tejido u órgano nuevo que haya sido fabricado en el laboratorio mediante técnicas de ingeniería tisular. El objetivo de Ia ingeniería tisular es Ia construcción de tejidos biológicos artificiales y Ia utilización con fines médicos de los mismos para restaurar, sustituir o incrementar las actividades funcionales de tejidos y órganos enfermos. La util idad terapéutica de este tipo de técnicas es prácticamente ilimitada con aplicaciones en todos los campos. El empleo de las técnicas de ingeniería tisular permite disminuir las listas de espera de tejidos y órganos, con Ia consigu iente d isminución de Ia morbi-mortal idad de Ia enfermedad en el receptor. Lógicamente, también tiene como consecuencia una disminución de Ia morbi-mortalidad en los donantes de órganos. Por otra parte, existen numerosas ventajas asociadas a Ia utilización de células o tejidos autólogos en Ia ingeniería tisular, destacando: (a) una reducción significativa del número de infecciones del donante al receptor por agentes infecciosos; y (b) Ia ausencia de rechazo inmune injerto contra huésped, por Io que el paciente no tiene necesidad de tomar tratamiento inmunosupresor, evitándose los efectos secundarios y los problemas asociados a Ia inmunodepresión.
Por tanto, un cuarto aspecto de Ia invención se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado. El tejido artificial de Ia invención puede emplearse para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de cualquier tejido u órgano enfermo o dañado de un organismo vivo. El tejido o el órgano pueden ser internos como, por ejemplo, pero sin limitarse, Ia uretra o Ia vejiga, o externos como, por ejemplo, pero sin limitarse, Ia córnea o Ia piel. En una realización preferida, el tej ido o el órgano dañado se seleccionan de Ia l ista que comprende: piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina. El tejido o el órgano pueden estar enfermos o dañados como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad, por ejemplo, pero sin limitarse, una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa; u n daño físico como un traumatismo o una intervención quirúrgica, un daño químico o una interrupción del flujo sanguíneo.
Una realización preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una piel. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una piel enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación congénita.
Una realización preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una vejiga. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una vejiga enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, una extrofia de cloaca o una microvejiga), una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una litiasis vesical.
Una realización preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una uretra. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una uretra enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, un hispospadias o un epispadias) o una estenosis.
Una realización preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una córnea. Una realización más preferida refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una córnea enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una úlcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticación, una insuficiencia l ímibica, una queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una infección , un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Una realización preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa, preferiblemente de una mucosa oral. Una realización aún más preferida se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa oral enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia ben igna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad periodontal. En una forma preferida de realización, el tejido que se usa para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa es un tejido que ha sido sometido a un paso (d2) de adición de una proteína entre el paso (d) y el paso (e). En una forma de realización aún más preferida, dicho paso se lleva a cabo mediante Ia adición de una composición que comprende colágeno al material obtenido en Ia etapa (d) tal y como se indicó en detalle anteriormente. Un quinto aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento.
Dicho medicamento es un medicamento de terapia celular somática. Se entiende por "terapia celular somática" Ia utilización de células somáticas vivas, autólogas, alogénicas o xenogénicas, cuyas características biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen Ia acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas. Un quinto aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tejido o un órgano. En una real ización preferida, el tejido o el órgano dañado se seleccionan de Ia lista que comprende: piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina.
Una realización preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un med icamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tej ido o un órgano enfermo o dañado como consecuencia de una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa, un daño físico o químico o una interrupción del flujo sanguíneo.
Una realización más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un med icamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una piel. Una realización aún más preferida se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una piel enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación congénita.
Una realización más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un med icamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una vejiga. Una realización aún más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una vejiga enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia l ista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, una extrofia de cloaca o una microvejiga), una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una litiasis vesical.
Una realización más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una uretra. Una realización aún más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una uretra enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, un hispospadias o un epispadias) o una estenosis.
Una realización más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una córnea. Una realización aún más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una córnea enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una úlcera corneal , un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticación, una insuficiencia límibica, una queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una infección, un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Una realización más preferida de este quinto aspecto se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un med icamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa, preferiblemente una mucosa oral. Una realización aún más preferida se refiere al uso del tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad fu ncional de u na m ucosa oral enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad periodontal. En una forma preferida de realización, el tejido que se para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa es un tejido que ha sido sometido a un paso (d2) de adición de una proteína entre el paso (d) y el paso (e). En una forma de realización aún más preferida, dicho paso se lleva a cabo mediante Ia adición de una composición que comprende colágeno al material obtenido en Ia etapa (d) tal y como se indicó en detalle anteriormente.
Un sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención.
Una realización preferida de este sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para su uso en terapia celular somática.
Una realización más preferida de este sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tejido o un órgano.
Una realización preferida de este sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tej ido o un órgano enfermo o dañado como consecuencia de una enfermedad infecciosa, inflamatoria, genética o degenerativa, un daño físico o químico o una interrupción del flujo sanguíneo. Una realización más preferida de este sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una piel. Una realización aún más preferida se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una piel enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación congénita.
Una realización más preferida de este sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una vejiga. Una realización aún más preferida se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una vejiga enferma o dañada como consecuencia de una d isfunción , una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia l ista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, una extrofia vesical, una extrofia de cloaca o una microvejiga), una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una litiasis vesical. Una realización más preferida de este sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una uretra. Una realización aún más preferida se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una uretra enferma o dañada como consecuencia de una disfunción , una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia l ista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita (como por ejemplo, pero sin limitarse, un hispospadias o un epispadias) o una estenosis. Una realización más preferida de este sexto aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una córnea. Una realización aún más preferida se refiere a una composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una córnea enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una úlcera corneal , un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, un traumatismo, una causticación, una insuficiencia límibica, una queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una infección, un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
Una realización más preferida de este quinto aspecto se refiere a u na composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa, preferiblemente una mucosa oral. Una realización aún más preferida se refiere una composición farmacéutica que comprende el tej ido artificial de Ia invención para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa oral enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad periodontal. En una forma Ia composición farmacéutica que comprende el tejido artificial de Ia invención para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de una mucosa o de una mucosa oral es un tejido que ha sido sometido a un paso (d2) de adición de una proteína entre el paso (d) y el paso (e). En una forma de realización aún más preferida, dicho paso se lleva a cabo mediante Ia adición de una composición que comprende colágeno al material obtenido en Ia etapa (d) tal y como se indicó en detalle anteriormente.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición farmacéutica comprende el tejido artificial de Ia invención, y además, un vehículo farmacéuticamente aceptable. En otra realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición farmacéutica comprende el tejido artificial de Ia invención, y además, otro principio activo. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia composición farmacéutica comprende el tejido artificial de Ia invención y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo. Como se emplea aqu í, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto d iferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a Ia estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales.
Las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. PROTOCOLO DE ELABORACIÓN DE UN PRODUCTO DE PIEL HUMANA ARTIFICIAL. A. -Obtención de muestras de piel humana.
Se utilizan muestras de piel de espesor total obtenidas de donantes bajo anestesia local y locoregional. Una vez obtenida Ia muestra de forma estéril, con Ia ayuda de unas tijeras se eliminará el tejido graso subcutáneo hasta dejar expuesta Ia capa de dermis. A continuación, los tejidos extraídos serán introducidos inmediatamente en medio de transporte estéril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con antibióticos (500 U/ml de penicilina G y 500 μg/ml de estreptomicina) y antimicóticos (1 ,25 μg/ml de anfotericina B) para evitar una eventual contaminación de Ia muestra. B.- Generación de cultivos primarios de f ibroblastos y queratinocitos.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deberán ser lavadas dos veces en una solución estéril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 μg/ml y 1 ,25 μg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extraños que pudieran encontrarse adheridos a las muestras.
En primer lugar, para separar Ia dermis de Ia epidermis, las muestras se incuban a 370C en una solución estéril con dispasa Il a 2mg/ml en PBS. De este modo, se consigue disgregar Ia membrana basal sobre Ia cual se ancla el ep itel io a Ia d erm is , por Io q ue tras esto se con seg u irá separar mecánicamente por un lado el epitelio y por otro Ia dermis.
Una vez separado, el epitelio correspondiente a Ia epidermis, se fragmenta éste con tijeras hasta obtener pequeños fragmentos para posteriormente incubarlos en una solución de tripsina-EDTA. Con Ia ayuda de una pipeta empapada en tripsina-EDTA se transfiere este epitelio a un frasco con agitador magnético previamente esterilizado. Agregar unos 2,5 mi de tripsina- EDTA al frasco con agitador e incubar a 370C durante 10 minutos para separar enzimáticamente los queratinocitos de Ia epidermis. Transcurrido este tiempo, se recoge Ia tripsina que contenía los queratinocitos individualizados en un tubo cónico de 50 mi con ayuda de una pipeta, procurando no arrastrar con ella fragmentos de epitelio. Neutralizar con igual cantidad de medio de cultivo suplementado con un 10% de suero bovino fetal y se centrifugar durante 10 minutos a 1000 rpm . El pellet resultante que contiene gran cantidad de queratinocitos individualizados se resuspende en 2-3 mi de medio de cultivo de queratinocitos, el cual favorece preferentemente el crecimiento de las células epiteliales sobre los fibroblastos. Este medio está compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F-12, todo ello suplementado con un 10% de suero bovino fetal, anti bióticos-anti m icóticos (100 U/ml de penicilina G, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B), 24 μg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 5 μg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1 ,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colérica.
Para llevar a cabo Ia digestión de Ia matriz extracelular de Ia dermis de Ia piel y conseguir Ia separación de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben ser incubadas a 370C en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostridium hystoliticum a 2mg/ml en medio de cultivo
DMEM sin suero bovino fetal durante 6 horas. Esta solución es capaz de digerir el colágeno de Ia dermis y liberar los fibroblastos estromales. Para Ia obtención de cultivos primarios de fibroblastos, se debe centrifugar a 1 .000 rpm durante 10 minutos Ia solución de digestión que contiene las células estromales disgregadas de Ia dermis y el pellet celular correspondiente a los fibrobastos se cultiva en frascos de cultivo de 15 cm2 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa suplementado con antibióticos y antimicóticos (1 00 U/ml de penicil ina G, 1 00 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10%. A este medio básico de cultivo Io denominamos medio de fibroblastos.
En todos los casos, las células serán incubadas a 370C con un 5% de dióxido de carbono, en condiciones estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada tres días. C- Subcultivo de las células procedentes de cultivos primarios de piel.
Una vez alcanzada Ia confluencia celular, los distintos cultivos celulares de fibroblastos o queratinocitos se deben lavar con PBS estéril e incubarse en 1 - 3 mi de una solución de tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l a 370C durante 10 minutos. Así se consigue disgregar los mecanismos de adhesión celular y obtener células individualizadas y no adheridas a Ia superficie del frasco de cultivo de queratinocitos y dermis.
Para el caso de Ia dermis, una vez que las células se desprenden de Ia superficie de los frascos de cultivo, se procede a inactivar Ia tripsina utilizada mediante adición de 10 mi de medio de cultivo de fibroblastos. La presencia de abundantes proteínas séricas es capaz de inactivar Ia acción proteolítica de Ia tripsina. En los queratinocitos, se utiliza el medio de cultivo de queratinocitos.
Posteriormente, las soluciones de queratinocitos y de fibroblastos en las cuales se localizan las células desprendidas, se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener un pellet o botón celular con las células de interés, desechándose el sobrenadante con Ia tripsina. El pellet celular se resuspende cuidadosamente en 5 mi de medio de cultivo y estas células se cultivan en frascos de cultivo de 15, 25 o 75 cm2 de superficie. Habitualmente, los cultivos de queratinocitos se expanden hasta aproximadamente cinco veces en nuevos frascos de cultivo.
En todos los casos, y para asegurar una adecuada viabilidad celular, Ia elaboración de sustitutos de piel se llevó a cabo utilizando células correspond ¡entes a los cuatro primeros subcultivos.
D.- Construcción de productos de piel humana artificial basados en fibrina y agarosa mediante ingeniería tisular.
1 - Generación de sustitutos de Ia dermis con fibroblastos inmersos en su espesor utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos dérmicos se generarán directamente sobre insertos porosos de 0,4 μm de diámetro para permitir el paso de nutrientes pero no de las propias células. Para preparar 10 mi de sustituto dérmico se procederá del siguiente modo:
- Obtención de 7,6 mi de plasma sanguíneo humano procedente de donación (posibilidad de origen autólogo).
- Adición de 150.000 fibroblastos de Ia piel humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 μl de medio de cultivo DMEM.
-Adición de 150 μl de ácido tranexámico para evitar Ia fibrinolisis del gel de fibrina.
Adición de 1 mi de CICa2 al 1 % para inducir Ia reacción de coagulación y generar una red de fibras de fibrina.
Adición rápida de 0,5 mi de agarosa tipo VII al 2% disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión y mezclado suave mediante agitación. La concentración final de agarosa en Ia mezcla será del 0,1 %. El rango de concentraciones de agarosa que permite productos dérmicos viables oscila entre y 0,025% y 0,3% y deberá establecerse en relación con el paciente objeto de su utilización.
Alicuotar Io antes posible en los insertos porosos de cultivo celular. Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2- Desarrollo de una capa de epitelio (epidermis) en Ia superficie del sustituto dérmico mediante subcultivo de los queratinocitos sobre el sustituto dérmico. Cubrir con medio de cultivo específico para queratinocitos. 3- Mantener en incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células epiteliales alcanzan Ia confluencia en Ia superficie del sustituto dérmico (alrededor de una semana).
4- Exponer Ia superficie epitelial al aire (técnica aire líquido) manteniendo el sustituto dérmico sumergido en medio de cultivo para promover Ia estratificación y Ia maduración de Ia epidermis (alrededor de una semana).
5- Extraer el producto de piel humana artificial de Ia superficie de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre Ia superficie del sustituto de piel para evitar que Ia capa epitelial del sustituto de piel se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto de piel cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre éste (Figura 1 ). Todo el proceso se ha de llevar a cabo en campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir sign ificativamente los niveles de hidratación del producto para alcanzar niveles óptimos de consistencia y elasticidad.
EVALUACIÓN DEL PRODUCTO DE PIEL HUMANA ARTIFICIAL (Figura 2):
1) Análisis microscópico del producto de piel artificial humana (control de calidad histológico). La evaluación de los productos de piel artificial reveló que Ia estructura de éstos presentaba numerosas similitudes con Ia piel humana nativa normal, aunque el tiempo de desarrollo en cultivo influ ía directamente sobre Ia estructura de estos productos artificiales. En concreto, el análisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas reveló Io siguiente:
Evaluación in vitro (Figura 2A):
• Los productos de piel evaluados a Ia semana de su elaboración presentaron una gruesa capa estromal en Ia que existe una abundante población de fibroblastos en proliferación. Sobre Ia superficie de este sustituto estromal, se apreció una única capa de células epiteliales.
• En Ia segunda semana de desarrollo en cultivo, se observó un mayor número de células en el estroma, así como una estratificación inicial del epitelio, formándose una o dos hileras de queratinocitos en su superficie.
• A partir de este momento continúa Ia proliferación de queratinocitos, observándose en Ia tercera semana una nueva hilera de células en el epitelio.
• En Ia cuarta semana existía un total de 3 a 4 hileras de células, pero no fue posible distinguir los distintos estratos del epitelio. No se apreciaron papilas, anejos cutáneos o estrato córneo.
Evaluación in vivo (Figura 2B): Al contrario de Io que se observó en los productos de piel artificial mantenidos en cultivo, Ia piel artificial implantada en un modelo animal presentó muy adecuados niveles de estructuración y diferenciación tisular, tal como se describe a continuación.
• En el día diez tras haber realizado Ia implantación del producto en el ratón se pudo observar Ia presencia de una dermis muy rica en células y con algunas fibras y material extracelular desorganizado. Destaca Ia presencia de infiltrados leucocitahos en Ia dermis, así como Ia neoformación de un tejido vascular importante comprendiendo arteholas, vénulas y capilares. A nivel epitelial, se observan entre tres y cinco capas celulares, no apreciándose de forma clara los estratos espinoso y granuloso, aunque sí el basal y un estrato córneo incipiente. De igual modo, se evidencia una línea dermoepidérmica homogénea, aunque sin Ia presencia de papilas ni anejos cutáneos.
• Tras veinte días del implante en los animales atímicos, se apreció una disminución en Ia concentración de fibroblastos y leucocitos de Ia dermis, así como un aumento significativo del contenido fibrilar en Ia dermis. De igual modo, se observó Ia existencia de entre cuatro y seis capas de queratinocitos epidérmicos, distinguiéndose en este momento cuatro estratos diferenciados: basal, espinoso, granuloso y córneo, siendo el estrato espinoso el menos evidente de los cuatro. Al igual que a los diez días de evolución, se aprecia una línea dermoepidérmica homogénea, aunque sin Ia presencia de papilas ni anejos cutáneos.
• En Ia muestra del día treinta se observó un mayor contenido fibrilar en Ia dermis que días anteriores, apreciándose ya gran cantidad de estratos en el epitelio, existiendo entre seis y nueve capas de queratinocitos, con una clara diferenciación de estratos epiteliales (basal, espinoso, granuloso y córneo).
Tampoco se apreciaron papilas ni anejos cutáneos.
• El día cuarenta de evolución in vivo, se observó un mayor contenido en fibras en el estrato dérmico, estabil izándose el número de capas de queratinocitos del epitelio (entre seis y nueve). No se evidenciaron papilas en unión dermoepidérmica ni anejos cutáneos.
2) Análisis inmunohistoquímico del producto de piel artificial humana (Figura 2C).
El análisis de Ia expresión de citoqueratinas (pancitoqueratina, citoqueratina 1 y citoqueratina 10), filagrina e involucrina de los controles de piel humana normal y los productos de piel obtenidos en el laboratorio, nos permitió determinar un patrón específico de expresión de estas proteínas para cada tipo de muestra, demostrándose que Ia piel humana artificial es capaz de expresar las mismas proteínas de superficie que Ia piel humana normal. EJEMPLO 2. ELABORACIÓN DE UN PRODUCTO DE PIEL HUMANA ARTIFICIAL UTILIZANDO CÉLULAS MADRE DE LA GELATINA DE WHARTON.
A. -Obtención de muestras de piel y de cordón umbilical humano. Se utilizan muestras de piel de espesor total obtenidas de donantes bajo anestesia local y locoregional. Una vez obtenida Ia muestra de forma estéril, con Ia ayuda de unas tijeras se eliminará el tejido graso subcutáneo hasta dejar expuesta Ia capa de dermis. A continuación, los tejidos extraídos serán introducidos inmediatamente en medio de transporte estéril constituido por med io de Eagle modificado por Dulbecco (DM EM) suplementado con antibióticos (500 U/ml de penicilina G y 500 μg/ml de estreptomicina) y antimicóticos (1 ,25 μg/ml de anfotericina B) para evitar una eventual contaminación de Ia muestra.
Los cordones umbilicales utilizados se obtienen de partos por cesárea de mujeres gestantes a término. Después de cada nacimiento, se obtiene un fragmento de 10-15 cm del cordón umbilical, el cual es inmediatamente conducido al laboratorio en medio de transporte similar al que se usa para Ia piel.
B.- Generación de cultivos primarios de fibroblastos y de células madre de Ia gelatina de Wharton.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deberán ser lavadas dos veces en una solución estéril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 μg/ml y 1 ,25 μg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extraños que pudieran encontrarse adheridos a las muestras. Posteriormente, se procesa cada tipo de muestra de forma independiente:
- En el caso de Ia piel, en primer lugar se procede a separar Ia dermis de Ia epidermis mediante incubación de las muestras a 370C en una solución estéril con dispasa Il a 2mg/ml en PBS. De este modo, se consigue disgregar Ia membrana basal sobre Ia cual se ancla el epitelio a Ia dermis, por Io que tras esto se conseguirá separar mecánicamente por un lado el epitelio y por otro Ia dermis.
Para llevar a cabo Ia digestión de Ia matriz extracelular de Ia dermis de Ia piel y conseguir Ia separación de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben ser incubadas a 370C en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostrídium hystoliticum a 2mg/ml en medio de cultivo DMEM sin suero bovino fetal durante 6 horas. Esta solución es capaz de digerir el colágeno de Ia dermis y liberar los fibroblastos estromales. Para Ia obtención de cultivos primarios de fibroblastos, se debe centrifugar a 1 .000 rpm durante 10 minutos Ia solución de digestión que contiene las células estromales disgregadas de Ia dermis y el pellet celular correspondiente a los fibrobastos se cultiva en frascos de cultivo de 15 cm2 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa suplementado con antibióticos y antimicóticos (100 U/ml de penicilina G, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10%. A este medio básico de cultivo Io denominamos medio de fibroblastos.
- En el caso del cordón umbilical, las muestras se seccionan long itud i nalmente a través de Ia vena umbilical. Se retiraran cuidadosamente las arterias y Ia vena u m bil ical para separar Ia gelatina de Wharton. Posteriormente, se fragmenta Ia gelatina hasta convertirla en fragmentos de tejido muy pequeño. Estos fragmentos de gelatina de Wharton se incuban en 30 mi de colagenasa tipo I (Gibco BRL Life Technologies, Karlsruhe, Alemania) a 370C en agitación durante aproximadamente 4-6 horas, para posteriormente recoger las células disociadas mediante centrifugación durante 7 min a 1050 revoluciones por minuto (rpm). A continuación, se elimina cuidadosamente el sobrenadante y se resuspende el pellet celular en 5-10 mi de tripsina prediluida (Sigma-Aldrich). De nuevo, se incuba a 370C en un baño de agitación durante 30 minutos. Después, se neutralizaron los efectos de Ia tripsina añadiendo 10-20 mi de medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal al 10%, centrifugándose de nuevo a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener las células aisladas. Finalmente, se resuspenden estas células en medio de cultivo Amniomax en un frasco de cultivo de 25 cm2.
En todos los casos, las células serán incubadas a 370C con un 5% de dióxido de carbono, en condiciones estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada tres días.
C- Subcultivo de las células procedentes de cultivos primarios de piel y de células madre de Ia gelatina de Wharton.
Una vez alcanzada Ia confluencia celular, los distintos cultivos celulares de fibroblastos o células madre de Ia gelatina de Wharton se deben lavar con PBS estéril e incubarse en 1 -3 mi de una solución de tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l a 370C durante 10 minutos.
Así se consigue disgregar los mecanismos de adhesión celular y obtener células individualizadas y no adheridas a Ia superficie del frasco de cultivo. Una vez que las células se desprenden de Ia superficie de los frascos de cultivo, se procede a inactivar Ia tripsina utilizada mediante adición de 10 mi de medio de cultivo de fibroblastos. La presencia de abundantes proteínas séricas es capaz de inactivar Ia acción proteolítica de Ia tripsina.
Posteriormente, las soluciones en las cuales se localizan las células desprendidas, se centrifugan a 1000 rpm durante 10 minutos para obtener un pel let o botón cel u lar con las cél ulas de interés, desechándose el sobrenadante con Ia tripsina. El pellet celular se resuspende cuidadosamente en 5 mi de medio de cultivo y estas células se cultivan en frascos de cultivo de 15, 25 o 75 cm2 de superficie. Habitual mente, los cu ltivos de q uerati nocitos se expanden hasta aproximadamente cinco veces en nuevos frascos de cultivo.
D.- Construcción de productos de piel humana artificial basados en fibrina y agarosa mediante ingeniería tisular. 1 - Generación de sustitutos de Ia dermis con fibroblastos inmersos en su espesor utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos dérmicos se generarán directamente sobre insertos porosos de 0,4 μm de diámetro para permitir el paso de nutrientes pero no de las propias células. Para preparar 10 mi de sustituto dérmico se procederá del siguiente modo:
- Obtención de 7,6 mi de plasma sanguíneo humano procedente dedonación (posibilidad de origen autólogo).
- Adición de 150.000 fibroblastos de Ia piel humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 μl de medio de cultivo DMEM.
- Adición de 150 μl de ácido tranexámico para evitar Ia fibrinolisis del gel de fibrina.
- Adición de 1 mi de CICa2 al 1 % para inducir Ia reacción de coagulación y generar una red de fibras de fibrina.
- Adición rápida de 0,5 mi de agarosa tipo VI I al 2% disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión y mezclado suave mediante agitación. La concentración final de agarosa en Ia mezcla será del 0,1 %. El rango de concentraciones de agarosa que permite productos dérmicos viables oscila entre y 0,025% y 0,3% y deberá establecerse en relación con el paciente objeto de su utilización.
- Alicuotar Io antes posible en los insertos porosos de cultivo celular.
- Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2- Desarrollo de una capa de epitelio en Ia superficie del sustituto dérmico mediante subcultivo de las células madre de Ia gelatina de Wharton sobre el sustituto dérmico. Cubrir con medio de cultivo específico para queratinocitos. Este medio está compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F-1 2, todo ello suplementado con un 10% de suero bovino fetal, anti bióticos-anti m icóticos (100 U/ml de penicilina G, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B), 24 μg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 5 μg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1 ,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colérica.
3- Mantener en incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células epiteliales alcanzan Ia confluencia en Ia superficie del sustituto dérmico (alrededor de una semana).
4- Exponer Ia superficie epitelial al aire (técnica aire líquido) manteniendo el sustituto dérmico sumergido en medio de cultivo para promover Ia estratificación y Ia maduración del epitelio de Ia capa superficial (alrededor de una semana).
5- Extraer el producto de piel humana artificial de Ia superficie de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre Ia superficie del sustituto de piel para evitar que Ia capa epitelial del sustituto de piel se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto de piel cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre éste (Figura 1 ). Todo el proceso se ha de llevar a cabo en campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratación del producto para alcanzar niveles óptimos de consistencia y elasticidad. EVALUACIÓN DEL PRODUCTO DE PIEL HUMANA ARTIFICIAL CON CÉLULAS DE LA GELATINA DE WHARTON (Figura 3):
1) Determinación de Ia viabilidad de las células madre de Ia gelatina de Wharton (control de calidad microanalítico) (Figura 3A). La determinación de Ia viabilidad celular mediante las técnicas microanálisis de energ ía d ispersiva de rayos X nos permite determinar el perfil de concentración iónica intracelular Na, Mg, P, Cl, K, S y Ca), y por tanto conocer el subcultivo más adecuado para su utilización posterior en Ia construcción de tejidos artificiales. Para ello es necesario realizar Ia siguiente metodología. a) Cultivo de las células sobre rejillas de oro previamente recubiertas con una capa de resina (pioloform). Alcanzada Ia subconfluencia de las células, las rejillas se lavan con agua destilada a 4o C durante 10 segundos para eliminar el medio de cultivo. b) Criofijación de las células en nitrógeno líquido. c) Desecación de las muestras criofijadas mediante Ia técnica de freeze- drying en vacío a baja temperatura (-1000C) durante 20 horas. La criofijación se realizara en un aparato de congelación-desecación Polaron E5300. d) Montaje de las muestras criofijadas y desecadas en portamuestras específicos. e) Recubrimiento de las células con carbón en un Sputtering Polaron E-5000. f) Observación en un Microscopio Electrónico de Barrido Philips XL-30 equipado con un Detector de Energía Dispersiva de rayos X (EDAX), y un detector de electrones retrodispersados. g) Análisis Microanalítico Cualitativo utilizando las siguientes constantes: voltaje 10 Kv, aumentos 10.000 x, ángulo de superficie 0o, ángulo de percepción .35°, 500cps, tiempo de acumulación de cuentas: 200 segundos. De este modo, se obtienen los espectros cualitativos para cada célula estudiada. En dichos espectros se seleccionan los niveles de Na, Mg, P, Cl, K, Ca en sus orbitales K contabilizándose las cuentas por segundo (CPS), el background (BKGD), fondo o radiaciones no características y el índice pico/fondo (P/B). h) Análisis Microanalítico Cuantitativo. En primer lugar, se cuantifican las concentraciones de los elementos Na, Mg, P, Cl, S, K, y Ca en mmol/Kg de peso seco mediante una modificación del método de Hall (Hall et al., 1973; Staham y Pawley, 1978). Para ello, se utilizan sales estándares de Na, Mg, P, Cl, K, S y Ca disueltas en dextrano al 20 % (300.000 Dalton), obteniéndose una curva o recta patrón. Estas sales se tratan del mismo modo que los especímenes a analizar. Finalmente, se calculan las concentraciones de cada uno de los elementos analizados utilizando el método de Ia regresión lineal a partir de las curvas patrón. Los resultados obtenidos tras Ia cuantificación de los niveles iónicos en las células madre de Ia gelatina de Wharton ponen de manifiesto que los niveles más elevados del índice K/Na corresponden a los subcultivos cuarto y quinto y por tanto, éstos se consideran los más idóneos para su utilización en Ia fabricación de piel humana mediante ingeniería tisular. 2) Análisis microscópico de los productos de piel artificial humana (control de calidad histológico) (Figura 3B).
La evaluación de los productos de piel artificial humana con células de Ia gelatina de Wharton reveló que Ia estructura de éstos presentaba numerosas similitudes con Ia piel humana nativa normal, aunque el tiempo de desarrollo en cultivo influía directamente sobre Ia estructura de estos tejidos artificiales. En concreto, el análisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas reveló Ia formación progresiva de hasta 5 capas de epitelio en Ia superficie del constructo, aunque las uniones intercelulares no se formaron hasta las últimas fases. Posteriormente, Ia evaluación in vivo de los productos de piel humana generada con células madre de Ia gelatina de Wharton mostró el desarrollo de una gruesa capa de epitelio sobre el estroma artificial, formándose numerosas uniones intercelulares tipo desmosoma y una membrana basal bien constituida. Todo ello resultθ en un producto de piel artificial indistinguible de Ia piel humana nativa normal, demostrando Ia utilidad del producto generado. 3) Análisis inmunohistoquímico del producto de piel artificial humana (Figura 3C).
El análisis de Ia expresión de citoqueratinas (pancitoqueratina, citoqueratina 1 y citoqueratina 10), filagrina e involucrina de los controles de piel humana normal y los productos de piel obtenidos en el laboratorio a partir de células madre de Ia gelatina de Wharton, nos permitiθ determinar un patrθn específico de expresión de estas proteínas para cada tipo de muestra, demostrándose que los productos de piel humana artificial son capaces de expresar las mismas proteínas de superficie que Ia piel humana normal. EJEMPLO 3. ELABORACIÓN DE CÓRNEAS ARTIFICIALES.
PROTOCOLO DE ELABORACIÓN DE CÓRNEAS ARTIFICIALES:
El protocolo que a continuación se expone es semejante en el producto corneal humano y animal, a excepción de Ia incorporación del estrato endotelial en el producto corneal animal. A. Generación de cultivos primarios de células de Ia córnea. Para establecer cultivos primarios de epitelio corneal, queratocitos estromales y endotel io corneal , si procede, se util izaron los siguientes métodos y protocolos:
- Obtención de una biopsia del limbo esclero-corneal bajo anestesia local o general y transporte al laboratorio en suero fisiológico estéril.
- Tallado quirúrgico de Ia córnea para eliminar restos de iris, conjuntiva y coágulos sanguíneos.
- En el producto corneal animal, disección quirúrgica de Ia membrana de Descemet para aislamiento de las células epiteliales, las cuales se cultivan en medio para células endoteliales. La composición de este medio es Ia siguiente: 3 partes de medio DMEM y una parte de medio Ham F-12, todo ello suplementado con un 10% de suero bovino fetal, anti bióticos-anti m icóticos, 24 μg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 5 μg/ml de insulina, 1 ,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colérica.
- Disección de 2 mm de córnea central e incubación en colagenasa I al 2% durante 6 h a 370C. Centrif ugación a 1000 rpm durante 10 min para recoger las células madre adultas del estroma corneal (queratocitos), las cuales se cultivarán en medio DMEM (Dulbecco's modified Eagle's médium) con un 10% de suero bovino fetal y antibióticos.
- Fragmentación del limbo esclero-corneal en pequeños explantes de alrededor de 1 mm y cultivo de estos explantes directamente sobre Ia superficie de frascos de cultivo para Ia obtención de cultivos primarios de células epiteliales corneales. El medio de cultivo a utilizar (medio de células epiteliales) está compuesto por 3 partes de medio DMEM y una parte de medio Ham F-12, todo ello suplementado con un 10% de suero bovino fetal, anti bióticos-anti m icóticos, 24 μg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 5 μg/ml de insulina, 1 ,3 ng/ml de triyodotironina, 8 ng/ml de toxina colérica y 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF).
Todos los cultivos se mantienen en un incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células alcanzan Ia confluencia en cultivo.
B. Construcción en laboratorio de los productos corneales mediante ingeniería tisular.
1 - Subcultivo de las células endoteliales previamente aisladas utilizando para ello insertos porosos de 0,4 μm de diámetro para permitir el paso de nutrientes pero no de las propias células. Las células seleccionadas deben pertenecer al cuarto subcultivo (máxima viabilidad de las células endoteliales). Este primer paso sólo se realizará para Ia generación del producto corneal animal trilaminar. 2- Generación de sustitutos del estroma corneal con queratocitos inmersos en su espesor utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa sobre los insertos porosos de 0,4 μm de diámetro (este será el primer paso en el caso del producto corneal humano bilaminar). Para preparar 10 mi de sustituto estromal:
- Obtención de 7,6 mi de plasma sangu íneo humano procedente de donación (posibilidad de origen autólogo).
- Adición de 150.000 queratocitos humanos previamente cultivados y resuspendidos en 750 μl de medio de cultivo DMEM.
- Adición de 150 μl de ácido tranexámico para evitar Ia fibrinolisis del gel de fibrina.
- Adición de 10 μl de fibronectina a una concentración de 500 mg/ml. El objeto es favorecer Ia adhesión de las células del epitelio de superficie al sustituto estromal, eliminando el riesgo de desprendimiento existente en los productos corneales actualmente desarrollados.
- Adición de 1 mi de CICa2 al 1 % para inducir Ia reacción de coagulación y generar una red de fibras de fibrina.
- Adición rápida de 0,5 mi de agarosa tipo VII al 2% disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión y mezclado suave mediante agitación. La concentración final de agarosa en Ia mezcla será del 0,1 %.
El rango de concentraciones de agarosa que permite productos corneales viables oscila entre y 0,025% y 0,3% y deberá establecerse en relación con el paciente objeto de su utilización.
- Alicuotar Io antes posible en los insertos porosos de cultivo celular.
- Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
3- Desarrollo de una capa de epitelio corneal en Ia superficie del sustituto del estroma corneal mediante subcultivo de las células epiteliales corneales sobre el sustituto estromal. Cubrir con medio de cultivo específico para células epiteliales. 4- Mantener en incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células epiteliales alcanzan Ia confluencia en Ia superficie del sustituto estromal (alrededor de una semana).
5- Exponer Ia superficie epitelial al aire (técnica aire líquido) manteniendo el sustituto estromal sumergido en medio de cultivo para promover Ia estratificación y Ia maduración del epitelio corneal (alrededor de una semana).
6- Extraer el producto de córnea humana artificial de Ia superficie de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre Ia superficie del sustituto corneal para evitar que Ia capa epitelial del sustituto corneal se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto corneal cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre éste (Figura 1 ). Todo el proceso se ha de llevar a cabo en campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratación del producto para alcanzar niveles óptimos de consistencia y elasticidad. EVALUACIÓN DE LOS PRODUCTOS CORNEALES (Figura 4):
1) Análisis microscópico e inmunohistoquímico de los productos corneales (control de calidad histológico) (Figura 4A).
El análisis microscópico reveló que los productos corneales generados mediante ingeniería tisular eran estructuralmente análogos a las córneas nativas utilizadas como control. En concreto, se pudo apreciar un epitelio corneal bien formado, con abundantes uniones intercelulares y un estroma compuesto por numerosas fibras de fibrina entre las que se disponían los queratocitos. Todo ello sugiere que los productos corneales artificiales bi o trilaminares construidos en base al protocolo arriba expuesto, son compatibles con córneas humanas y animales ortotípicas.
En Io que respecta a Ia estructura del epitelio de los productos corneales, es de destacar el hecho de que todas las células del epitelio expresaron elevados niveles de citoqueratinas típicas y exclusivas del epitelio corneal
(CK3 y CK1 2), Io cual sugiere que estas células podrían ser funcionales in vitro. Del mismo modo, el análisis de proteínas relacionadas con uniones intercelulares reveló Ia expresión secuencial de diversos componentes de los desmosomas (placoglobina, desmogleína 3 y desmoplaquina), las uniones estrechas (ZO-1 y ZO-2) y las uniones comunicantes gap (conexina 37) a nivel epitelial, siendo todo ello similar a Ia córnea nativa normal.
2) Control de calidad reológico (Figura 4B).
El análisis de las propiedades mecánicas de los productos corneales artificiales bi o trilaminares construidos en base al protocolo arriba expuesto mostró un comportamiento viscoelástico de dichos tejidos, con un módulo de elasticidad creciente en las córneas con mayor contenido en agarosa y un punto de fractura sign if ¡cativamente menor cuando Ia agarosa se utilizó a menores concentraciones. Los análisis de viscosimetría y punto de fractura revelaron que las características físicas de los productos de fibrina y agarosa eran superiores a aquéllos que sólo contenían fibrina o colágeno. Todo ello sugiere que las propiedades físicas de las córneas de fibrina y agarosa son óptimas y, en parte, similares a las de las córneas humanas normales utilizadas como control.
3) Control de calidad óptico (Figura 4C). Las propiedades ópticas de los productos corneales artificiales fueron adecuadas para un tejido que ha de cumplir las funciones de Ia córnea humana o animal. En concreto, los análisis de transmitancia espectral mostraron que los productos corneales tendían a mostrar niveles muy adecuados de transparencia, comparables a los de Ia córnea humana normal, con niveles de scattehng muy similares. Además, los coeficientes de absorción, dispersión y extinción de los productos de fibrina y agarosa fueron superiores que aquéllos obtenidos con los tejidos de fibrina. Sin embargo, Ia absorbancia para longitudes de onda pequeñas (rango de los ultravioletas) fue menor en los productos corneales artificiales bi o trilaminares que en los controles, Io cual sugiere Ia necesidad de utilizar filtros para Ia luz ultravioleta en este tipo de productos. En suma, Ia translucidez de los productos corneales fue aceptable, especialmente en aquellos productos cuyo espesor no superaba los 0,7 mm. 4) Control de calidad genético (Figura 4C y 4D).
Para el análisis de expresión génica se extrajo el ARN total de los cultivos corneales primarios de células epiteliales y queratocitos estromales humanos y de los productos corneales artificiales bilaminares humanos, analizándose éste mediante microarray (Affymetrix Human Genome U133 plus 2.0®). Este análisis demostró que los genes que se expresaban en los productos corneales artificiales humanos eran compatibles con una función corneal normal, aunque numerosos genes relacionados con el desarrollo tisular estaban sobreexpresados en relación con Ia córnea normal. En concreto, los productos corneales artificiales expresaron un gran número de genes cuya función se centraba en el establecimiento de uniones intercelulares (conexinas, integrinas, desmoplaquina, placoglobina, etc.), desarrollo epitelial (Sema3A, RUNX2, TBX1 ), diferenciación celular (PLXNA4A, FLG, DKK4, DCN), membrana basal (lamin inas, colágeno IV), matriz extracelular (colágenos, decorina, biglicán, MMP, fibronectina), etc. Estos resultados sugieren que los productos corneales construidos podrían estar experimentando un proceso de desarrollo similar al que ocurre en Ia córnea normal y que las funciones génicas expresadas por estos productos son compatibles con Ia normalidad.
4) Evaluación in vivo (Figura 4E). Para evaluar el comportamiento clínico de los productos corneales artificiales, se procedió al implante de 6 córneas humanas bilaminares de espesor parcial en conejos de laboratorio y a su seguimiento evolutivo durante 6 meses. Los resultados de este ensayo muestran adecuados niveles de biocompatibilidad, con total ausencia de inflamación o infección, manteniendo buenos niveles de transparencia. Todo esto sugiere que los productos corneales generados mediante ingeniería tisular podrían presentar utilidad potencial desde un punto de vista clínico y farmacológico experimental.
EJEMPLO 4. ELABORACIÓN DE UN PRODUCTO DE URETRA HUMANA ARTIFICIAL.
PROTOCOLO DE ELABORACIÓN DE UN PRODUCTO DE URETRA HUMANA ARTIFICIAL:
A. -Obtención de muestras de uretra humana.
Para Ia generación de uretras artificiales, se utilizan pequeñas biopsias de uretra humana normal obtenidas mediante endoscopia de pacientes o donantes normales. Una vez obtenida Ia muestra de forma estéril, los tejidos extraídos serán introducidos inmediatamente en medio de transporte estéril constitu ido por med io de Eag le mod ificado por Dul becco (DM EM) suplementado con antibióticos (500 U/ml de penicilina G y 500 μg/ml de estreptomicina) y antimicóticos (1 ,25 μg/ml de anfotericina B) para evitar una eventual contaminación de Ia muestra.
Alternativamente, en los casos en los que no es factible Ia toma de muestras de uretra humana, se pueden utilizar muestras de mucosa oral o de piel para Ia generación de sustitutos de Ia uretra. B.- Generación de cultivos primarios de células estromales y epiteliales.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deberán ser lavadas dos veces en una solución estéril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 μg/ml y 1 ,25 μg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extraños que pudieran encontrarse adheridos a las muestras.
En primer lugar, para separar el estroma del epitelio, las muestras se incuban a 370C en una solución estéril con tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l en PBS, recogiéndose el sobrenadante con las células tras 30 minutos mediante centrifugación. Este proceso se repite hasta 5 veces añadiendo nueva solución de tripsina-EDTA cada vez. De este modo, se consigue una cantidad apreciable de células epiteliales de Ia uretra, las cuales se cultivan en medio de cultivo de células epiteliales, el cual favorece preferentemente el crecimiento de las células epiteliales sobre los fibroblastos. Este medio está compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F-12, todo ello suplementado con un 10% de suero bovino fetal, anti bióticos-anti m icóticos (100 U/ml de penicilina G, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B), 24 μg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 5 μg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1 ,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colérica.
Para llevar a cabo Ia digestión de Ia matriz extracelular del estroma uretral y conseguir Ia separación de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben ser incubadas a 370C en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostήdium hystoliticum a 2mg/ml en medio de cultivo DMEM sin suero bovino fetal durante 6 horas. Esta solución es capaz de digerir el colágeno de Ia dermis y liberar los fibroblastos estromales. Para Ia obtención de cultivos primarios de fibroblastos, se debe centrifugar a 1 .000 rpm durante 10 minutos Ia solución de digestión que contiene las células estromales disgregadas de Ia dermis y el pellet celular correspondiente a los fibrobastos se cultiva en frascos de cultivo de 15 cm2 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa suplementado con antibióticos y antim icóticos (1 00 U/ml de penicil ina G, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10%. A este medio básico de cultivo Io denominamos medio de fibroblastos. En todos los casos, las células serán incubadas a 370C con un 5% de dióxido de carbono, en condiciones estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada tres días.
C- Construcción de productos de uretra humana artificial basados en fibrina y agarosa mediante ingeniería tisular.
1- Generación de sustitutos estromales con fibroblastos inmersos en su espesor utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos estromales se generarán directamente sobre placas de Petri para cultivo celular. Para preparar 10 mi de sustituto estromal se procederá del siguiente modo:
- Obtención de 7,6 mi de plasma sangu íneo humano procedente de donación (posibilidad de origen autólogo).
- Adición de 150.000 fibroblastos de Ia uretra humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 μl de medio de cultivo DMEM.
- Adición de 150 μl de ácido tranexámico para evitar Ia fibrinolisis del gel de fibrina.
- Adición de 1 mi de CICa2 al 1 % para inducir Ia reacción de coagulación y generar una red de fibras de fibrina.
- Adición rápida de 0,5 mi de agarosa tipo VII al 2% disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión y mezclado suave mediante agitación. La concentración final de agarosa en Ia mezcla será del 0,1 %. El rango de concentraciones de agarosa que permite productos dérmicos viables oscila entre y 0,025% y 0,3% y deberá establecerse en relación con el paciente objeto de su utilización.
- Alicuotar Io antes posible en las placas de Petri de cultivo celular.
- Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2- Desarrollo de una capa de epitelio (epidermis) en Ia superficie del sustituto dérmico mediante subcultivo de las células epiteliales sobre el sustituto estromal. Cubrir con medio de cultivo específico para células epiteliales. 3- Mantener en incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células epiteliales alcanzan Ia confluencia en Ia superficie del sustituto dérmico (alrededor de una semana). 4- Extraer el producto de uretra humana artificial de Ia superficie de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre Ia superficie del sustituto estromal para evitar que Ia capa epitelial del sustituto uretral se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre éste (Figura 1 ). Todo el proceso se ha de llevar a cabo en campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratación del producto para alcanzar niveles óptimos de consistencia y elasticidad.
5- Una vez deshidratado el tejido, cortar a medida el sustituto uretral y enrollarlo sobre sí mismo, procediendo a suturarlo con hilo de sutura quirúrgica monofilamento. De este modo, se consigue un sustituto de Ia uretra con forma tubular muy similar a Ia uretra humana nativa. Hemos de destacar que el deshidratado del tejido resulta en adecuados niveles de consistencia y elasticidad, permitiendo llevar a cabo el enrollamiento y Ia sutura sin ninguna dificultad.
EVALUACIÓN DEL PRODUCTO DE URETRA HUMANA ARTIFICIAL
(Figura 5):
1) Análisis microscópico del producto de uretra artificial humana (control de calidad histológico) (Figura 5A). La evaluación de los productos de uretra artificial reveló que Ia estructura de éstos presentaba numerosas similitudes con Ia uretra humana nativa normal. En concreto, el análisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas reveló Ia formación de un epitelio pavimentoso estratificado en Ia superficie del estroma artificial y Ia generación de un estroma denso, rico en fibras, en el que las células estromales proliferaban activamente. Todo ello sugiere que Ia estructura de Ia uretra artificial era análoga a Ia de Ia uretra nativa normal.
En aquellos casos en los que se utilizaron células de Ia mucosa oral, se obtuvieron sustitutos estromales muy similares a los obtenidos a partir de células uretrales.
2) Análisis inmunohistoquímico del producto de uretra artificial humana (Figura 5B).
El análisis de Ia expresión de citoqueratinas de los controles de uretra normal y los productos de uretra artificial obtenidos en el laboratorio, demostró Ia expresión de integrinas por parte del epitelio uretral artificial, Io cual sugiere que este epitelio es plenamente funcional y podría ser utilizado para Ia sustitución de Ia uretra humana.
EJEMPLO 5. ELABORACIÓN DE UN PRODUCTO DE VEJIGA URINA ARTIFICIAL.
PROTOCOLO DE FABRICACIÓN DE UN PRODUCTO DE VEJIGA URINARIA HUMANA ARTIFICIAL:
A. -Obtención de muestras de vejiga urinaria humana.
Para Ia generación de sustitutos artificiales de Ia vejiga urinaria, se utilizan pequeñas biopsias de Ia vejiga humana normal obtenidas mediante endoscopia de pacientes o donantes normales. Una vez obtenida Ia muestra de forma estéril, los tejidos extraídos serán introducidos inmediatamente en medio de transporte estéril constituido por medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con antibióticos (500 U/ml de penicilina G y 500 μg/ml de estreptomicina) y antimicóticos (1 ,25 μg/ml de anfotericina B) para evitar una eventual contaminación de Ia muestra.
Alternativamente, en los casos en los que no es factible Ia toma de muestras de vejiga humana, se pueden utilizar muestras de mucosa oral o de piel para Ia generación de sustitutos vesicales.
B.- Generación de cultivos primarios de células estromales y epiteliales.
Transcurrido el periodo de transporte, todas las muestras deberán ser lavadas dos veces en una solución estéril de PBS con penicilina, estreptomicina y anfotericina B (500 U/ml, 500 μg/ml y 1 ,25 μg/ml, respectivamente) para eliminar todos los restos de sangre, fibrina, grasa o materiales extraños que pudieran encontrarse adheridos a las muestras.
En primer lugar, para separar el estroma del epitelio, las muestras se incuban a 370C en una solución estéril con tripsina 0,5 g/l y EDTA 0,2 g/l en PBS, recogiéndose el sobrenadante con las células tras 30 minutos mediante centrifugación. Este proceso se repite hasta 5 veces añadiendo nueva solución de tripsina-EDTA cada vez. De este modo, se consigue una cantidad apreciable de células epiteliales de Ia vejiga, las cuales se cultivan en medio de cultivo de células epiteliales, el cual favorece preferentemente el crecimiento de las células epiteliales sobre los fibroblastos. Este medio está compuesto por 3 partes de medio DMEM rico en glucosa y una parte de medio Ham F-12, todo ello suplementado con un 10% de suero bovino fetal, anti bióticos-anti m icóticos (100 U/ml de penicilina G, 100 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B), 24 μg/ml de adenina y distintos factores de crecimiento: 0,4 μg/ml de hidrocortisona, 5 μg/ml de insulina, 10 ng/ml de factor de crecimiento epitelial (EGF), 1 ,3 ng/ml de triyodotironina y 8 ng/ml de toxina colérica.
Para llevar a cabo Ia digestión de Ia matriz extracelular del estroma vesical y conseguir Ia separación de los fibroblastos estromales incluidos en dicha matriz, las muestras deben ser incubadas a 370C en una solución estéril de colagenasa tipo I de Clostridium hystoliticum a 2 mg/ml en medio de cultivo DMEM sin suero bovino fetal durante 6 horas. Esta solución es capaz de digerir el colágeno del estroma y liberar los fibroblastos inmersos en éste. Para Ia obtención de cultivos primarios de fibroblastos, se debe centrifugar a 1 .000 rpm durante 10 minutos Ia solución de digestión que contiene las células estromales disgregadas y el pellet celular correspondiente a los fibrobastos se cultiva en frascos de cultivo de 15 cm2 de superficie. Como medio de cultivo, se utiliza DMEM enriquecido en glucosa suplementado con antibióticos y antimicóticos (1 00 U/ml de penicil ina G, 1 00 μg/ml de estreptomicina y 0,25 μg/ml de anfotericina B) y suero bovino fetal (SBF) al 10%. A este medio básico de cultivo Io denominamos medio de fibroblastos.
En todos los casos, las células serán incubadas a 370C con un 5% de dióxido de carbono, en condiciones estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada tres días. C- Construcción de productos de vejiga urinaria humana artificial basados en fibrina y agarosa mediante ingeniería tisular.
1- Generación de sustitutos estromales con fibroblastos inmersos en su espesor utilizando matrices extracelulares de fibrina y agarosa. Estos sustitutos estromales se generarán directamente sobre placas de Petri para cultivo celular. Para preparar 10 mi de sustituto estromal se procederá del siguiente modo:
- Obtención de 7,6 mi de plasma sangu íneo humano procedente de donación (posibilidad de origen autólogo).
- Adición de 150.000 fibroblastos de Ia vejiga humana previamente cultivados y resuspendidos en 750 μl de medio de cultivo DMEM.
- Adición de 150 μl de ácido tranexámico para evitar Ia fibrinolisis del gel de fibrina.
- Adición de 1 mi de CICa2 al 1 % para inducir Ia reacción de coagulación y generar una red de fibras de fibrina. - Adición rápida de 0,5 mi de agarosa tipo VII al 2% disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión y mezclado suave mediante agitación. La concentración final de agarosa en Ia mezcla será del 0,1 %. El rango de concentraciones de agarosa que permite productos dérmicos viables oscila entre y 0,025% y 0,3% y deberá establecerse en relación con el paciente objeto de su utilización.
- Alicuotar Io antes posible en las placas de Petri de cultivo celular.
- Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min.
2- Desarrollo de una capa de epitelio (urotelio) en Ia superficie del sustituto estromal mediante subcultivo de las células epiteliales sobre este sustituto.
Cubrir con medio de cultivo específico para células epiteliales.
3- Mantener en incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células epiteliales alcanzan Ia confluencia en Ia superficie del sustituto dérmico (alrededor de una semana).
4- Extraer el producto de vejiga humana artificial de Ia superficie de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre Ia superficie del sustituto estromal para evitar que Ia capa epitelial del sustituto vesical se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre éste (Figura 1 ). Todo el proceso se ha de llevar a cabo en campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratación del producto para alcanzar niveles óptimos de consistencia y elasticidad. 5- Una vez deshidratado el tejido, cortar a medida el sustituto vesical y suturarlo sobre sí mismo dándole Ia forma deseada, utilizando hilo de sutura quirúrgica monofilamento. Hemos de destacar que el deshidratado del tejido resulta en adecuados niveles de consistencia y elasticidad, permitiendo llevar a cabo Ia sutura sin ninguna dificultad.
EVALUACIÓN DEL PRODUCTO DE VEJIGA URINARIA HUMANA ARTIFICIAL (Figura 6):
1 ) Análisis microscópico e inmunohistoquímico del producto de vejiga artificial humana (control de calidad histológico) (Figuras 6A y 6B). La evaluación de los productos de vejiga artificial reveló que Ia estructura de éstos presentaba numerosas similitudes con Ia vejiga humana nativa normal. En concreto, el análisis de muestras mantenidas en cultivo durante cuatro semanas reveló Ia formación de un epitelio simple cúbico o pavimentoso en Ia superficie del estroma artificial y Ia generación de un estroma denso, rico en fibras, en el que las células estromales proliferaban activamente (Figura 6A).
El análisis inmunohistoquímico reveló que estos tejidos expresaban citoqueratina 13 y pancitoqueratina, al igual que los tejidos de vejiga humana control normal, así como citoqueratinas 7 y 8, típicas de tejidos embrionarios o en proceso de maduración (Figura 6B). Todo ello sugiere que Ia estructura de Ia vejiga artificial era análoga a Ia de Ia vejiga nativa normal.
En aquellos casos en los que se utilizaron células de Ia mucosa oral, se obtuvieron sustitutos estromales muy similares a los obtenidos a partir de células vesicales.
EJEMPLO 6. ELABORACIÓN DE PRODUCTOS ARTIFICIALES MEDIANTE BIOMATERIALES DE FIBRINA, AGAROSA Y COLÁGENO.
PROTOCOLO DE ELABORACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE MUCOSA ORAL HUMANA ARTIFICIAL: A. Generación de cultivos primarios de células epiteliales y estromales.
Para establecer cultivos primarios de células epiteliales (células epiteliales de Ia mucosa oral) y estromales (fibroblastos), se utilizan biopsias de mucosa oral normal procedente de donantes humanos o de animales de laboratorio, utilizando los siguientes métodos y protocolos:
- Obtención de una biopsia de Ia mucosa oral y transporte al laboratorio en suero fisiológico estéril.
- Aislamiento y cultivo de células epiteliales y estromales utilizando técnicas estándar de digestión enzimática (tripsina o dispasa para aislamiento epitelial y colagenasa para el estroma) o de explante tisular.
- Cultivo en medios específicos para células epiteliales o estromales hasta alcanzar Ia confluencia celular.
Todos los cultivos se mantienen en un incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 d ías hasta que las células alcanzan Ia confluencia en cultivo.
B. Construcción en laboratorio de los sustitutos tisulares de fibrina, agarosa y colágeno mediante ingeniería tisular. 1 - Generación de sustitutos del estroma tisular con células estromales inmersas en su espesor. Para preparar 20 mi de sustituto estromal:
a. -Preparar 10 mi de colágeno tipo I líquido tomando un volumen de colágeno líquido concentrado a 6,4 mg/ml de 8,81 mi. Añadir 1 ,1 mi de PBS 10X y ajustar el pH a 7,4±0,2 mediante Ia adición de aproximadamente 90 μl_ de NaOH. Para elevar el pH se suele emplear NaOH a una concentración de entre 0,1 y 1 M, aunque también pueden emplearse otros productos. Mezclar mediante agitación suave y mantener en hielo para evitar Ia gelificación prematura. b.- Preparar 10 mi de una mezcla de fibrina y agarosa procediendo del siguiente modo:
Obtención de 7,6 mi de plasma sangu íneo humano procedente de donación (posibilidad de origen autólogo).
- Adición de 150.000 células estromales previamente cultivadas y resuspendidas en 750 μl de medio de cultivo DMEM.
Adición de 150 μl de ácido tranexámico para evitar Ia fibrinolisis del gel de fibrina.
Adición de 1 mi de CICa2 al 1 % para inducir Ia reacción de coagulación y generar una red de fibras de fibrina.
Adición rápida de 0,5 mi de agarosa tipo VII al 2% disuelta en PBS y calentada hasta alcanzar el punto de fusión y mezclado suave mediante agitación. La concentración final de agarosa en Ia mezcla será del 0,1 %. El rango de concentraciones de agarosa que permite productos corneales viables oscila entre y 0,025% y 0,3% y deberá establecerse en relación con el paciente objeto de su utilización.
c- Mezclar ambas soluciones (de colágeno y de fibrina-agarosa) en proporción variable en dependencia del producto que se quiera generar. En todos los casos, mezclar Io más rápidamente posible ambas soluciones, manteniendo Ia solución de colágeno en frío hasta el momento exacto de Ia mezcla.
Para generar el producto A (2,8 g/L de colágeno, 1 ,25 g/L de fibrina y 0,5 g/L de agarosa), añadir 10 mi de Ia solución de colágeno y 10 mi de Ia solución de fibrina-agarosa.
Para generar el producto B (3,8 g/L de colágeno, 0,6 g/L de fibrina y 0,25 g/L de agarosa), añadir 15 mi de Ia solución de colágeno y 5 mi de Ia solución de fibrina-agarosa.
Para generar el producto C (1 ,9 g/L de colágeno, 1 ,9 g/L de fibrina y 0,75 g/L de agarosa), añadir 5 mi de Ia solución de colágeno y 15 mi de Ia solución de fibrina-agarosa.
d.- Alicuotar Io antes posible en insertos porosos de cultivo celular o en placas de Petri estériles,
e.- Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min en incubador a 370C. 2- Desarrollo de una capa de epitelio en Ia superficie del sustituto estromal mediante subcultivo de las células epiteliales de Ia mucosa oral sobre el sustituto estromal . Cubrir con medio de cultivo específico para células epiteliales.
3- Mantener en incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células epiteliales alcanzan Ia confluencia en Ia superficie del sustituto estromal (alrededor de una semana).
4- Exponer Ia superficie epitelial al aire (técnica aire líquido) manteniendo el sustituto estromal sumerg ido en med io de cultivo para promover Ia estratificación y Ia maduración del epitelio (alrededor de una semana).
5- Extraer el tejido artificial de Ia superficie de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre Ia superficie del sustituto estromal para evitar que Ia capa epitelial del sustituto tisular se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre éste (Figura 1) Todo el proceso se ha de llevar a cabo en campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos. El objetivo de este proceso es reducir significativamente los niveles de hidratación del producto para alcanzar niveles óptimos de consistencia y elasticidad. 6- Una vez deshidratado el tejido, cortarlo a medida dándole Ia forma deseada, utilizando hilo de sutura quirúrgica monofilamento. Hemos de destacar que el deshidratado del tejido resulta en adecuados niveles de consistencia y elasticidad, permitiendo llevar a cabo Ia sutura sin ninguna dificultad.
C. Construcción en laboratorio de los sustitutos tisulares de colágeno mediante ingeniería tisular.
1 - Generación de sustitutos del estroma tisular con células estromales inmersas en su espesor. Para preparar 20 mi de sustituto estromal:
Tomar 17,62 mi de colágeno líquido concentrado a 6,4 mg/ml; añadir 1 ,45 mi de PBS 10X y ajustar el pH a 7,4±0,2 mediante Ia adición de aproximadamente 180 μl_ de NaOH. Para elevar el pH se suele emplear NaOH a una concentración de entre 0,1 y 1 M, aunque también pueden emplearse otros productos. Mezclar mediante agitación suave y mantener en hielo para evitar Ia gelificación prematura.
- Adición de 150.000 células estromales previamente cultivadas y resuspendidas en 750 μl de medio de cultivo DMEM.
Alicuotar Io antes posible en insertos porosos de cultivo celular o en placas de Petri estériles.
Dejar polimerizar en reposo durante al menos 30 min en incubador a 370C.
2- Desarrollo de una capa de epitelio en Ia superficie del sustituto estromal mediante subcultivo de las células epiteliales de Ia mucosa oral sobre el sustituto estromal . Cubrir con medio de cultivo específico para células epiteliales.
3- Mantener en incubador a 370C con un 5% de CO2 en ambiente húmedo siguiendo protocolos estándar de cultivo celular. Los medios de cultivo se renuevan cada 3 días hasta que las células epiteliales alcanzan Ia confluencia en Ia superficie del sustituto estromal (alrededor de una semana). 4- Exponer Ia superficie epitelial al aire (técnica aire líquido) manteniendo el sustituto estromal su merg ido en med io de cu ltivo para promover Ia estratificación y Ia maduración del epitelio (alrededor de una semana). 5- Extraer el tejido artificial de Ia superficie de cultivo y proceder a su deshidratación parcial depositando el mismo sobre un papel de filtro estéril de 3-5 mm de espesor colocado sobre una superficie plana de vidrio estéril. Colocar un fragmento de tul o tela porosa de nylon esterilizada con alcohol 70% sobre Ia superficie del sustituto estromal para evitar que Ia capa epitelial del sustituto tisular se adhiera al papel de filtro. Tras ello, colocar un segundo papel de filtro estéril de 3-5 mm de grosor sobre el sustituto estromal cubierto por tela. Depositar un fragmento plano de vidrio estéril en su superficie y colocar un objeto de aproximadamente 250 g de peso sobre éste (Figura 1) Todo el proceso se ha de llevar a cabo en campana de flujo laminar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
6- Una vez deshidratado el tejido, cortarlo a medida dándole Ia forma deseada, utilizando hilo de sutura quirúrgica monofilamento. EVALUACIÓN DE LOS PRODUCTOS DE MUCOSA ORAL HUMANA ARTIFICIAL (Figura 7):
Se llevó a cabo Ia evaluación de los productos obtenidos según el protocolo anterior. Las concentraciones de fibrina, agarosa y colágeno para cada uno de los productos elaborados se indican a continuación:
A.- fibrina (1 ,25 g/L), agarosa (0,5 g/L) y colágeno (2,8 g/L).
B.- fibrina (0,6 g/L), agarosa (0,25 g/L) y colágeno (3,8 g/L).
C- fibrina (1 ,9 g/L), agarosa (0,75 g/L) y colágeno (1 ,9 g/L).
D.- fibrina (0 g/L), agarosa (0 g/L) y colágeno (5,6 g/L). 1) Análisis microscópico de los tejidos artificiales (control de calidad histológico) (Figura 7A).
El análisis microscópico reveló que los tejidos artificiales generados mediante ingeniería tisular presentaban analogía estructural con los tejidos nativos utilizados como control. En concreto, se pudo apreciar un estroma compuesto por numerosas fibras entre las que se disponían las células estromales, mostrando adecuados niveles de proliferación celular. En comparación con otros modelos previamente descritos (especialmente, los modelos de fibrina y de fibrina con agarosa), los tejidos de fibrina, agarosa y colágeno presentan mayor densidad fibrilar a nivel del estroma. Todo ello sugiere que los productos tisulares construidos en base al protocolo arriba expuesto, son compatibles con los tejidos humanos nativos normales. 2) Control de calidad reológico (Figura 7B).
El análisis de las propiedades biomecánicas de los productos tisulares construidos en base al protocolo arriba expuesto mediante un reómetro. Los resultados se muestran en Ia figura 7C y revelan que el mejor tejido es el producto A seguido del C, siendo el B muy similar al D (colágeno sólo). Por tanto, el anál isis real izado demostró una mejora del comportam iento viscoelástico y un esfuerzo umbral creciente según se aumenta Ia concentración de colágeno, y más elevado que el mostrado por los tejidos artificiales de colágeno.
Los datos presentados en estos ejemplos muestran que las propiedades físicas de los tejidos de fibrina, agarosa y colágeno son óptimas y similares a las de los tejidos humanos normales utilizados como control, Io que supone una mejora con respecto a los tejidos artificiales descritos con respecto a su utilización clínica. EJEMPLO 8: MEJORA DE LOS BIOMATERIALES DE FIBRIN A-AGAROS A TRAS LA APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE ESTRUCTURACIÓN.
La aplicación de técnicas de nanoestructuración es capaz de modificar sustancialmente Ia estructura y el comportamiento de los biomateriales sometidos a este proceso. Los principales efectos de Ia nanoestructuración sobre el biomaterial de fibrina y agarosa al 0,1 % (concentración final preferida de Ia solicitud de patente) son los siguientes: - Mejora significativa de las propiedades biomecánicas del tejido. Este aumento permite Ia manipulación del tejido nanoestructurado y supone una mejora sustancial y no esperada de las propiedades reológicas del biomaterial. Como se muestra en Ia figura 8, el esfuerzo umbral fue 3,8 veces superior en los tejidos nanoestructurados respecto a los no nanoestructurados (16,2 y 4,23 Paséales, respectivamente). En Ia misma línea, el módulo viscoso G" de las muestras sometidas a nanoestructuración fue 5,26 veces mayor respecto a las muestras no nanoestructuradas (19,3 y 3,67 Pa, respectivamente) (figura 9). Estos datos indican que Ia resistencia de los biomateriales nanoestructurados es muy superior a Ia de los tejidos no nanoestructurados.
Del mismo modo, el modulo elástico G' de los tejidos nanoestructurados fue 5,55 veces mayor (figure 10) respecto a los biomateriales nativos no nanoestructurados (152 y 27,4 Pa, respectivamente), Io cual significa que estos tejidos presentan niveles significativamente más altos de elasticidad.
Todos estos fenómenos son muy significativos y evidentemente no dependen de Ia concentración de agua en el biomaterial, sino de las reacciones internas g en erad as en el biom aterial como con secu en cia d el proceso d e nanoestructuración.
- Mejora sustancial de Ia manipulabilidad del tejido nanoestructurado, Io cual permitió su manipulación quirúrgica, Ia sutura al lecho receptor y el implante en animales de experimentación. Es importante destacar que los tejidos no nanoestructurados fueron significativamente más difíciles de manipular, tendiendo a Ia ruptura y dificultando notablemente Ia sutura y el implante clínico. Esta mejora es muy significativa y no podemos explicarla simplemente por Ia disminución de Ia concentración de agua en el biomaterial, sino por Ia formación de estructuras tridimensionales de enlace entre las distintas fibras de fibrina y agarosa, modificándose de forma inesperada las propiedades del biomaterial. - Mejora significativa de Ia transparencia de los tej idos sometidos a n a noestru ctu ra c ió n . La tra n s pa re n c i a d e l os b io m ate ri a l es n o nanoestructurados de fibrina-agarosa 0,1 %, medida como porcentaje de transmitancia del espectro de Ia luz visible (aproximadamente, de 400 a 700 nm), alcanzó niveles del 90-94%, dependiendo de Ia long itud de onda considerada (media 92%), mientras que los biomateriales no nanoestructurados presentaron una transmitancia del 87-90% (media 88,5%) (figura 10). Existe por tanto una mejor transparencia (mayor transmitancia de Ia luz visible) en los biomateriales sometidos al proceso de nanoestructuración. Al igual que en los casos anteriores, este fenómeno es el resultado de un proceso complejo de reacciones químicas y físicas en Ia estructura interna del biomaterial y no es en absoluto previsible encontrar una mejora de Ia transparencia, puesto que los tejidos nanoestructurados son más densos y más pobres en contenido de agua que los tejidos no nanoestructurados. - Resultado clínico una vez implantados en animales de laboratorio. El implante de los biomateriales sometidos a nanoestructuración ha demostrado ser más efectivo desde un punto de vista cl ínico que el de los biomateriales no nanoestructurados. Este hecho, que no es previsible de antemano, habría que relacionarlo, por un lado, con Ia mayor eficacia del implante clínico debido a las adecuadas propiedades biomecánicas del biomaterial y, por otro lado, al hecho de que los biomateriales sometidos a nanoestructuración presentan una mayor densidad de fibras por mm2 y, por tanto, presentan más lenta remodelación por parte del organismo receptor.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Método in vitro de preparación de un tejido artificial que comprende:
a) añadir una composición que comprende fibrinógeno a una muestra de células aisladas,
b) añadir un agente antifibrinolítico al producto resultante del paso (a),
c) añadir, al menos, un factor de coagulación, una fuente de calcio, trombina, o cualquier combinación de los anteriores al producto resultante del paso (b),
d) añadir una composición de un pol isacárido al producto resultante del paso (c),
e) cultivar células aisladas en o sobre el producto resultante del paso (d), y
f) inducir Ia nanoestructuración del producto resultante del paso (e).
2. Método según Ia reivindicación 1 en donde las células del paso (a) son fibroblastos o queratocitos.
3. Método según Ia reivindicación 2 donde los fibroblastos proceden del estroma de un tejido o un órgano seleccionado de Ia lista que comprende: mucosa oral, pared abdominal, piel, vejiga, uretra o córnea.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde Ia composición que contiene fibrinógeno del paso (a) es plasma sanguíneo.
5. Método según Ia reivindicación 4 donde el plasma sanguíneo es de origen autólogo.
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde el agente antifibrinolítico del paso (b) es ácido tranexámico.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde Ia fuente de calcio del paso (c) es una sal de calcio.
8. Método según Ia reivindicación 7 en donde Ia sal de calcio del paso (c) es cloruro calcico
9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde el polisacárido del paso (d) es agarosa.
10. Método según Ia reivindicación 9 donde Ia agarosa es de tipo VII.
11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además comprende un paso (paso b2) entre los pasos (b) y (c) en el que se añade una proteína.
12. Método según Ia reivindicación 11 donde Ia proteína añadida en el paso (b2) es fibronectina.
13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 que comprende un paso (d2) entre los pasos (d) y (e) que comprende Ia adición de una composición que comprende una proteína al producto resultante del paso (d).
14. Método según Ia reivindicación 13 donde Ia proteína añadida en el paso (d2) es colágeno.
15. Método según Ia reivindicación 14 donde el colágeno es colágeno tipo I.
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 donde las células del paso (e) comprenden células madre del cordón umbilical.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 donde las células del paso (e) comprenden células epiteliales.
18. Método según Ia reivindicación 17 donde las células epiteliales del paso (e) se seleccionan de Ia lista que comprende: queratinocitos, células del urotelio, células del epitelio de Ia uretra, células del epitelio corneal o células del epitelio de Ia mucosa oral.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 donde las células del paso (a) y/o las células del paso (e) son de origen autólogo.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 donde Ia i nd u cción d e I a n anoestructuración del paso (f) comprende Ia deshidratación y/o Ia compresión mecánica del producto resultante del paso (e).
21. Método según Ia reivindicación 20 donde Ia deshidratación del producto resultante del paso (e) comprende un procedimiento seleccionado de Ia lista que comprende: drenaje, evaporación, succión, presión capilar, osmosis o electro-osmosis.
22. Método según Ia reivindicación 21 donde Ia deshidratación del producto resultante del paso (e) mediante presión capilar comprende Ia aplicación de un material absorbente sobre el producto resultante del paso (e).
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 donde Ia compresión mecán ica del paso (f) comprende un procedimiento seleccionado de Ia lista que comprende: aplicación de una carga estática, aplicación de u hidráulico, aplicación de una leva, aplicación de uno o más rodillos, aplicación de un globo, extrusión o centrifugación.
24. Método según Ia reivindicación 23 donde Ia aplicación de una carga estática del paso (f) comprende Ia colocación de un peso sobre el producto resultante del paso (e).
25. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24 donde entre el paso
(e) y el paso (f) hay un paso adicional en el que el producto resultante del paso (e) se expone al aire.
26. Tej ido artificial obten ible por el método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25.
27. Uso del tejido artificial según Ia reivindicación 26 para Ia evaluación de un producto farmacológico y/o químico.
28. Uso del tejido artificial según Ia reivindicación 26 en medicina.
29. Uso del tejido artificial según Ia reivindicación 26 para Ia elaboración de un medicamento para incrementar, restaurar o sustituir parcial o totalmente Ia actividad funcional de un tejido o un órgano enfermo o dañado.
30. Uso según Ia reivindicación 29 donde el tejido o el órgano dañado se selecciona de Ia lista que comprende: piel, vejiga, uretra, córnea, mucosa, conjuntiva, pared abdominal, conjuntiva, tímpano, faringe, laringe, intestino, peritoneo, ligamento, tendón, hueso, meninge o vagina.
31. Uso según Ia reivindicación 30 donde Ia piel está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación o una malformación congénita.
32. Uso según Ia reivindicación 30 donde Ia vejiga está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita, una vejiga neurógena, una incontinencia urinaria, una disfunción vesical, una infección o una litiasis vesical.
33. Uso según Ia reivindicación 30 donde Ia uretra está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una neoplasia benigna o maligna, una infección, un traumatismo, una malformación congénita o una estenosis.
34. Uso según Ia reivindicación 30 donde Ia córnea está enferma o dañada como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia l ista que comprende: una úlcera corneal, un queratocono, un queratoglobo, un descematocele, ,un traumatismo, una causticación, una insuficiencia límibica, una queratitis atrófica, una distrofia corneal, una queratopatía primaria o secundaria, una infección, un leucoma, una queratopatía bullosa, un fallo endotelial corneal o una neoplasia benigna o maligna.
35. Uso del tejido artificial según Ia reivindicación 30 donde Ia mucosa está dañada o enferma como consecuencia de una disfunción, una lesión o una enfermedad seleccionada de Ia lista que comprende: una herida, una úlcera, una quemadura, una neoplasia benigna o maligna, una infección, una contusión, un traumatismo, una causticación, una malformación congénita, una pérdida de sustancia o una enfermedad periodontal.
36. Uso según Ia reivindicación 35 en donde Ia mucosa es Ia mucosa oral.
37. Uso según las reivindicaciones 35 ó 36 en donde el tejido se ha obtenido empleado un paso (d2).
38. Composición farmacéutica que comprende el tejido artificial según Ia reivindicación 26.
39. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 38 que comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
40. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 38 ó 39 que comprende, además, otro principio activo.
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