JP2858066B2 - 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 - Google Patents
組織培養法並びにこれに用いる培養基材Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品、化粧品等の毒
性、刺激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した
人工皮膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる
培養皮膚及びその製造法に関する。
性、刺激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した
人工皮膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる
培養皮膚及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から薬品、食品、或は化粧品といっ
た分野では、毎年多くのものが開発され上市されている
が、これらのように人体に直接適用されるものについて
の開発においては、安全性の確認を行うことが必須とな
っている。かかる安全性の確認試験としてはこれまで主
に動物実験が行われていたが、経費、試験期間、データ
の信頼性等の問題に加え、最近では動物愛護の観点から
動物実験の見直しが求められている。特に、皮膚毒性試
験、眼刺激性試験に関しては、動物実験ではあまりにも
残酷であるため、人工皮膚モデル等のｉｎ ｖｉｔｒｏ
試験による代替が急がれている。
た分野では、毎年多くのものが開発され上市されている
が、これらのように人体に直接適用されるものについて
の開発においては、安全性の確認を行うことが必須とな
っている。かかる安全性の確認試験としてはこれまで主
に動物実験が行われていたが、経費、試験期間、データ
の信頼性等の問題に加え、最近では動物愛護の観点から
動物実験の見直しが求められている。特に、皮膚毒性試
験、眼刺激性試験に関しては、動物実験ではあまりにも
残酷であるため、人工皮膚モデル等のｉｎ ｖｉｔｒｏ
試験による代替が急がれている。
【０００３】一方、臨床の場において、全層に達する創
傷、火傷をより早く、きれいに治癒させるための手段と
して、患者から皮膚細胞を取り出し、それを培養するこ
とによって得る培養皮膚が有効であると考えられるよう
になってきた。かかる培養皮膚として例えば、ヒト繊維
芽細胞をコラーゲンゲル内で培養し、ゲルが収縮した時
点でそのゲル上にヒト角化細胞を播種、培養したもの
（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．
４，４８５，０９６）やナイロンメッシュにヒト繊維芽
細胞を播種、培養してメッシュの空孔が繊維芽細胞の分
泌物により埋まった時点でその上にヒト角化細胞を播
種、培養したもの（Ｓｌｉｖｋａ，Ｓ．Ｒ．，Ｌ．Ｌａ
ｎｄｅｅｎ，Ｚｉｍｂｅｒ，Ｍ．，Ｇ．Ｋ．Ｎａｕｇｈ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｂａｒｔｅｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９６：５４４Ａ，１９９
１）、或は、ヒト繊維芽細胞を加えたスポンジメッシュ
上にゲルやフィルムを貼り付け、その上にヒト角化細胞
を播種、培養したもの等がある（日形会誌、１０：１６
５〜１８０，１９９０）。
傷、火傷をより早く、きれいに治癒させるための手段と
して、患者から皮膚細胞を取り出し、それを培養するこ
とによって得る培養皮膚が有効であると考えられるよう
になってきた。かかる培養皮膚として例えば、ヒト繊維
芽細胞をコラーゲンゲル内で培養し、ゲルが収縮した時
点でそのゲル上にヒト角化細胞を播種、培養したもの
（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．
４，４８５，０９６）やナイロンメッシュにヒト繊維芽
細胞を播種、培養してメッシュの空孔が繊維芽細胞の分
泌物により埋まった時点でその上にヒト角化細胞を播
種、培養したもの（Ｓｌｉｖｋａ，Ｓ．Ｒ．，Ｌ．Ｌａ
ｎｄｅｅｎ，Ｚｉｍｂｅｒ，Ｍ．，Ｇ．Ｋ．Ｎａｕｇｈ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｂａｒｔｅｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９６：５４４Ａ，１９９
１）、或は、ヒト繊維芽細胞を加えたスポンジメッシュ
上にゲルやフィルムを貼り付け、その上にヒト角化細胞
を播種、培養したもの等がある（日形会誌、１０：１６
５〜１８０，１９９０）。
【０００４】しかしながら、かかる培養皮膚は、細胞播
種から完成まで１か月以上の時間を要したり、或は、実
際のヒト皮膚に比べ角化細胞がわずか数層にしか重層化
せず、分化も乏しいものしか得られないといった問題が
あった。
種から完成まで１か月以上の時間を要したり、或は、実
際のヒト皮膚に比べ角化細胞がわずか数層にしか重層化
せず、分化も乏しいものしか得られないといった問題が
あった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のよう
な実状に鑑みてなされたもので、その目的とするところ
は、より早く、しかもより完全にヒト皮膚の構造を再現
した培養皮膚を提供することにある。
な実状に鑑みてなされたもので、その目的とするところ
は、より早く、しかもより完全にヒト皮膚の構造を再現
した培養皮膚を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、生体親
和性高分子のスポンジにヒト繊維芽細胞を播種、培養し
た後、かかるスポンジ上にスポンジの性質とフィルムの
性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を
重ね、更にその上にヒト角化細胞を播種した後、ヒト繊
維芽細胞増殖層を培養液下で、かつヒト角化細胞を空気
中に露出させた状態で培養することに特徴を有する組織
培養法、並びにスポンジの性質とフィルムの性質を有す
る生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を構成素材と
すること、或は生体親和性高分子のスポンジ、及びスポ
ンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子
の多孔性細胞培養基材とから成ることに特徴を有する培
養基材に関する。
和性高分子のスポンジにヒト繊維芽細胞を播種、培養し
た後、かかるスポンジ上にスポンジの性質とフィルムの
性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を
重ね、更にその上にヒト角化細胞を播種した後、ヒト繊
維芽細胞増殖層を培養液下で、かつヒト角化細胞を空気
中に露出させた状態で培養することに特徴を有する組織
培養法、並びにスポンジの性質とフィルムの性質を有す
る生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を構成素材と
すること、或は生体親和性高分子のスポンジ、及びスポ
ンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子
の多孔性細胞培養基材とから成ることに特徴を有する培
養基材に関する。
【０００７】
【作用】前記構成において、本発明を構成する生体親和
性高分子のスポンジとは、多孔質の構造を有しており、
それにより繊維芽細胞の増殖に適した無数の孔（空間）
を提供するものである。かかるスポンジの製造方法とし
ては、これまでに多くの方法が開示されているが、例え
ば、特開平５−４３７３４号公報に開示されているよう
に、生体親和性高分子のコラーゲン溶液に脂溶性有機溶
媒を添加し、ホモジナイズして発泡させた後、真空凍結
乾燥して得る方法等がある。なお、この方法によれば、
均一なポアサイズを有するコラーゲンスポンジを得るこ
とができる。本発明に用いるスポンジのポアサイズとし
ては、８０〜９５μｍが好ましく、更に、かかるスポン
ジの厚みとしては、１〜５ｍｍが好ましい。
性高分子のスポンジとは、多孔質の構造を有しており、
それにより繊維芽細胞の増殖に適した無数の孔（空間）
を提供するものである。かかるスポンジの製造方法とし
ては、これまでに多くの方法が開示されているが、例え
ば、特開平５−４３７３４号公報に開示されているよう
に、生体親和性高分子のコラーゲン溶液に脂溶性有機溶
媒を添加し、ホモジナイズして発泡させた後、真空凍結
乾燥して得る方法等がある。なお、この方法によれば、
均一なポアサイズを有するコラーゲンスポンジを得るこ
とができる。本発明に用いるスポンジのポアサイズとし
ては、８０〜９５μｍが好ましく、更に、かかるスポン
ジの厚みとしては、１〜５ｍｍが好ましい。
【０００８】一方、本発明を構成するスポンジの性質と
フィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞
培養基材とは、例えば上記生体親和性高分子のスポンジ
をプレスすること等によって得られるものであるが、こ
れは単なるフィルムではなく、ポアサイズが好ましくは
１〜３０μｍであるようなフィルム状の多孔性細胞培養
基材である。なお、かかるポアサイズが１μｍより小さ
いと、培養液中の水分や養分が自由に通過できなくな
り、かかる多孔性細胞培養基材の上に存在しているヒト
角化細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう。ま
た、かかるポアサイズが３０μｍより大きいと、ヒト角
化細胞が多孔性細胞培養基材に固定されず、所望の培養
皮膚が得られなくなってしまう。また、かかる基材の厚
みとしては、２０〜８０μｍが好ましい。
フィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞
培養基材とは、例えば上記生体親和性高分子のスポンジ
をプレスすること等によって得られるものであるが、こ
れは単なるフィルムではなく、ポアサイズが好ましくは
１〜３０μｍであるようなフィルム状の多孔性細胞培養
基材である。なお、かかるポアサイズが１μｍより小さ
いと、培養液中の水分や養分が自由に通過できなくな
り、かかる多孔性細胞培養基材の上に存在しているヒト
角化細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう。ま
た、かかるポアサイズが３０μｍより大きいと、ヒト角
化細胞が多孔性細胞培養基材に固定されず、所望の培養
皮膚が得られなくなってしまう。また、かかる基材の厚
みとしては、２０〜８０μｍが好ましい。
【０００９】また、本発明を構成するスポンジ、及びス
ポンジの性質とフィルムの性質を有する多孔性細胞培養
基材の素材としては、生体親和性高分子であるＩ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラ
ミニン、ＥＨＳマウス腫瘍可溶化抽出物等が例示でき
る。
ポンジの性質とフィルムの性質を有する多孔性細胞培養
基材の素材としては、生体親和性高分子であるＩ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラ
ミニン、ＥＨＳマウス腫瘍可溶化抽出物等が例示でき
る。
【００１０】更に、ヒト繊維芽細胞増殖層を培養液下
で、かつヒト角化細胞を空気中に露出させた状態で培養
する方法としては、例えば、エアーリキッドインターフ
ェース培養法と称される方法等が例示できる。かかる培
養法を本発明の請求項２、或は請求項３の培養基材と併
用した請求項１の組織培養法により、角化細胞をより実
際のヒト皮膚に近い状態、即ち、表面が空気に触れて乾
燥し、一方、湿潤な身体の内側から栄養が供給されると
いう状態を再現でき、しかも、正常な分化重層化を短期
間のうちに実現できる。
で、かつヒト角化細胞を空気中に露出させた状態で培養
する方法としては、例えば、エアーリキッドインターフ
ェース培養法と称される方法等が例示できる。かかる培
養法を本発明の請求項２、或は請求項３の培養基材と併
用した請求項１の組織培養法により、角化細胞をより実
際のヒト皮膚に近い状態、即ち、表面が空気に触れて乾
燥し、一方、湿潤な身体の内側から栄養が供給されると
いう状態を再現でき、しかも、正常な分化重層化を短期
間のうちに実現できる。
【００１１】なお、本発明の組織培養法では、播種、培
養する細胞は、ヒト繊維芽細胞、ヒト角化細胞に限定さ
れるものではなく、これら以外にも適宜の各種動物細胞
を播種、培養することができる。
養する細胞は、ヒト繊維芽細胞、ヒト角化細胞に限定さ
れるものではなく、これら以外にも適宜の各種動物細胞
を播種、培養することができる。
【００１２】以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
【実施例１】 （１）スポンジの作製 ３ｍｇ／ｍｌに希釈したＴｙｐｅＩコラーゲン溶液５０
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に熱架橋、グルタルアルデヒド架橋をし
た後、再び凍結乾燥をしてポアサイズ９０μｍ、厚さ３
ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。 （２）多孔性細胞培養基材の作製 ０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、
１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、
１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９
ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結
し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２
４時間の条件で凍結乾燥を行い、ポアサイズ３０μｍ、
厚さ３ｍｍコラーゲンスポンジを得た。その後、かかる
コラーゲンスポンジをテフロンシート及び３ｍｍ厚のス
テンレス板にはさんで５０ｋｇのプレスをかけた。更
に、かかる状態のまま真空下で１０５℃、２４時間熱架
橋を行い所望の多孔性細胞培養基材を得た。なお、かか
る基材のポアサイズは５〜２９μｍで、厚さは４０μｍ
であった。 （３）細胞の播種及び培養 ２４ウェル培養プレートの底面に（１）で作製したコラ
ーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）から購入し
たヒト繊維芽細胞をＫＧＭ＋１０％血清培地に懸濁し、
このスポンジ上に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の
濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で約１晩培養した。次に、このスポンジ
上に（２）で作製した多孔性細胞培養基材を重ね、クラ
ボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ＋１０％
血清培地に懸濁し、この多孔性細胞培養基材上に８．０
×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完
全に基材に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で約１晩培
養した。次に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレー
トから取り出し、６ウェル培養プレートに移した後、培
地をＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血清培地に変更
した。培養液の量を角化細胞が空気中にでるように調整
しながら６日間培養を続けた後、所望の培養皮膚を得
た。なお、培養状態を模式的に表したものを図１に示
す。この図の中で、１はコラーゲンスポンジ、２は繊維
芽細胞、３は多孔性細胞培養基材、４は角化細胞、５は
ＫＧＭ＋１０％血清培地、６は２４ウェル培養プレート
を表している。
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に熱架橋、グルタルアルデヒド架橋をし
た後、再び凍結乾燥をしてポアサイズ９０μｍ、厚さ３
ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。 （２）多孔性細胞培養基材の作製 ０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、
１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、
１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９
ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結
し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２
４時間の条件で凍結乾燥を行い、ポアサイズ３０μｍ、
厚さ３ｍｍコラーゲンスポンジを得た。その後、かかる
コラーゲンスポンジをテフロンシート及び３ｍｍ厚のス
テンレス板にはさんで５０ｋｇのプレスをかけた。更
に、かかる状態のまま真空下で１０５℃、２４時間熱架
橋を行い所望の多孔性細胞培養基材を得た。なお、かか
る基材のポアサイズは５〜２９μｍで、厚さは４０μｍ
であった。 （３）細胞の播種及び培養 ２４ウェル培養プレートの底面に（１）で作製したコラ
ーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）から購入し
たヒト繊維芽細胞をＫＧＭ＋１０％血清培地に懸濁し、
このスポンジ上に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の
濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で約１晩培養した。次に、このスポンジ
上に（２）で作製した多孔性細胞培養基材を重ね、クラ
ボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ＋１０％
血清培地に懸濁し、この多孔性細胞培養基材上に８．０
×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完
全に基材に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で約１晩培
養した。次に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレー
トから取り出し、６ウェル培養プレートに移した後、培
地をＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血清培地に変更
した。培養液の量を角化細胞が空気中にでるように調整
しながら６日間培養を続けた後、所望の培養皮膚を得
た。なお、培養状態を模式的に表したものを図１に示
す。この図の中で、１はコラーゲンスポンジ、２は繊維
芽細胞、３は多孔性細胞培養基材、４は角化細胞、５は
ＫＧＭ＋１０％血清培地、６は２４ウェル培養プレート
を表している。
【００１３】以上のようにして得た培養皮膚をホルマリ
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、繊維
芽細胞は三次元的によく伸展し、また角化細胞は１０層
程度に重層化しており、しかもよく分化し、実際のヒト
皮膚に非常によく似た形態が得られた。
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、繊維
芽細胞は三次元的によく伸展し、また角化細胞は１０層
程度に重層化しており、しかもよく分化し、実際のヒト
皮膚に非常によく似た形態が得られた。
【００１４】
【発明の効果】本発明は、以上説明したようにより完全
にヒト皮膚の構造を再現した培養皮膚を人工的に、しか
も短期間で得られるため、医薬品、化粧品等の毒性、刺
激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した人工皮
膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる培養皮
膚等に好適に用いることができる。
にヒト皮膚の構造を再現した培養皮膚を人工的に、しか
も短期間で得られるため、医薬品、化粧品等の毒性、刺
激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した人工皮
膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる培養皮
膚等に好適に用いることができる。
【図１】本発明における培養状態を模式的に示した断面
図。
図。
１ コラーゲンスポンジ ２ 繊維芽細胞 ３ 多孔性細胞培養基材 ４ 角化細胞 ５ ＫＧＭ＋１０％血清培地 ６ ２４ウェル培養プレート
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/08 A61L 27/00
Claims (2)
- 【請求項１】 生体親和性高分子のスポンジにヒト
繊維芽細胞（フィブロブラスト）を播種、培養した後、
かかるスポンジ上にスポンジの性質とフィルムの性質を
有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を重ね、
更にその上にヒト角化細胞（ケラチノサイト）を播種し
た後、ヒト繊維芽細胞増殖層を培養液下で、かつヒト角
化細胞を空気中に露出させた状態で培養することを特徴
とする組織培養法。 - 【請求項２】 生体親和性高分子のスポンジ、及び
スポンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高
分子の多孔性細胞培養基材とから成ることを特徴とする
培養基材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5116310A JP2858066B2 (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5116310A JP2858066B2 (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06292568A JPH06292568A (ja) | 1994-10-21 |
| JP2858066B2 true JP2858066B2 (ja) | 1999-02-17 |
Family
ID=14683838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5116310A Expired - Lifetime JP2858066B2 (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2858066B2 (ja) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000125855A (ja) * | 1998-10-21 | 2000-05-09 | Gunze Ltd | 人工皮膚 |
| JP3728750B2 (ja) * | 2001-11-22 | 2005-12-21 | ニプロ株式会社 | 培養皮膚及びその製造方法 |
| JP4097544B2 (ja) * | 2003-02-27 | 2008-06-11 | 独立行政法人理化学研究所 | 人工リンパ節 |
| FR2878035B1 (fr) * | 2004-11-15 | 2014-10-17 | Oreal | Dispositif comportant un echantillon de peau reconstruite et un systeme de detection. |
| JP5252538B2 (ja) * | 2007-11-09 | 2013-07-31 | グンゼ株式会社 | 弾性線維組織を有する培養血管の製造方法及び弾性線維組織を有する培養血管 |
| JP5360869B2 (ja) * | 2008-08-19 | 2013-12-04 | グンゼ株式会社 | 培養皮膚の製造方法、及び、弾性線維組織層を有する培養皮膚 |
| EP2441477B1 (en) | 2009-06-11 | 2019-02-13 | KM Biologics Co., Ltd. | Wound-covering material |
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| JP6010460B2 (ja) * | 2009-08-25 | 2016-10-19 | セルビシオ アンダルス デ サルＳｅｒｖｉｃｉｏ Ａｎｄａｌｕｚ Ｄｅ Ｓａｌｕｄ | フィブリンおよびアガロース生体材料を用いる組織工学による、人工組織の製造 |
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-
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