JPH06292568A - 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 - Google Patents
組織培養法並びにこれに用いる培養基材Info
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- JPH06292568A JPH06292568A JP5116310A JP11631093A JPH06292568A JP H06292568 A JPH06292568 A JP H06292568A JP 5116310 A JP5116310 A JP 5116310A JP 11631093 A JP11631093 A JP 11631093A JP H06292568 A JPH06292568 A JP H06292568A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は、医薬品、化粧品等の毒性、刺激
性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した人工皮膚
モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる培養皮膚
及びその製造法に関する。 【構成】 本発明は、生体親和性高分子のスポンジにヒ
ト繊維芽細胞を播種、培養した後、かかるスポンジ上に
スポンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高
分子の多孔性細胞培養基材を重ね、更にその上にヒト角
化細胞を播種した後、ヒト繊維芽細胞増殖層を培養液下
で、かつヒト角化細胞を空気中に露出させた状態で培養
することに特徴を有する組織培養法、並びにスポンジの
性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔
性細胞培養基材を構成素材とすること、或は生体親和生
高分子のスポンジ、及びスポンジの性質とフィルムの性
質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材とか
ら成ることに特徴を有する培養基材に関する。
性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した人工皮膚
モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる培養皮膚
及びその製造法に関する。 【構成】 本発明は、生体親和性高分子のスポンジにヒ
ト繊維芽細胞を播種、培養した後、かかるスポンジ上に
スポンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高
分子の多孔性細胞培養基材を重ね、更にその上にヒト角
化細胞を播種した後、ヒト繊維芽細胞増殖層を培養液下
で、かつヒト角化細胞を空気中に露出させた状態で培養
することに特徴を有する組織培養法、並びにスポンジの
性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔
性細胞培養基材を構成素材とすること、或は生体親和生
高分子のスポンジ、及びスポンジの性質とフィルムの性
質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材とか
ら成ることに特徴を有する培養基材に関する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、医薬品、化粧品等の毒
性、刺激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した
人工皮膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる
培養皮膚及びその製造法に関する。
性、刺激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した
人工皮膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる
培養皮膚及びその製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来から薬品、食品、或は化粧品といっ
た分野では、毎年多くのものが開発され上市されている
が、これらのように人体に直接適用されるものについて
の開発においては、安全性の確認を行うことが必須とな
っている。かかる安全性の確認試験としてはこれまで主
に動物実験が行われていたが、経費、試験期間、データ
の信頼性等の問題に加え、最近では動物愛護の観点から
動物実験の見直しが求められている。特に、皮膚毒性試
験、眼刺激性試験に関しては、動物実験ではあまりにも
残酷であるため、人工皮膚モデル等のｉｎ ｖｉｔｒｏ
試験による代替が急がれている。
た分野では、毎年多くのものが開発され上市されている
が、これらのように人体に直接適用されるものについて
の開発においては、安全性の確認を行うことが必須とな
っている。かかる安全性の確認試験としてはこれまで主
に動物実験が行われていたが、経費、試験期間、データ
の信頼性等の問題に加え、最近では動物愛護の観点から
動物実験の見直しが求められている。特に、皮膚毒性試
験、眼刺激性試験に関しては、動物実験ではあまりにも
残酷であるため、人工皮膚モデル等のｉｎ ｖｉｔｒｏ
試験による代替が急がれている。
【０００３】一方、臨床の場において、全層に達する創
傷、火傷をより早く、きれいに治癒させるための手段と
して、患者から皮膚細胞を取り出し、それを培養するこ
とによって得る培養皮膚が有効であると考えられるよう
になってきた。かかる培養皮膚として例えば、ヒト繊維
芽細胞をコラーゲンゲル内で培養し、ゲルが収縮した時
点でそのゲル上にヒト角化細胞を播種、培養したもの
（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．
４，４８５，０９６）やナイロンメッシュにヒト繊維芽
細胞を播種、培養してメッシュの空孔が繊維芽細胞の分
泌物により埋まった時点でその上にヒト角化細胞を播
種、培養したもの（Ｓｌｉｖｋａ，Ｓ．Ｒ．，Ｌ．Ｌａ
ｎｄｅｅｎ，Ｚｉｍｂｅｒ，Ｍ．，Ｇ．Ｋ．Ｎａｕｇｈ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｂａｒｔｅｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９６：５４４Ａ，１９９
１）、或は、ヒト繊維芽細胞を加えたスポンジメッシュ
上にゲルやフィルムを貼り付け、その上にヒト角化細胞
を播種、培養したもの等がある（日形会誌、１０：１６
５〜１８０，１９９０）。
傷、火傷をより早く、きれいに治癒させるための手段と
して、患者から皮膚細胞を取り出し、それを培養するこ
とによって得る培養皮膚が有効であると考えられるよう
になってきた。かかる培養皮膚として例えば、ヒト繊維
芽細胞をコラーゲンゲル内で培養し、ゲルが収縮した時
点でそのゲル上にヒト角化細胞を播種、培養したもの
（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．
４，４８５，０９６）やナイロンメッシュにヒト繊維芽
細胞を播種、培養してメッシュの空孔が繊維芽細胞の分
泌物により埋まった時点でその上にヒト角化細胞を播
種、培養したもの（Ｓｌｉｖｋａ，Ｓ．Ｒ．，Ｌ．Ｌａ
ｎｄｅｅｎ，Ｚｉｍｂｅｒ，Ｍ．，Ｇ．Ｋ．Ｎａｕｇｈ
ｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｌ．Ｂａｒｔｅｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅ
ｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．９６：５４４Ａ，１９９
１）、或は、ヒト繊維芽細胞を加えたスポンジメッシュ
上にゲルやフィルムを貼り付け、その上にヒト角化細胞
を播種、培養したもの等がある（日形会誌、１０：１６
５〜１８０，１９９０）。
【０００４】しかしながら、かかる培養皮膚は、細胞播
種から完成まで１か月以上の時間を要したり、或は、実
際のヒト皮膚に比べ角化細胞がわずか数層にしか重層化
せず、分化も乏しいものしか得られないといった問題が
あった。
種から完成まで１か月以上の時間を要したり、或は、実
際のヒト皮膚に比べ角化細胞がわずか数層にしか重層化
せず、分化も乏しいものしか得られないといった問題が
あった。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上述のよう
な実状に鑑みてなされたもので、その目的とするところ
は、より早く、しかもより完全にヒト皮膚の構造を再現
した培養皮膚を提供することにある。
な実状に鑑みてなされたもので、その目的とするところ
は、より早く、しかもより完全にヒト皮膚の構造を再現
した培養皮膚を提供することにある。
【０００６】
【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、生体親
和性高分子のスポンジにヒト繊維芽細胞を播種、培養し
た後、かかるスポンジ上にスポンジの性質とフィルムの
性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を
重ね、更にその上にヒト角化細胞を播種した後、ヒト繊
維芽細胞増殖層を培養液下で、かつヒト角化細胞を空気
中に露出させた状態で培養することに特徴を有する組織
培養法、並びにスポンジの性質とフィルムの性質を有す
る生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を構成素材と
すること、或は生体親和性高分子のスポンジ、及びスポ
ンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子
の多孔性細胞培養基材とから成ることに特徴を有する培
養基材に関する。
和性高分子のスポンジにヒト繊維芽細胞を播種、培養し
た後、かかるスポンジ上にスポンジの性質とフィルムの
性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を
重ね、更にその上にヒト角化細胞を播種した後、ヒト繊
維芽細胞増殖層を培養液下で、かつヒト角化細胞を空気
中に露出させた状態で培養することに特徴を有する組織
培養法、並びにスポンジの性質とフィルムの性質を有す
る生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を構成素材と
すること、或は生体親和性高分子のスポンジ、及びスポ
ンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子
の多孔性細胞培養基材とから成ることに特徴を有する培
養基材に関する。
【０００７】
【作用】前記構成において、本発明を構成する生体親和
性高分子のスポンジとは、多孔質の構造を有しており、
それにより繊維芽細胞の増殖に適した無数の孔（空間）
を提供するものである。かかるスポンジの製造方法とし
ては、これまでに多くの方法が開示されているが、例え
ば、特開平５−４３７３４号公報に開示されているよう
に、生体親和性高分子のコラーゲン溶液に脂溶性有機溶
媒を添加し、ホモジナイズして発泡させた後、真空凍結
乾燥して得る方法等がある。なお、この方法によれば、
均一なポアサイズを有するコラーゲンスポンジを得るこ
とができる。本発明に用いるスポンジのポアサイズとし
ては、８０〜９５μｍが好ましく、更に、かかるスポン
ジの厚みとしては、１〜５ｍｍが好ましい。
性高分子のスポンジとは、多孔質の構造を有しており、
それにより繊維芽細胞の増殖に適した無数の孔（空間）
を提供するものである。かかるスポンジの製造方法とし
ては、これまでに多くの方法が開示されているが、例え
ば、特開平５−４３７３４号公報に開示されているよう
に、生体親和性高分子のコラーゲン溶液に脂溶性有機溶
媒を添加し、ホモジナイズして発泡させた後、真空凍結
乾燥して得る方法等がある。なお、この方法によれば、
均一なポアサイズを有するコラーゲンスポンジを得るこ
とができる。本発明に用いるスポンジのポアサイズとし
ては、８０〜９５μｍが好ましく、更に、かかるスポン
ジの厚みとしては、１〜５ｍｍが好ましい。
【０００８】一方、本発明を構成するスポンジの性質と
フィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞
培養基材とは、例えば上記生体親和性高分子のスポンジ
をプレスすること等によって得られるものであるが、こ
れは単なるフィルムではなく、ポアサイズが好ましくは
１〜３０μｍであるようなフィルム状の多孔性細胞培養
基材である。なお、かかるポアサイズが１μｍより小さ
いと、培養液中の水分や養分が自由に通過できなくな
り、かかる多孔性細胞培養基材の上に存在しているヒト
角化細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう。ま
た、かかるポアサイズが３０μｍより大きいと、ヒト角
化細胞が多孔性細胞培養基材に固定されず、所望の培養
皮膚が得られなくなってしまう。また、かかる基材の厚
みとしては、２０〜８０μｍが好ましい。
フィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞
培養基材とは、例えば上記生体親和性高分子のスポンジ
をプレスすること等によって得られるものであるが、こ
れは単なるフィルムではなく、ポアサイズが好ましくは
１〜３０μｍであるようなフィルム状の多孔性細胞培養
基材である。なお、かかるポアサイズが１μｍより小さ
いと、培養液中の水分や養分が自由に通過できなくな
り、かかる多孔性細胞培養基材の上に存在しているヒト
角化細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう。ま
た、かかるポアサイズが３０μｍより大きいと、ヒト角
化細胞が多孔性細胞培養基材に固定されず、所望の培養
皮膚が得られなくなってしまう。また、かかる基材の厚
みとしては、２０〜８０μｍが好ましい。
【０００９】また、本発明を構成するスポンジ、及びス
ポンジの性質とフィルムの性質を有する多孔性細胞培養
基材の素材としては、生体親和性高分子であるＩ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラ
ミニン、ＥＨＳマウス腫瘍可溶化抽出物等が例示でき
る。
ポンジの性質とフィルムの性質を有する多孔性細胞培養
基材の素材としては、生体親和性高分子であるＩ、Ｉ
Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラ
ミニン、ＥＨＳマウス腫瘍可溶化抽出物等が例示でき
る。
【００１０】更に、ヒト繊維芽細胞増殖層を培養液下
で、かつヒト角化細胞を空気中に露出させた状態で培養
する方法としては、例えば、エアーリキッドインターフ
ェース培養法と称される方法等が例示できる。かかる培
養法を本発明の請求項２、或は請求項３の培養基材と併
用した請求項１の組織培養法により、角化細胞をより実
際のヒト皮膚に近い状態、即ち、表面が空気に触れて乾
燥し、一方、湿潤な身体の内側から栄養が供給されると
いう状態を再現でき、しかも、正常な分化重層化を短期
間のうちに実現できる。
で、かつヒト角化細胞を空気中に露出させた状態で培養
する方法としては、例えば、エアーリキッドインターフ
ェース培養法と称される方法等が例示できる。かかる培
養法を本発明の請求項２、或は請求項３の培養基材と併
用した請求項１の組織培養法により、角化細胞をより実
際のヒト皮膚に近い状態、即ち、表面が空気に触れて乾
燥し、一方、湿潤な身体の内側から栄養が供給されると
いう状態を再現でき、しかも、正常な分化重層化を短期
間のうちに実現できる。
【００１１】なお、本発明の組織培養法では、播種、培
養する細胞は、ヒト繊維芽細胞、ヒト角化細胞に限定さ
れるものではなく、これら以外にも適宜の各種動物細胞
を播種、培養することができる。
養する細胞は、ヒト繊維芽細胞、ヒト角化細胞に限定さ
れるものではなく、これら以外にも適宜の各種動物細胞
を播種、培養することができる。
【００１２】以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
【実施例１】 （１）スポンジの作製 ３ｍｇ／ｍｌに希釈したＴｙｐｅＩコラーゲン溶液５０
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に熱架橋、グルタルアルデヒド架橋をし
た後、再び凍結乾燥をしてポアサイズ９０μｍ、厚さ３
ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。 （２）多孔性細胞培養基材の作製 ０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、
１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、
１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９
ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結
し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２
４時間の条件で凍結乾燥を行い、ポアサイズ３０μｍ、
厚さ３ｍｍコラーゲンスポンジを得た。その後、かかる
コラーゲンスポンジをテフロンシート及び３ｍｍ厚のス
テンレス板にはさんで５０ｋｇのプレスをかけた。更
に、かかる状態のまま真空下で１０５℃、２４時間熱架
橋を行い所望の多孔性細胞培養基材を得た。なお、かか
る基材のポアサイズは５〜２９μｍで、厚さは４０μｍ
であった。 （３）細胞の播種及び培養 ２４ウェル培養プレートの底面に（１）で作製したコラ
ーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）から購入し
たヒト繊維芽細胞をＫＧＭ＋１０％血清培地に懸濁し、
このスポンジ上に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の
濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で約１晩培養した。次に、このスポンジ
上に（２）で作製した多孔性細胞培養基材を重ね、クラ
ボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ＋１０％
血清培地に懸濁し、この多孔性細胞培養基材上に８．０
×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完
全に基材に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で約１晩培
養した。次に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレー
トから取り出し、６ウェル培養プレートに移した後、培
地をＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血清培地に変更
した。培養液の量を角化細胞が空気中にでるように調整
しながら６日間培養を続けた後、所望の培養皮膚を得
た。なお、培養状態を模式的に表したものを図１に示
す。この図の中で、１はコラーゲンスポンジ、２は繊維
芽細胞、３は多孔性細胞培養基材、４は角化細胞、５は
ＫＧＭ＋１０％血清培地、６は２４ウェル培養プレート
を表している。
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に熱架橋、グルタルアルデヒド架橋をし
た後、再び凍結乾燥をしてポアサイズ９０μｍ、厚さ３
ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。 （２）多孔性細胞培養基材の作製 ０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、
１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、
１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９
ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結
し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２
４時間の条件で凍結乾燥を行い、ポアサイズ３０μｍ、
厚さ３ｍｍコラーゲンスポンジを得た。その後、かかる
コラーゲンスポンジをテフロンシート及び３ｍｍ厚のス
テンレス板にはさんで５０ｋｇのプレスをかけた。更
に、かかる状態のまま真空下で１０５℃、２４時間熱架
橋を行い所望の多孔性細胞培養基材を得た。なお、かか
る基材のポアサイズは５〜２９μｍで、厚さは４０μｍ
であった。 （３）細胞の播種及び培養 ２４ウェル培養プレートの底面に（１）で作製したコラ
ーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）から購入し
たヒト繊維芽細胞をＫＧＭ＋１０％血清培地に懸濁し、
このスポンジ上に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の
濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で約１晩培養した。次に、このスポンジ
上に（２）で作製した多孔性細胞培養基材を重ね、クラ
ボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ＋１０％
血清培地に懸濁し、この多孔性細胞培養基材上に８．０
×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完
全に基材に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で約１晩培
養した。次に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレー
トから取り出し、６ウェル培養プレートに移した後、培
地をＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血清培地に変更
した。培養液の量を角化細胞が空気中にでるように調整
しながら６日間培養を続けた後、所望の培養皮膚を得
た。なお、培養状態を模式的に表したものを図１に示
す。この図の中で、１はコラーゲンスポンジ、２は繊維
芽細胞、３は多孔性細胞培養基材、４は角化細胞、５は
ＫＧＭ＋１０％血清培地、６は２４ウェル培養プレート
を表している。
【００１３】以上のようにして得た培養皮膚をホルマリ
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、繊維
芽細胞は三次元的によく伸展し、また角化細胞は１０層
程度に重層化しており、しかもよく分化し、実際のヒト
皮膚に非常によく似た形態が得られた。
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、繊維
芽細胞は三次元的によく伸展し、また角化細胞は１０層
程度に重層化しており、しかもよく分化し、実際のヒト
皮膚に非常によく似た形態が得られた。
【００１４】
【発明の効果】本発明は、以上説明したようにより完全
にヒト皮膚の構造を再現した培養皮膚を人工的に、しか
も短期間で得られるため、医薬品、化粧品等の毒性、刺
激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した人工皮
膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる培養皮
膚等に好適に用いることができる。
にヒト皮膚の構造を再現した培養皮膚を人工的に、しか
も短期間で得られるため、医薬品、化粧品等の毒性、刺
激性、浸透性等各種安全性試験を行うのに適した人工皮
膚モデル、或は全層を失う火傷等の治療に用いる培養皮
膚等に好適に用いることができる。
【図１】本発明における培養状態を模式的に示した断面
図。
図。
１ コラーゲンスポンジ ２ 繊維芽細胞 ３ 多孔性細胞培養基材 ４ 角化細胞 ５ ＫＧＭ＋１０％血清培地 ６ ２４ウェル培養プレート
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年４月７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００８】一方、本発明を構成するスポンジの性質と
フィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞
培養基材とは、例えば上記生体親和性高分子のスポンジ
をプレスすること等によって得られるものであるが、こ
れは単なるフィルムではなく、ポアサイズが好ましくは
１〜３０μｍであるようなフィルム状の多孔性細胞培養
基材である。なお、かかるポアサイズが１μｍより小さ
いと、培養液中の水分や養分が自由に通過できなくな
り、かかる多孔性細胞培養基材の上に存在しているヒト
角化細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう。ま
た、かかるポアサイズが３０μｍより大きいと、ヒト角
化細胞が多孔性細胞培養基材に固定されず、所望の培養
皮膚が得られなくなってしまう。また、かかる基材の厚
みとしては、２０〜８０μｍが好ましい。なお、スポン
ジに直接ヒト角化細胞を播種すれば、スポンジの中にヒ
ト角化細胞が落ち込んでしまうのでこれを防止するこ
と、即ちヒト角化細胞に足場を与えることが、このスポ
ンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子
の多孔性細胞培養基材を用いることの主な目的である
が、更にこの多孔性細胞培養基材の素材を生体親和性高
分子としているため、ヒト角化細胞を播種する際にはそ
の足場を与え、所望の期間ヒト角化細胞を培養して安定
した後、上記の多孔性細胞培養基材は分解して体内に吸
収され消失する。このように、ヒト角化細胞が安定した
後、実際の皮膚には存在しないスポンジの性質とフィル
ムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基
材が消えてなくなるため、実物の皮膚により近いものと
なり、これを用いて得られた試験結果もより信頼性の高
いものとなる。更に、多孔性細胞培養基材に対する架橋
条件をコントロールすることにより、所望の消失速度の
多孔性細胞培養基材を得ることができる。例えば、コラ
ーゲンを素材とする多孔性細胞培養基材に１０５℃、２
４時間の熱架橋を施したものをＤＭＥ＋５％血清培地で
培養すると、５日目にはこの多孔性細胞培養基材は分解
して体内に吸収され消失する。
フィルムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞
培養基材とは、例えば上記生体親和性高分子のスポンジ
をプレスすること等によって得られるものであるが、こ
れは単なるフィルムではなく、ポアサイズが好ましくは
１〜３０μｍであるようなフィルム状の多孔性細胞培養
基材である。なお、かかるポアサイズが１μｍより小さ
いと、培養液中の水分や養分が自由に通過できなくな
り、かかる多孔性細胞培養基材の上に存在しているヒト
角化細胞に栄養分等が供給できなくなってしまう。ま
た、かかるポアサイズが３０μｍより大きいと、ヒト角
化細胞が多孔性細胞培養基材に固定されず、所望の培養
皮膚が得られなくなってしまう。また、かかる基材の厚
みとしては、２０〜８０μｍが好ましい。なお、スポン
ジに直接ヒト角化細胞を播種すれば、スポンジの中にヒ
ト角化細胞が落ち込んでしまうのでこれを防止するこ
と、即ちヒト角化細胞に足場を与えることが、このスポ
ンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子
の多孔性細胞培養基材を用いることの主な目的である
が、更にこの多孔性細胞培養基材の素材を生体親和性高
分子としているため、ヒト角化細胞を播種する際にはそ
の足場を与え、所望の期間ヒト角化細胞を培養して安定
した後、上記の多孔性細胞培養基材は分解して体内に吸
収され消失する。このように、ヒト角化細胞が安定した
後、実際の皮膚には存在しないスポンジの性質とフィル
ムの性質を有する生体親和性高分子の多孔性細胞培養基
材が消えてなくなるため、実物の皮膚により近いものと
なり、これを用いて得られた試験結果もより信頼性の高
いものとなる。更に、多孔性細胞培養基材に対する架橋
条件をコントロールすることにより、所望の消失速度の
多孔性細胞培養基材を得ることができる。例えば、コラ
ーゲンを素材とする多孔性細胞培養基材に１０５℃、２
４時間の熱架橋を施したものをＤＭＥ＋５％血清培地で
培養すると、５日目にはこの多孔性細胞培養基材は分解
して体内に吸収され消失する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１２】以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
【実施例１】 （１）スポンジの作製 ３ｍｇ／ｍｌに希釈したＴｙｐｅＩコラーゲン溶液５０
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に熱架橋、グルタルアルデヒド架橋をし
た後、再び凍結乾燥をしてポアサイズ９０μｍ、厚さ３
ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。 （２）多孔性細胞培養基材の作製 ０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、
１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、
１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９
ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結
し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２
４時間の条件で凍結乾燥を行い、ポアサイズ３０μｍ、
厚さ３ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。その後、かか
るコラーゲンスポンジをテフロンシート及び３ｍｍ厚の
ステンレス板にはさんで５０ｋｇのプレスをかけた。更
に、かかる状態のまま真空下で１０５℃、２４時間熱架
橋を行い所望の多孔性細胞培養基材を得た。なお、かか
る基材のポアサイズは５〜２９μｍで、厚さは４０μｍ
であった。 （３）細胞の播種及び培養 ２４ウェル培養プレートの底面に（１）で作製したコラ
ーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）から購入し
たヒト繊維芽細胞をＫＧＭ＋１０％血清培地に懸濁し、
このスポンジ上に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の
濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で約１晩培養した。次に、このスポンジ
上に（２）で作製した多孔性細胞培養基材を重ね、クラ
ボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ＋１０％
血清培地に懸濁し、この多孔性細胞培養基材上に８．０
×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完
全に基材に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で約１晩培
養した。次に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレー
トから取り出し、６ウェル培養プレートに移した後、培
地をＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血清培地に変更
した。培養液の量を角化細胞が空気中にでるように調整
しながら６日間培養を続けた後、所望の培養皮膚を得
た。なお、培養状態を模式的に表したものを図１に示
す。この図の中で、１はコラーゲンスポンジ、２は繊維
芽細胞、３は多孔性細胞培養基材、４は角化細胞、５は
ＫＧＭ＋１０％血清培地、６は２４ウェル培養プレート
を表している。
ｇにクロロホルム０．５ｇを添加し、ホモジナイザーを
用いて６０００ｒｐｍで１分間ホモジナイズしたものを
ステンレス製枠に流し込み、−４０℃で凍結し、これを
真空減圧下（０．０１ｍｍＨｇ）、３０℃で２４時間凍
結乾燥した。更に熱架橋、グルタルアルデヒド架橋をし
た後、再び凍結乾燥をしてポアサイズ９０μｍ、厚さ３
ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。 （２）多孔性細胞培養基材の作製 ０．３％水溶液（ｐＨ３）のＴｙｐｅＩコラーゲンを、
１５％エタノールで３倍希釈し、０．１％コラーゲン、
１０％エタノール水溶液とした。更にこの溶液を直径９
ｃｍのシャーレに１５ｇ流し込み、−１３５℃で凍結
し、真空度：０．１、乾燥温度：４０℃、乾燥時間：２
４時間の条件で凍結乾燥を行い、ポアサイズ３０μｍ、
厚さ３ｍｍのコラーゲンスポンジを得た。その後、かか
るコラーゲンスポンジをテフロンシート及び３ｍｍ厚の
ステンレス板にはさんで５０ｋｇのプレスをかけた。更
に、かかる状態のまま真空下で１０５℃、２４時間熱架
橋を行い所望の多孔性細胞培養基材を得た。なお、かか
る基材のポアサイズは５〜２９μｍで、厚さは４０μｍ
であった。 （３）細胞の播種及び培養 ２４ウェル培養プレートの底面に（１）で作製したコラ
ーゲンスポンジを敷き詰め、クラボウ（株）から購入し
たヒト繊維芽細胞をＫＧＭ＋１０％血清培地に懸濁し、
このスポンジ上に１．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の
濃度で播種し、細胞が完全に基材に接着するまで３７
℃、５％ＣＯ２で約１晩培養した。次に、このスポンジ
上に（２）で作製した多孔性細胞培養基材を重ね、クラ
ボウ（株）から購入したヒト角化細胞をＫＧＭ＋１０％
血清培地に懸濁し、この多孔性細胞培養基材上に８．０
×１０５ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の濃度で播種し、細胞が完
全に基材に接着するまで３７℃、５％ＣＯ２で約１晩培
養した。次に、かかる培養基材を２４ウェル培養プレー
トから取り出し、６ウェル培養プレートに移した後、培
地をＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血清培地に変更
した。培養液の量を角化細胞が空気中にでるように調整
しながら６日間培養を続けた後、所望の培養皮膚を得
た。なお、培養状態を模式的に表したものを図１に示
す。この図の中で、１はコラーゲンスポンジ、２は繊維
芽細胞、３は多孔性細胞培養基材、４は角化細胞、５は
ＫＧＭ＋１０％血清培地、６は２４ウェル培養プレート
を表している。
【実施例２】
（１）スポンジの作製、及び（２）多孔性細胞培養基材
の作製は実施例１と同じ方法により作製し、（３）細胞
の播種及び培養については、実施例１中のＫＧＭ＋１０
％血清培地、及びＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血
清培地をともにＤＭＥ＋５％血清培地に変更して細胞を
播種及び培養した。
の作製は実施例１と同じ方法により作製し、（３）細胞
の播種及び培養については、実施例１中のＫＧＭ＋１０
％血清培地、及びＫＧＭ（１．２ｍＭＣａ）＋１０％血
清培地をともにＤＭＥ＋５％血清培地に変更して細胞を
播種及び培養した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１３】以上のようにして得た培養皮膚をホルマリ
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、繊維
芽細胞は三次元的によく伸展し、また角化細胞は１０層
程度に重層化しており、しかもよく分化し、実際のヒト
皮膚に非常によく似た形態が得られた。なお、実施例２
のようにＤＭＥ＋５％血清培地を用いることにより、実
施例１に比べ培養期間が短縮され、更に分化重層化もよ
り優れたものになる。
ン固定し、次いでＨＥ染色を行い観察したところ、繊維
芽細胞は三次元的によく伸展し、また角化細胞は１０層
程度に重層化しており、しかもよく分化し、実際のヒト
皮膚に非常によく似た形態が得られた。なお、実施例２
のようにＤＭＥ＋５％血清培地を用いることにより、実
施例１に比べ培養期間が短縮され、更に分化重層化もよ
り優れたものになる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/15 7055−2Ｊ
Claims (3)
- 【請求項１】 生体親和性高分子のスポンジにヒト繊維
芽細胞（フィブロブラスト）を播種、培養した後、かか
るスポンジ上にスポンジの性質とフィルムの性質を有す
る生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を重ね、更に
その上にヒト角化細胞（ケラチノサイト）を播種した
後、ヒト繊維芽細胞増殖層を培養液下で、かつヒト角化
細胞を空気中に露出させた状態で培養することを特徴と
する組織培養法。 - 【請求項２】 スポンジの性質とフィルムの性質を有す
る生体親和性高分子の多孔性細胞培養基材を構成素材と
することを特徴とする培養基材。 - 【請求項３】 生体親和性高分子のスポンジ、及びスポ
ンジの性質とフィルムの性質を有する生体親和性高分子
の多孔性細胞培養基材とから成ることを特徴とする培養
基材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5116310A JP2858066B2 (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5116310A JP2858066B2 (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06292568A true JPH06292568A (ja) | 1994-10-21 |
| JP2858066B2 JP2858066B2 (ja) | 1999-02-17 |
Family
ID=14683838
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5116310A Expired - Lifetime JP2858066B2 (ja) | 1993-04-06 | 1993-04-06 | 組織培養法並びにこれに用いる培養基材 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2858066B2 (ja) |
Cited By (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000125855A (ja) * | 1998-10-21 | 2000-05-09 | Gunze Ltd | 人工皮膚 |
| JP2003154000A (ja) * | 2001-11-22 | 2003-05-27 | Nipro Corp | 培養皮膚及びその製造方法 |
| JP2004255110A (ja) * | 2003-02-27 | 2004-09-16 | Sangaku Renkei Kiko Kyushu:Kk | 人工リンパ節 |
| WO2006051515A1 (en) * | 2004-11-15 | 2006-05-18 | L'oreal | A device comprising a sample of reconstructed tissue and a detection system |
| JP2009112285A (ja) * | 2007-11-09 | 2009-05-28 | Gunze Ltd | 弾性線維組織を有する培養血管の製造方法及び弾性線維組織を有する培養血管 |
| JP2010045984A (ja) * | 2008-08-19 | 2010-03-04 | Gunze Ltd | 培養皮膚の製造方法、及び、弾性線維組織層を有する培養皮膚 |
| WO2010143711A1 (ja) | 2009-06-11 | 2010-12-16 | 一般財団法人化学及血清療法研究所 | 創傷被覆材 |
| JP2011004935A (ja) * | 2009-06-25 | 2011-01-13 | Fujifilm Corp | 細胞積層体 |
| JP2012247284A (ja) * | 2011-05-27 | 2012-12-13 | Nikko Chemical Co Ltd | 皮膚乾燥刺激評価装置 |
| WO2012176908A1 (ja) | 2011-06-24 | 2012-12-27 | Ｋｉｓｃｏ株式会社 | 細胞培養用基膜、細胞培養用基材、及び細胞培養用基材の製造方法 |
| JP2013502915A (ja) * | 2009-08-25 | 2013-01-31 | セルビシオ アンダルス デ サル | フィブリンおよびアガロース生体材料を用いる組織工学による、人工組織の製造 |
| WO2016006944A1 (ko) * | 2014-07-09 | 2016-01-14 | 전세화 | 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 삼차원 배양 피부모델 |
| WO2016159555A1 (ko) * | 2015-03-31 | 2016-10-06 | (주)아모레퍼시픽 | 인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법 |
| CN107320781A (zh) * | 2017-07-11 | 2017-11-07 | 广州润虹医药科技股份有限公司 | 含活细胞的组织工程皮肤及其制备方法 |
| WO2017222065A1 (ja) * | 2016-06-24 | 2017-12-28 | 株式会社資生堂 | 三次元培養皮膚シート、その製造に使用するための細胞培養容器及びその製造方法 |
| JP2020202754A (ja) * | 2019-06-14 | 2020-12-24 | 株式会社 資生堂 | 三次元培養皮膚の製造方法、及びそれにより得られる三次元培養皮膚 |
| JP2020202757A (ja) * | 2019-06-14 | 2020-12-24 | 株式会社 資生堂 | 皮膚様組織の製造方法、及びそれにより得られる皮膚様組織 |
-
1993
- 1993-04-06 JP JP5116310A patent/JP2858066B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (25)
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| JP2000125855A (ja) * | 1998-10-21 | 2000-05-09 | Gunze Ltd | 人工皮膚 |
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| JP2009112285A (ja) * | 2007-11-09 | 2009-05-28 | Gunze Ltd | 弾性線維組織を有する培養血管の製造方法及び弾性線維組織を有する培養血管 |
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| WO2016006944A1 (ko) * | 2014-07-09 | 2016-01-14 | 전세화 | 진피층 및 표피층을 포함하는 삼차원 배양 피부모델을 제조하는 방법 및 이를 통해 제조된 삼차원 배양 피부모델 |
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| KR20160116982A (ko) * | 2015-03-31 | 2016-10-10 | (주)아모레퍼시픽 | 인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법 |
| WO2016159555A1 (ko) * | 2015-03-31 | 2016-10-06 | (주)아모레퍼시픽 | 인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법 |
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| CN109415692A (zh) * | 2016-06-24 | 2019-03-01 | 株式会社资生堂 | 三维培养皮肤片、用于其制造的细胞培养容器和该三维培养皮肤片的制造方法 |
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|---|---|
| JP2858066B2 (ja) | 1999-02-17 |
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