KR20160116982A - 인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법 - Google Patents

인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 한천을 이용하되 상기 한천의 일부를 소수성으로 개질시킴으로써, 인공피부 제작과정에서 인공피부의 진피층에 존재하는 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용으로 인해 발생하는 진피층의 수축 및 배양용기로부터의 탈착 문제 해결할 수 있다. 이로써 상기 배양용기를 이용하면 인공피부를 안정적으로 배양할 수 있고, 인체피부와 유사한 인공피부를 제조할 수 있다. 또한, 본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 한천을 포함하므로, 배양용기의 하부뿐만 아니라 측면부를 통하여도 배양액을 공급할 수 있어, 인공피부를 효과적으로 배양할 수 있다.

Description

인공피부 배양용기 및 이를 이용한 인공피부의 제조방법{Culture container for artificial skin and process for producing artificial skin using the same}
본 발명은 인공 피부를 배양하기 위한 배양용기 및 이를 이용하여 인공피부를 제조하는 방법에 관한 것이다.
피부는 신체의 외부를 덮고 있는 기관으로 바깥쪽에서부터 표피, 진피 및 피하지방층의 세 개의 층으로 구성되어 있다. 표피는 중층편평상피의 각질형성세포가 대부분을 차지하고 있다. 콜라겐 섬유와 탄력 섬유와 같은 기질 단백질로 이루어진 진피는 표피 아래에 위치하며, 진피에는 혈관, 신경, 땀샘 등이 있다. 피하지방층은 지방세포로 구성되어 있다. 피부는 상기와 같은 다양한 세포들과 구성물질들이 상호작용하여 그 형태를 유지하며 체온 조절과 외부 환경에 대한 장벽으로의 기능 등 다양한 기능을 나타낸다.
인공피부(artificail skin)는 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐, 엘라스틴 등을 이용하여 3차원적으로 상기와 같은 피부를 재구성한 것으로서, 살아있는 섬유아세포와 각질형성세포로 구성되어 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내기 때문에 피부 모사체(skin equivalent 또는 reconstructed skin)라고도 불린다. 인공피부는 주로 피부와 탄력, 강도, 물질 투과 등에 있어 비슷한 물성을 나타내는 고분자 복합체로, 피부와 같은 생명현상을 나타내지 않는다는 점에서 차이점이 있다. 인공피부는 화상, 외상 등 손상을 입은 피부의 대체(영구생착형) 또는 재생(일시 피복형)을 위해 이용될 뿐만 아니라, 피부 생리연구, 피부 자극 평가, 피부 효능평가 등 다양한 영역에서 이용되고 있다.
그러나 기존의 인공피부는 제조과정에서 콜라겐과 진피 섬유아세포를 섞은 다음 굳혀 진피층을 만들고 이를 배양하게 되는데, 이 조직배양 중에 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용에 의해 불가피하게 진피가 점차 수축하는 현상이 나타나는 문제점이 있었다. 결국 인공피부 제조과정에서 인공피부의 진피층이 배양용기에서 탈착하게 되며, 나아가 진피 수축이 심한 경우에는 인공피부조직의 구조에 전체적인 변형이 일어나고 조직의 생리학적인 이상을 초래하여 결국 폐기해야 하는 문제가 있었다.
일본 특허등록공보 제1996-243156호
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 인공피부 제조시 나타나는 진피의 수축 현상을 방지할 수 있는 신규 인공피부의 배양용기를 제공하고, 이를 이용하여 제조된 구조적, 기능적으로 실제 피부와 높은 인체상관성을 갖는 인공피부를 제공하고자 한다.
본 발명에 따른 구현예들은, 겔 형태의 한천(agar)을 포함하고, 상기 한천은 일부가 소수성으로 개질된 것인, 인공피부 배양용기를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 구현예들은 상기 인공피부 배양용기에서 인공피부를 제조하는 방법으로, 상기 인공피부 배양용기의 내부에 무세포 콜라겐(Acellular Collagen) 용액을 도입하는 단계; 상기 콜라겐 용액을 배양하여 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계; 상기 인공피부 배양용기 내부에 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast) 용액을 도입하고, 상기 콜라겐 용액을 겔화시키는 단계; 및 상기 섬유아세포 용액을 배양하면서 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 일부가 소수성으로 개질되고 3차원 미세기공이 형성된 한천을 포함함으로써, 인공피부 제작과정에서 인공피부의 진피층에 존재하는 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용으로 인해 발생하는 진피층의 수축 및 배양용기로부터의 탈착 문제 해결할 수 있다. 이로써 기존 세포배양용기의 대체하여 상기 배양용기를 이용하면 인공피부를 안정적으로 배양할 수 있고, 인체피부와 유사한 인공피부를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 인공피부 배양용기는 한천을 포함하므로, 배양용기의 바닥면뿐만 아니라 측면부를 통하여도 배양액을 공급할 수 있어, 3차원적으로 배양액의 공급이 가능하여 인공피부를 효과적으로 배양할 수 있다.
도 1은 아가로스의 겔구조를 나타낸 도이다.
도 2는 인공피부 배양용기의 모식도 및 그 내부구조에 형성된 3차원 미세기공의 모습을 촬영한 SEM(scanning electron microscope) 사진을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 제조하는 방법을 순차적으로 나타낸 도이다.
도 4는 일반 인공피부 배양용기인 비교예 2, 순수 한천으로 제조된 비교예 1, 본 발명에 따른 실시예 1의 소수성 한천 배양용기에서 인공피부세포를 7일간 배양한 모습을 촬영하여 나타낸 도이다.
도 5는 인공피부를 비교예 1의 일반적인 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착한 모습(왼쪽 두 사진)과 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착되지 않고 밀접하게 결합된 모습(오른쪽 두 사진)을 나타낸 도이다.
도 6은 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우, 진피층의 콜라겐 파이버가 배양용기 안쪽으로 배향되어 진입한 모습을 동결건조 후 SEM(scanning electron microscope)으로 촬영한 도이다.
본 명세서에서 "인공피부(artificail skin)"라 함은 피부세포와 피부 구성물질인 콜라겐 등을 이용하여 3차원적으로 피부를 재구성한 것을 의미하며, 실제 피부와 유사한 구조적, 기능적 특성을 나타내는 고분자 복합체라면 모두 포함하는 최광의의 의미이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 구현예들은 겔 형태의 한천(agar)을 포함하고, 상기 한천은 일부가 소수성으로 개질된 인공피부 배양용기를 제공할 수 있다.
상기 한천(agar)은 우뭇가사리 등의 홍조해초에서 분리한 갈락토오스가 주성분인 황산기를 포함한 세포간 점성다당의 다당체의 일종으로, 한천조(寒天藻)로는 우뭇가사리속(Gelidium)외에 지누아리속(Grateloupia), 꼬시래기속(Gracilaria), 하프니아속(Hypnea), 돌가사리속(Gigartina) 등에 속하는 홍조류와 수 종의 속에 속하는 홍조가 알려져 있다. 한천의 주 구성성분은 아가로스(약 70%)와 아가로펙틴(약 30%)으로, 백색이며 투명하고 광택이 있으며 냉수에는 녹지않으나 뜨거운 물에는 녹아 졸(sol) 상태가 된다. 구체적으로, 한천 분말을 수용액에 혼합하여 약 100 내지 140℃에서 항온가압한 다음, 이를 상온에서 식혀주면(cooling or ageing) 한천 분말내 분자들의 물리적 결합으로 인해 졸 상태에서 겔(gel) 상태로 겔화된다. 이 겔은 약 85℃ 이하에서는 녹지 않으며, 특수한 세균 이외에는 작용하지 않고 염류에는 녹지 않는다. 산에는 약하지만 알칼리에는 강하다. 하기 화학식 1은 한천 내 아가로스의 구조를 나타낸 것이고, 도 1은 아가로스의 겔구조를 나타낸 도이다. 도 1은 Laas T., Acta University 1975에 기재된 아가로스의 겔 구조로서, 상기 문헌은 그 전체가 본 명세서에 참고로서 통합된다.
Figure pat00001
본 발명의 구현예들은 상기 인공피부 배양용기를 구성하는 한천의 일부 아가로스(agarose)의 하나 이상의 수소가 소수성 분자로 치환되어, 소수성으로 개질된 한천(Hydrophobically-modified agar)을 포함할 수 있다. 상기 소수성 분자는 탄소수 12 내지 18의 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl) 및 아실(acyl) 사슬 중 하나 이상; 폴리프로필렌 글리콜(Polypropylene glycol, PPG); 및 폴리카프로락톤(polycaprolactone, PCL)으로 이루어진 군에서 선택된 것을 예로 들 수 있으나, 한천을 소수성으로 개질할 수 있는 것이면 이에 한정되지 않는다.
일 구현예로서 상기 한천이 겔화되기 전의 한천 분말 100개를 1 유닛(unit)으로 하고, 1 유닛당 한천 분말에 치환된 소수성 분자수를 접목도(Degree of substitution(DS), %)라 할 때, 상기 인공피부 배양용기를 구성하는 한천에 대한 소수성 분자 접목도는 1.0% 내지 40%, 보다 구체적으로는 5.0% 내지 20%일 수 있다. 상기 소수성 분자 접목도가 5.0% 미만이면 소수성이 약하여 콜라겐 겔과의 결합력이 미미하고, 20% 초과여도 한천과 콜라겐 겔의 친화력이 떨어지는 문제가 있다.
다른 일 구현예로는 상기 인공피부 배양용기의 한천 총 중량에 대하여 소수성으로 개질된 한천의 비율은 5.0 내지 50 중량%, 보다 구체적으로는 5.0 내지 20% 중량%일 수 있다. 상기와 같은 중량비에 따라 인공피부 배양용기의 소수성이 결정되며, 목적하는 소수성 정도에 따라 상기 중량비에 제한되지 않고 소수성으로 개질된 한천의 비율을 조절하는 것이 가능하다. 또한, 상기 소수성으로 개질된 한천의 비율은 배양할 인공피부의 섬유아세포수에 따라 선택될 수 있다. 예를 들면, 소수성으로 개질된 한천의 비율이 높은 배양용기를 사용하면 콜라겐과의 결합력이 높으므로 많은 수의 섬유아세포를 수축현상 없이 배양하여 인공피부를 제조할 수 있다.
일 구현예로서 상기 인공피부 배양용기의 측면부 및 하부의 한천 겔 두께는 0.5 내지 50mm, 인공피부를 배양할 내부 바닥부의 지름(diameter)은 0.3 내지 20.0mm를 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(도 2의 배양용기 모식도 참조).
본 발명의 구현예들에 따르면, 상기 한천은 미세기공을 포함할 수 있으며, 상기 미세기공의 평균 입경은 0.1 내지 10 ㎛를 예로 들 수 있다. 또한, 상기 인공피부 배양용기의 기공율은 인공피부 배양용기의 한천 총 부피에 대하여 5 내지 50 부피%일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 상기 기공율 및 미세기공의 평균 입경은 본 발명에 포함되는 한천의 농도에 따라 조절이 가능하다.
상기 미세기공은 상기 한천의 일부가 소수성으로 개질되면서 형성된 것을 포함하나, 상기 입경은 한천의 소수성에 영향을 받지 않는다. 상기 배양용기 내에서 인공피부를 배양시 상기 미세기공을 통하여 인공피부의 콜라겐 섬유가 배양용기 내부로 진입하게 되고, 콜라겐 섬유가 소수성 분자들과 3차원 결합을 통해 배양용기에 고정되어 결합력이 증진됨으로써, 인공피부의 제작과정에서 진피층의 섬유아세포와 콜라겐 섬유의 상호작용으로 인해 진피층이 수축하고 배양 도중 진피층이 용기에서 탈착되는 문제를 방지할 수 있다. 또한, 상기 배양용기를 이용하여 인공피부를 제조할 때 상기 미세기공을 통해 배양용액을 자유롭게 공급할 수 있다. 이로써 정상적인 조직과 생리학적 기능을 갖는 인공피부를 효과적으로 제조할 수 있다(도 2의 오른쪽 사진 참조). 도 2는 상기와 같은 본 발명의 구현예들에 따른 인공피부 배양용기의 모식도와, 그 내부구조에 3차원 미세기공이 도입된 SEM(scanning electron microscope) 사진을 나타낸 도로서, 본 발명의 인공피부 배양용기의 제조방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 한천 겔의 제조방법을 적용하여 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한편, 본 발명의 구현예들은 상기 인공피부 배양용기에서 인공피부를 제조하는 방법으로,
상기 인공피부 배양용기의 내부에 무세포 콜라겐(Acellular Collagen) 용액을 도입하는 단계;
상기 콜라겐 용액을 배양하여 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계;
상기 인공피부 배양용기 내부에 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast) 용액을 도입하고, 상기 콜라겐 용액을 겔화시키는 단계; 및
상기 피부섬유아세포 용액을 배양하면서 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계;
를 포함하는 인공피부의 제조방법을 제공할 수 있다.
첨부된 도 3은 본 발명의 구현예들에 따른 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 제조하는 방법의 예시를 도시한 것이다. 도 3을 참조하여 설명하면, 상기 도입되는 콜라겐의 농도는 3 mg/ml 내지 6 mg/ml를 예로 들 수 있으나, 이에 한정되지 않고 조절이 가능하다. 또한, 상기 도입된 콜라겐 용액을 배양하는 단계는 1~10℃ 또는 3~5℃에서 하루밤 동안 인큐베이션(overnight incubation)하는 것을 포함할 수 있다. 일 구현예로서 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계는, 상기 콜라겐 용액의 콜라겐 섬유가 인공피부 배양용기에 포함된 미세기공에 진입하여 인공피부 배양용기의 소수성으로 개질된 한천과 결합하여 고정되는 단계를 포함할 수 있다. 도 3의 세번째 단계 박스 아래 사진을 참조할 때, 콜라겐 용액의 콜라겐 섬유가 한천으로 된 용기방향으로 배향하여 내부로 진입하였음을 확인할 수 있다.
또한, 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계는, 상기 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음 챔버 내에 배양액을 공급하여 상기 배양액을 상기 인공피부 배양용기의 측면부 및 하부에서 공급하여, 기존에 용기의 아래에서만 공급되던 것과 달리 3차원적으로 공급하는 단계를 포함할 수 있다. 그 다음, 상기 인공피부를 배양용기 내에서 약 7일간 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이때 배양되는 인공피부의 섬유아세포수는 1.0×103 내지 1.0×105 (cells/a culture insert)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예를 통하여 설명한다. 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기의 실시예의 범위로 제한되는 것은 아니다. 또한, 아래에 기술된 비교예는 실시예와 대비하기 위한 것으로 기재된 것일 뿐이며, 종래의 기술로서 기재한 것이 아니다. 또한, 이 기술분야의 통상의 지식을 가진 자이면 누구나 이 발명의 기술 사상의 범주를 이탈하지 않고 첨부한 특허청구범위 내에서 다양한 변형 및 모방이 가능하다.
[실시예 1]
본 발명의 일 실시예로서, 소수성으로 개질되지 않은 한천(Agar, extra pure reagents, Yakuri pure chemicals Co.,Ltd, Japan)과 옥타데실(octadecyl, Sigma Aldrich) 소수성 분자로 개질된 한천을 10:2의 중량비로 포함하고, 한천을 인공피부 배양용기에 대하여 3(w/v)%로 포함하는 한천 겔로 이루어진 인공피부 배양용기를 준비하였다. 상기 한천 배양용기의 두께는 2 mm, 내부 바닥부의 지름(diameter)은 12 mm 이며, 내부 미세기공의 크기는 약 0.5 μm 였다.
[비교예 1]
본 발명의 비교예로서, 한천(Agar, extra pure reagents, Yakuri pure chemicals Co.,Ltd, Japan)을 인공피부 배양용기에 대하여 3 (w/v)%로 포함하는 한천 겔로 이루어진, 순수 한천으로 구성된 인공피부 배양용기를 준비하였다. 상기 한천 배양용기의 두께는 2 mm, 내부 바닥부의 지름(diameter)은 12 mm 이며, 내부 미세기공의 크기는 약 0.5 μm 였다.
[비교예 2]
본 발명의 또다른 비교예로는 기존에 일반적으로 사용되고 있는 인공피부 배양용기인 지름 12 mm, 바닥면 기공크기 0.4 μm를 갖는 트렌스웰(Transwell, Corning, NY, 14831, USA)을 준비하였다.
[시험예 1] 인공피부의 배양 1
상기 제조한 실시예 1, 비교예 1 및 2의 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 하기의 방법에 따라 각각 배양하였다.
이때 제조되는 인공피부 모델은 진피층과 표피층으로 구성된 살아 있는 피부 모사체(Amorepacific Reconstructed Skin)인 아모레스킨(AmoReSkinTM, ㈜아모레퍼시픽 그룹)으로, 상기 인공피부 모델은 콜라겐과 피부섬유아세포를 이용하여 진피층을 형성하고, 그 위에서 각질형성세포를 증식, 분화시킴으로써 실제 피부와 구조적/기능적으로 유사한 특징을 가지고 있다.
먼저, 상기 제조된 실시예 1 및 비교예 1의 배양용기를 각각 상온건조를 통해 수분 함량을 80% 이하까지 낮추었다. 6 mg/ml 콜라겐 용액을 건조된 한천 배양용기에 0.5 ml 도입하고, 4˚C에서 하루밤 동안 인큐베이션(overnight incubation)하였다. 인큐베이션을 통해 콜라겐 용액을 한천 배양용기 내부에 진입시킨 후, 1.0 × 104 개수의 피부섬유아세포를 콜라겐 용액에 혼합하여, 60 μl의 콜라겐용액(reconstitution solution, 0.22 g NaHCO3, 0.477g HEPES, 0.4 mL 1N NaOH in 10 mL H2O)으로 콜라겐을 겔화시켰다. 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음, 챔버 내에 배양액(DMEM)을 공급하여 3차원적으로 배양액을 공급하는 가운데 7일간 배양하여 인공피부의 진피층을 형성하였다.
또한, 상기 비교예 2에는 6 mg/ml 콜라겐 용액을 0.5 ml를 도입하고, 1.0 × 104 개수의 피부섬유아세포를 혼합한 콜라겐용액(reconstitution solution, 0.22 g NaHCO3, 0.477g HEPES, 0.4 mL 1N NaOH in 10 mL H2O)으로 콜라겐을 겔화시켰다. 트렌스웰을 챔버 내부에 위치시킨 다음, 챔버 내에 배양액(DMEM)을 공급하여 배양액을 트렌스웰 하부를 통해 공급하는 가운데 7일간 배양하여 인공피부의 진피층을 형성하였다.
상기와 같이 형성된 진피층 위에 1.5x105개의 각질형성세포(human neonatal keratinocyte, HEKn, Cascade Biologics)를 심고, 배양 삽입체의 내부와 외부에 모두 각질형성세포 배양배지(EpiLife, Cascade Biologics)를 넣어주고 하루 밤 동안 배양 후 세포의 부착상태를 확인하였다. 이후 이틀에 한번씩 배지를 교환하면서 약 일주일간 배양하여 표피 세포들의 증식을 유도하였다. 표피세포들이 잘 증식하여 진피층의 상부를 모두 덮으면 배지에 1.2mM 농도의 Ca2 +를 첨가하여 이틀간 각질형성세포의 분화를 유도하였다. 이후 배지를 모두 제거하고 배양삽입체의 외부에만 배지를 넣어주어 각질형성세포를 공기 중에 노출시켰다. 매일 배지를 갈아주면서 일주일간 공기노출배양을 진행하여 표피층을 생성시켜 인공피부를 완성하였다.
상기와 같이 7일간 인공피부의 진피층을 배양하는 동안 진피층의 수축 정도를 관찰하였고, 최종적으로 완성된 인공피부의 모습을 촬영하여 도 4에 나타내었다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 일반 인공피부 배양용기인 비교예 2의 경우 진피층의 심한 수축으로 인공피부의 조직 형태를 유지하지 못하였고, 순수 한천으로 제조된 비교예 1의 배양용기 역시 콜라겐과 섬유아세포의 상호작용으로 인공피부가 배양용기로부터 탈착되었음을 알 수 있다. 이에 반해, 본 발명에 따른 실시예 1의 소수성 한천 배양용기는 콜라겐 섬유가 배양용기와 높은 결합력을 가짐으로써 진피층의 수축 및 배양용기로부터의 탈착이 방지되었음을 확인할 수 있다.
[시험예 2] 인공피부의 배양 2
상기 제조한 실시예 1 및 비교예 1의 인공피부 배양용기를 사용하여 인공피부를 하기의 방법에 따라 각각 배양하였다.
이때 제조되는 인공피부 모델은 진피층과 표피층으로 구성된 살아 있는 피부 모사체(Amorepacific Reconstructed Skin)인 아모레스킨(AmoReSkinTM, ㈜아모레퍼시픽 그룹)으로, 상기 인공피부 모델은 이는 콜라겐과 섬유아세포를 이용하여 진피층을 형성하고, 그 위에서 각질형성세포를 증식, 분화시킴으로써 실제 피부와 구조적, 기능적으로 유사한 특징을 가지고 있다.
먼저, 상기 제조된 실시예 1 및 비교예 1의 배양용기를 각각 상온건조를 통해 수분 함량을 80% 이하까지 낮추었다. 6 mg/ml 콜라겐 용액을 건조된 한천 배양용기에 0.5 ml 도입하고, 4˚C에서 하루밤 동안 인큐베이션(overnight incubation)하였다. 인큐베이션을 통해 콜라겐 용액을 한천 배양용기 내부에 진입시킨 후, 1.0 × 104 개수의 피부섬유아세포를 콜라겐 용액에 혼합하여, 60 μl의 콜라겐용액(reconstitution solution, 0.22 g NaHCO3, 0.477g HEPES, 0.4 mL 1N NaOH in 10 mL H2O)으로 콜라겐을 겔화시켰다. 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음, 챔버 내에 배양액(DMEM)을 공급하여 3차원적으로 배양액을 공급하는 가운데 인공피부를 7일간 배양하여 인공피부의 진피층을 형성하였다.
상기와 같이 형성된 진피층 위에 1.5x10^5개의 각질형성세포(human neonatal keratinocyte, HEKn, Cascade Biologics)를 심고, 배양 삽입체의 내부와 외부에 모두 각질형성세포 배양배지(EpiLife, Cascade Biologics)를 넣어주고 하루 밤 동안 배양 후 세포의 부착상태를 확인하였다. 이후 이틀에 한번씩 배지를 교환하면서 약 일주일간 배양하여 표피 세포들의 증식을 유도하였다. 표피세포들이 잘 증식하여 진피층의 상부를 모두 덮으면 배지에 1.2mM 농도의 Ca2 +를 첨가하여 이틀간 각질형성세포의 분화를 유도하였다. 이후 배지를 모두 제거하고 배양삽입체의 외부에만 배지를 넣어주어 각질형성세포를 공기 중에 노출시켰다. 매일 배지를 갈아주면서 일주일간 공기노출배양을 진행하여 표피층을 생성시켜 인공피부를 완성하였다.
그 다음, 최종배양된 인공피부의 한천 배양용기와 진피층의 탈착 및 결합 모습을 촬영하여 도 5 및 도 6에 나타내었다.
도 5의 왼쪽 두 사진은 인공피부를 비교예 1의 일반적인 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착하였음을 보이고 있으며, 오른쪽 두 사진은 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우 인공피부가 용기로부터 탈착되지 않고 밀접하게 결합되어 있음을 보이고 있다. 또한, 도 6은 인공피부를 실시예 1의 소수성으로 개질된 한천 배양용기에서 배양한 경우, 진피층의 콜라겐 파이버가 배양용기 안쪽으로 배향되어 진입한 모습을 촬영한 것이다.
이로부터, 본 발명에 따른 인공피부 배양용기는 인공피부의 배양시 인공피부와 밀접하게 결합함으로써 인공피부가 배양되는 과정에서 발생하는 수축으로 인한 용기와의 탈착을 방지하여, 효과적으로 인공피부를 배양할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (11)

  1. 겔 형태의 한천(agar)을 포함하고,
    상기 한천은 일부가 소수성으로 개질된 것인, 인공피부 배양용기.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 한천 중 소수성으로 개질된 한천(Hydrophobically-modified agar)은 한천에 포함되는 아가로스(agarose)의 하나 이상의 수소가 소수성 분자로 치환된 것인, 인공피부 배양용기.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 소수성 분자는,
    탄소수 12 내지 18의 알킬(alkyl), 알케닐(alkenyl) 및 아실(acyl) 사슬 중 하나 이상;
    폴리프로필렌 글리콜(Polypropylene glycol); 및
    폴리카프로락톤(polycaprolactone)으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 인공피부 배양용기.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 한천이 겔화되기 전의 한천 분말 100개를 1 유닛(unit)으로 하고, 1 유닛당 한천 분말에 치환된 소수성 분자수를 접목도(Degree of substitution, %)라 할 때, 상기 인공피부 배양용기의 한천에 대한 소수성 분자 접목도는 5.0% 내지 20%인, 인공피부 배양용기.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 인공피부 배양용기의 한천 총 중량에 대하여 소수성으로 개질된 한천의 비율은 5.0 내지 50중량%인 인공피부 배양용기.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 한천은 미세기공을 포함하는 것인, 인공피부 배양용기.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 미세기공의 평균 입경은 0.1 내지 10 ㎛인, 인공피부 배양용기.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 인공피부 배양용기의 기공율은 인공피부 배양용기의 한천 총 부피에 대하여 5 내지 50 부피%인, 인공피부 배양용기.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 인공피부 배양용기에서 인공피부를 제조하는 방법으로,
    상기 인공피부 배양용기의 내부에 무세포 콜라겐(Acellular Collagen) 용액을 도입하는 단계;
    상기 콜라겐 용액을 배양하여 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계;
    상기 인공피부 배양용기 내부에 피부섬유아세포(Human dermal fibroblast) 용액을 도입하고, 상기 콜라겐 용액을 겔화시키는 단계; 및
    상기 섬유아세포 용액을 배양하면서 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계;
    를 포함하는 인공피부의 제조방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 도입된 무세포 콜라겐 용액을 상기 인공피부 배양용기의 한천 내부로 진입(invasion)시키는 단계는, 상기 콜라겐 용액의 콜라겐 섬유가 인공피부 배양용기에 포함된 미세기공에 진입하여 인공피부 배양용기의 소수성으로 개질된 한천과 결합하여 고정되는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 인공피부 배양용기 외부에서 배양액을 공급하는 단계는, 상기 인공피부 배양용기를 챔버 내부에 위치시킨 다음 챔버 내에 배양액을 공급하여 상기 배양액을 상기 인공피부 배양용기의 측면부 및 하부에서 공급하는 단계를 포함하는 인공피부의 제조방법.
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