JPH08243156A - 培養皮膚およびその製造法 - Google Patents
培養皮膚およびその製造法Info
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- JPH08243156A JPH08243156A JP7047587A JP4758795A JPH08243156A JP H08243156 A JPH08243156 A JP H08243156A JP 7047587 A JP7047587 A JP 7047587A JP 4758795 A JP4758795 A JP 4758795A JP H08243156 A JPH08243156 A JP H08243156A
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- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 コラーゲン基材に播種する際に細胞が落下逸
脱することなく培養増殖された表皮細胞および／または
線維芽細胞への充分な栄養分の供給ならびに適用部から
の浸出液の排出を円滑に行いうると同時に収縮をおさえ
た培養皮膚を提供する。 【構成】 コラーゲン基材に貫通孔を設けることによ
り、細胞を播種する際に生ずる細胞の落下逸脱の防止を
目的とした前処理を必要としない手段を用いて、培養皮
膚を創面に適用する前に該培養皮膚に貫通孔を設けるこ
とによって、適用創面からの培養細胞への栄養供給、お
よび適用部に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうる
と同時に収縮度を下げた培養皮膚用基材、培養皮膚およ
びそれらの製造法。
脱することなく培養増殖された表皮細胞および／または
線維芽細胞への充分な栄養分の供給ならびに適用部から
の浸出液の排出を円滑に行いうると同時に収縮をおさえ
た培養皮膚を提供する。 【構成】 コラーゲン基材に貫通孔を設けることによ
り、細胞を播種する際に生ずる細胞の落下逸脱の防止を
目的とした前処理を必要としない手段を用いて、培養皮
膚を創面に適用する前に該培養皮膚に貫通孔を設けるこ
とによって、適用創面からの培養細胞への栄養供給、お
よび適用部に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうる
と同時に収縮度を下げた培養皮膚用基材、培養皮膚およ
びそれらの製造法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は培養皮膚およびその製造
法に関する。さらに詳しくは、熱傷、創傷、褥瘡または
皮膚潰瘍などの皮膚欠損創に用いて、欠損組織を早期に
再建させるまたは治療するための培養皮膚用基材、培養
皮膚およびそれらの製造法に関する。
法に関する。さらに詳しくは、熱傷、創傷、褥瘡または
皮膚潰瘍などの皮膚欠損創に用いて、欠損組織を早期に
再建させるまたは治療するための培養皮膚用基材、培養
皮膚およびそれらの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来より浅達性II度熱傷など真皮の浅い
部分に達する皮膚欠損創の治療としては創傷被覆材の適
用あるいは軟膏塗布ガーゼなどを適用するのが一般的に
行われてきた治療である。しかしながら、深達性II度熱
傷、III度熱傷あるいはII度以上の褥瘡など真皮の深い
部分に達する皮膚欠損を負ったばあい、自己の表皮細胞
増殖による皮膚組織の再建は期待できない。そこで、ま
ず壊死組織あるいは不良肉芽組織を切除し、同種皮膚ま
たは創傷被覆材などを適用して良好な肉芽組織を再建し
たのち、自家分層植皮を行うことにより皮膚を再建する
という治療が行われてきた。しかし、自家分層植皮を行
うばあいには、自己の健全な部位から採皮するが、採皮
した部位には傷跡が残るという整容についての問題が生
じる。また患部が広範囲であるばあいには、自家分層植
皮が困難である。
部分に達する皮膚欠損創の治療としては創傷被覆材の適
用あるいは軟膏塗布ガーゼなどを適用するのが一般的に
行われてきた治療である。しかしながら、深達性II度熱
傷、III度熱傷あるいはII度以上の褥瘡など真皮の深い
部分に達する皮膚欠損を負ったばあい、自己の表皮細胞
増殖による皮膚組織の再建は期待できない。そこで、ま
ず壊死組織あるいは不良肉芽組織を切除し、同種皮膚ま
たは創傷被覆材などを適用して良好な肉芽組織を再建し
たのち、自家分層植皮を行うことにより皮膚を再建する
という治療が行われてきた。しかし、自家分層植皮を行
うばあいには、自己の健全な部位から採皮するが、採皮
した部位には傷跡が残るという整容についての問題が生
じる。また患部が広範囲であるばあいには、自家分層植
皮が困難である。
【０００３】この問題を解決するために、わずかな皮膚
片から表皮細胞あるいは線維芽細胞を採取し、フラスコ
中で大量培養する技術が開発され、これらの培養細胞を
用いた種々の培養皮膚が開発されてきている。
片から表皮細胞あるいは線維芽細胞を採取し、フラスコ
中で大量培養する技術が開発され、これらの培養細胞を
用いた種々の培養皮膚が開発されてきている。
【０００４】ハワード・グリーン（Ｈ．Ｇｒｅｅｎ）、
ジェームズ・レインワルド（Ｊ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）
らが開発した培養表皮は、切手大の皮膚を採取し、表皮
細胞をフラスコ中で大量培養して表皮シートをうるもの
であるが、該シートをフラスコから剥離する際の酵素処
理によって最も重要な細胞である基底細胞が損傷を受け
るために自家移植において生着率が低いという問題点が
指摘されている（黒柳能光、生体材料９巻、１９９１年
２月号参照）。
ジェームズ・レインワルド（Ｊ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）
らが開発した培養表皮は、切手大の皮膚を採取し、表皮
細胞をフラスコ中で大量培養して表皮シートをうるもの
であるが、該シートをフラスコから剥離する際の酵素処
理によって最も重要な細胞である基底細胞が損傷を受け
るために自家移植において生着率が低いという問題点が
指摘されている（黒柳能光、生体材料９巻、１９９１年
２月号参照）。
【０００５】またユージーン・ベル（Ｅ．Ｂｅｌｌ）ら
（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１１巻、１０５２
〜１０５４頁、１９８１年参照）は、皮膚から分離、採
取した表皮細胞および線維芽細胞を各々フラスコ中で大
量に培養し、線維芽細胞を組み込んだコラーゲンゲル上
に表皮細胞を重層化させた培養皮膚を開発した。しかし
コラーゲンゲルは、細胞培養中に極端に収縮するのが欠
点であった。
（サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２１１巻、１０５２
〜１０５４頁、１９８１年参照）は、皮膚から分離、採
取した表皮細胞および線維芽細胞を各々フラスコ中で大
量に培養し、線維芽細胞を組み込んだコラーゲンゲル上
に表皮細胞を重層化させた培養皮膚を開発した。しかし
コラーゲンゲルは、細胞培養中に極端に収縮するのが欠
点であった。
【０００６】さらに、スティーブン・ボイス（Ｓ．Ｂｏ
ｙｃｅ）ら（サージェリー（ＳＵＲＧＥＲＹ）、１０３
巻、４２１〜４３１頁、１９８８年４月号参照）は、皮
膚からえられる表皮細胞をフラスコ中で大量に培養し、
コラーゲンにコンドロイチン−６−硫酸を少量添加して
スポンジ状にした基材上に表皮細胞を重層化させた培養
皮膚を開発した。
ｙｃｅ）ら（サージェリー（ＳＵＲＧＥＲＹ）、１０３
巻、４２１〜４３１頁、１９８８年４月号参照）は、皮
膚からえられる表皮細胞をフラスコ中で大量に培養し、
コラーゲンにコンドロイチン−６−硫酸を少量添加して
スポンジ状にした基材上に表皮細胞を重層化させた培養
皮膚を開発した。
【０００７】また、アテロコラーゲンを基材として有す
る培養皮膚が、特開昭６２−２４６３７１号公報および
特開平第４−３３２５６１号公報に記載されている。特
開昭６２−２４６３７１号公報には、アテロコラーゲン
シートを基材とする培養皮膚が記載されているが、シー
トに貫通孔がないので、適用創面からもたらされる細胞
増殖などに欠かすことのできない栄養分がシートを透過
してシート上の表皮細胞にまで供給され難いために自家
移植においては、表皮の生着率が低いという問題があっ
た。
る培養皮膚が、特開昭６２−２４６３７１号公報および
特開平第４−３３２５６１号公報に記載されている。特
開昭６２−２４６３７１号公報には、アテロコラーゲン
シートを基材とする培養皮膚が記載されているが、シー
トに貫通孔がないので、適用創面からもたらされる細胞
増殖などに欠かすことのできない栄養分がシートを透過
してシート上の表皮細胞にまで供給され難いために自家
移植においては、表皮の生着率が低いという問題があっ
た。
【０００８】また、線維芽細胞のみを組み込んだ培養皮
膚を作製したばあいにおいても、やはり適用創面からも
たらされる栄養分が培養皮膚基材全体へ供給され難いた
めに線維芽細胞の増殖と代謝が不活発となること、生理
活性物質の放出が円滑になされなくなることなどのため
に皮膚の再建または良性肉芽の形成に支障をきたすこと
がある。
膚を作製したばあいにおいても、やはり適用創面からも
たらされる栄養分が培養皮膚基材全体へ供給され難いた
めに線維芽細胞の増殖と代謝が不活発となること、生理
活性物質の放出が円滑になされなくなることなどのため
に皮膚の再建または良性肉芽の形成に支障をきたすこと
がある。
【０００９】さらに貫通孔がないことで、適用部に浸出
液が過度に貯留し、この排出が適度になされず感染の温
床となるという問題もあった。
液が過度に貯留し、この排出が適度になされず感染の温
床となるという問題もあった。
【００１０】特開平第４−３３２５６１号公報には、前
記のような問題点を解決するために貫通孔を設けたアテ
ロコラーゲンスポンジが記載されているが、貫通孔を設
けると細胞を播種する際に細胞が落下逸脱してしまうの
で、これを防ぐために細胞播種前にあらかじめアテロコ
ラーゲンゲルなどでスポンジをコーティングすることを
必須としたものであり、こうした方法は、煩雑であるば
かりでなくコストの高い培養皮膚となってしまうという
問題がある。そのため、より安価で簡便な代替品または
手法の開発が望まれていた。
記のような問題点を解決するために貫通孔を設けたアテ
ロコラーゲンスポンジが記載されているが、貫通孔を設
けると細胞を播種する際に細胞が落下逸脱してしまうの
で、これを防ぐために細胞播種前にあらかじめアテロコ
ラーゲンゲルなどでスポンジをコーティングすることを
必須としたものであり、こうした方法は、煩雑であるば
かりでなくコストの高い培養皮膚となってしまうという
問題がある。そのため、より安価で簡便な代替品または
手法の開発が望まれていた。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】従来からコラーゲンを
基材として用いた培養皮膚において課題とされていた点
は、 １．細胞の培養中における培養皮膚の収縮、 ２．皮膚欠損組織に適用後に、培養皮膚基材がバリアー
となり、適用創面から培養皮膚全体への栄養供給が円滑
にいかないこと、 ３．皮膚欠損組織への適用後に、培養皮膚適用部に浸出
液が過度に貯留すること、および ４．前記２および３を防ぐために基材に貫通孔を設けた
ばあい、細胞播種時に細胞が落下逸脱してしまうことで
あった。
基材として用いた培養皮膚において課題とされていた点
は、 １．細胞の培養中における培養皮膚の収縮、 ２．皮膚欠損組織に適用後に、培養皮膚基材がバリアー
となり、適用創面から培養皮膚全体への栄養供給が円滑
にいかないこと、 ３．皮膚欠損組織への適用後に、培養皮膚適用部に浸出
液が過度に貯留すること、および ４．前記２および３を防ぐために基材に貫通孔を設けた
ばあい、細胞播種時に細胞が落下逸脱してしまうことで
あった。
【００１２】本発明はかかる１〜４の課題を解消するた
めになされたものであり、熱傷、創傷、褥瘡または皮膚
潰瘍など皮膚欠損創に用いて、皮膚欠損組織を早期に再
建させるまたは治療するための培養皮膚を提供すること
を目的とする。さらに詳しくは、適用創面から培養皮膚
の細胞への栄養分供給および適用部に過度に貯留する浸
出液の排出が円滑に行われうる機能を有し、しかも同時
に収縮をおさえて安価に作製しうる培養皮膚を提供する
ことを目的とする。
めになされたものであり、熱傷、創傷、褥瘡または皮膚
潰瘍など皮膚欠損創に用いて、皮膚欠損組織を早期に再
建させるまたは治療するための培養皮膚を提供すること
を目的とする。さらに詳しくは、適用創面から培養皮膚
の細胞への栄養分供給および適用部に過度に貯留する浸
出液の排出が円滑に行われうる機能を有し、しかも同時
に収縮をおさえて安価に作製しうる培養皮膚を提供する
ことを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】前記の目的は、培養皮膚
用コラーゲン基材へ細胞を播種する際の細胞の落下逸脱
の防止を目的とした処理を必要としない手段で、培養皮
膚を適用する時点では貫通孔を設けられていることによ
って、培養皮膚に播種された細胞への栄養供給、および
適用部に過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われう
ると同時に収縮をおさえた培養皮膚を提供することであ
る。
用コラーゲン基材へ細胞を播種する際の細胞の落下逸脱
の防止を目的とした処理を必要としない手段で、培養皮
膚を適用する時点では貫通孔を設けられていることによ
って、培養皮膚に播種された細胞への栄養供給、および
適用部に過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われう
ると同時に収縮をおさえた培養皮膚を提供することであ
る。
【００１４】したがって本発明は、 ａ）コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラ
ーゲンゲルからなる培養皮膚用基材に貫通孔を生じるた
めの突起物を有する手段内で作製する工程、 ｂ）該基材に皮膚由来の細胞を播種培養する工程および ｃ）培養皮膚が適用される前に突起物を有する手段によ
り貫通孔が設けられる工程からなり、工程ａ）および
ｂ）は同時に行ってもよい培養皮膚の製造法、突起物を
有する手段により培養皮膚が適用される前に貫通孔が設
けられる、コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまた
はコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材の製造法に関
する。
ーゲンゲルからなる培養皮膚用基材に貫通孔を生じるた
めの突起物を有する手段内で作製する工程、 ｂ）該基材に皮膚由来の細胞を播種培養する工程および ｃ）培養皮膚が適用される前に突起物を有する手段によ
り貫通孔が設けられる工程からなり、工程ａ）および
ｂ）は同時に行ってもよい培養皮膚の製造法、突起物を
有する手段により培養皮膚が適用される前に貫通孔が設
けられる、コラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまた
はコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材の製造法に関
する。
【００１５】前記製造法において好ましくは、工程ｂ）
が該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細胞を播
種する工程、該基材の片面に表皮細胞を播種培養する工
程または該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細
胞を播種培養し、かつ該基材の片面に表皮細胞を播種培
養する工程であり、工程ｃ）が該突起物を取除くことに
より成し遂げられ、突起物を有する手段が突起物を有す
る支持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う
突起物を有する支持体ないし容器であり、コラーゲンは
アテロコラーゲンであり、および／または培養皮膚用基
材がヒアルロン酸を含んでなる。
が該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細胞を播
種する工程、該基材の片面に表皮細胞を播種培養する工
程または該基材の少なくとも片面に皮膚由来の線維芽細
胞を播種培養し、かつ該基材の片面に表皮細胞を播種培
養する工程であり、工程ｃ）が該突起物を取除くことに
より成し遂げられ、突起物を有する手段が突起物を有す
る支持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う
突起物を有する支持体ないし容器であり、コラーゲンは
アテロコラーゲンであり、および／または培養皮膚用基
材がヒアルロン酸を含んでなる。
【００１６】さらに本発明は、中空の貫通孔を有するコ
ラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲン
ゲルからなる培養皮膚用基材ならびに中空の貫通孔を有
するコラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラ
ーゲンゲルからなる培養皮膚用基材および線維芽細胞、
表皮細胞またはこれらの組合せである皮膚由来の細胞か
らなる培養皮膚に関する。
ラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲン
ゲルからなる培養皮膚用基材ならびに中空の貫通孔を有
するコラーゲンスポンジ、コラーゲンシートまたはコラ
ーゲンゲルからなる培養皮膚用基材および線維芽細胞、
表皮細胞またはこれらの組合せである皮膚由来の細胞か
らなる培養皮膚に関する。
【００１７】本発明においては、突起物を有する手段と
して、けんざんのようなもので、培養皮膚用基材作製後
に貫通孔を設けることもできるが好ましくは、中空の貫
通孔が突起物を有する手段により設けられ、突起物を有
する手段が配された、該突起物を取除くことにより生じ
る中空の貫通孔を有し、突起物を有する手段が突起物を
有する支持体、突起物を有する容器または剥離シートを
伴う突起物を有する支持体ないし容器であり、コラーゲ
ンがアテロコラーゲンであり、および／または培養皮膚
用基材がヒアルロン酸を含んでなる。
して、けんざんのようなもので、培養皮膚用基材作製後
に貫通孔を設けることもできるが好ましくは、中空の貫
通孔が突起物を有する手段により設けられ、突起物を有
する手段が配された、該突起物を取除くことにより生じ
る中空の貫通孔を有し、突起物を有する手段が突起物を
有する支持体、突起物を有する容器または剥離シートを
伴う突起物を有する支持体ないし容器であり、コラーゲ
ンがアテロコラーゲンであり、および／または培養皮膚
用基材がヒアルロン酸を含んでなる。
【００１８】
【実施例】本明細書において「中空」という語は、ゲル
などを含まない状態、たとえば前記突起物が取除かれた
状態などを意味する。
などを含まない状態、たとえば前記突起物が取除かれた
状態などを意味する。
【００１９】本願発明の培養皮膚用基材には、コラーゲ
ン、ゼラチン、キチン、キトサン、ポリグリコール酸、
コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸などのムコ多糖
類などを用いることができ、前記コラーゲンは、たとえ
ばアテロコラーゲンなどのように生体適合性に優れたも
のであることが好ましい。
ン、ゼラチン、キチン、キトサン、ポリグリコール酸、
コンドロイチン硫酸またはヒアルロン酸などのムコ多糖
類などを用いることができ、前記コラーゲンは、たとえ
ばアテロコラーゲンなどのように生体適合性に優れたも
のであることが好ましい。
【００２０】本発明に用いられるコラーゲンスポンジ
は、酸性に調製したコラーゲン溶液をホモジナイザーを
用いてホモジナイズすることにより充分に気泡を含ませ
たものを突起物を有する手段、すなわち突起物を有する
支持体を設置したプラスチックなどの容器もしくは突起
物を有する容器または剥離シートを伴う突起物を有する
支持体ないし容器に流し込み、アンモニアガス雰囲気中
に静置してゲル化させたのち凍結乾燥を行い、ついで紫
外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入するこ
とにより作製することができる。
は、酸性に調製したコラーゲン溶液をホモジナイザーを
用いてホモジナイズすることにより充分に気泡を含ませ
たものを突起物を有する手段、すなわち突起物を有する
支持体を設置したプラスチックなどの容器もしくは突起
物を有する容器または剥離シートを伴う突起物を有する
支持体ないし容器に流し込み、アンモニアガス雰囲気中
に静置してゲル化させたのち凍結乾燥を行い、ついで紫
外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入するこ
とにより作製することができる。
【００２１】本発明においてコラーゲン溶液は、ウシ真
皮などからえられたコラーゲンから調製して、ｐＨを好
ましくは２〜４に調整し、濃度が０．２〜３ｗ／ｖ％、
好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％とすることによりえられ
る。ゲル化はアンモニアなどのガス雰囲気下で必要に応
じて数分〜２時間程度行い、こののち、凍結乾燥を行
う。
皮などからえられたコラーゲンから調製して、ｐＨを好
ましくは２〜４に調整し、濃度が０．２〜３ｗ／ｖ％、
好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％とすることによりえられ
る。ゲル化はアンモニアなどのガス雰囲気下で必要に応
じて数分〜２時間程度行い、こののち、凍結乾燥を行
う。
【００２２】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
スポンジの大きさは患部の大きさにあわせて適宜選択さ
れる。また、コラーゲンスポンジの厚さおよび形状は適
用される患部の状態によって変化するが、厚さ０．２〜
３０ｍｍ、形状は、シート状、板状、棒状、球状、紡錘
状あるいは両側凸のレンズ状などに成形するとよい。
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
スポンジの大きさは患部の大きさにあわせて適宜選択さ
れる。また、コラーゲンスポンジの厚さおよび形状は適
用される患部の状態によって変化するが、厚さ０．２〜
３０ｍｍ、形状は、シート状、板状、棒状、球状、紡錘
状あるいは両側凸のレンズ状などに成形するとよい。
【００２３】本発明に用いられるコラーゲンシートは、
コラーゲン溶液を前記スポンジ作製と同様の容器に入
れ、乾燥機の中で風乾してシートを形成させたのち、紫
外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入するこ
とにより作製することができる。
コラーゲン溶液を前記スポンジ作製と同様の容器に入
れ、乾燥機の中で風乾してシートを形成させたのち、紫
外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入するこ
とにより作製することができる。
【００２４】前記コラーゲンシート作製に用いられるコ
ラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲン
から調製して、ｐＨを好ましくは２〜４に調整し、濃度
が０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％
とすることによりえられる。
ラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲン
から調製して、ｐＨを好ましくは２〜４に調整し、濃度
が０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％
とすることによりえられる。
【００２５】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
シートの大きさおよび厚さは患部の状態にあわせて適宜
選択される。
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
シートの大きさおよび厚さは患部の状態にあわせて適宜
選択される。
【００２６】本発明に用いられるコラーゲンゲルは、コ
ラーゲン溶液を前記スポンジを作製するのと同様の容器
に流し込み、熱をかけるかあるいはアンモニアガス雰囲
気中に放置してゲル化させることにより作製することが
できる。
ラーゲン溶液を前記スポンジを作製するのと同様の容器
に流し込み、熱をかけるかあるいはアンモニアガス雰囲
気中に放置してゲル化させることにより作製することが
できる。
【００２７】前記コラーゲンゲルを作製するのに用いら
れるコラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラ
ーゲンから調製して、ｐＨを好ましくは２〜４、濃度が
０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％と
し、ゲル化はアンモニアなどのアルカリ性ガス雰囲気下
で必要に応じて数分〜２時間行う。ゲル化後、緩衝液な
どでよくすすぐ。または、コラーゲンの中性溶液（ｐＨ
６．５〜８）をゲル化させるばあい濃度０．１〜１ｗ／
ｖ％、好ましくは０．２〜０．５ｗ／ｖ％でアルカリ性
ガスなどは用いずに３６〜４０℃（度）に静置してゲル
をうる。
れるコラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラ
ーゲンから調製して、ｐＨを好ましくは２〜４、濃度が
０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％と
し、ゲル化はアンモニアなどのアルカリ性ガス雰囲気下
で必要に応じて数分〜２時間行う。ゲル化後、緩衝液な
どでよくすすぐ。または、コラーゲンの中性溶液（ｐＨ
６．５〜８）をゲル化させるばあい濃度０．１〜１ｗ／
ｖ％、好ましくは０．２〜０．５ｗ／ｖ％でアルカリ性
ガスなどは用いずに３６〜４０℃（度）に静置してゲル
をうる。
【００２８】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
ゲルの大きさは患部の大きさに合わせて適宜選択され
る。また、コラーゲンゲルの厚さおよび形状は適用され
る患部の状態によって適宜選択されればよいが、厚さ
０．２〜３０ｍｍ、形状は、シート状、板状、棒状、紡
錘状あるいは両側凸のレンズ状などに成形するとよい。
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ2の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、
グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレン
ジイソシアネートなどがあげられる。また、コラーゲン
ゲルの大きさは患部の大きさに合わせて適宜選択され
る。また、コラーゲンゲルの厚さおよび形状は適用され
る患部の状態によって適宜選択されればよいが、厚さ
０．２〜３０ｍｍ、形状は、シート状、板状、棒状、紡
錘状あるいは両側凸のレンズ状などに成形するとよい。
【００２９】本発明の培養皮膚は、培養皮膚の収縮を抑
え同時に適用創面から培養皮膚に播種された細胞への栄
養供給、および適用部に過度に貯留する浸出液の排出が
円滑に行われうるよう突起物を配して貫通孔が設けられ
るように作製されるが、該貫通孔を設ける手段は、たと
えばゲルによる被覆のように細胞播種時の細胞の落下逸
脱を目的とした特定の前処理などを必要としないもので
ある。
え同時に適用創面から培養皮膚に播種された細胞への栄
養供給、および適用部に過度に貯留する浸出液の排出が
円滑に行われうるよう突起物を配して貫通孔が設けられ
るように作製されるが、該貫通孔を設ける手段は、たと
えばゲルによる被覆のように細胞播種時の細胞の落下逸
脱を目的とした特定の前処理などを必要としないもので
ある。
【００３０】このような培養皮膚の収縮を抑え同時に貫
通孔を設ける手段としては、基材を作製する際に用いら
れ、培養皮膚適用前に除去される、突起物を有する支持
体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突起物
を有する支持体ないし容器などがあげられる。
通孔を設ける手段としては、基材を作製する際に用いら
れ、培養皮膚適用前に除去される、突起物を有する支持
体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突起物
を有する支持体ないし容器などがあげられる。
【００３１】支持体は、好ましくは網目状の骨格を有
し、その骨格上に突起物が配されるものである。
し、その骨格上に突起物が配されるものである。
【００３２】前記支持体の骨格となる網目の形状はたと
えば多角形、円形、楕円形などでよいがとくに限定され
ず、また必ずしも全体にわたって同一の形状である必要
はない。また空隙の大きさも適宜変化してよいが、支持
体の面積の少なくとも１／２以上を有して、均斉にある
ことが好ましい。網目が交差する各部位のあいだの距離
は５〜３０ｍｍ、好ましくは７〜２０ｍｍとするとよ
い。支持体の厚さは破損しない程度に薄い方が好まし
い。
えば多角形、円形、楕円形などでよいがとくに限定され
ず、また必ずしも全体にわたって同一の形状である必要
はない。また空隙の大きさも適宜変化してよいが、支持
体の面積の少なくとも１／２以上を有して、均斉にある
ことが好ましい。網目が交差する各部位のあいだの距離
は５〜３０ｍｍ、好ましくは７〜２０ｍｍとするとよ
い。支持体の厚さは破損しない程度に薄い方が好まし
い。
【００３３】突起物の形状、数、大きさもとくには限定
されないが、作製および取扱い操作において簡便である
ものがよい。突起物の高さは、えられる基材の厚さ以上
であればよく、また搾設される面積が、０．００３〜
０．２５ｃｍ2／ｃｍ2、好ましくは０．０１〜０．１２
ｃｍ2／ｃｍ2を満たす太さまたは形状を有する。具体的
には、円柱形、円錐形、多角柱形、多角錐形などのもの
が好適に用いられる。なお、これらの形状の先端は丸み
を帯びていてもよい。
されないが、作製および取扱い操作において簡便である
ものがよい。突起物の高さは、えられる基材の厚さ以上
であればよく、また搾設される面積が、０．００３〜
０．２５ｃｍ2／ｃｍ2、好ましくは０．０１〜０．１２
ｃｍ2／ｃｍ2を満たす太さまたは形状を有する。具体的
には、円柱形、円錐形、多角柱形、多角錐形などのもの
が好適に用いられる。なお、これらの形状の先端は丸み
を帯びていてもよい。
【００３４】また、培養皮膚基材の片面および／または
内部に細胞が播種、培養増殖されるばあい、支持体の骨
格は網目などの空隙を含まない平板でよく、支持体は該
平板の少なくとも片面に突起物が配されたものである。
内部に細胞が播種、培養増殖されるばあい、支持体の骨
格は網目などの空隙を含まない平板でよく、支持体は該
平板の少なくとも片面に突起物が配されたものである。
【００３５】一方、ここで培養皮膚作製に用いる容器
は、その底部に前記支持体上に配したのと同様の突起物
を有する。
は、その底部に前記支持体上に配したのと同様の突起物
を有する。
【００３６】前記支持体および容器およびそれらの突起
物は、たとえばプラスチック、ステンレス、アルミニウ
ム、ガラス、セラミックなどによって作製される。支持
体は、創傷面に培養皮膚を適用する際に培養皮膚が支持
体から容易に剥がれうるように曲げやすい材質が好まし
い。
物は、たとえばプラスチック、ステンレス、アルミニウ
ム、ガラス、セラミックなどによって作製される。支持
体は、創傷面に培養皮膚を適用する際に培養皮膚が支持
体から容易に剥がれうるように曲げやすい材質が好まし
い。
【００３７】前記支持体および容器の骨格は貫通孔が均
斉に設けられる、突起物が均斉に配される構造となるよ
うに設計されることが培養皮膚の収縮を良好に抑え、培
養皮膚全体にわたって栄養分がゆきわたり、適用部より
の浸出液の排出も効率よく行われうるため好ましい。
斉に設けられる、突起物が均斉に配される構造となるよ
うに設計されることが培養皮膚の収縮を良好に抑え、培
養皮膚全体にわたって栄養分がゆきわたり、適用部より
の浸出液の排出も効率よく行われうるため好ましい。
【００３８】さらに、前記突起物を有する支持体ないし
容器は、剥離シートを伴ったものを用いてもよい。剥離
シートは創傷面に培養皮膚を適用する際に培養皮膚が容
器から容易にはがれるように端部が折り曲げられ（図４
の５参照）るような材質が好ましい。たとえばプラスチ
ックシート、ステンレス、アルミシートなどがあげられ
る。
容器は、剥離シートを伴ったものを用いてもよい。剥離
シートは創傷面に培養皮膚を適用する際に培養皮膚が容
器から容易にはがれるように端部が折り曲げられ（図４
の５参照）るような材質が好ましい。たとえばプラスチ
ックシート、ステンレス、アルミシートなどがあげられ
る。
【００３９】しかしながら、本発明の培養皮膚用基材に
播種された細胞への栄養供給、および適用部に過度に貯
留する浸出液の排出が円滑に行われうる貫通孔を設けう
ると同時に培養皮膚の収縮を抑え、細胞播種時の細胞の
落下逸脱を目的とした特定の前処理などを必要としない
手段であれば、本発明の製造法に用いることができるで
あろうことは理解される。
播種された細胞への栄養供給、および適用部に過度に貯
留する浸出液の排出が円滑に行われうる貫通孔を設けう
ると同時に培養皮膚の収縮を抑え、細胞播種時の細胞の
落下逸脱を目的とした特定の前処理などを必要としない
手段であれば、本発明の製造法に用いることができるで
あろうことは理解される。
【００４０】本発明の培養皮膚用基材には、その少なく
とも片面において哺乳動物皮膚由来の表皮細胞および／
または線維芽細胞が播種され培養増殖される。前記表皮
細胞とは、基底細胞を含む角質化細胞および表皮細胞層
に通常存在するその他の細胞を意味するが、このうち培
養増殖させるのは角質化細胞である。前記線維芽細胞と
は、真皮中の主要な細胞であり、コラーゲンをはじめと
する結合組織成分を産生し、これらの成分と結合して結
合組織を形成している細胞をいう。
とも片面において哺乳動物皮膚由来の表皮細胞および／
または線維芽細胞が播種され培養増殖される。前記表皮
細胞とは、基底細胞を含む角質化細胞および表皮細胞層
に通常存在するその他の細胞を意味するが、このうち培
養増殖させるのは角質化細胞である。前記線維芽細胞と
は、真皮中の主要な細胞であり、コラーゲンをはじめと
する結合組織成分を産生し、これらの成分と結合して結
合組織を形成している細胞をいう。
【００４１】本発明の培養皮膚は、播種される細胞に応
じて以下の３種類を作製することが可能である： 本発明のコラーゲン基材の好ましくは両面、少なくと
も片面に線維芽細胞のみを播種培養した培養皮膚（複合
培養真皮）、 本発明のコラーゲン基材の片面に表皮細胞を播種培養
した培養皮膚（複合培養表皮）および 本発明のコラーゲン基材の少なくとも片面で線維芽細
胞を播種培養して、該基材の片面に表皮細胞を播種培養
した培養皮膚（複合培養皮膚）。このばあい、先に線維
芽細胞を播種培養する工程を行う方が、表皮細胞の脱落
を防ぐことができるのでより好ましいが、表皮細胞をま
ず播種培養増殖させたのち、線維芽細胞を播種培養する
工程で行うこともできる。
じて以下の３種類を作製することが可能である： 本発明のコラーゲン基材の好ましくは両面、少なくと
も片面に線維芽細胞のみを播種培養した培養皮膚（複合
培養真皮）、 本発明のコラーゲン基材の片面に表皮細胞を播種培養
した培養皮膚（複合培養表皮）および 本発明のコラーゲン基材の少なくとも片面で線維芽細
胞を播種培養して、該基材の片面に表皮細胞を播種培養
した培養皮膚（複合培養皮膚）。このばあい、先に線維
芽細胞を播種培養する工程を行う方が、表皮細胞の脱落
を防ぐことができるのでより好ましいが、表皮細胞をま
ず播種培養増殖させたのち、線維芽細胞を播種培養する
工程で行うこともできる。
【００４２】前記の３種類の培養皮膚は、患部の面積、
深さおよび患者の症状などによって適宜使い分けること
でより効果が発揮される。また、これらの培養皮膚を自
家、他家で適宜使い分けることもできる。
深さおよび患者の症状などによって適宜使い分けること
でより効果が発揮される。また、これらの培養皮膚を自
家、他家で適宜使い分けることもできる。
【００４３】前記表皮細胞は以下の手順で調製される。
清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および、真皮の一
部または真皮全層）を消毒し、抗生物質を含有する生理
食塩水またはハンクス（Ｈａｎｋ′ｓ）液などの緩衝液
に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度を１０００Ｕ
／ｍｌに調製したダルベッコ変法イーグル最小必須培地
（ＤＭＥＭ）（以下、「ディスパーゼ溶液」という）に
浸漬したのち表皮と真皮に分離する。えられた表皮をト
リプシン濃度０．２５ｗ／ｖ％、エチレンジアミン４酢
酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）濃度０．００５ｍＭ／ｍＬに
調製したハンクス液（以下、「トリプシン溶液」とい
う）中、３７℃で約１５分間浸漬したのち１０ｖ／ｖ％
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（以下、「ＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳ」という）などの培地中に移し、振
とうすることにより細胞を分散させ、約４００×ｇ、５
分間、遠心分離して採取させることによってうることが
できる。えられた表皮細胞は、たとえばグリーン（Ｇｒ
ｅｅｎ）培地、ＮＣＴＣ１６８培地、ＭＣＤＢ１５３培
地、とくに好ましくはグリーン培地を加えて表皮細胞懸
濁液とする。 前記グリーン培地とはＤＭＥＭとＨａ
ｍ′ｓ Ｆ−１２を３：１に混合し、ヒドロコルチゾン
（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、
トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）、トリヨードチロニ
ン（０．００１３μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０．０１
μｇ／ｍＬ）、アデニン（２４．３μｇ／ｍＬ）、表皮
増殖因子（０．０１μｇ／ｍＬ）と抗生物質を添加し、
１０％ＦＣＳを含んでなる表皮細胞増殖培地である（セ
ル（Ｃｅｌｌ）、４０巻、６７７〜６８３頁、１９８５
年３月参照）。
清潔な環境下で採取された皮膚（表皮および、真皮の一
部または真皮全層）を消毒し、抗生物質を含有する生理
食塩水またはハンクス（Ｈａｎｋ′ｓ）液などの緩衝液
に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃度を１０００Ｕ
／ｍｌに調製したダルベッコ変法イーグル最小必須培地
（ＤＭＥＭ）（以下、「ディスパーゼ溶液」という）に
浸漬したのち表皮と真皮に分離する。えられた表皮をト
リプシン濃度０．２５ｗ／ｖ％、エチレンジアミン４酢
酸ナトリウム（ＥＤＴＡ）濃度０．００５ｍＭ／ｍＬに
調製したハンクス液（以下、「トリプシン溶液」とい
う）中、３７℃で約１５分間浸漬したのち１０ｖ／ｖ％
ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含むＤＭＥＭ（以下、「ＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳ」という）などの培地中に移し、振
とうすることにより細胞を分散させ、約４００×ｇ、５
分間、遠心分離して採取させることによってうることが
できる。えられた表皮細胞は、たとえばグリーン（Ｇｒ
ｅｅｎ）培地、ＮＣＴＣ１６８培地、ＭＣＤＢ１５３培
地、とくに好ましくはグリーン培地を加えて表皮細胞懸
濁液とする。 前記グリーン培地とはＤＭＥＭとＨａ
ｍ′ｓ Ｆ−１２を３：１に混合し、ヒドロコルチゾン
（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、
トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）、トリヨードチロニ
ン（０．００１３μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０．０１
μｇ／ｍＬ）、アデニン（２４．３μｇ／ｍＬ）、表皮
増殖因子（０．０１μｇ／ｍＬ）と抗生物質を添加し、
１０％ＦＣＳを含んでなる表皮細胞増殖培地である（セ
ル（Ｃｅｌｌ）、４０巻、６７７〜６８３頁、１９８５
年３月参照）。
【００４４】前記表皮細胞を高効率で増殖させるには、
たとえばマイトマインシン処理や放射線照射などによっ
て増殖能を停止させたマウス由来の線維芽細胞である３
Ｔ３細胞などを支持細胞として定着させたフラスコ中で
培養を行うことが好ましい。
たとえばマイトマインシン処理や放射線照射などによっ
て増殖能を停止させたマウス由来の線維芽細胞である３
Ｔ３細胞などを支持細胞として定着させたフラスコ中で
培養を行うことが好ましい。
【００４５】具体的には、この３Ｔ３細胞を培養したの
ち、培地を除去してハンクス液ですすぎ、これを除去す
る。ついでマイトマイシンＣ ４μｇ／ｍＬ含有ＤＭＥ
Ｍ溶液を細胞全体が充分漬かるように（７５ｃｍ2フラ
スコでは、２〜４ｍＬ程度が好ましい）加え３７℃にて
２時間程度静置したのち緩衝液で洗浄し、マイトマイシ
ンＣを除去する。こうして、３Ｔ３細胞は生きたままで
増殖能のみが停止せしめられる。この増殖能を有さない
３Ｔ３細胞を採取して、前記グリーン培地に懸濁し、１
×１０3〜５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2、好ましくは５
×１０3〜３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度になるよ
うに調製したのちフラスコへ播種する。このフラスコに
前記表皮細胞を３Ｔ３細胞を播種したのちに５×１０3
〜５×１０5cells/cm2、好ましくは１×１０4〜２×１
０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にて播種する。
ち、培地を除去してハンクス液ですすぎ、これを除去す
る。ついでマイトマイシンＣ ４μｇ／ｍＬ含有ＤＭＥ
Ｍ溶液を細胞全体が充分漬かるように（７５ｃｍ2フラ
スコでは、２〜４ｍＬ程度が好ましい）加え３７℃にて
２時間程度静置したのち緩衝液で洗浄し、マイトマイシ
ンＣを除去する。こうして、３Ｔ３細胞は生きたままで
増殖能のみが停止せしめられる。この増殖能を有さない
３Ｔ３細胞を採取して、前記グリーン培地に懸濁し、１
×１０3〜５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2、好ましくは５
×１０3〜３×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度になるよ
うに調製したのちフラスコへ播種する。このフラスコに
前記表皮細胞を３Ｔ３細胞を播種したのちに５×１０3
〜５×１０5cells/cm2、好ましくは１×１０4〜２×１
０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にて播種する。
【００４６】たとえば約２×２ｃｍの分層皮膚からえた
前記皮膚細胞を５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃
にて培養する。３Ｔ３細胞はこの培養継続中に表皮細胞
がコロニーを形成する過程においてフラスコ底面より培
地中に浮き上がり、培地を交換する際に除去されるの
で、最終的にえられる表皮細胞にはほとんど含まれな
い。
前記皮膚細胞を５％ＣＯ2インキュベーター中、３７℃
にて培養する。３Ｔ３細胞はこの培養継続中に表皮細胞
がコロニーを形成する過程においてフラスコ底面より培
地中に浮き上がり、培地を交換する際に除去されるの
で、最終的にえられる表皮細胞にはほとんど含まれな
い。
【００４７】培養増殖した表皮細胞は、ディスパーゼ溶
液を加え３７℃にて約２時間静置することにより剥す。
これをトリプシン溶液に加え表皮細胞を分散させたの
ち、採取し、グリーン培地を添加して細胞懸濁液をえ
る。表皮細胞は、必要に応じて継代培養する。具体的に
は、前記支持細胞を必要数量作製し前記したように培養
増殖した表皮細胞を採取して、支持細胞に播種培養す
る。この際、表皮細胞が角質化しないよう注意して継代
培養する。えらえた表皮細胞は、突起物を有する支持体
を設置した容器内で収縮を抑えて作製された、たとえば
約６×９．５ｃｍ、厚さ１ｍｍのコラーゲンスポンジ基
材に、５×１０4〜２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞
密度にて播種する。
液を加え３７℃にて約２時間静置することにより剥す。
これをトリプシン溶液に加え表皮細胞を分散させたの
ち、採取し、グリーン培地を添加して細胞懸濁液をえ
る。表皮細胞は、必要に応じて継代培養する。具体的に
は、前記支持細胞を必要数量作製し前記したように培養
増殖した表皮細胞を採取して、支持細胞に播種培養す
る。この際、表皮細胞が角質化しないよう注意して継代
培養する。えらえた表皮細胞は、突起物を有する支持体
を設置した容器内で収縮を抑えて作製された、たとえば
約６×９．５ｃｍ、厚さ１ｍｍのコラーゲンスポンジ基
材に、５×１０4〜２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞
密度にて播種する。
【００４８】表皮細胞が基材に接着したのち、グリーン
培地を加えて５％のＣＯ2インキュベーター中３７℃に
て３日ごとに培地を交換しながら７〜２１日間培養す
る。このようにして複合培養表皮がえられる。
培地を加えて５％のＣＯ2インキュベーター中３７℃に
て３日ごとに培地を交換しながら７〜２１日間培養す
る。このようにして複合培養表皮がえられる。
【００４９】前記線維芽細胞は、採取された皮膚を前記
と同様に表皮と真皮に分離したのち、えられた真皮をハ
サミ、ホモジナイザーなどを用いて砕き、０．５ｗ／ｖ
％のコラゲナーゼのＤＭＥＭ溶液（以下、「コラゲナー
ゼ溶液」という）に加えて、約６時間、約３７℃にて振
とうして結合組織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜約
１，０００×ｇ、好ましくは約６００×ｇ〜約８００×
ｇで遠心分離して採取する。えられた線維芽細胞は、Ｄ
ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳなどを培地としてＣＯ２インキュ
ベーター中３７℃にてサブコンフルエントとなるまで培
養し、必要に応じて多くの線維芽細胞をうるように継代
培養する。
と同様に表皮と真皮に分離したのち、えられた真皮をハ
サミ、ホモジナイザーなどを用いて砕き、０．５ｗ／ｖ
％のコラゲナーゼのＤＭＥＭ溶液（以下、「コラゲナー
ゼ溶液」という）に加えて、約６時間、約３７℃にて振
とうして結合組織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜約
１，０００×ｇ、好ましくは約６００×ｇ〜約８００×
ｇで遠心分離して採取する。えられた線維芽細胞は、Ｄ
ＭＥＭ＋１０％ＦＣＳなどを培地としてＣＯ２インキュ
ベーター中３７℃にてサブコンフルエントとなるまで培
養し、必要に応じて多くの線維芽細胞をうるように継代
培養する。
【００５０】培養した線維芽細胞をトリプシン溶液を用
いてフラスコからはがし、採取して、ＤＭＥＭ＋１０％
ＦＣＳ中で調製する。この線維芽細胞懸濁液を５×１０
３〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2、好ましくは５×１０
4〜２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にてコラー
ゲン基材に播種する。細胞が基材に接着したのち、ＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、５％ＣＯ2インキュベータ
ー中３７℃にて３日ごとに培地を交換しながら１〜１４
日間培養を行う。このようにして複合培養真皮をうるこ
とができる。複合培養真皮は基材の少なくとも片面に線
維芽細胞を培養増殖させてえられる。
いてフラスコからはがし、採取して、ＤＭＥＭ＋１０％
ＦＣＳ中で調製する。この線維芽細胞懸濁液を５×１０
３〜５×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2、好ましくは５×１０
4〜２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細胞密度にてコラー
ゲン基材に播種する。細胞が基材に接着したのち、ＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、５％ＣＯ2インキュベータ
ー中３７℃にて３日ごとに培地を交換しながら１〜１４
日間培養を行う。このようにして複合培養真皮をうるこ
とができる。複合培養真皮は基材の少なくとも片面に線
維芽細胞を培養増殖させてえられる。
【００５１】表皮細胞および真皮細胞の両方を併せて有
する複合培養皮膚は、以下のように作製される。前記し
た複合培養真皮の作製工程にて線維芽細胞を播種し、細
胞を良好に基材に接着させたのち該基材を支持体ごと裏
返し、複合培養表皮の作製における工程を行い複合培養
皮膚をうる。
する複合培養皮膚は、以下のように作製される。前記し
た複合培養真皮の作製工程にて線維芽細胞を播種し、細
胞を良好に基材に接着させたのち該基材を支持体ごと裏
返し、複合培養表皮の作製における工程を行い複合培養
皮膚をうる。
【００５２】このようにしてえらえた培養皮膚は、創面
に適用される前に、ＤＭＥＭを用いて洗浄し、ＦＣＳを
除いた同様の培地に置き換えておくことが好ましい。
に適用される前に、ＤＭＥＭを用いて洗浄し、ＦＣＳを
除いた同様の培地に置き換えておくことが好ましい。
【００５３】貫通孔を設けられていない基材を用いた培
養皮膚では、その適用部に浸出液などが過度に貯留し、
感染の温床となることがあるのに対し、本発明の基材を
用いた培養皮膚においては、前記のように患部への適用
前に貫通孔を設けることによって患部における浸出液の
排出が良好に行われ、良好な肉芽組織を形成するうえで
極めて有用である。
養皮膚では、その適用部に浸出液などが過度に貯留し、
感染の温床となることがあるのに対し、本発明の基材を
用いた培養皮膚においては、前記のように患部への適用
前に貫通孔を設けることによって患部における浸出液の
排出が良好に行われ、良好な肉芽組織を形成するうえで
極めて有用である。
【００５４】本発明の培養皮膚に用いられるヒアルロン
酸は、創傷などを負ったばあいに初期の段階で細胞から
産出される生理活性物質であり、患部の治癒過程におい
て表皮細胞および線維芽細胞のいずれもがコラーゲン基
材上で良好に移動する上で必要なものであるといわれて
いる。ヒアルロン酸は細胞の足場をゆるやかにすること
により細胞を移動しやすくするという機能を果たしてい
ると考えられている。ヒアルロン酸は、コラーゲン基材
を作製する際にコラーゲンの０．１％〜５％の濃度で用
いられる。
酸は、創傷などを負ったばあいに初期の段階で細胞から
産出される生理活性物質であり、患部の治癒過程におい
て表皮細胞および線維芽細胞のいずれもがコラーゲン基
材上で良好に移動する上で必要なものであるといわれて
いる。ヒアルロン酸は細胞の足場をゆるやかにすること
により細胞を移動しやすくするという機能を果たしてい
ると考えられている。ヒアルロン酸は、コラーゲン基材
を作製する際にコラーゲンの０．１％〜５％の濃度で用
いられる。
【００５５】細胞を基材に良好に接着させるために、細
胞接着因子としてフィブロネクチンやラミニンなどを本
発明の基材に被覆しておくとさらに良好な培養皮膚がえ
られる。
胞接着因子としてフィブロネクチンやラミニンなどを本
発明の基材に被覆しておくとさらに良好な培養皮膚がえ
られる。
【００５６】以下に本発明を実施例をあげてさらに詳細
に説明するが、本発明はもとよりこれら実施例に限定さ
れるものではない。
に説明するが、本発明はもとよりこれら実施例に限定さ
れるものではない。
【００５７】実施例１ 本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔
が設けられたアテロコラーゲンゲルの作製 ０．２ｗ／ｖ％アテロコラーゲンＤＭＥＭ溶液（ｐＨ
７．４（株）高研製）２０ｍｌを、縦８ｍｍ、横８ｍｍ
の間隔にて長さ７ｍｍ、一辺１ｍｍの正四角柱形の突起
物を配した網目の空隙が７×７ｍｍである網目構造を有
するプラスチック製の支持体（５．５×９ｃｍ）を設置
したプラスチックケース（６×９．５ｃｍ、高さ２．８
ｃｍ）に注加し、３７℃、１時間静置してゲル化させ、
ＵＶを２ｍＷ／ｃｍ2、３０分間照射して厚さ０．３ｃ
ｍのアテロコラーゲンゲルをえた。
が設けられたアテロコラーゲンゲルの作製 ０．２ｗ／ｖ％アテロコラーゲンＤＭＥＭ溶液（ｐＨ
７．４（株）高研製）２０ｍｌを、縦８ｍｍ、横８ｍｍ
の間隔にて長さ７ｍｍ、一辺１ｍｍの正四角柱形の突起
物を配した網目の空隙が７×７ｍｍである網目構造を有
するプラスチック製の支持体（５．５×９ｃｍ）を設置
したプラスチックケース（６×９．５ｃｍ、高さ２．８
ｃｍ）に注加し、３７℃、１時間静置してゲル化させ、
ＵＶを２ｍＷ／ｃｍ2、３０分間照射して厚さ０．３ｃ
ｍのアテロコラーゲンゲルをえた。
【００５８】実施例２ 本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔
を設けた複合培養真皮（ゲル状）の作製 清潔な環境下で採取されたヒトの皮膚片（約２×２ｃ
ｍ、厚さ約０．５ｍｍ）をイソジン溶液に浸漬し、ハン
クス液で洗浄後ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍ
Ｌ）、ペニシリン（１０００Ｕ／ｍＬ）およびアンホテ
リシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）を混合したハンクス液に
室温、３０分間浸漬した。
を設けた複合培養真皮（ゲル状）の作製 清潔な環境下で採取されたヒトの皮膚片（約２×２ｃ
ｍ、厚さ約０．５ｍｍ）をイソジン溶液に浸漬し、ハン
クス液で洗浄後ストレプトマイシン（１０００μｇ／ｍ
Ｌ）、ペニシリン（１０００Ｕ／ｍＬ）およびアンホテ
リシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）を混合したハンクス液に
室温、３０分間浸漬した。
【００５９】つぎに、ディスパーゼ（合同酒精（株）
製）溶液１０ｍｌに４℃にて１２時間浸漬し、ピンセッ
トを用いて表皮と真皮に分離し、えられた真皮部分をハ
サミでペースト状に砕いてコラゲナーゼ溶液１０ｍｌで
約６時間、３７℃にて処理して結合組織を除去したの
ち、約７００×ｇ、５分間の遠心分離にて線維芽細胞を
えた。えられた線維芽細胞はＤＭＥＭ（ギブコ社製）＋
１０％ＦＣＳを用いて５％のＣＯ2インキュベーター中
３７℃にてプラスチック製培養フラスコ中で３日ごとに
培地を交換しながら継代培養し、増殖させた。
製）溶液１０ｍｌに４℃にて１２時間浸漬し、ピンセッ
トを用いて表皮と真皮に分離し、えられた真皮部分をハ
サミでペースト状に砕いてコラゲナーゼ溶液１０ｍｌで
約６時間、３７℃にて処理して結合組織を除去したの
ち、約７００×ｇ、５分間の遠心分離にて線維芽細胞を
えた。えられた線維芽細胞はＤＭＥＭ（ギブコ社製）＋
１０％ＦＣＳを用いて５％のＣＯ2インキュベーター中
３７℃にてプラスチック製培養フラスコ中で３日ごとに
培地を交換しながら継代培養し、増殖させた。
【００６０】こののち、トリプシン溶液を用いて細胞を
フラスコから剥がし、５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細
胞密度にて実施例１で作製したアテロコラーゲンゲルに
播種した。そのまま、細胞をゲルに接着させるため播種
後、室温にて１２時間静置したのち前記ＤＭＥＭ＋１０
％ＦＣＳ１５ｍｌを加え、５％のＣＯ2インキュベータ
ー中で３７℃にて７日間、３日ごとに培地を交換しなが
ら培養し、支持体が装着された状態にある複合培養真皮
をえた。
フラスコから剥がし、５×１０4ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の細
胞密度にて実施例１で作製したアテロコラーゲンゲルに
播種した。そのまま、細胞をゲルに接着させるため播種
後、室温にて１２時間静置したのち前記ＤＭＥＭ＋１０
％ＦＣＳ１５ｍｌを加え、５％のＣＯ2インキュベータ
ー中で３７℃にて７日間、３日ごとに培地を交換しなが
ら培養し、支持体が装着された状態にある複合培養真皮
をえた。
【００６１】本発明の複合培養真皮は、培養皮膚用コラ
ーゲン基材へ細胞を播種する際の細胞の落下逸脱の防止
を目的とした処理を必要としない手段で作製され、著明
に収縮率が抑えられており、また該培養皮膚は、適用の
際支持体のまま患部に貼設でき、そののち支持体を剥が
すことにより貫通孔が設けられ、細胞への栄養分の供給
および移植部よりの浸出液の排出が良好にできた。
ーゲン基材へ細胞を播種する際の細胞の落下逸脱の防止
を目的とした処理を必要としない手段で作製され、著明
に収縮率が抑えられており、また該培養皮膚は、適用の
際支持体のまま患部に貼設でき、そののち支持体を剥が
すことにより貫通孔が設けられ、細胞への栄養分の供給
および移植部よりの浸出液の排出が良好にできた。
【００６２】実施例３ 本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔
を設けたアテロコラーゲンスポンジの作製 １ｗ／ｖ％となるよう調製したアテロコラーゲン
（（株）高研製）の水溶液（塩酸でｐＨ４に調整）１０
０ｍｌをホモジナイザー（（株）日本精機製作所製）を
用いて１分間撹拌することにより気泡をいれ、縦８ｍ
ｍ、横８ｍｍの間隔にて長さ８ｍｍ、直径１ｍｍの円柱
形の突起物を配した網目の空隙が７×７ｍｍである網目
構造を有するプラスチック製の支持体（５．５×９ｃ
ｍ）を設置したプラスチックケース底部（６×９．５ｃ
ｍ、高さ２．３ｃｍ）に２５ｍｌ注加し、これをアンモ
ニアガス雰囲気下に１時間静置したのち、凍結乾燥を行
って厚さ約１ｍｍのアテロコラーゲンスポンジをえた。
ついで、このスポンジの片面にＵＶを１ｍＷ／ｃｍ2、
３０分間照射したのちプラスチックケースに入れたまま
エチレンオキサイドガス滅菌を行った。
を設けたアテロコラーゲンスポンジの作製 １ｗ／ｖ％となるよう調製したアテロコラーゲン
（（株）高研製）の水溶液（塩酸でｐＨ４に調整）１０
０ｍｌをホモジナイザー（（株）日本精機製作所製）を
用いて１分間撹拌することにより気泡をいれ、縦８ｍ
ｍ、横８ｍｍの間隔にて長さ８ｍｍ、直径１ｍｍの円柱
形の突起物を配した網目の空隙が７×７ｍｍである網目
構造を有するプラスチック製の支持体（５．５×９ｃ
ｍ）を設置したプラスチックケース底部（６×９．５ｃ
ｍ、高さ２．３ｃｍ）に２５ｍｌ注加し、これをアンモ
ニアガス雰囲気下に１時間静置したのち、凍結乾燥を行
って厚さ約１ｍｍのアテロコラーゲンスポンジをえた。
ついで、このスポンジの片面にＵＶを１ｍＷ／ｃｍ2、
３０分間照射したのちプラスチックケースに入れたまま
エチレンオキサイドガス滅菌を行った。
【００６３】実施例４ 本発明にしたがい突起物を有する支持体を用いて貫通孔
を設けた複合培養皮膚（スポンジ状）の作製 表皮細胞は、清潔な環境下にて採取されたヒトの皮膚
（約２×２ｃｍ、厚さ約０．５ｍｍ）から実施例２に記
載したのと同様に分離した表皮を、トリプシン溶液１０
ｍｌに移し、この中で１５分間、３７℃にて処理したの
ち実施例２で用いたものと同様のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ
Ｓ中に移し、振とうすることにより細胞を分散させ、約
４００×ｇ、５分間の遠心分離にて沈殿させることによ
って集め、前記の組成よりなるグリーン培地に懸濁し
た。表皮細胞を高効率で増殖させるために、以下の支持
細胞を用いた。マウス由来線維芽細胞である３Ｔ３細胞
は前記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、サブコンフルエント
となるまで５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて培
養した。ついで、培地を除去してハンクス液ですすぎ、
実施例２と同様のＤＭＥＭを加えて最終濃度が０．００
０４％になるようにマイトマイシンＣ（和光純薬工業
（株）製）含有生理的食塩水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）
を添加した。このフラスコを３７℃で２時間静置したの
ち、ハンクス液を用いて洗浄してマイトマイシンＣを除
き、増殖能が停止した３Ｔ３細胞を採取した。えられた
細胞を、グリーン培地に懸濁し、計数後２×１０4ｃｅ
ｌｌｓ／ｃｍ2の密度となるよう調製してフラスコに播
種した。
を設けた複合培養皮膚（スポンジ状）の作製 表皮細胞は、清潔な環境下にて採取されたヒトの皮膚
（約２×２ｃｍ、厚さ約０．５ｍｍ）から実施例２に記
載したのと同様に分離した表皮を、トリプシン溶液１０
ｍｌに移し、この中で１５分間、３７℃にて処理したの
ち実施例２で用いたものと同様のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣ
Ｓ中に移し、振とうすることにより細胞を分散させ、約
４００×ｇ、５分間の遠心分離にて沈殿させることによ
って集め、前記の組成よりなるグリーン培地に懸濁し
た。表皮細胞を高効率で増殖させるために、以下の支持
細胞を用いた。マウス由来線維芽細胞である３Ｔ３細胞
は前記ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中、サブコンフルエント
となるまで５％ＣＯ2インキュベーター中３７℃にて培
養した。ついで、培地を除去してハンクス液ですすぎ、
実施例２と同様のＤＭＥＭを加えて最終濃度が０．００
０４％になるようにマイトマイシンＣ（和光純薬工業
（株）製）含有生理的食塩水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）
を添加した。このフラスコを３７℃で２時間静置したの
ち、ハンクス液を用いて洗浄してマイトマイシンＣを除
き、増殖能が停止した３Ｔ３細胞を採取した。えられた
細胞を、グリーン培地に懸濁し、計数後２×１０4ｃｅ
ｌｌｓ／ｃｍ2の密度となるよう調製してフラスコに播
種した。
【００６４】このようにして調製した３Ｔ３細胞を播種
した翌日、前記表皮細胞をこれに播種し、３７℃にて５
％のＣＯ2インキュベーター中で培養増殖させた。
した翌日、前記表皮細胞をこれに播種し、３７℃にて５
％のＣＯ2インキュベーター中で培養増殖させた。
【００６５】一方、実施例３でえられたアテロコラーゲ
ンスポンジに実施例２と同様に線維芽細胞を１×１０4
ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、前記ＤＭＥＭ＋１
０％ＦＣＳ中で２日間培養した。つぎに培地を除去し、
アテロコラーゲンスポンジをケース中で支持体ごと反転
させ、前記で培養増殖させた表皮細胞を支持体の裏側か
らスポンジの裏側へ２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度
で播種した。これをクリーンベンチの中で８時間静置し
たのち、グリーン培地を加えて５％のＣＯ2インキュベ
ーター中で３７℃にて３日毎に培地を替えながら、１４
日間培養し、複合培養皮膚をえた。
ンスポンジに実施例２と同様に線維芽細胞を１×１０4
ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度で播種し、前記ＤＭＥＭ＋１
０％ＦＣＳ中で２日間培養した。つぎに培地を除去し、
アテロコラーゲンスポンジをケース中で支持体ごと反転
させ、前記で培養増殖させた表皮細胞を支持体の裏側か
らスポンジの裏側へ２×１０5ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2の密度
で播種した。これをクリーンベンチの中で８時間静置し
たのち、グリーン培地を加えて５％のＣＯ2インキュベ
ーター中で３７℃にて３日毎に培地を替えながら、１４
日間培養し、複合培養皮膚をえた。
【００６６】実施例５ ヒアルロン酸を含有する培養皮膚用基材（スポンジ状）
の作製 塩酸でｐＨ３に調整した蒸留水にアテロコラーゲン
（（株）高研製）１ｇを溶解したのち、水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨ４．５に調整した水溶液をえた。ついで
ヒアルロン酸（分子量約２００万）０．０１ｇをこのア
テロコラーゲン水溶液に溶かし、これにｐＨ４．５に調
整した蒸留水を加えて１００ｍＬとした（アテロコラー
ゲン１ｗ／ｖ％、ヒアルロン酸０．０１ｗ／ｖ％溶
液）。これを１分間ホモジナイズしたのち突起物を有す
る支持体を設置した６×９．５ｃｍ、高さ２．３ｃｍの
ケース底部にこのアテロコラーゲン−ヒアルロン酸水溶
液２５ｍＬを流し込んだ。突起物を有する支持体におい
て、突起物は支持体からの長さ８ｍｍ、一辺２ｍｍの正
四角柱であり、相互に７ｍｍ間隔で配置されたものを用
いた。これをアンモニアガス雰囲気下にて２時間静置し
てゲル化させ、水洗したのち、凍結乾燥を行った。
の作製 塩酸でｐＨ３に調整した蒸留水にアテロコラーゲン
（（株）高研製）１ｇを溶解したのち、水酸化ナトリウ
ム水溶液でｐＨ４．５に調整した水溶液をえた。ついで
ヒアルロン酸（分子量約２００万）０．０１ｇをこのア
テロコラーゲン水溶液に溶かし、これにｐＨ４．５に調
整した蒸留水を加えて１００ｍＬとした（アテロコラー
ゲン１ｗ／ｖ％、ヒアルロン酸０．０１ｗ／ｖ％溶
液）。これを１分間ホモジナイズしたのち突起物を有す
る支持体を設置した６×９．５ｃｍ、高さ２．３ｃｍの
ケース底部にこのアテロコラーゲン−ヒアルロン酸水溶
液２５ｍＬを流し込んだ。突起物を有する支持体におい
て、突起物は支持体からの長さ８ｍｍ、一辺２ｍｍの正
四角柱であり、相互に７ｍｍ間隔で配置されたものを用
いた。これをアンモニアガス雰囲気下にて２時間静置し
てゲル化させ、水洗したのち、凍結乾燥を行った。
【００６７】これに１ｍＷ／ｃｍ2でＵＶを３０分間照
射した後、エチレンオキサイドガス滅菌を行ってヒアル
ロン酸を含有したアテロコラーゲン基材をえた。
射した後、エチレンオキサイドガス滅菌を行ってヒアル
ロン酸を含有したアテロコラーゲン基材をえた。
【００６８】えられた基材に実施例２と同様、線維芽細
胞を播種し培養増殖させ、支持体より取出すことにより
貫通孔を有する収縮度の小さい複合培養真皮を作製し
た。
胞を播種し培養増殖させ、支持体より取出すことにより
貫通孔を有する収縮度の小さい複合培養真皮を作製し
た。
【００６９】この複合培養真皮を２×２ｃｍの全層皮膚
欠損を作製したヌードマウスの背部に欠損の大きさに合
わせて切り取り移植した。適用後、２週間では、適用部
に浸出液の貯留は認められず、肉芽組織が良好に形成さ
れ、順調な治癒経過を示した。
欠損を作製したヌードマウスの背部に欠損の大きさに合
わせて切り取り移植した。適用後、２週間では、適用部
に浸出液の貯留は認められず、肉芽組織が良好に形成さ
れ、順調な治癒経過を示した。
【００７０】実施例６ 剥離シートを伴う突起物を有する容器を用いて貫通孔を
設けた複合培養真皮の作製 底面に四角柱（一辺２ｍｍの正四角柱、高さ７ｍｍ）の
突起物を配した容器を準備して、この容器（６×９．５
ｃｍ）の底部上に突起物部分をくり抜いたポリエステル
シートを設置した。なお、このシートには取っ手が造作
されている。
設けた複合培養真皮の作製 底面に四角柱（一辺２ｍｍの正四角柱、高さ７ｍｍ）の
突起物を配した容器を準備して、この容器（６×９．５
ｃｍ）の底部上に突起物部分をくり抜いたポリエステル
シートを設置した。なお、このシートには取っ手が造作
されている。
【００７１】０．２％コラーゲンＤＭＥＭ中性溶液（セ
ルゲン（ＣＥＬＬＧＥＮ）、（株）高研製）２０ｍＬと
線維芽細胞を混合し、播種密度１×１０5ｃｅｌｌｓ／
ｃｍ2となるように調製した。
ルゲン（ＣＥＬＬＧＥＮ）、（株）高研製）２０ｍＬと
線維芽細胞を混合し、播種密度１×１０5ｃｅｌｌｓ／
ｃｍ2となるように調製した。
【００７２】この混合液を前記容器に流し込んで、ふた
をして３７℃に５時間静置した。こののち、実施例２と
同様のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、１週間培養して
複合培養真皮をえた。適用の際には、ふたをとり、シー
トの取手部を持ち上げることにより複合培養真皮および
シートが容器から容易にはずれた。こうして貫通孔がで
き、複合培養真皮もシートから簡単にはずすことが可能
であった。
をして３７℃に５時間静置した。こののち、実施例２と
同様のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、１週間培養して
複合培養真皮をえた。適用の際には、ふたをとり、シー
トの取手部を持ち上げることにより複合培養真皮および
シートが容器から容易にはずれた。こうして貫通孔がで
き、複合培養真皮もシートから簡単にはずすことが可能
であった。
【００７３】比較例１ 実施例６において突起物を設置してない容器を用いて同
様に実施したところ細胞を播種培養開始したのち５日目
までには、コラーゲンゲルは著しく収縮し、実施例６で
作製した複合培養皮膚の面積で２５％、体積で約１５％
となった。
様に実施したところ細胞を播種培養開始したのち５日目
までには、コラーゲンゲルは著しく収縮し、実施例６で
作製した複合培養皮膚の面積で２５％、体積で約１５％
となった。
【００７４】
【発明の効果】本発明によれば、コラーゲン基材に細胞
を播種する際に生ずる細胞の落下逸脱の防止を目的とし
た前処理を必要としない手段を用いて、培養皮膚を創面
に適用する前に該培養皮膚に貫通孔を設けることによっ
て、培養増殖された細胞への栄養供給、および適用部に
過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうると同時
に収縮をおさえた培養皮膚を提供することが可能とな
る。
を播種する際に生ずる細胞の落下逸脱の防止を目的とし
た前処理を必要としない手段を用いて、培養皮膚を創面
に適用する前に該培養皮膚に貫通孔を設けることによっ
て、培養増殖された細胞への栄養供給、および適用部に
過度に貯留する浸出液の排出が円滑に行われうると同時
に収縮をおさえた培養皮膚を提供することが可能とな
る。
【図１】本発明の支持体を用いて貫通孔が設けられた複
合培養皮膚の作製手順を示す図である。
合培養皮膚の作製手順を示す図である。
【図２】本発明にしたがった突起物を有する容器および
剥離シートの上面（ａ）ならびに断面（ｂ）を示す図で
ある。
剥離シートの上面（ａ）ならびに断面（ｂ）を示す図で
ある。
【図３】前記の容器に設置された剥離シートの上面
（ａ）および断面（ｂ）を示す図である。
（ａ）および断面（ｂ）を示す図である。
【図４】前記の容器に培養皮膚を完成させた横断面（ａ
−ｂ）および前記の容器からはずされた培養皮膚の付い
た剥離シートの断面（ａ´−ｂ´）を示す図である。
−ｂ）および前記の容器からはずされた培養皮膚の付い
た剥離シートの断面（ａ´−ｂ´）を示す図である。
１ 突起物 ２ 孔 ３ 容器 ４ 剥離シート ５ 取手 ６ 培養皮膚
Claims (19)
- 【請求項１】 ａ）コラーゲンスポンジ、コラーゲンシ
ートまたはコラーゲンゲルからなる培養皮膚用基材に貫
通孔を生じるための突起物を有する手段内で作製する工
程、 ｂ）該基材に皮膚由来の細胞を播種培養する工程および ｃ）培養皮膚が適用される前に突起物を有する手段によ
り貫通孔が設けられる工程からなり、工程ａ）および
ｂ）は同時に行ってもよい培養皮膚の製造法。 - 【請求項２】 工程ｂ）が該基材の少なくとも片面に皮
膚由来の線維芽細胞を播種培養する工程、該基材の片面
に表皮細胞を播種培養する工程または該基材の少なくと
も片面に皮膚由来の線維芽細胞を播種培養し、かつ該基
材の片面に表皮細胞を播種培養する工程である請求項１
記載の製造法。 - 【請求項３】 工程ｃ）が該突起物を取除くことにより
成し遂げられる請求項１または２記載の製造法。 - 【請求項４】 突起物を有する手段により培養皮膚が適
用される前に貫通孔が設けられる、コラーゲンスポン
ジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる培
養皮膚用基材の製造法。 - 【請求項５】 突起物を有する手段が突起物を有する支
持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突起
物を有する支持体ないし容器である請求項１、２、３ま
たは４記載の製造法。 - 【請求項６】 コラーゲンがアテロコラーゲンである請
求項１、２、３、４または５記載の製造法。 - 【請求項７】 培養皮膚用基材がヒアルロン酸を含んで
なる請求項１、２、３、４、５または６記載の製造法。 - 【請求項８】 中空の貫通孔を有するコラーゲンスポン
ジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる培
養皮膚用基材。 - 【請求項９】 中空の貫通孔が突起物を有する手段によ
り設けられた請求項８記載の培養皮膚用基材。 - 【請求項１０】 突起物を有する手段が配された、該突
起物を取除くことにより生じる中空の貫通孔を有する請
求項８記載の培養皮膚用基材。 - 【請求項１１】 突起物を有する手段が突起物を有する
支持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突
起物を有する支持体ないし容器である請求項９または１
０記載の培養皮膚用基材。 - 【請求項１２】 コラーゲンがアテロコラーゲンである
請求項８、９、１０または１１記載の培養皮膚用基材。 - 【請求項１３】 培養皮膚用基材がヒアルロン酸を含ん
でなる請求項８、９、１０、１１または１２記載の培養
皮膚用基材。 - 【請求項１４】 中空の貫通孔を有するコラーゲンスポ
ンジ、コラーゲンシートまたはコラーゲンゲルからなる
培養皮膚用基材および線維芽細胞、表皮細胞またはこれ
らの組合わせである皮膚由来の細胞からなる培養皮膚。 - 【請求項１５】 中空の貫通孔が突起物を有する手段に
より設けられた請求項１４記載の培養皮膚。 - 【請求項１６】 突起物を有する手段が配された、該突
起物を取除くことにより生じる中空の貫通孔を有する請
求項１４記載の培養皮膚。 - 【請求項１７】 突起物を有する手段が突起物を有する
支持体、突起物を有する容器または剥離シートを伴う突
起物を有する支持体ないし容器である請求項１５または
１６記載の培養皮膚。 - 【請求項１８】 コラーゲンがアテロコラーゲンである
請求項１４、１５、１６または１７記載の培養皮膚。 - 【請求項１９】 培養皮膚用基材がヒアルロン酸を含ん
でなる請求項１４、１５、１６、１７または１８記載の
培養皮膚。
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