JP3377354B2

JP3377354B2 - 人工皮膚

Info

Publication number: JP3377354B2
Application number: JP35152795A
Authority: JP
Inventors: 章寿杉山; 剛森山; 京子濱野
Original assignee: Menicon Co Ltd
Current assignee: Menicon Co Ltd
Priority date: 1995-12-25
Filing date: 1995-12-25
Publication date: 2003-02-17
Anticipated expiration: 2015-12-25
Also published as: JPH09173362A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は人工皮膚およびその
製造法に関する。さらに詳しくは、熱傷、創傷、褥瘡ま
たは皮膚潰瘍などの皮膚欠損創において、広範囲でかつ
真皮の深部に達する皮膚欠損に用いて、良性肉芽組織の
形成を促進する。狭い範囲の皮膚欠損であれば、良性肉
芽組織の形成と共に表皮を含む欠損組織の再建を促進す
る、または治療するための人工皮膚およびその製造法に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来より熱傷や擦過傷または褥瘡など皮
膚に創傷を負ったばあい、ガーゼや脱脂綿などに軟膏を
併用した治療が行なわれてきた。これらは、細菌感染防
止能が低く、かつ、浸出液を迅速に吸収するため創面を
乾燥させてしまい、除去の際に新生表皮細胞を剥離し、
痛みや出血を伴うことも多かった。また、ガーゼや脱脂
綿の交換も頻繁に行なわねばならなかった。

【０００３】こうした状況に鑑みて、近年、種々の創傷
被覆材が開発されてきている。

【０００４】たとえば、合成被覆材、生体被覆材および
ハイブリッド被覆材などがあげられる。前記合成被覆材
としては、合成高分子からなり、フィルム、ハイドロゲ
ルなどの形態のものがあるが、ポリウレタンなどからな
るフィルムやハイドロコロイドドレッシングと呼ばれる
創傷被覆材は閉塞性が高いために、患部に浸出液を貯留
させ治癒を遅延させることがしばしばある。

【０００５】またナイロンなどの不織布による創傷被覆
材では、患部への密着が強く、交換の際に形成した肉芽
組織や上皮が剥離する問題があった。シリコーン膜＋ナ
イロン繊維＋コラーゲンからなるハイブリッド被覆材も
開発されているが、患部への密着性が強すぎ、上皮化が
阻害されるという問題がある。前記生体被覆材として
は、凍結乾燥豚皮、コラーゲンを原料として用いた不織
布またはスポンジ、キチンおよび／またはキトサンを不
織布としたものがあるが、生体適合性は高く、合成被覆
材より創傷治癒効果は認められるばあいがあるが、満足
できるものではない。

【０００６】これらの創傷被覆材は、材質特性により一
長一短があり、またいずれも満足した治癒効果がえられ
ていないのが現状である。

【０００７】一方、これらの問題を解決するために、わ
ずかな皮膚片から表皮細胞あるいは線維芽細胞を採取
し、培養フラスコ中で大量培養する技術が開発され、こ
れらの培養細胞を用いた種々の培養皮膚が開発されてき
ている。

【０００８】ハワード・グリーン（Ｈ．Ｇｒｅｅｎ）、
ジェームズ・レインワルド（Ｊ．Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ）
らが開発した培養表皮シートは、切手大の皮膚を採取
し、表皮細胞を培養フラスコ中で大量培養して表皮シー
トをうるものである（ハワード・グリーン（Ｈ．Ｇｒｅ
ｅｎ）、サイエンティフィック・アメリカン（ＳＣＩＥ
ＮＴＩＦＩＣＡＭＥＲＩＣＡＮ）、１９９１年１１月
号参照）。

【０００９】さらに、スティーブン・ボイス（Ｓ．Ｂｏ
ｙｃｅ）ら（サージェリー（ＳＵＲＧＥＲＹ）、１０３
巻、６３２〜６４１頁、１９９３年４月号参照）は、皮
膚からえられる表皮細胞をフラスコ中で大量に培養し、
コラーゲンにコンドロイチン−６−硫酸を少量添加して
スポンジ状にした基材上に表皮細胞を重層化させた培養
皮膚を開発した。

【００１０】また、線維芽細胞をコラーゲン基材に組み
込み、この上に表皮細胞を重層化させた培養皮膚が、特
開平第４−３３２５６１号公報に記載されている。

【００１１】このようにして培養された皮膚は自家培養
皮膚および他家培養皮膚に分けられる。前記したように
自家培養皮膚は一部に市販されてはいるが、生着率が非
常に悪いという報告がなされている（ローリング・ダブ
リゥー・リウ（ＬｏｒｉｎｇＷ. Ｒｕｅ）など、ザ・
ジャーナル・オブ・トラウマ、３５巻、Ｎｏ．５、１９
９３年５月号参照）。また、短期間の保存しかできない
ので、受注時生産となるため膨大なコストがかかってし
まう。一方、他家培養皮膚は基本的には生着しないが、
細胞から産生される種々の生理活性物質によって良性肉
芽組織の形成を促進し、皮膚欠損が深部にいたらないば
あいには表皮を含む皮膚の再建も可能である。また、大
量生産も可能であるのでコストをある程度低減できる。
しかしながら、このばあいでも長期に在庫できず、培養
皮膚を凍結保存したり、播種する細胞を凍結保存して細
胞の活性（生存）を確保しておく必要がある。凍結保存
方法としてはプログラムフリーザーを用いて室温から−
８０℃程度まで−１℃／ｍｉｎで凍結し、液体窒素中約
−１９６℃に漬けるか、または−１５０℃程度の液体窒
素気相中かまたは超低温冷凍庫−８０℃以下にて保存す
ることが好ましい。このような方法は煩雑で、これらの
装置は非常に高価であり、また、このような方法であっ
ても細胞の生存率は半年ほどで半減してしまう。さら
に、培養皮膚の流通の段階においては、培養皮膚に組み
込まれた細胞の活性（生存）を確保するために新鮮な培
地中で適切な温度を保ち、早急に使用せねばならない。
凍結したまま流通させるばあいは前記のような低温を保
った状態で運搬し、使用前に凍結保存液を培地などで置
きかえて細胞の活性を回復する必要がある。これらの結
果、培養皮膚は大変高価なものになってしまう。そのた
め、簡便に利用でき、より安価な代替品または手法の開
発が望まれていた。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】熱傷、創傷、褥瘡また
は皮膚潰瘍など皮膚欠損創に用いて、早期に良性肉芽組
織を形成させるもしくは表皮を含む欠損組織の再建を促
進するまたは治療するための人工皮膚を提供することを
目的とする。さらに詳しくは、哺乳動物皮膚の細胞由来
の生理活性物質により欠損組織を早期にしかも良好に再
建し、しかも培養皮膚などに比べて安価にかつ安定に長
期間保存できる人工皮膚を提供することを目的とする。

【００１３】

【課題を解決するための手段】前記の目的は、コラーゲ
ン、キチン、キトサン、ゼラチン、ヒアルロン酸、コン
ドロイチン硫酸およびポリグリコール酸などからなる培
養皮膚用基材に哺乳動物皮膚由来の細胞を播種培養して
培養皮膚を作製し、これを凍結真空乾燥することで、創
傷被覆材より早期にしかも良好に皮膚欠損組織における
良性肉芽組織を形成できあるいは皮膚を再建でき、かつ
培養皮膚などに比べて非常に簡便に扱え、安価に安定に
長期間保存のできる人工皮膚を提供することである。

【００１４】したがって本発明は、哺乳動物皮膚由来の
細胞をスポンジ状、不織布状または織布状の培養皮膚用
基材に播種培養してえられたところの、細胞および基材
からなる培養皮膚を、培養により基材に生理活性物質が
沈着した状態で凍結乾燥することを特徴とする人工皮膚
およびその製造法に関する。

【００１５】本発明において好ましくは、培養皮膚用基
材がコラーゲン、キチン、キトサン、ゼラチン、ヒアル
ロン酸、コンドロイチン硫酸およびポリグリコール酸か
らなる群より選ばれた少なくとも１つの生体適合物質よ
りなり、培養皮膚用基材がゲル状、スポンジ状、薄膜
状、不織布状または織布状であり、培養皮膚用基材に貫
通した孔が設けられ、コラーゲンとしては、アテロコラ
ーゲンである。

【００１６】

【実施例】本発明において、哺乳動物とはヒトを含むあ
らゆる哺乳動物を意味する。

【００１７】本発明において、培養皮膚用基材として、
コラーゲン、ゼラチン、キチン、キトサン、または、ヒ
アルロン酸、コンドロイチン硫酸などのムコ多糖類また
はポリグリコール酸などの生体適合物質を好ましく用い
ることができる。さらには、前記コラーゲンとしては、
アテロコラーゲンが生体親和性の点で好ましい。

【００１８】本発明に用いられるコラーゲンゲルは、コ
ラーゲン溶液をプラスチックなどの容器に流し込み、熱
をかけるかあるいはアンモニアガス雰囲気下などでゲル
化させ平衡塩溶液などに置換することにより作製するこ
とができる。

【００１９】前記コラーゲンゲルを作製するのに用いら
れるコラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラ
ーゲンから調製して、ｐＨを好ましくは２〜４、濃度が
０．２〜５ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％と
して、ゲル化はアンモニアなどのガス雰囲気下で必要に
応じて数分〜２時間行なう。ゲル化後、平衡塩溶液など
に置換してコラーゲンゲルをうる。あるいは、コラーゲ
ンの中性溶液（ｐＨ６．５〜８）をゲル化させるばあい
濃度０．１〜１ｗ／ｖ％、好ましくは、０．２〜０．５
ｗ／ｖ％でアルカリ性ガスなどは用いずに３５〜４０℃
に静置してゲルをうる。

【００２０】ゲルが簡単に溶解しないようにこののち架
橋するのが好ましい。架橋は、紫外線（ＵＶ）を照射す
ることによるかまたは架橋剤を用いて行なう。紫外線を
照射するばあい、架橋に用いる紫外線の主波長は２５０
〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００〜１
２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²、好ましくは１０００〜５
０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²を照射するとよい。本発明に
用いられる架橋剤の例としてはたとえば、グルタルアル
デヒド、ホルマリン、エチレングリコールジグリシジル
エーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテ
ル、ポリグリセロールポリグリシジルエーテル、グリセ
ロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメチレンジイソ
シアネートなどがあげられる。また、コラーゲンゲルの
大きさは適用する創面の大きさにあわせて適宜選択され
る。また、コラーゲンゲルの厚さおよび形状は適用され
る創面の状態によって適宜選択すればよいが、厚さ０．
３〜３０ｍｍ、形状は、薄板状、板状、棒状、紡錘状あ
るいは両側凸のレンズ状などに成形するとよい。

【００２１】本発明に用いられるコラーゲンスポンジ
は、コラーゲン溶液をホモジナイザーを用いてホモジナ
イズすることにより充分に気泡を含ませたものを前記ゲ
ル作製と同様の容器に流し込み、アンモニアガス雰囲気
中に静置してゲル化させたのち凍結乾燥を行ない、つい
で紫外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入す
ることにより作製することができる。

【００２２】前記コラーゲンスポンジ作製に用いられる
コラーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲ
ンから調製して、ｐＨを好ましくは２〜４に調整し、濃
度が０．２〜５ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ
％とすることによりえられる。ゲル化は前記と同様に必
要に応じて数分〜２時間行ない、こののち、凍結乾燥を
行なって架橋することで作製される。

【００２３】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、ホルマリン、エチレングリコール
ジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリ
シジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエー
テル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメ
チレンジイソシアネートなどがあげられる。また、コラ
ーゲンスポンジの大きさは適用する創面の大きさにあわ
せて適宜選択される。また、コラーゲンスポンジの厚さ
および形状は適用される患部の状態によって変化する
が、厚さ０．３〜３０ｍｍ、形状は、薄板状、板状、棒
状、球状、紡錘状あるいは両側凸のレンズ状などに成形
するとよい。

【００２４】本発明に用いられるコラーゲン薄膜は、コ
ラーゲン溶液を前記ゲルおよびスポンジ作製と同様の容
器に入れ、乾燥機の中で風乾して薄膜を形成させたの
ち、紫外線照射または架橋剤によって分子間架橋を導入
することにより作製することができる。また、通常用い
られる湿式抄紙法などによりコラーゲン短繊維から不織
布を作製してもよく、コラーゲン繊維を織って織布を作
製してもよい。

【００２５】前記コラーゲン薄膜作製に用いられるコラ
ーゲン溶液は、ウシ真皮などからえられたコラーゲンか
ら調製して、ｐＨを好ましくは２〜４に調整し、濃度が
０．２〜３ｗ／ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％と
することによりえられる。

【００２６】架橋に用いる紫外線（ＵＶ）の主波長は２
５０〜２７０ｎｍのものが好ましく、紫外線量は５００
〜１２０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²、好ましくは１０００
〜５０００ｍＷｓｅｃ／ｃｍ²の線量を照射するとよ
い。本発明に用いられる架橋剤の例としてはたとえば、
グルタルアルデヒド、ホルマリン、エチレングリコール
ジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールジグリ
シジルエーテル、ポリグリセロールポリグリシジルエー
テル、グリセロールポリグリシジルエーテル、ヘキサメ
チレンジイソシアネートなどがあげられる。また、コラ
ーゲン薄膜の大きさおよび厚さは適用する創面の大きさ
にあわせて適宜選択される。

【００２７】本発明に用いられるコラーゲン不織布は、
一般的な湿式抄紙法により作製される。すなわち、塩
酸、酢酸などを用いてｐＨを１．５〜４、好ましくは２
〜３に調整し、濃度を０．５〜５ｗ／ｖ％、好ましくは
１〜３ｗ／ｖ％にしたコラーゲン水溶液（紡糸原液）を
紡糸ノズルから濃厚塩溶液へ紡出することによりコラー
ゲン繊維をえる。紡糸ノズルは、０．１〜０．４ｍｍ、
好ましくは０．１５〜０．３ｍｍの直径を有するもので
あってもよい。前記濃厚塩溶液は、２０〜２６ｗ／ｖ％
に調整された塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸ア
ンモニウムなどの水溶液であってよい。えられたコラー
ゲン繊維は室温にて風乾したのち、カッター、はさみな
どの切断手段を用いて繊維を３〜１０ｍｍ、好ましくは
４〜８ｍｍの長さの短繊維となるよう切断される。つい
で、えられたコラーゲン短繊維を水に対して不溶性とす
るためにポリエポキシ化合物、アルデヒド化合物などに
より架橋する。この方法は、たとえばつぎのようにして
遂行できる。えられた短繊維を繊維に対して０．０１〜
０．１ｗ／ｖ％のグルタルアルデヒド化合物などの１０
％程度の塩化ナトリウム水溶液あるいは硫酸ナトリウム
水溶液などを分散媒として用いて１〜３時間浸漬する。

【００２８】こののち、充分に水洗し、蒸留水などに分
散させ叩解処理して均一な分散液（スラリー）をうる。
抄紙は、たとえばナイロン、ポリエステルなどの繊維、
ステンレスなどの金属または樹脂から作製された５０〜
１００メッシュの篩上で手抄する。もしくは工業的に
は、前記短繊維の分散液を抄紙機にかけて抄紙する。え
られる薄板状のものを脱水し、２５〜３５℃でゆるやか
に風乾するかまたは室温にて減圧乾燥することによりコ
ラーゲン不織布がえられる。

【００２９】さらに、強度を持たせるばあいには、コラ
ーゲンまたはゼラチンの希薄な水溶液を不織布表面に噴
霧し、架橋させる。たとえば、乾燥させた不織布にグル
タルアルデヒド０．０１ｖ／ｖ％を含む０．０１〜０．
５ｗ／ｖ％コラーゲン水溶液を１００ｍＬ／ｍ²程度で
噴霧して、風乾する。こののち水洗し、再度風乾させ
る。

【００３０】本発明に用いられるコラーゲン織布は前記
のようにしてえられたコラーゲン繊維を通常の方法で織
ることにより作製される。

【００３１】本発明で用いられるヒアルロン酸薄膜は、
ヒアルロン酸ナトリウムを蒸留水に溶解させ、このの
ち、水酸化ナトリウム水溶液を加え、これに架橋剤を加
えて撹拌する。このヒアルロン酸ナトリウム水溶液をシ
ャーレに流し込んで、６０℃程度に加熱することでゲル
状物をえた。これを０．１〜１規定の塩酸などの酸性の
水溶液に浸漬することで中和し、水洗したのち、凍結乾
燥してヒアルロン酸薄膜をえた。

【００３２】本発明で用いられるヒアルロン酸含有コラ
ーゲンスポンジおよび薄膜は、以下のように作製され
る。すなわち、ヒアルロン酸ナトリウムを蒸留水に溶解
させ、このヒアルロン酸ナトリウム水溶液をコラーゲン
水溶液に加え撹拌する。前記コラーゲン水溶液は、ウシ
真皮などからえられたコラーゲンから調製して、ｐＨを
好ましくは３〜４．５に調整し、濃度が０．２〜５ｗ／
ｖ％、好ましくは０．５〜２ｗ／ｖ％とすることにより
えられる。ヒアルロン酸の濃度は、０．０１〜０．２ｍ
ｇ／ｍＬが好ましい。このヒアルロン酸−コラーゲン混
合液を用いて前記コラーゲンスポンジおよび薄膜の作製
方法でヒアルロン酸含有コラーゲンスポンジおよび薄膜
を作製する。

【００３３】本発明で用いられる基材には、その少なく
とも片面において哺乳動物皮膚の表皮細胞が播種され培
養増殖されるのが好ましいが、哺乳動物皮膚の線維芽細
胞であってもよい、当然表皮細胞と線維芽細胞の両方が
播種培養されていてもよい。

【００３４】基材がゲルのばあいは、これら細胞と中性
コラーゲン溶液とを混合してゲル化する。前記表皮細胞
とは、基底細胞を含む角質化細胞およびその他の表皮細
胞層に通常存在する細胞を意味するが、ここでは主に角
質化細胞をいう。前記線維芽細胞とは、主に真皮中の主
要な細胞であり、コラーゲンをはじめとする結合組織成
分を産生して、これらの成分と結合して結合組織を形成
している細胞をいう。

【００３５】前記表皮細胞は、一例として、以下の手順
で調製される。清潔な環境下で採取された皮膚（表皮お
よび、真皮の一部または皮膚全層）を消毒し、抗生物質
を含有する生理食塩水またはハンクス（Ｈａｎｋ´ｓ）
液などの緩衝液に浸漬する。この皮膚をディスパーゼ濃
度１０００Ｕ／ｍＬに調製したハンクス液（以下、「デ
ィスパーゼ溶液」という。）に浸漬したのち表皮と真皮
に分離する。えられた表皮をトリプシン濃度０．２５ｗ
／ｖ％、エチレンジアミン四酢酸ナトリウム（ＥＤＴ
Ａ）濃度０．５ｍＭ／ｍＬに調製したハンクス液（以
下、「トリプシン溶液」という。）中、３７℃で約１５
分間浸漬したのち１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）
を含むダルベッコ変法イーグル最少必須培地（ＤＭＥ
Ｍ）（以下、「ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ」という。）な
どの培地中に移し、振とうすることにより細胞を分散さ
せ、約４００×ｇ、５分間、遠心分離にてうることがで
きる。えられた表皮細胞は、たとえばグリーン（Ｇｒｅ
ｅｎ）培地、ＮＣＴＣ１６８培地、ＭＣＤＢ１５３培
地、とくに好ましくはグリーン培地を加えて表皮細胞懸
濁液とする。

【００３６】前記グリーン培地とはＤＭＥＭとＨａｍ´
ｓＦ−１２を３：１に混合し、ハイドロコルチゾン
（０．４μｇ／ｍＬ）、インスリン（５μｇ／ｍＬ）、
トランスフェリン（５μｇ／ｍＬ）、トリヨードチロニ
ン（０．００１３μｇ／ｍＬ）、コレラ毒素（０．０１
μｇ／ｍＬ）、アデニン（２４．３μｇ／ｍＬ）、表皮
増殖因子（０．０１μｇ／ｍＬ）と抗生物質を添加し、
１０％ＦＣＳを含んでなる表皮細胞増殖培地である（セ
ル（Ｃｅｌｌ）、４０巻、６７７〜６８３頁、１９８５
年３月号参照）。

【００３７】前記表皮細胞を高効率で増殖させるには、
たとえばマイトマイシン処理や放射線照射などによって
増殖能を消失させたマウス由来の線維芽細胞である３Ｔ
３細胞などを支持細胞として定着させた培養フラスコ中
で表皮培養を行なうことが好ましい。

【００３８】具体的には、この３Ｔ３細胞を培養したの
ち、培地を除去してハンクス液ですすぎ、これを除去す
る。ついでマイトマイシンＣ４μｇ／ｍＬ含有ＤＭＥＭ
溶液を細胞全体が充分漬かるように７５ｃｍ²フラスコ
では、１〜３ｍＬ加え３７℃にて２時間程度静置したの
ちハンクス液で洗浄し、マイトマイシンＣを除去する。
こうして、３Ｔ３細胞は生きたままで増殖能のみが消失
せしめられる。えられた増殖能を有しない３Ｔ３細胞を
採取して、前記グリーン培地に懸濁し、１×１０³〜５
×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、好ましくは５×１０³〜３
×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の密度になるよう調製したの
ち培養フラスコへ播種する。この培養フラスコに前記表
皮細胞を３Ｔ３細胞と同時にまたは３Ｔ３細胞播種の１
〜２日後に５×１０³〜５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、
好ましくは１×１０⁴〜２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の
細胞密度にて播種して、５％ＣＯ₂インキュベーター
中、３７℃にて培養する。３Ｔ３細胞はこの培養継続中
に表皮細胞がコロニーを形成する過程においてフラスコ
底面より培地中に浮き上がり、培地を交換する際に除去
されるので、最終的にえられる表皮細胞にはほとんど含
まれない。

【００３９】培養増殖させた表皮細胞は、ディスパーゼ
溶液を加え３７℃にて約２時間静置することにより剥が
す。これをトリプシン溶液に加え表皮細胞を分散させた
のち遠心分離して採取し、グリーン培地を添加して細胞
懸濁液をえる。

【００４０】表皮細胞は、必要に応じて継代培養する。
具体的には、前記支持細胞を必要数量作製し、前記した
ように培養増殖した表皮細胞を採取して支持細胞に播種
培養する。この際、表皮細胞が角質化しないように注意
して継代培養する。

【００４１】えられた表皮細胞を作製されたたとえば約
６×９．５ｃｍ、厚さ２ｍｍのコラーゲンスポンジ基材
に５×１０⁴〜２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度
にて播種する。表皮細胞が基材に接着したのち、グリー
ン培地を加えて５％のＣＯ₂インキュベーター中３７℃
にて３日ごとに培地を交換しながら１〜２０日間培養す
る。このようにしてコラーゲンスポンジ基材に表皮細胞
が付着した培養表皮がえられる。

【００４２】線維芽細胞は、採取された皮膚を前記と同
様に表皮と真皮に分離したのち、えられた真皮をハサ
ミ、ホモジナイザーなどを用いて砕き、０．５ｗ／ｖ％
のコラゲナーゼＤＭＥＭ溶液（以下、「コラゲナーゼ溶
液」という）に加え、約６時間、約３７℃にて振とうし
て結合組織を溶解させたうえで約４００×ｇ〜約１，０
００×ｇ、好ましくは約６００×ｇ〜約８００×ｇで遠
心分離して採取する。えられた線維芽細胞は、ＤＭＥＭ
＋１０％ＦＣＳなどを培地として５％ＣＯ₂インキュベ
ーター中３７℃にてサブコンフルエントとなるまで培養
し、必要に応じて多くの線維芽細胞をうるように継代培
養する。

【００４３】こうしてえられた線維芽細胞をたとえば約
６×９．５ｃｍ、厚さ２ｍｍのコラーゲンスポンジ基材
に播種するばあい、培養した線維芽細胞をトリプシン溶
液を用いて剥がし、遠心分離して採取し、ＤＭＥＭ＋１
０％ＦＣＳ中で線維芽細胞懸濁液を調製する。この細胞
懸濁液を５×１０³〜５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²、好
ましくは５×１０⁴〜２×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細
胞密度にてコラーゲン基材に播種する。細胞が基材に接
着したのち、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、５％ＣＯ
₂インキュベーター中３７℃にて３日ごとに培地を交換
しながら１〜２０日間培養を行なう。このようにしてコ
ラーゲンスポンジに線維芽細胞が付着した培養真皮をう
ることができる。

【００４４】また、表皮細胞および真皮細胞の両方を併
せて有する複合培養皮膚は、以下のように作製される。
前記した培養真皮の作製工程にて線維芽細胞を播種し３
時間〜３日程度培養したのち該基材を裏返し、培養表皮
の作製における工程を行ない複合培養皮膚をうることが
できる。

【００４５】本発明の人工皮膚の作製方法は以下のとお
りである。こうして作製された培養表皮、培養真皮また
は複合培養皮膚である培養皮膚を−５℃以下、好ましく
は−１０℃以下で凍結する。凍結手段としては凍結乾燥
機、冷凍庫、超低温冷凍庫、液化炭酸ガスなどを用い
る。凍結された培養皮膚を−５℃〜−８５℃、好ましく
は凍結させた温度で真空下にて乾燥を開始する。この
際、真空度は、凍結温度における氷の水蒸気圧以下とす
る。乾燥の過程は、凍結せしめた培養皮膚の温度を測定
することで観測する。凍結した培養皮膚を真空乾燥する
と、氷結は昇華し蒸発潜熱が奪われるので、培養皮膚
（人工皮膚）の（凍結）設定温度より低温であるが、昇
華が完了した時点で設定温度と同程度となる。しかし、
こののちわずかな水分が水蒸気の状態で人工皮膚中に残
存するので昇華完了後さらに１０〜７２時間真空下で乾
燥する。

【００４６】乾燥が完了したのち５〜２０℃、好ましく
は５〜１０℃で取り出し、２０℃以下、好ましくは１０
℃以下にて保存する。培養皮膚作製において前記のよう
に血清を含む培地を用いたばあいには、人工皮膚作製に
おいて凍結前に培養した培地を除去し、血清を含まない
ＤＭＥＭまたはＭＣＤＢ１５３培地に置換したうえで凍
結乾燥を行なうことが好ましい。

【００４７】培養皮膚作製において、ＭＣＤＢ１５３培
地などの無血清培地を用いたばあいには、そのまま凍結
乾燥を行なうことができる。

【００４８】本発明における培養皮膚用基材には、貫通
した孔を設けることができる。前記孔は、とくに培養皮
膚用基材に厚みがあるばあい（たとえば０．５ｍｍ以
上）には設けられているのが好ましい。

【００４９】本発明における培養皮膚用基材に用いられ
るヒアルロン酸は、創傷などを負ったばあいに初期の段
階で細胞から出現する生体由来高分子であり、患部の治
癒過程において細胞の足場をゆるやかにすることにより
細胞を移動しやすくするという機能を果たしていると考
えられている。ヒアルロン酸は、コラーゲン基材を作製
する際に０．０１〜０．２ｍｇ／ｍＬの濃度で用いられ
る。

【００５０】また、細胞を基材に良好に接着させるため
に、細胞接着因子としてフィブロネクチンやラミニンな
どを本発明の基材に被覆しておくとさらに良好な培養皮
膚がえられる。

【００５１】本発明に用いられる培養皮膚は、移植用に
作製され長期に培養された培養皮膚または凍結保存され
た培養皮膚が細胞生存率の低下により破棄することとな
ったものを利用することができる。このばあい、簡単に
乾燥するだけで本発明の人工皮膚へ転換することがで
き、培養皮膚の有効利用が可能である。凍結保存された
培養皮膚を当該人工皮膚に転換するばあい、凍結保護剤
（グリセロール、ＤＭＳＯなど）を除去したうえで人工
皮膚を作製することが好ましい。

【００５２】哺乳動物皮膚の細胞を用いて作製された培
養皮膚より作製された人工皮膚は、以下のようにして創
傷治癒に有効に働くと考えられる。

【００５３】創傷の治癒過程は、血管の収縮による止
血、血小板による血液凝固（血液凝固期）、白血球の遊
走・食作用（炎症期）、線維芽細胞の増殖・コラーゲン
の産生（増殖期）、組織の再構築（構築期）からなる４
段階の連鎖反応である。

【００５４】こうした創傷治癒過程には、様々な生理活
性物質が関与している。

【００５５】炎症期には、炎症反応によって浸潤する好
中球、リンパ球、マクロファージが、種々の炎症性の生
理活性物質を産出する。これらの炎症細胞の出現が引き
金となって連鎖反応が起り生理活性物質が産生されるこ
とで線維芽細胞が増殖し、コラーゲンやフィブロネクチ
ンなどが産出して細胞外基質が形成される。同時に血管
内皮細胞の増殖が進み血管新生が促進され肉芽組織が再
構築される。引き続き、表皮細胞が残存しているか、ま
たは狭い範囲の創傷であれば、これらの生理活性物質の
作用により表皮細胞が増殖、移動して皮膚組織を再構築
する。

【００５６】ここで、生理活性物質とは、成長因子およ
びサイトカインのことである。成長因子とは、特異的な
レセプターを介して細胞の増殖、分化を制御している物
質であり、大部分はポリペプチドである。サイトカイン
とは、免疫応答、炎症反応など細胞間相互作用を媒介す
る糖タンパク質であり、マクロファージ、リンパ球、線
維芽細胞、表皮細胞、血管内皮細胞で産生される。

【００５７】成長因子とサイトカインは、一般に厳密に
区別して取り扱われていないのが現状であるので、ここ
では総称してサイトカインと呼ぶ。

【００５８】前記した創傷治癒過程とサイトカインの関
係は、未だ不明な点が多いが、最近次第に解明されつつ
ある。

【００５９】具体的には、炎症期にマクロファージが、
インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−６、腫瘍壊死因
子（ＴＮＦ）−α、トランスホーミング成長因子（ＴＧ
Ｆ）−β、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）など多くの創
傷治癒反応を促進するサイトカインを産生する。

【００６０】続いて、線維芽細胞は、血小板由来増殖因
子（ＰＤＧＦ）、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞
増殖因子（ＦＧＦ）などの作用を受け増殖する。線維芽
細胞はＩＬ−１、ＩＬ−６、インターフェロン（ＩＦ
Ｎ）−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）−Ｉなどを
産生して、自己分泌（オートクライン）的な増殖も認め
られている。オートクラインとは、細胞が自ら成長因子
をつくってその細胞自身に作用することを言う。

【００６１】細胞外基質の形成にはＴＧＦ−αが重要な
働きをしている。肉芽組織の形成には、血管新生が不可
欠であり、ＦＧＦ、血小板由来血管内皮細胞成長因子
（ＰＤ−ＥＣＧＦ）が働いている。（徳永昭ら、創傷治
癒とサイトカイン、バイオメディカル・パースペクティ
ブ（ＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ、
４巻、Ｎｏ．１、１５〜２２頁、１９９５年参照）。

【００６２】表皮のケラチノサイトからは、ＩＬ−１、
ＩＬ−３、ＩＬ−６、顆粒球マクロファージコロニー刺
激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＴＧＦが産出されており、そ
のメカニズムはほとんど解明されていないが、皮膚構成
細胞に様々に作用し、毛包などに残存する表皮細胞また
は創周辺の表皮細胞の増殖、移動を促進して表皮を形成
する。

【００６３】小野らは、浅達性II度熱傷で生じた水疱中
の浸出液に含まれる種々のサイトカイン（ＩＬ−１α、
ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ
−β１、ＴＧＦ−β２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ベイシック
ＦＧＦ（ｂＦＧＦ））の定量を行ない、同時に、浸出液
が表皮細胞（ケラチノサイト）の増殖を促進することを
確認している（バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）、２１巻、Ｎ
ｏ．５、３５２〜３５５頁、１９９５年参照）。

【００６４】ＩＬ−６は、マクロファージのみならず、
血管内皮細胞、線維芽細胞、表皮細胞から産出されてい
る。これら外的な侵襲に際して、生体防御の最前線にあ
る細胞がＩＬ−６を産出することから、非特異的生体防
御反応の早期にＩＬ−６が働いていること考えられてい
る。表皮細胞表面には、ＩＬ−６レセプターが存在する
ことは明らかになっており、ＩＬ−６のオートクライン
機構も考えられている（吉崎和幸、ＩＬ−６、サイトカ
イン９４、７４〜８１頁、１９９４年参照）。

【００６５】哺乳動物皮膚からえられ、培養した線維芽
細胞、表皮細胞の培養液には、種々のサイトカインが存
在している。培養ケラチノサイトからは、正常な表皮に
比し、多くのサイトカインを放出していると言われてい
る。

【００６６】これらの培養細胞を前記培養皮膚用基材に
播種、培養した状態で、培養細胞から生理活性物質が分
泌される。そして、この一部は培養細胞に付着し、一部
は、培養皮膚用基材に沈着して留まり、また一部は培地
中に拡散すると考えられる。

【００６７】こうして作製した培養皮膚を凍結乾燥する
ことで細胞は死滅するが、ポリペプチドや糖タンパク質
である生理活性物質の一部は、人工皮膚中に温存され
る。

【００６８】こうしてえられた人工皮膚を創面に適用す
ることで創傷治癒を促進することができる。

【００６９】

【実施例】以下に本発明を実施例をあげてさらに詳細に
説明するが、本発明はもとよりこれら実施例に限定され
るものではない。

【００７０】実施例１アテロコラーゲンゲルを基材とする培養皮膚を用いた人
工皮膚の作製清潔な環境下で採取されたヒトの正常皮膚片（約２×２
ｃｍ、厚さ約０．５ｍｍ）をイソジン溶液（明治製菓
（株）製）に浸漬し、ついでストレプトマイシン（１０
００μｇ／ｍＬ）、ペニシリン（１０００Ｕ／ｍＬ）お
よびアンホテリシンＢ（２．５μｇ／ｍＬ）を混合した
ハンクス液に室温、３０分間浸漬した。

【００７１】つぎに、ディスパーゼ（合同酒精（株）
製）溶液１０ｍＬに４℃にて１２時間浸漬し、ピンセッ
トを用いて表皮と真皮に分離し、えられた真皮部分をハ
サミでペースト状になるまで砕いたのち、コラゲナーゼ
（和光純薬工業（株）製）溶液１０ｍＬで約６時間、３
７℃にて処理して結合組織を除去し、約７００×ｇ、５
分間の遠心分離にて沈殿させることによって線維芽細胞
をえた。えられた線維芽細胞はＤＭＥＭ（ライフテック
オリエンタル社製）＋１０％ＦＣＳに懸濁してプラスチ
ック製培養フラスコに播種し、５％ＣＯ₂インキュベー
ター中、３７℃にて初代培養した。この線維芽細胞が増
殖したのち、継代培養し、さらに増殖させた。

【００７２】培養フラスコ中で増殖した線維芽細胞をト
リプシン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）溶液を用いて剥
がし、遠心分離してこれを採取し、ＤＭＥＭ＋１０％Ｆ
ＣＳに懸濁させた。

【００７３】こうしてえた線維芽細胞を計数したのち、
プラスチックケース（６×９．５ｃｍ、高さ２．８ｃ
ｍ）にアテロコラーゲン溶液と線維芽細胞を混合して５
×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度になるように混合
して前記プラスチックケースに注加した。

【００７４】ここで用いたアテロコラーゲン溶液は、
０．２ｗ／ｖ％アテロコラーゲンＤＭＥＭ溶液（ｐＨ
７．４、アテロコラーゲンは（株）高研製）２０ｍＬで
ある。

【００７５】線維芽細胞を含んだアテロコラーゲン溶液
は、５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃に静置する
ことでゲル化した。５時間静置したのち、ＤＭＥＭ＋１
０％ＦＣＳにて培地を置換し、５％ＣＯ₂インキュベー
ター中、３７℃にて６日間、３日ごとに培地を交換しな
がら培養した。

【００７６】培養後、この培養皮膚の培地をＤＭＥＭで
置換し、過剰な培地を除去した。こののち、凍結乾燥機
に入れ、−０．５℃／ｍｉｎにて−３０℃まで凍結し、
５時間後、真空度３×１０^-2ｍｂａｒにて真空乾燥を開
始し、品温（人工皮膚温度）が棚温（設定温度：−３０
℃）とほぼ同じになったのち棚温を５℃に上昇させ、さ
らに１５時間乾燥し凍結乾燥機より取り出し、スポンジ
状の本発明の人工皮膚をえた。この人工皮膚を５℃冷蔵
庫で保存した。

【００７７】実施例２アテロコラーゲンスポンジを基材とする培養皮膚を用い
た人工皮膚の作製アテロコラーゲン（（株）高研製）を塩酸でｐＨ３に調
整した蒸留水１００ｍＬに１ｗ／ｖ％になるように加
え、溶解させたのち、ｐＨ４に調整した。これをホモジ
ナイザー（（株）日本精機製作所製）を用いて１分間撹
拌することにより気泡を入れた。これをプラスチックケ
ース（６×９．５ｃｍ、高さ２．８ｃｍ）に２５ｍＬ注
加し、アンモニアガス雰囲気中に２時間静置してゲル化
させたのち、流水中にて水洗し、凍結乾燥を行なって厚
さ２ｍｍのアテロコラーゲンスポンジをえた。ついで、
このスポンジの片面にＵＶを１ｍＷ／ｃｍ²、３０分間
照射したのちプラスチックケースに入れたままエチレン
オキサイドガス滅菌した。

【００７８】えられたアテロコラーゲンスポンジにＤＭ
ＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え２４時間浸漬した。ついで余
分なＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを除去し、実施例１と同様
にして採取、培養してえられた線維芽細胞を５×１０⁴
ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度で播種し、５時間静置し
たのち、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを加え、蓋をして５％
ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃にて６日間で３日毎
に培地を交換して６日間培養し、線維芽細胞を組み込ん
だ培養皮膚をえた。

【００７９】この培養皮膚の１ｃｍ²を２片切り取り、
実施例１に記載されたコラゲナーゼ溶液に入れ、それぞ
れ溶解させ、基材のコラーゲンスポンジが溶解したの
ち、トリパンブルー色素排除法にて生細胞数を計測し
た。生細胞数は１．３×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²であっ
た。

【００８０】こののち実施例１の条件と同様に凍結乾燥
し、本発明の人工皮膚をえた。この人工皮膚を冷蔵庫で
５℃にて保存した。

【００８１】実施例３アテロコラーゲンスポンジを基材とする複合培養皮膚を
用いた人工皮膚の作製表皮細胞は、バイオプシーでえら
れたヒトの皮膚（約２×２ｃｍ、厚さ約０．５ｍｍ）か
ら実施例１に記載したと同様に分離した表皮を、実施例
１に記載されたトリプシン溶液１０ｍＬで１５分間、３
７℃にて処理したのちＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中に移
し、振とうすることにより細胞を分散させ、４００×
ｇ、５分間の遠心分離にて沈殿させることによってこれ
を集め、前記組成よりなるグリーン培地に懸濁した。

【００８２】表皮細胞を高効率で増殖させるために、以
下の支持細胞を用いた。マウス由来線維芽細胞である３
Ｔ３細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳに懸濁させ、これを
培養フラスコ中に播種し、サブコンフルエントとなるま
で５％ＣＯ₂インキュベーター中、３７℃にて培養し
た。ついで、培地を除去してハンクス液ですすぎ、ＤＭ
ＥＭを加えてここに最終濃度が０．０００４％になるよ
うにマイトマイシンＣ（和光純薬工業（株）製）含有生
理的食塩水溶液（０．１ｍｇ／ｍＬ）を添加した。この
培養フラスコを３７℃で２時間静置したのち、ハンクス
液を用いて洗浄してマイトマイシンＣを除き、増殖能が
停止した３Ｔ３細胞を採取した。えられた細胞は、グリ
ーン培地に懸濁し、計数後２×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²
の密度となるように調製して培養フラスコに播種した。
このようにして調製した３Ｔ３細胞を播種して２０時間
後に、前記表皮細胞を前記３Ｔ３細胞上に播種し、３７
℃にて５％のＣＯ₂インキュベーター中で培養増殖させ
た。

【００８３】一方、実施例２と同様にしてアテロコラー
ゲンスポンジに線維芽細胞を播種し、ＤＭＥＭ＋１０％
ＦＣＳ中で２日間培養し、線維芽細胞が付着した培養皮
膚を作製した。

【００８４】つぎに前記培養皮膚が入ったプラスチック
ケース中の培地を除去し、線維芽細胞が付着した培養皮
膚をケース中で反転させ、前記のように培養増殖させた
表皮細胞を１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｃｍ²の細胞密度で播
種した。ここで用いた表皮細胞は、前記したようにして
培養増殖させたものを、実施例１に記載されたディスパ
ーゼ溶液を培養フラスコに加えて３７℃で１時間静置す
ることにより剥がし、これを遠心分離して、採取したの
ち実施例１に記載されたトリプシン溶液を加えて分散さ
せ、再び遠心分離してこれを採取した。こうしてえられ
た表皮細胞にグリーン培地を加え、計数後、前記のよう
に線維芽細胞を付着させた培養皮膚に播種したものであ
る。

【００８５】表皮細胞の播種後、クリーンベンチの中で
８時間静置したのち、グリーン培地を加えて５％のＣＯ
₂インキュベーター中で３７℃にて３日毎に培地を交換
しながら１０日間培養し、複合培養皮膚をえた。

【００８６】えられた複合培養皮膚の入ったケースの培
地を除去し、前記培養皮膚をＤＭＥＭで洗浄し、過剰な
ＤＭＥＭを除去したのち−１℃／ｍｉｎにて−８０℃ま
で凍結した。１カ月後、これを凍結の状態で真空下乾燥
した。この際の凍結乾燥条件は、−３０℃、２×１０^-2
ｍｂａｒであり、品温（人工皮膚温度）が棚温（設定温
度：−３０℃）とほぼ同じになってから棚温５℃として
１５時間真空乾燥し、本発明の人工皮膚をえた。

【００８７】実施例４ヒアルロン酸含有コラーゲンスポンジを基材とする培養
皮膚を用いた人工皮膚の作製塩酸でｐＨ３に調整した蒸留水１００ｍＬにアテロコラ
ーゲン（（株）高研製）を溶解して１ｗ／ｖ％の水溶液
とした。こののち、アテロコラーゲン水溶液をｐＨ４に
調整した。また、別にヒアルロン酸ナトリウム（紀文フ
ードケミファ（株）製）０．０１ｇを蒸留水に溶かして
１ｗ／ｖ％の水溶液を調製した。この溶液１ｍＬを前記
アテロコラーゲン水溶液と混合して１００ｍＬとし、ヒ
アルロン酸−アテロコラーゲン水溶液（ヒアルロン酸
０．０１ｗ／ｖ％溶液）をえた。これを１分間ホモジナ
イズしたのち、プラスチックケース（６×９．５ｃｍ、
高さ２．８ｃｍ）にヒアルロン酸−アテロコラーゲン水
溶液２５ｍＬを流し込んだ。これをアンモニア雰囲気下
にて２時間静置してゲル化させ、水洗したのち、凍結乾
燥を行なった。

【００８８】これに１ｍＷ／ｃｍ²でＵＶを３０分間照
射したのち、エチレンオキサイドガス滅菌を行なってヒ
アルロン酸を含有したアテロコラーゲン基材をえた。

【００８９】この基材に実施例２と同様の方法で採取
し、増殖せしめた線維芽細胞を５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／
ｃｍ²の細胞密度で播種し、培養増殖させた。

【００９０】こののち、培地を除去し、この培養皮膚を
ＤＭＥＭで洗浄し、余分なＤＭＥＭを除去した。このの
ち、凍結乾燥機に入れ約−１℃／ｍｉｎにて−３０℃ま
で冷凍して凍結させた５時間後、真空度２×１０^-2ｍｂ
ａｒにて真空乾燥を開始し、品温（人工皮膚温度）が棚
温（設定温度：−３０℃）とほぼ同じになってから棚温
を５℃として１５時間真空下で乾燥したのち、凍結乾燥
機から取り出し本発明の人工皮膚をえた。この人工皮膚
を冷蔵庫で５℃にて保存した。

【００９１】実施例５ヒアルロン酸薄膜を基材とする培養皮膚を用いた人工皮
膚の作製ヒアルロン酸ナトリウム０．２ｇに蒸留水１ｍＬを加
え、これに１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液０．５ｍＬを加
えて溶解させ、ヒアルロン酸ナトリウム水溶液とした。
グリセロールポリグリシジルエーテル（デナコールＥ
Ｘ−３１３メディカルグレード、ナガセ化成工業（株）
製）２ｇをエタノール５ｍＬに溶解させた。グリセロー
ルポリグリシジルエーテルのエタノール溶液０．４３ｇ
をヒアルロン酸ナトリウム水溶液に加えてよく撹拌し
た。この混合液を直径約２ｃｍのプラスチックシャーレ
に入れ乾燥機で６０℃、１５分間加熱した。

【００９２】えられた薄膜をこのシャーレからはずして
蒸留水で水洗したのち、０．１Ｎ塩酸にて中和し、５０
ｖ／ｖ％エタノール水溶液に置換してまた蒸留水中に浸
漬した。そののち、実施例２と同様に、線維芽細胞を播
種し培養増殖させ、凍結乾燥して本発明の人工皮膚をえ
た。

【００９３】試験例１本発明の人工皮膚に温存された生理活性物質は、創面に
おいて浸出液に溶解または拡散し前記したような機構で
創傷治癒を促進すると考えられる。人工皮膚にて創傷治
癒が促進されることを動物実験にて確認した。

【００９４】４週齢のオスＩＣＲマウス（４匹）を飼育
室で２週潤化させてから以下の実験に供した。マウスを
左手でしっかり保持したのち、生理的食塩水で５倍に希
釈したペントバルビタール（ピボット社）を５０ｍｇ／
ｋｇの濃度で腹腔内に投与し、深麻酔に至ってから背部
中央の３ｃｍ四方を剃毛した。翌日、マウスに前日と同
様の麻酔を施し、深麻酔に至ったマウスをコルク板上に
固定した。７０％アルコールで背部正中皮膚を消毒した
のち、左右２カ所の皮膚剥離位置にそれぞれ直径２０ｍ
ｍの皮膚切離マークを施した。円形マークの頭側の円周
上の一点をピンセットでつまみ上げ、マークの内縁に沿
って眼科用ハサミで約２ｍｍを切り、ここを拠点として
皮切を伸ばして行き、出血および皮下筋層の切断なしに
直径２０ｍｍの移植床を２カ所作製した（図１）。

【００９５】実施例２で作製したスポンジ状の人工皮膚
を６ケ月間５℃にて保存したのち、直径２０ｍｍに切
り、ＤＭＥＭに浸漬後、室温に３０分間放置し、充分に
ＤＭＥＭになじませてから、人工皮膚より大きな滅菌ガ
ーゼで覆った。このとき、人工皮膚と滅菌ガーゼを密着
させたまま、移植床の中央に置き、人工皮膚を移植床面
に隙間が残らないように広げた。

【００９６】このようにして、移植床と人工皮膚の辺縁
を合わせたのち、周辺の６ケ所を６−０ナイロン糸付角
型縫合針（協和時計工業（株）製）で縫合した。

【００９７】人工皮膚の上に、直径２０ｍｍの円形に作
製した創傷被覆用不織膜を載せ、人工皮膚と同様に６カ
所を縫合し、さらに２５ｍｍ四方に折りたたんだ滅菌ガ
ーゼ２〜３枚を載せ、弾性包帯を胸腹部に巻き固定し
た。

【００９８】同時に、実施例２の前半で作製方法を開示
したコラーゲンスポンジを対照として人工皮膚の代わり
に同一マウスに使用し、同様の処置をした。移植後は、
隔離式のケージを用い一匹毎に飼育した。

【００９９】移植した人工皮膚の観察および２次移植
は、一週間ごとに４週間行なった。観察を行なう時に
は、前記同様、麻酔を施し、包帯を除去したのち、眼科
用ハサミで抜糸し、移植した人工皮膚を取り除いた。創
面を肉眼的に観察したのち、前述同様に人工皮膚を移植
し（２次移植）さらに実験終了まで毎週同様の操作を繰
り返した。

【０１００】観察全期間を通して、創面の壊死、硬結、
浮腫などの所見を伴う拒絶反応は出現しなかった。移植
後１週間では、人工皮膚移植面（図２右創面）は、創全
面に良性肉芽組織が形成しているのが観察できたが、コ
ラーゲンスポンジのみを適用した創面（図２左創面）で
は、肉芽の発達が良くなく、若干の感染と若干の皮膚拘
縮が見られた。２週間後には、人工皮膚移植面（図３右
創面）は、さらに肉芽が発達し、周囲からの表皮の伸展
が明らかとなっているのに対して、コラーゲンスポンジ
のみを適用した創面（図３左創面）は、肉芽組織の形成
および表皮の伸展共に人工皮膚を貼付したものほどでは
なかった。４週間後には、人工皮膚を移植した創面（図
４右創面）は、コラーゲンスポンジのみを適用した創面
（図４左創面）に比し、表皮の閉塞が早く、かつ、拘縮
もみられず良好に治癒していた。

【０１０１】試験例２ＩＬ−６の定量本発明の人工皮膚中に温存されたＩＬ−６タンパク質量
は、固相上に固定化した抗体により、測定すべきＩＬ−
６タンパク質をトラップし、酵素標識二次抗体を使って
トラップされたＩＬ−６タンパク質の定量を行なう、サ
ンドイッチ型酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ法）で行なっ
た。

【０１０２】実施例２で作製した人工皮膚および対照と
して実施例２前半で作製したコラーゲンスポンジを２０
ｍｍ四方に切り、あらかじめ眼科用ハサミで細断し、１
０倍容量のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳとともにプラスチッ
ク製チューブ（住友ベークライト（株）製）に入れ、ポ
リトロン型ホモジナイザー（キネマチカ（Ｋｉｎｅｍａ
ｔｉｃａ）社製）を用いて１０００ｒｐｍで５〜１０回
上下させながら、３０秒間破壊し測定試料を調製した。
そののち、孔径０．２２μｍのメンブレンフィルターを
通過させることにより試料中の残骸（デブリ）を取り除
いてから、ＩＬ−６タンパク質の定量に供した。

【０１０３】固相としてポリスチレン製のマイクロタイ
タープレート（日本インターメッド（株）製）を使用し
た。抗ＩＬ−６抗体（カペル社）を０．０５Ｍリン酸ナ
トリウム緩衝液、ｐＨ７．０で２０μｇ／ｍＬの濃度に
溶解し、えられた溶液中に前記プレートを４℃で一夜漬
けて、抗ＩＬ−６抗体を固相へ物理的吸着により固定化
した。

【０１０４】前記プレートを０．０５Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄したのち、同じ緩衝液で３
〜３００ｐｇ／ｍＬの濃度に希釈した測定試料およびＩ
Ｌ−６標準物質と抗ＩＬ−６抗体が固定化されたマイク
ロタイタープレートを３７℃で振とうしながら、１時間
インキュベートした。０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝
液、ｐＨ７．０で洗浄後、測定すべきＩＬ−６タンパク
質のトラップされたマイクロタイタープレートと二次抗
体である抗ＩＬ−６タンパク質抗体（カペル社）とを３
７℃で１時間インキュベートした。こののち、前記の緩
衝液で洗浄後、ペルオキシダーゼ標識抗体を加えさらに
３７℃で１時間インキュベートし、前記緩衝液で洗浄
後、ペルオキシターゼの基質であるＡＢＴＳ（２，２′
−アゾノジ（３−エチルベンズチアゾリン）−６′−ス
ルホン酸）（シグマ社）および過酸化水素を用いた発色
法により、ペルオキシダーゼ活性を定量し、マイクロタ
イタープレート中のＩＬ−６タンパク質量を算出した。

【０１０５】測定試料の一部を用いて、牛血清アルブミ
ンを標準にしたビシンコニン酸法によるタンパク質定量
を行ない、マイクロタイタープレート各穴毎のタンパク
質量を求めた。最終的な指標として、各マイクロタイタ
ープレート穴毎に、全タンパク質量に対するＩＬ−６タ
ンパク質量を計算し、これを人工皮膚中のＩＬ−６タン
パク質量とした。

【０１０６】この結果、測定試料中の全タンパク質量あ
たりのＩＬ−６タンパク質量が人工皮膚と培養皮膚に含
有されていることが認められた。

【０１０７】すなわち、本発明の人工皮膚からは、全タ
ンパク質１ｍｇあたり平均１９０ｐｇのＩＬ−６タンパ
ク質が検出できた。

【０１０８】対照として用いたコラーゲンスポンジから
は、ＩＬ−６タンパク質は検出されなかった。

【０１０９】

【発明の効果】本発明によれば、哺乳動物皮膚由来の細
胞を培養皮膚用基材に播種培養してえられる培養皮膚を
凍結乾燥することによって、従来の創傷被覆材より早期
にしかも良好に皮膚欠損組織を再建できかつ培養皮膚な
どに比べて安価かつ安定に流通でき、長期間保存できる
人工皮膚を提供することが可能となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】全層欠損創（ａおよびｂ）を作製したマウスの
創面をスケッチした図である。図１中、ｃおよびｄは全
層欠損創（ａおよびｂ）の作製時に切り取った皮膚片で
ある。

【図２】人工皮膚移植１週間後のマウスの創面をスケッ
チした図である。右背部（ａ）は本発明の人工皮膚を適
用した創面であり、左背部（ｂ）は対照のコラーゲンス
ポンジを適用した創面である。図２中、ｃは創面（ａ）
に適用した人工皮膚であり、ｄは創面（ｂ）に適用した
コラーゲンスポンジである。

【図３】移植後２週間後のマウスの創面をスケッチした
図である。右背部（ａ）は本発明の人工皮膚を適用した
創面であり、左背部（ｂ）は対照のコラーゲンスポンジ
を適用した創面である。図３中、ｃは創面（ａ）に適用
した人工皮膚であり、ｄは創面（ｂ）に適用したコラー
ゲンスポンジである。

【図４】移植後４週間のマウスの創面をスケッチした図
である。右背部（ａ）は本発明の人工皮膚を適用した創
面であり、左背部（ｂ）は対照のコラーゲンスポンジを
適用した創面である。図４中、ｃは創面（ａ）に適用し
た人工皮膚であり、ｄは創面（ｂ）に適用したコラーゲ
ンスポンジである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭62−246371（ＪＰ，Ａ) 特表平７−501214（ＪＰ，Ａ) 特表平10−509610（ＪＰ，Ａ) 特表平５−504085（ＪＰ，Ａ) 特表昭55−501130（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61L 27/00 A61F 2/10

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】哺乳動物皮膚由来の細胞をスポンジ状、
不織布状または織布状の培養皮膚用基材に播種培養して
えられたところの、細胞および基材からなる培養皮膚
を、培養により基材に生理活性物質が沈着した状態で凍
結乾燥することを特徴とする人工皮膚の製造法。
【請求項２】培養皮膚用基材がコラーゲン、キチン、
キトサン、ゼラチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫
酸およびポリグリコール酸からなる群より選ばれた少な
くとも１つの生体適合物質よりなる請求項１記載の製造
法。
【請求項３】培養皮膚用基材に貫通した孔が設けられ
た請求項１または２記載の製造法。
【請求項４】コラーゲンがアテロコラーゲンである請
求項２記載の製造法。
【請求項５】哺乳動物皮膚由来の細胞をスポンジ状、
不織布状または織布状の培養皮膚用基材に播種培養して
えられたところの、細胞および基材からなる培養皮膚
を、培養により基材に生理活性物質が沈着した状態で凍
結乾燥してなる人工皮膚。
【請求項６】培養皮膚用基材がコラーゲン、キチン、
キトサン、ゼラチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫
酸およびポリグリコール酸からなる群より選ばれた少な
くとも１つの生体適合物質よりなる請求項５記載の人工
皮膚。
【請求項７】培養皮膚用基材に貫通した孔が設けられ
た請求項５または６記載の人工皮膚。
【請求項８】コラーゲンがアテロコラーゲンである請
求項６記載の人工皮膚。