CN105833354A - 表皮片及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制品领域，公开了一种表皮片及其制备方法和应用。本发明的制备方法包括：制备胶原‑壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至胶原‑壳聚糖多孔支架上，再将胶原‑壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞诱导培养为表皮细胞。本发明的表皮片能够明显、高效、安全地促进大面积皮肤创面的再生、重构、修复与愈合。

Description

表皮片及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物制品领域，具体地，涉及一种表皮片及其制备方法和在制备皮肤替代品中的应用。
背景技术
对于大面积的皮肤全层缺损，临床上常用的修复方法是自体或异体皮肤移植，但这些方法会造成供区新的创伤。同时，供皮来源和免疫排斥问题也限制了其有效的应用。伴随组织工程技术的发展，组织工程皮肤成为最先用于临床的组织工程产品，这些产品虽可暂时覆盖创面，但仍存在一定的免疫排斥反应，且治疗效果也并不理想。组织工程的关键问题是种子细胞和支架结构问题。目前常用的种子细胞为自体或同种异体的角质细胞及成纤维细胞，但这些种子细胞因其自我增殖能力有限、易老化、不易获得，且具有一定的免疫排斥反应等限制了其应用。因此，如何改进组织工程皮肤，使其快速、高质量的修复创面，具有重要的研究价值和治疗前景。
寻找取材容易并能在体外大量扩增的种子细胞是目前研究的热点之一。近年来干细胞的研究和发展为解决这一难题提供了新的思路和可能手段。研究表明，间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)具有自我更新能力、增殖能力强、低免疫原性等优势，能够促进皮肤创面的愈合，其机制包括：能够分化为皮肤组织相关细胞、促进成纤维细胞的增殖、加速血管生成、抑制炎症细胞因子等，特别是在合适的条件下可以分化为表皮细胞，为制备双层活性组织工程皮肤、表皮片并用于大面积皮肤缺损提供了丰富的种子细胞。
以胶原和壳聚糖两种高分子生物为基础的胶原-壳聚糖组织工程支架是运用多学科的方法和手段制备的一种较为完善的工程化组织，是能够恢复、保持或改善皮肤功能的皮肤替代品，它可以模拟细胞外基质，构建组织再生的框架，支架的形态和微观结构直接影响细胞的粘附、生长、迁移、增殖和代谢功能，最终使组织得以重建，完成创面的修复与再生。但是，其治疗大面积皮肤全层缺损的效率较低，不利于促进大面积创面的修复进程与皮肤附件的再生。
目前，治疗大面积皮肤全层缺损研究仍未取得重大突破。随着大面积创面研究的进一步深入，组织工程皮肤在大面积创面应用研究上有了逐步发展，但如今的难点之一(如前所述)是目前用于构建组织工程皮肤的种子细胞(如角质细胞和成纤维细胞)自我增殖能力有限、易老化、不易获得，且具有一定的免疫排斥反应，进而导致运用组织工程技术治疗大面积创面存在一定限制；难点之二是无法有效地将间充质干细胞运用在大面积创面的修复与再生上，进而如何利用间充质干细胞安全、稳定、快速、高质量地获得组织工程皮肤的问题也越来越突出，是亟需解决的难题。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术中的上述缺陷，提供一种表皮片及其制备方法和应用，该表皮片用于治疗创伤等造成的大面积皮肤创面，能够明显、高效、安全地促进大面积皮肤创面的再生、重构、修复与愈合。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种表皮片的制备方法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上，再将胶原-壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞诱导培养为表皮细胞。
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的表皮片。
第三方面，本发明提供了上述表皮片在制备皮肤替代品中的应用。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明的表皮片，能够明显加快大面积皮肤创面的损伤修复，这一加速作用是将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上并将胶原-壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞诱导培养为表皮细胞来实现的，为治疗大面积皮肤创面提供了有效手段，能够明显、高效、安全的加快其修复进程与皮肤附件再生。
(2)本发明的表皮片，可以抑制创面的炎症反应，促进血管新生及再上皮化，促进创面愈合及促进损伤皮肤生成毛囊等附属结构，避免免疫排斥反应，从而使损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化，能够应用于慢性创面、大面积皮肤创伤、烧伤患者等缺乏可供移植的自体皮肤，为促进皮肤创面愈合、解决移植皮源问题提供了新的出路。
(3)本发明的表皮片拥有合理的孔径、孔隙、三维多孔结构、优良的生物降解率和溶胀属性，在体内可以较好的模拟正常皮肤微环境，释放生物活性因子，有利于细胞迁移增殖以及生长因子的浸润，可以有效促进损伤部位移植后的快速血管新生及再上皮化，促进大面积皮肤创面的修复再生和愈合，提高移植效率。
(4)本发明有效的揭示了表皮片在治疗大面积创面中新的作用机制，为大面积创面的治疗提供了新思路。
(5)本发明的表皮片可以作为体外皮肤模型进行一些相关的基础医学领域比如皮肤生理学及皮肤病理学方面的研究。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1显示的是本发明实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的特性，其中，(A)为胶原-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片，(B)为扫描电镜(标尺长度为100μm)下的胶原-壳聚糖多孔支架的显微图片。
图2显示的是本发明的采用模拟皮肤在体微环境下诱导间充质干细胞分化为表皮细胞，即接种间充质干细胞至胶原-壳聚糖多孔支架材料表面、在条件培养基的作用下结合气-液培养的方式进行诱导分化为表皮细胞。(A)体外间充质干细胞在支架上培养的HE染色图。(B)免疫组化检测表皮细胞标志物的表达情况。(C)Western Blotting检测表皮细胞标志物的表达情况。
图3显示的是细胞死活实验(Live/Dead实验)的结果图，其中，绿色为活细胞，红色为死细胞。
图4显示的是将实施例1的表皮片移植于全层皮肤损伤部位后第7天和第21天的皮肤愈合情况图。
图5显示的是将实施例1的表皮片移植于全层皮肤损伤部位后第21天的组织学观察图。
图6显示的是将实施例1的表皮片移植于全层皮肤损伤部位后第7天和第21天的创面愈合率统计图(图例中从左到右依次为空白对照组、单纯支架组、对照组和实验组)。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
第一方面，本发明提供了一种表皮片的制备方法，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上，再将胶原-壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞诱导培养为表皮细胞。
本发明的制备方法中，对于制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种制备方法。但是，本发明的发明人在研究中发现，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，控制胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的特定的浓度和胶原-壳聚糖溶液的pH值会得到孔径大小不一的胶原-壳聚糖多孔支架。因此，为了进一步寻求更适于间充质干细胞生长的胶原-壳聚糖多孔支架，优选情况下，制备胶原-壳聚糖多孔支架的方法包括：配制胶原-壳聚糖溶液，使得胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，进一步优选均为2-3mg/mL；然后将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，进一步优选为6.2-6.4；再将胶原-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理、第一冷冻干燥处理、化学交联处理和第二冷冻干燥处理。
本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的溶剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种溶剂，优选情况下，所述溶剂为醋酸溶液，即，胶原-壳聚糖溶液为胶原-壳聚糖的醋酸溶液，进一步优选地，醋酸溶液中醋酸的浓度为0.05-0.5mol/L。
本发明的制备方法中，对于配制胶原-壳聚糖溶液的方法没有特别的限定，只要能够配制得到前述特定浓度的胶原-壳聚糖溶液即可，例如可以包括：分别将胶原粉末和壳聚糖粉末溶解于醋酸溶液中，配制2-10mg/mL优选3-7mg/mL的胶原溶液和2-10mg/mL优选3-7mg/mL的壳聚糖溶液，然后以适当的体积比例将两种溶液混合。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，第一冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，化学交联处理的条件包括：将第一冷冻干燥处理得到的支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为4-8℃，浸泡时间为8-18h。对于交联剂没有特别的限定，可以为本领域常用的各种交联剂，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。
本发明的制备方法中，为了去除残余交联剂，在化学交联处理之后可以用去离子水洗涤支架2-4次，每次5-10min。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，第二冷冻干燥处理为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
本发明的制备方法中，在制备胶原-壳聚糖多孔支架时，优选情况下，胶原的来源为猪、牛、羊、猴或鼠，进一步优选为牛，更进一步优选为牛肌腱。制备胶原粉末的方法可以为本领域技术人员所公知的各种方法，在此不再赘述。
本发明的制备方法中，本领域技术人员应该理解的是，所有操作均在无菌条件下进行。
本发明的制备方法中，优选情况下，将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上(表面)的方法包括如下步骤：
(1)将胶原-壳聚糖多孔支架进行灭菌，然后在无菌条件下，将胶原-壳聚糖多孔支架的pH值调节为7-7.5；
(2)将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上，30-38℃下孵育4-6h。
对于将胶原-壳聚糖多孔支架进行灭菌的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以采用钴-60或电子束辐照灭菌，辐照剂量可以为20-30kGy。
对于将胶原-壳聚糖多孔支架的pH值调节为7-7.5的方法没有特别的限定，可以为本领域常用的各种方法，例如可以为：在30-38℃下，先用1×PBS缓冲液孵育胶原-壳聚糖多孔支架2-4次，每次30min，然后弃除PBS，在30-38℃下用低糖DMEM培养基孵育胶原-壳聚糖多孔支架，每3-4h更换一次低糖DMEM培养基，更换2-4次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变、并测定pH值为7-7.5即可。
步骤(2)中，将间充质干细胞仅一次接种至胶原-壳聚糖多孔支架表面。本发明的发明人在研究中进一步发现，步骤(2)中，向胶原-壳聚糖多孔支架上接种的间充质干细胞的密度对制备得到的表皮片能否有效促进大面积皮肤创面的修复再生有重要影响，而间充质干细胞的接种密度为2.5×105-5×105个间充质干细胞/cm2胶原-壳聚糖多孔支架时，能够有效促进大面积皮肤创面的修复再生，因此，优选情况下，步骤(2)中，间充质干细胞的接种量为2.5×105-5×105个间充质干细胞/cm2胶原-壳聚糖多孔支架。其中，本发明的发明人发现间充质干细胞的接种量为3×105个间充质干细胞/cm2胶原-壳聚糖多孔支架时制备得到的表皮片移植于大面积创面损伤部位的治疗效果最佳。
本领域技术人员应该理解的是，在胶原-壳聚糖多孔支架上接种的间充质干细胞能够接种到胶原-壳聚糖多孔支架的表面，作为被诱导培养为表皮细胞的细胞。其中，对于含有间充质干细胞的培养基没有特别的限定，可以为本领域中用于培养间充质干细胞的各种培养基，例如可以为低糖DMEM培养基或无血清培养基，前述各培养基均可通过商购获得。
本发明的制备方法中，优选情况下，将胶原-壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞诱导培养为表皮细胞的方法包括：在30-38℃下，将接种有间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架先在液面条件下培养2-4天，然后在气-液条件下培养7-14天。优选地，液面条件下培养所用的培养基为低糖DMEM，气-液条件下培养所用的培养基为含5-20μM全反式维甲酸的无血清角质细胞培养基KSFM。进一步优选地，液面条件下培养的实施方式包括：将接种有间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架完全处于培养基环境中进行培养；气-液条件下培养的实施方式包括：将接种有间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架处于培养基环境和空气环境中进行培养，更进一步优选地，在气-液条件下，以高度计，将至少1/2的胶原-壳聚糖多孔支架处于培养基环境中。本发明的发明人在研究中发现，将在气-液条件下诱导培养7天得到的表皮片移植于大面积创面损伤部位的治疗效果最佳。
本发明的制备方法中，优选情况下，间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞可来自SD大鼠或人。对于SD大鼠或人的骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞的制备方法没有特别的限定，可以分别为本领域常用的各种制备方法，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。另外，骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和脐带间充质干细胞均可通过商购获得。
第二方面，本发明提供了上述方法制备得到的表皮片。
第三方面，本发明提供了上述表皮片在制备皮肤替代品中的应用。
本发明的应用中，对于皮肤替代品没有特别的限定，可以为本领域常用的各种皮肤替代品。
利用本发明的表皮片制备得到的皮肤替代品能够明显促进大面积皮肤创面的再生、重构、修复与愈合，明显促进大面积皮肤创面损伤部位新生血管的再生、再上皮化和减少炎症细胞浸润，以及明显促进毛囊等附属结构再生和胶原重排，在最大程度上促进大面积皮肤创面损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
实施例
以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
以下实施例和对比例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例和对比例中所用的实验材料，如无特殊说明，均可市售获得。
壳聚糖粉末购自Sigma公司。
扫描电镜购自日本日立公司，型号为TM100。
SD大鼠骨髓间充质干细胞购自天津卫凯生物工程有限公司。
EDC/NHS交联剂的配制方法为：将EDC、NHS分别溶于95％乙醇溶液中至浓度为33nmol/L和8nmol/L，得到EDC溶液和NHS溶液，然后将EDC溶液和NHS溶液等体积混合。
制备例
本制备例用于说明胶原粉末的提取方法。
(1)取新鲜牛肌腱10g，去除周围结缔组织，将牛肌腱剪成1-2mm大小的组织块。
(2)将组织块放入0.1质量％Na2CO3溶液中浸泡2h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。
(3)将组织块放入含1mol/L NaCl的0.5％Tris-HCl(pH＝7.5)溶液中浸泡12h，蒸馏水漂洗3次，每次10min。
(4)将组织块放入250mL含500mg胃蛋白酶的0.05mol/L的醋酸溶液中，4℃浸泡72h，期间反复搅拌至充分消化成透明糊状。
(5)将混合液在4℃，5000g下离心20min，取上清。
(6)将步骤(5)中的离心沉淀再进行步骤(4)、(5)的操作，重复操作2次。
(7)向所得上清溶液中加入其体积1％的双氧水，4℃静置4h，去除沉淀杂质。
(8)向所得溶液中加入NaCl至沉淀不再析出，4℃静置12h。
(9)将混合液在4℃，5000g下离心20min，收集沉淀。
(10)将步骤(9)中的上清液再进行步骤(8)、(9)的操作一次。
(11)将所得沉淀溶解于100ml浓度为0.05mol/L的醋酸溶液中，用0.05mol/L醋酸溶液透析2天，再用超纯水透析3天，每天换液三次至胶原溶液中盐离子浓度为0.02-0.06mol/L之间。
(12)将透析后的所得溶液-80℃冻干后，通过真空冷冻干燥机在-80℃下干燥24h，获得固体粉末胶原。
实施例1
本实施例用于说明本发明的表皮片及其制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为6mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为4mg/mL的胶原溶液。
(2)将等体积的壳聚糖溶液和胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.3。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，37℃孵育30min。
(4)-80℃冷冻24小时后，置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，得到胶原-壳聚糖初级支架。
(5)将胶原-壳聚糖初级支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，4℃放置12h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(6)将步骤(5)得到的胶原-壳聚糖支架于-80℃冷冻24小时后，再置于真空冷冻干燥机中-80℃冻干12h，即获得胶原-壳聚糖多孔支架。
(7)将步骤(6)得到的胶原-壳聚糖多孔支架进行钴-60辐照灭菌，辐照剂量为25kGy，然后在37℃、无菌条件下，将灭菌处理得到的胶原-壳聚糖多孔支架放置于6孔板，先用1×PBS缓冲液孵育胶原-壳聚糖多孔支架3次，每次30min，然后弃除PBS，用低糖DMEM培养基孵育胶原-壳聚糖多孔支架，每3h更换一次低糖DMEM培养基，更换3次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变，测定胶原-壳聚糖多孔支架的pH值为7.2。
(8)弃除步骤(7)的低糖DMEM培养基，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入100μl含有1.35×106个骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基，37℃下孵育5h。
(9)在37℃下，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培养基，将步骤(8)得到的接种有骨髓间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架完全处于低糖DMEM培养基环境中液面培养2天，然后弃除前述低糖DMEM培养基，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入1.5ml含10μM全反式维甲酸的KSFM培养基，将胶原-壳聚糖多孔支架在气-液条件下培养7天，所述气-液条件为将液面培养后的胶原-壳聚糖多孔支架处于培养基环境和空气环境中进行培养，其中，以高度计，将2/3的胶原-壳聚糖多孔支架处于KSFM培养基环境中，将1/3的胶原-壳聚糖多孔支架处于空气中。
(10)从步骤(9)得到的胶原-壳聚糖多孔支架取样，进行免疫组化实验(一抗为鼠抗cytokeratin19(即细胞角蛋白19，1:200)和鼠抗involucin(即外皮蛋白，1:1000)，二抗为山羊抗小鼠二抗(1:250))和Western Blotting实验(一抗为鼠抗cytokeratin19(1:500)和鼠抗involucin(1:1000)，二抗为山羊抗小鼠二抗(1:2000))以检测表皮细胞标志物角蛋白19和外皮蛋白的表达情况。其中，免疫组化实验检测表皮细胞标志物的表达结果如图2(B)所示，Western Blotting实验检测表皮细胞标志物的表达结果如图2(C)所示。结果表明胶原-壳聚糖多孔支架表面的细胞表达呈阳性，说明已成功诱导胶原-壳聚糖多孔支架表面的骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞并构建成表皮片。
实施例2
本实施例用于说明本发明的表皮片及其制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为5mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为5mg/mL的胶原溶液。
(2)将等体积的壳聚糖溶液和胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.2。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，38℃孵育25min。
(4)-70℃冷冻30小时后，置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，得到胶原-壳聚糖初级支架。
(5)将胶原-壳聚糖初级支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，6℃放置18h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(6)将步骤(5)得到的胶原-壳聚糖支架于-90℃冷冻8小时后，再置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，即获得胶原-壳聚糖多孔支架。
(7)将步骤(6)得到的胶原-壳聚糖多孔支架进行钴-60辐照灭菌，辐照剂量为20kGy，然后在30℃、无菌条件下，将灭菌处理得到的胶原-壳聚糖多孔支架放置于6孔板，先用1×PBS缓冲液孵育胶原-壳聚糖多孔支架2次，每次30min，然后弃除PBS，用低糖DMEM培养基孵育胶原-壳聚糖多孔支架，每4h更换一次低糖DMEM培养基，更换4次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变，测定胶原-壳聚糖多孔支架的pH值为7.3。
(8)弃除步骤(7)的低糖DMEM培养基，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入100μl含有1.125×106个骨髓间充质干细胞的低糖DMEM培养基，30℃下孵育6h。
(9)在37℃下，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培养基，将步骤(8)得到的接种有骨髓间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架完全处于低糖DMEM培养基环境中液面培养4天，然后弃除前述低糖DMEM培养基，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入1.5ml含8μM全反式维甲酸的KSFM培养基，将胶原-壳聚糖多孔支架在气-液条件下培养14天，所述气-液条件为将液面培养后的胶原-壳聚糖多孔支架处于培养基环境和空气环境中进行培养，其中，以高度计，将3/4的胶原-壳聚糖多孔支架处于KSFM培养基环境中，将1/4的胶原-壳聚糖多孔支架处于空气中。
(10)从步骤(9)得到的胶原-壳聚糖多孔支架取样，进行免疫组化实验和Western Blotting实验(条件同实施例1)以检测表皮细胞标志物角蛋白19和外皮蛋白的表达情况。其中，免疫组化实验检测表皮细胞标志物的表达结果与图2(B)相一致，Western Blotting实验检测表皮细胞标志物的表达结果与图2(C)相一致。结果表明胶原-壳聚糖多孔支架表面的细胞表达呈阳性，说明已成功诱导胶原-壳聚糖多孔支架表面的骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞并构建成表皮片。
实施例3
本实施例用于说明本发明的表皮片及其制备方法。
(1)将壳聚糖粉末和制备例制得的胶原粉末分别溶于0.05mol/L醋酸溶液中，得到浓度为4mg/mL的壳聚糖溶液和浓度为6mg/mL的胶原溶液。
(2)将等体积的壳聚糖溶液和胶原溶液混合均匀，获得胶原-壳聚糖溶液，然后用0.01mol/L的NaOH溶液调节胶原-壳聚糖溶液的pH值至6.4。
(3)将胶原-壳聚糖溶液搅拌均匀，真空脱泡后注入模具中，37℃孵育40min。
(4)-90℃冷冻18小时后，置于真空冷冻干燥机中-70℃冻干18h，得到胶原-壳聚糖初级支架。
(5)将胶原-壳聚糖初级支架浸泡于EDC/NHS交联剂中，8℃放置8h，用去离子水洗涤三次，每次5min。
(6)将步骤(5)得到的胶原-壳聚糖支架于-70℃冷冻30小时后，再置于真空冷冻干燥机中-90℃冻干8h，即获得胶原-壳聚糖多孔支架。
(7)将步骤(6)得到的胶原-壳聚糖多孔支架进行钴-60辐照灭菌，辐照剂量为30kGy，然后在37℃、无菌条件下，将灭菌处理得到的胶原-壳聚糖多孔支架放置于6孔板，先用1×PBS缓冲液孵育胶原-壳聚糖多孔支架4次，每次30min，然后弃除PBS，用低糖DMEM培养基孵育胶原-壳聚糖多孔支架，每4h更换一次低糖DMEM培养基，更换3次直至低糖DMEM培养基的颜色不发生改变，测定胶原-壳聚糖多孔支架的pH值为7.1。
(8)弃除步骤(7)的低糖DMEM培养基，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入100μl含有2.25×106个脐带间充质干细胞的低糖DMEM培养基，38℃下孵育4h。
(9)在37℃下，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入2ml低糖DMEM培养基，将步骤(8)得到的接种有骨髓充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架完全处于低糖DMEM培养基环境中液面培养3天，然后弃除前述低糖DMEM培养基，向每个孔板的胶原-壳聚糖多孔支架中加入1.5ml含15μM全反式维甲酸的KSFM培养基，将胶原-壳聚糖多孔支架在气-液条件下培养10天，所述气-液条件为将液面培养后的胶原-壳聚糖多孔支架处于培养基环境和空气环境中进行培养，其中，以高度计，将3/5的胶原-壳聚糖多孔支架处于KSFM培养基环境中，将2/5的胶原-壳聚糖多孔支架处于空气中。
(10)从步骤(9)得到的胶原-壳聚糖多孔支架取样，进行免疫组化实验和Western Blotting实验(条件同实施例1)以检测表皮细胞标志物角蛋白19和外皮蛋白的表达情况。其中，免疫组化实验检测表皮细胞标志物的表达结果与图2(B)相一致，Western Blotting实验检测表皮细胞标志物的表达结果与图2(C)相一致。结果表明胶原-壳聚糖多孔支架表面的细胞表达呈阳性，说明已成功诱导胶原-壳聚糖多孔支架表面的骨髓间充质干细胞分化为表皮细胞并构建成表皮片。
对比例1
按照实施例1的方法，不同的是，步骤(9)为：
(9)在37℃下，将步骤(8)得到的接种有骨髓间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架完全处于低糖DMEM培养基环境中液面培养2天。
试验例1
分别对本发明实施例1-3的步骤(6)得到的胶原-壳聚糖多孔支架的生物学性能和机械性能进行评估，评估内容和方法如下：
(1)胶原-壳聚糖多孔支架的宏观和微观结果评估。本发明的胶原-壳聚糖多孔支架的肉眼直观图片如图1(A)所示，扫描电镜下的实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的显微图片如图1(B)所示。其中，本发明实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的孔径为115-145μm、孔隙约为94％，为相互交联、高度均一的三维多孔网状结构。
(2)对实施例1-3的胶原-壳聚糖多孔支架进行支架溶胀率测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在室温下浸泡到去离子水中一定时间(如1、3、6、9、12天)，然后再称重，计为W2，计算支架溶胀率(％)＝(W2-W1)/W1×100％。
实施例1-3的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀率如表1所示，由表1数据可以看出：本发明的方法得到的胶原-壳聚糖多孔支架的溶胀性能良好。
表1
(3)对实施例1-3的胶原-壳聚糖多孔支架进行支架降解率测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的降解率的测定为例，测定方法包括：对实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架进行称重，计为W1，在37℃将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架置于含1mg/mL的I型胶原酶的1×PBS溶液中，一定时间后(如第1、2、3、4、5天)取出支架，去离子水漂洗后烘干称重，计为W2，计算残余质量(％)＝W2/W1×100％。
实施例1-3的胶原-壳聚糖多孔支架的残余质量如表2所示。生物材料在体内的降解速度，应该满足细胞对支架的降解要求，以促进修复细胞的增殖及迁移。由表2可以看出，本发明的胶原-壳聚糖多孔支架均具有较为优良的生物降解性能以配合组织修复再生。
表2
(4)对实施例1-3的胶原-壳聚糖多孔支架进行机械性能测定，其中，以实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架的测定为例，测定方法包括：将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架剪裁为40mm×5mm×0.3mm的条形，采用KES-G1材料试验机测试其干燥状态下的机械性能，拉伸速度为10mm/min。同时将实施例1的胶原-壳聚糖多孔支架在去离子水中浸泡24h后取出，滤纸吸去表面水分后相同条件下测定支架在湿性状态下的机械性能。
本发明实施例1-3中的胶原-壳聚糖多孔支架在干燥状态和湿性状态的拉伸强度如表3所示。由表3中数据可知，本发明的方法得到的胶原-壳聚糖多孔支架均具有较好的机械性能，在干燥状态下，随着壳聚糖浓度的增加，支架材料的断裂程度逐渐增强，表明支架的机械性能逐渐增强；但在干燥及湿性两种状态进行对比后发现，干湿状态相差较少时比较好，得到的胶原-壳聚糖多孔支架的拉伸强度较大且干湿状态下可变范围较小，说明该支架具有优良的柔韧度。
表3
干燥状态(G，MPa) 湿性状态(G，MPa)
实施例1 1.48 0.52
实施例2 2.17 1.43
实施例3 1.79 0.75
试验例2
(1)通过细胞活性实验检测本发明实施例1-3的步骤(8)得到的接种有间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞的生长状况。实施例1的结果如图3所示，几乎所有细胞均为活细胞。实施例2-3的结果与实施例1相同，在此不再赘述。
(2)分别将本发明实施例1-3的步骤(8)得到的接种有间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架用10％福尔马林溶液中固定24小时，将固定好的支架材料进行脱水处理，放入石蜡进行包埋，包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8微米厚的薄片，放于45℃恒温箱中烘干待用，进行苏木精-伊红染色，观察间充质干细胞在支架材料中的排列分布情况。实施例1的苏木精-伊红染色图如图2(A)所示。实施例2-3的结果与实施例1相同，在此不再赘述。由上述结果可知，接种间充质干细胞的接种密度为2.5×105-5×105个间充质干细胞/cm2胶原-壳聚糖多孔支架时，能够将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖三维支架材料表面，细胞在材料表面均匀分布，并且在材料表面能够形成细胞层，类似于皮肤结构。
试验例3
分别将实施例1步骤(7)得到的胶原-壳聚糖多孔支架(即单纯支架组)、实施例1得到的表皮片(即实验组)和对比例1得到的支架(即对照组)移植于糖尿病全层皮肤损伤部位(除支架不同外，其他条件均相同)，观察相应的损伤部位的愈合情况，同时对相同条件的损伤部位不进行任何处理，作为空白对照组进行对比。
(1)检测损伤部位在不同时间点愈合面积的动态变化。创面愈合率(％)＝(原始伤口面积-不同时间点的伤口面积)/原始伤口面积×100％。
上述不同处理组在第7天、第21天的皮肤愈合情况图如图4所示，结果表明：在损伤后第0-21天，本发明的表皮片能够明显减少创面瘢痕的形成，明显促进全层皮肤损伤部位愈合。
(2)分别取移植21天后的空白对照组、单纯支架组、实验组及对照组的皮肤损伤组织，于10％福尔马林溶液中固定24小时。将固定好的组织块进行脱水处理，放入石蜡进行包埋，包埋好的蜡块固定于切片机上，切成5-8微米厚的薄片，放于45℃恒温箱中烘干待用，进行苏木精-伊红染色。电镜观察不同处理组损伤部位的皮肤病理学改变及胶原分布情况。
上述不同处理组在移植后第21天的糖尿病全层皮肤损伤部位的苏木精-伊红染色图如图5所示。结果显示在移植后第21天，本发明的表皮片能够明显促进损伤部位新生血管的再生、再上皮化和减少炎症细胞浸润，以及明显促进真皮毛囊等附属结构再生，在最大程度上促进损伤部位皮肤结构和功能趋于正常化。
(3)支架移植于全层皮肤损伤部位后第7天和第21天的创面愈合率统计图如图6所示，结果显示：在移植后第7天、21天，空白对照组的创面愈合率分别为50％和85％，而单纯支架组的创面愈合率分别为55％和88％，对照组的创面愈合率分别为59％和90％，实验组的创面愈合率则高达70％和100％。即，本发明的表皮片能够明显、高效、安全地促进大面积皮肤创面的再生、重构、修复与愈合。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种表皮片的制备方法，其特征在于，该方法包括：制备胶原-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上，再将胶原-壳聚糖多孔支架上的间充质干细胞诱导培养为表皮细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上的方法包括如下步骤：
(1)将胶原-壳聚糖多孔支架进行灭菌，然后在无菌条件下，将胶原-壳聚糖多孔支架的pH值调节为7-7.5；
(2)将间充质干细胞接种至胶原-壳聚糖多孔支架上，30-38℃下孵育4-6h。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，步骤(2)中，间充质干细胞的接种量为2.5×105-5×105个间充质干细胞/cm2胶原-壳聚糖多孔支架。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述诱导培养的方法包括：在30-38℃下，将接种有间充质干细胞的胶原-壳聚糖多孔支架先在液面条件下培养2-4天，然后在气-液条件下培养7-14天；
优选地，液面条件下培养所用的培养基为低糖DMEM，气-液条件下培养所用的培养基为含5-20μM全反式维甲酸的KSFM培养基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，胶原-壳聚糖多孔支架的制备方法包括：配制胶原-壳聚糖溶液，使得胶原-壳聚糖溶液中胶原和壳聚糖的浓度均为1-5mg/mL，优选均为2-3mg/mL；然后将胶原-壳聚糖溶液的pH值调节为6-7，优选为6.2-6.4；再将胶原-壳聚糖溶液真空脱泡后注入模具中依次进行孵育处理、第一冷冻干燥处理、化学交联处理和第二冷冻干燥处理；
优选地，所述胶原-壳聚糖溶液为胶原-壳聚糖的醋酸溶液；
优选地，所述孵育处理的条件包括：温度为30-38℃，时间为25-40min。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述化学交联处理的条件包括：将第一冷冻干燥处理得到的支架浸泡于交联剂中，浸泡温度为4-8℃，浸泡时间为8-18h，优选地，所述交联剂为EDC/NHS交联剂。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述第一冷冻干燥处理和第二冷冻干燥处理均为先进行冷冻处理再进行干燥处理，冷冻处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为18-30h；干燥处理的条件包括：温度为-70～-90℃，时间为8-18h。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其中，所述间充质干细胞为骨髓间充质干细胞、脂肪间充质干细胞或脐带间充质干细胞。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的方法制备得到的表皮片。
10.权利要求9所述的表皮片在制备皮肤替代品中的应用。
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