CN112980001B - 一种胶原蛋白复合透明质酸凝胶、细胞外基质仿生材料及制备方法 - Google Patents
一种胶原蛋白复合透明质酸凝胶、细胞外基质仿生材料及制备方法 Download PDFInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
本发明提出了一种胶原蛋白复合透明质酸凝胶、细胞外基质仿生材料及制备方法,涉及仿生材料技术领域。该胶原蛋白复合透明质酸凝胶的制备方法,将胶原蛋白和透明质酸分别制成溶液后混合,交联后即得。所述细胞外基质仿生材料的制备方法包括将凝胶冻干后得到凝胶冻干粉;将自体组织先脱细胞后再冻干制成细胞外基质冻干粉,将粉末溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或平衡盐溶液,得到细胞外基质溶液;将凝胶冻干粉溶于细胞外基质溶液,溶胀后得到细胞外基质仿生材料。本发明的优点在于,首次将胶原蛋白、透明质酸和细胞外基质融合制备仿生材料,得到的生物医用材料具有仿生性好、生物相容度高和可降解的优点。
Description
技术领域
本发明涉及新材料和生物技术领域,具体而言,涉及一种胶原蛋白复合透明质酸凝胶、细胞外基质仿生材料及制备方法。
背景技术
透明质酸,又名玻尿酸,是一种酸性粘多糖,由于其良好的生物相容性和独特的理化性质,在食品、化妆品、医疗美容、组织工程和再生医学中被广泛应用。天然透明质酸是由D葡萄糖酸和N-乙酰基葡萄糖双糖单位组成,D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-配糖键相连,双糖单位之间由β-1,4-配糖键相连。由于人体内存在透明质酸酶,如果将天然透明质酸直接注射入体内,则容易被透明质酸酶降解,在体内保留时间较短,使得透明质酸在医疗美容、组织工程和再生医学等体内应用方向受到的极大的限制。
为了增加透明质酸在体内的保留时间,提高透明质酸凝胶的粘弹性,通常通过交联剂对其进行化学修饰得到交联HA凝胶,改善其易被体内透明质酸酶降解的不足。交联剂的选择及交联工艺对最终得到的透明质酸的交联度、修饰度等都有较大的影响,进而影响最终得到的透明质酸的吸水膨胀性、粘弹性和体内半衰期等。修饰后的透明质酸在整形填充、细胞培养等方面具有较大的优势,如能够使皮肤弹性更好,祛除皱纹等。但由于透明质酸天然的结构问题,机械性能不足,无法为皮肤或器官提供一定的支撑,在需要一定机械性能的领域如组织支架、类器官以及3D打印等领域的使用受到限制。
胶原蛋白作为人体细胞外基质的主要物质之一,是支撑细胞的重要来源。因此,胶原蛋白是具有良好的机械性能和生物相容性的仿生材料来源,在体内能够被胶原蛋白酶及基质金属酶降解,降解产物可营养和修复周围组织,支持种子细胞的粘附、增殖、分化和组织的形成,同时免疫原性低,具有优异的透湿性及透气性。虽然胶原蛋白具有上述优点,但其加工性能较弱,使用范围较为受限。
因此,透明质酸和胶原蛋白本身就是人体中的重要物质,是细胞外基质的重要组成。胶原蛋白为细胞提供空间结构,透明质酸为细胞提供水合环境。如果以透明质酸和胶原蛋白复合制备细胞外基质仿生材料,将为各种需要仿生材料的领域提供极大的帮助。
发明内容
本发明的目的在于提供一种胶原蛋白复合透明质酸凝胶的制备方法,首次将胶原蛋白和透明质酸交联,以便能制备适应于仿生领域的材料。
本发明的另一目的在于提供前述制备方法制备的胶原蛋白复合透明质酸凝胶,该胶原蛋白复合透明质酸凝胶综合了胶原蛋白和透明质酸的生物学特点,更适用于仿生材料等领域对于材料特定的需求。
本发明的另一目的在于提供一种胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料的制备方法,此制备方法通过特定工艺将胶原蛋白、透明质酸和脱细胞自体细胞外基质制备仿生材料,克服了原有胶原蛋白、透明质酸和细胞外基质的缺陷,得到了仿生性、孔隙率和机械性能良好的细胞外基质仿生材料。
本发明的另一目的在于提供一种前述制备方法制备的胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料。该细胞外基质仿生材料不仅具有各类有益因子,如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等,还具有较好的机械性能和孔隙率,孔隙率能达到97%以上,利于原生细胞和/或种子细胞的生长、粘附和融合等。
本发明的另一目的在于提供一种前述胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料的用途。
本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
一方面,胶原蛋白复合透明质酸凝胶的制备方法,包括如下步骤,将胶原蛋白和透明质酸分别制成溶液后混合,交联,得到所述胶原蛋白复合透明质酸凝胶。
另一方面,本申请实施例提供一种胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料的制备方法,包括如下步骤,将胶原蛋白和透明质酸凝胶冻干后得到凝胶冻干粉;将自体组织先脱细胞后再冻干制成细胞外基质冻干粉,将所述粉末溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或平衡盐溶液,得到细胞外基质溶液;将所述凝胶冻干粉溶于所述细胞外基质溶液,溶胀后得到细胞外基质仿生材料。
另一方面,本申请实施例提供一种前述制备方法制备的胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料。
综上,相对于现有技术,本发明的实施例至少具有如下优点或有益效果:
本发明提供的一种胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料的制备方法,首次将胶原蛋白、透明质酸和细胞外基质融合制备仿生材料,得到的生物医用材料具有仿生性好、生物相容性高、可降解的特点,是组织工程和再生医学的理想材料,可广泛用于3D生物打印、细胞/干细胞培养支架、整形美容填充、类器官、肿瘤疾病模型、药物筛选细胞芯片以及基因药物递送系统等领域。
此外,本发明提供的细胞外基质仿生材料,其中的透明质酸和胶原蛋白都是支撑正常细胞形态、增殖、分化、迁移等生理过程的重要物质,本发明中通过在透明质酸中添加胶原蛋白,为透明质酸凝胶孔径提供三维支柱,共同形成具有一定机械性能的凝胶。此外,在前述凝胶的基础上,融入采用脱细胞工艺制备自体细胞外基质,使得最终制备的细胞外基质仿生材料,免疫源性低,无排异性,可很好的适应自身组织,满足移植要求,同时细胞外基质中含有的各类有益生长因子,如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等,利于粘附在其上的种子细胞或者移植环境周围的原生细胞在其上的粘附、生长、增殖和分化,促进血管生成和组织修复。此外还具有较好的机械性能和孔隙率,孔隙率能达到97%以上。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
一方面,本申请实施例提供一种胶原蛋白复合透明质酸凝胶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤,将胶原蛋白和透明质酸分别制成溶液后混合,交联,得到所述胶原蛋白复合透明质酸凝胶。首次采用胶原蛋白和透明质酸直接交联复合,克服了各自的缺点,使得制备的凝胶更适用于仿生领域对于细胞支架的需求。
在本发明的一些实施例中,上述制备方法中所述胶原蛋白和透明质酸的重量比为1:(1~10)。在一定范围内,透明质酸和胶原蛋白中胶原蛋白的比例升高,则透明质酸的孔径减少,故过高的胶原蛋白比例不利于透明质酸形成三维空隙,因此本发明采用特定比例的胶原蛋白可以有效改变透明质酸的机械性能,同时保证透明质酸的孔隙利于细胞的粘附、增殖和分化,便于特定组织填充原生细胞与种子细胞的融合,由于其具有一定的机械性能,也可用于单独填充,改变了原有胶原蛋白和透明质酸用途的局限性。
在本发明的一些实施例中,上述制备方法中所述交联过程中所用交联剂为京尼平、戊二醛(GTA)、聚乙二醇、碳化二亚胺(EDAC/EDC)、异氰酸盐(HDI)、环氧化合物(EC)、DPPA、NDGA、DVS、DBBC中的一种或几种,所述交联温度为45~70℃,交联时间为1h~3.5h。
在本发明的一些实施例中,上述制备方法中所述胶原蛋白选自I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性胶原蛋白中的一种或多种。这三类蛋白都是细胞外基质支架中的重要组成成分,相对于其他细胞外基质支架中的成分,与脱细胞细胞外基质融合难度更低,便于制备仿生材料。
在本发明的一些实施例中,上述制备方法中所述凝胶冻干和细胞冻干的条件为-20℃~-80℃下冷冻12~24h,然后真空干燥24~48h。
另一方面,本发明实施例提供一种前述制备方法制备的胶原蛋白复合透明质酸凝胶。
另一方面,本发明实施例提供一种胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料的制备方法,包括如下步骤,将前述胶原蛋白复合透明质酸冻干后得到凝胶冻干粉;将自体组织先脱细胞后再冻干制成细胞外基质冻干粉,将所述粉末溶于水、生理盐水、磷酸盐缓冲液或平衡盐溶液,得到细胞外基质溶液;将所述凝胶冻干粉溶于所述细胞外基质溶液,溶胀后得到细胞外基质仿生材料。透明质酸和胶原蛋白都是支撑正常细胞形态、增殖、分化、迁移等生理过程的重要物质,传统的生物材料都是将二者分别制备仿生材料,本发明的创造点之一就在于将透明质酸和胶原蛋白融合交联,制备含有透明质酸和胶原蛋白的凝胶,以作为细胞外基质仿生材料的部分组分,由于透明质酸是一种酸性粘多糖,虽然交联后具有三维结构,且也有一定的空隙,但细胞粘附性差,机械性能不足,无法作为组织支架、再生医学器官等需要一定机械力度材料来源,因此,本发明中通过添加胶原蛋白,为透明质酸凝胶孔径提供三维支柱,共同形成具有一定机械性能的凝胶,但胶原蛋白在体内易被降解,导致凝胶容易坍塌变形。此外,在前述凝胶的基础上,采用脱细胞工艺制备自体细胞外基质,进而制备细胞外基质仿生材料,自体细胞制备的细胞外基质,不同于异体细胞在体内会产生排异性,可很好的适应自身组织,满足移植要求,同时其中含有的各类有益生长因子,利于粘附在其上的种子细胞或者移植环境周围的原生细胞在其上的粘附、生长、增殖和分化,促进血管生成和组织修复。然而,细胞外基质虽然具有前述优点,但在实际操作过程中,提取方法会不可避免的破坏其仿生学性能,比如破坏表面分子结构,尤其是其中胶原蛋白和透明质酸,因此,将前述凝胶和细胞外基质溶液混合溶胀,也是本发明的创造点之一,最终得到的细胞外基质仿生材料,不仅具有各类有益因子,如成纤维细胞生长因子(FGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等,还具有较好的机械性能和孔隙率,孔隙率能达到97%以上。
在本发明的一些实施例中,上述制备方法中所述脱细胞和冻干包括如下步骤,将自体组织用0.6~0.8g/L的胶原酶酶解过夜,再置于于-70℃以下冷冻20~40min,再36~37℃加热15~30min,反复4~6次,然后于1wt%~1.2wt%的SDS震荡3~6h,清洗消毒后得到所述自体组织脱细胞膜;将所述自体组织脱细胞膜冻干后得到细胞外基质冻干粉。在该实施例中,使用特定冻融工艺制备细胞外基质,迅速冷冻可以使细胞内形成小冰晶,小冰晶在形成过程中胀破细胞膜,引起细胞溶解,反复多次的低温冷冻后融化可以有效破坏细胞结构,使细胞膜内物质逐步溶出细胞膜,但由于冻融时间和次数的有效控制,避免了冰晶对细胞外基质的破坏。SDS作为离子洗涤剂对于细胞的去除效果较好,但也会对细胞外基质的结构进行一定程度的破坏,胰蛋白酶不会对细胞外基质的结构造成破坏,但也对细胞的清除率不足,因此本实施例中同时再使用SDS和胰蛋白酶联合洗脱细胞和去除细胞内的残余成分,充分保护细胞外基质的分子结构同时达到最好的细胞清除效果,降低细胞外基质的免疫原性,减少排异情况,该方法避免了其他机械处理方法对细胞外基质结构的破坏,同时也避免了化学处理方法中大量试剂的添加,不利于后续的移植。
在本发明的一些实施例中,上述制备方法中所述胶原酶的浓度为0.7g/L,所述SDS的浓度为1wt%。
在本发明的一些实施例中,上述制备方法中所述凝胶冻干粉和所述细胞粉末的重量比为1:(1~10)。
另一方面,本申请实施例提供一种前述制备方法制备的胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料。
另一方面,本申请实施例提供一种前述胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料在制备3D生物打印材料、细胞/干细胞培养支架、类器官、组织工程材料、再生医学材料、整形美容填充材料、肿瘤疾病模型、药物筛选细胞芯片以及基因药物递送系统中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例的目的在于探索胶原蛋白和透明质酸的最优比例。
(1)按量称取胶原蛋白,将胶原蛋白溶于稀乙酸,制成0.5%的胶原蛋白溶液;
(2)按量称取将透明质酸,将透明质酸溶于稀乙酸,制成0.5%的透明质酸溶液;
(3)将前述胶原蛋白溶液和透明质酸溶液按照体积比1:3、1:5、1:7和1:9混合均匀,得到四种不同比例的混合溶液一;
(4)将DBBE溶于磷酸盐缓冲液中,制备1.2mmol/L的交联剂溶液,将交联剂溶液和混合溶液按照1:30、1:50、1:70混合,调整pH至5~6,磁悬浮搅拌器搅拌,混合均匀,得到混合溶液二,搅拌温度为50℃,交联时间为3h;
(5)将混合溶液二排除气泡后,于-20℃预冷冻2h,然后冷冻干燥机内冷冻干燥,冷冻干燥机内条件为-80℃冷冻12h,然后真空干燥24~48h得到得到凝胶冻干粉。
将最终得到的凝胶冻干粉溶于水,制成凝胶,测定不同比例的凝胶的孔隙率和孔径,结果如表1所示:
表1
由上表可知,在不同的交联剂与混合溶液(胶原蛋白+透明质酸)比例中,均存在随着胶原蛋白浓度的降低,凝胶孔径逐渐增大,但当胶原蛋白浓度过低时,由于缺少胶原蛋白的支撑,凝胶的孔径虽然增加,但孔隙率显著下降,故胶原蛋白溶液和透明质酸溶液以1:7比例混合,最终得到的凝胶孔隙率和孔径都最佳。对于同一胶原蛋白和透明质酸体积比,不同的交联比例也存在较大不同,其中以1:50的交联比例得到的胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料在孔隙率和孔径方面都能达到最优。
在本发明的前期试验中,对于交联剂进行了删选,包括京尼平、戊二醛(GTA)、聚乙二醇、碳化二亚胺(EDAC/EDC)、异氰酸盐(HDI)、环氧化合物(EC)、DPPA、NDGA、DVS和DBBE,其中DBBE交联效果最好,故在本实施例中直接使用DBBE。另外,对于交联条件的预实验中发现,交联温度在45~70℃,交联时间为1h~3.5h均能获得较好的交联效果,但以50℃交联3h为最优。同时,胶原蛋白可选自I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性胶原蛋白中的任意一种,具体视最终制备的胶原蛋白复合透明质酸凝胶的用途而定。
实施例2
本实施例的目的在于探索实施例1中提供的凝胶的最佳冻干条件。
(1)按量称取胶原蛋白,将胶原蛋白溶于稀乙酸,制成0.5%的胶原蛋白溶液;
(2)按量称取将透明质酸,将透明质酸溶于稀乙酸,制成0.5%的透明质酸溶液;
(3)将前述胶原蛋白溶液和透明质酸溶液按照体积比1:7混合均匀,得到四种不同比例的混合溶液一;
(4)将DBBE溶于磷酸盐缓冲液中,制备1.2mmol/L的交联剂溶液,将交联剂溶液和混合溶液按照1:30混合,调整pH至5~6,磁悬浮搅拌器搅拌,混合均匀,得到混合溶液二,搅拌温度为50℃,交联时间为3h;
(5)将混合溶液二排除气泡后,按如下分类组别进行冻干,然后真空干燥24~48h得到得到凝胶冻干粉:
A、于-20℃预冷冻2h,再-80℃冷冻12h;
B、于-20℃预冷冻2h,再-70℃冷冻12h;
C、于-20℃预冷冻2h,再-70℃冷冻24h;
将最终得到的凝胶冻干粉溶于水,制成凝胶,测定不同比例的凝胶的孔隙率和孔径,结果如表1所示:
表2
组别 | 孔隙率(%) | 孔径(um) |
A | 96 | 80~130 |
B | 94 | 120~160 |
C | 96 | 120~160 |
由上表可知,相同冷冻时间内,冷冻温度高利于形成更大的孔径,但对于孔径的数量并无显著影响,相同冷冻温度下,增加冷冻时间可以提升一定的孔隙率,但对于孔径大小并无改变。
实施例3
本实施例的目的在于探索制备自体细胞外基质溶液的最佳工艺。
将自体组织用0.6g/L的胶原酶酶解过夜,再置于于-70℃以下冷冻20min,再37℃加热15min,反复4次,然后于1.2wt%的SDS震荡3~6h,清洗消毒后得到所述自体组织脱细胞膜;将所述自体组织脱细胞膜冻干后得到细胞外基质冻干粉。
实施例4
本实施例的目的在于探索制备自体细胞外基质溶液的最佳工艺。
将自体组织用0.7g/L的胶原酶酶解过夜,再置于于-70℃以下冷冻30min,再37℃加热20min,反复5次,然后于1.2wt%的SDS震荡3~6h,清洗消毒后得到所述自体组织脱细胞膜;将所述自体组织脱细胞膜冻干后得到细胞外基质冻干粉。
实施例5
本实施例的目的在于探索制备自体细胞外基质溶液的最佳工艺。
将自体组织用0.8g/L的胶原酶酶解过夜,再置于于-70℃以下冷冻40min,再37℃加热30min,反复6次,然后于1.2wt%的SDS震荡3~6h,清洗消毒后得到所述自体组织脱细胞膜;将所述自体组织脱细胞膜冻干后得到细胞外基质冻干粉。
实施例6
本实施例的目的在于提供一种胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料,包括如下步骤:
(1)按量称取胶原蛋白,将胶原蛋白溶于稀乙酸,制成0.5%的胶原蛋白溶液;
(2)按量称取将透明质酸,将透明质酸溶于稀乙酸,制成0.5%的透明质酸溶液;
(3)将前述胶原蛋白溶液和透明质酸溶液按照体积比1:3、1:5、1:7和1:9混合均匀,得到四种不同比例的混合溶液一;
(4)将DBBE溶于磷酸盐缓冲液中,制备1.2mmol/L的交联剂溶液,将交联剂溶液和混合溶液按照1:30、1:50、1:70混合,调整pH至5~6,磁悬浮搅拌器搅拌,混合均匀,得到混合溶液二,搅拌温度为50℃,交联时间为3h;
(5)将混合溶液二排除气泡后,于-20℃预冷冻2h,然后冷冻干燥机内冷冻干燥,冷冻干燥机内条件为-80℃冷冻12h,然后真空干燥24~48h得到得到凝胶冻干粉;
(6)将自体组织用0.6~0.8g/L的胶原酶酶解过夜,再置于于-70℃以下冷冻20~40min,再36~37℃加热15~30min,反复4~6次,然后于1wt%~1.2wt%的SDS震荡3~6h,清洗消毒后得到所述自体组织脱细胞膜;将所述自体组织脱细胞膜冻干后得到细胞外基质冻干粉,将细胞外基质粉末溶于磷酸盐缓冲液,得到细胞外基质溶液;
(7)将所述凝胶冻干粉溶于所述细胞外基质溶液,溶胀后得到细胞外基质仿生材料。
需要注意的是,本实施例中还可使用水、生理盐水或平衡盐溶液溶解细胞外基质粉末,但从溶解效果、制得的细胞外基质溶液生物特性及成本考虑,以磷酸盐缓冲液溶解得到的细胞外基质溶液性能最佳。
实施例7
本实施例的目的在于提供验证不同来源胶原蛋白复合透明质酸的细胞外基质仿生材料的细胞生长情况,包括如下步骤:
(1)按量称取胶原蛋白,将胶原蛋白溶于稀乙酸,制成0.5%的胶原蛋白溶液;
(2)按量称取将透明质酸,将透明质酸溶于稀乙酸,制成0.5%的透明质酸溶液;
(3)将前述胶原蛋白溶液和透明质酸溶液按照体积比1:7混合均匀,得到四种不同比例的混合溶液一;
(4)将DBBE溶于磷酸盐缓冲液中,制备1.2mmol/L的交联剂溶液,将交联剂溶液和混合溶液按照1:50混合,调整pH至5~6,磁悬浮搅拌器搅拌,混合均匀,得到混合溶液二,搅拌温度为50℃,交联时间为3h;
(5)将混合溶液二排除气泡后,于-20℃预冷冻2h,然后冷冻干燥机内冷冻干燥,冷冻干燥机内条件为-70℃冷冻12h,然后真空干燥24~48h得到得到凝胶冻干粉;
(6)将实施例3~5得到的细胞外基质冻干粉分别溶于磷酸盐缓冲液,得到三种不同的细胞外基质溶液;
(7)将所述凝胶冻干粉按照不同比例(表3所示)分别溶于上述三种不同的细胞外基质溶液,溶胀后得到不同的细胞外基质仿生材料;
(8)将间充质干细胞包埋于步骤(7)中得到的细胞外基质仿生材料中,并使凝胶内的细胞密度为1×106/ML。将凝胶移入12孔板培养,每孔加入2ML DMEM培养基培养,每48h换入新鲜的完全培养基,培养温度为37℃,CO2浓度为5%。对照组细胞培养:将细胞接种于96孔板,每孔5×103个,每孔加入100微升培养基培养,隔天换液。实验组MTT实验:将实验组的凝胶取出置于新的48孔板内,每孔加入300μL MTT工作液,置于培养箱孵育6h。孵育结束后吸出含有MTT的培养基,每孔加入500μLDMSO,置于摇床持续晃动60min。待凝胶中的紫色结晶完全溶于DMSO后,从每个孔中抽取150μL溶有MTT结晶的DMSO移入新的96孔板。将孔板置于酶标仪,检测490nm波长吸光度,统计阳性细胞率,结果如下:
表3
由上表可知,实施例4中提供的细胞外基质冻干粉制备的细胞外基质仿生材料更利于间充质干细胞的增殖,增殖率可以达到50%,但其他条件下的细胞外基质冻干粉制备的细胞外基质仿生材料最少也能达到接近30%的增长率。其中,又以凝胶冻干粉与细胞外基质冻干粉的比例为1:10时增殖率最高,最高可达到56%。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围,而是仅仅表示本发明的选定实施例。例如在实施例7中,选取了间充质干细胞培养,实际上本发明所述的仿生材料同样适用于成纤维细胞、肿瘤细胞等其他各类细胞的培养,以及通过这些细胞培养构建类器官。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
Claims (2)
1.一种细胞外基质仿生材料的制备方法,其特征在于,步骤为,
(1)按量称取胶原蛋白,将胶原蛋白溶于稀乙酸,制成0.5%的胶原蛋白溶液;
(2)按量称取将透明质酸,将透明质酸溶于稀乙酸,制成0.5%的透明质酸溶液;
(3)将前述胶原蛋白溶液和透明质酸溶液按照体积比1:7混合均匀,得到混合溶液一;
(4)将DBBE溶于磷酸盐缓冲液中,制备1.2mmol/L的交联剂溶液,将交联剂溶液和混合溶液一按照1:50混合,调整pH至5~6,磁悬浮搅拌器搅拌,混合均匀,得到混合溶液二,搅拌温度为50℃,交联时间为3h;
(5)将混合溶液二排除气泡后,于-20℃预冷冻2h,然后冷冻干燥机内冷冻干燥,冷冻干燥机内条件为-70℃冷冻12h,然后真空干燥24~48h得到得到凝胶冻干粉;
将自体组织用0.7g/L的胶原酶酶解过夜,再置于于-70℃以下冷冻30min,再37℃加热20min,反复5次,然后于1.2wt%的SDS震荡3~6h,清洗消毒后得到所述自体组织脱细胞膜;将所述自体组织脱细胞膜冻干后得到细胞外基质冻干粉;
(6)将所述细胞外基质冻干粉溶于磷酸盐缓冲液,得到细胞外基质溶液;
(7)将所述凝胶冻干粉溶于细胞外基质溶液,溶胀后得到细胞外基质仿生材料;所述凝胶冻干粉与细胞外基质冻干粉的重量比为1:10。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,所述胶原蛋白选自I型胶原蛋白、III型胶原蛋白和弹性胶原蛋白中的一种或多种。
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