KR20220038705A - 3d 프린팅을 위한 무세제 탈세포화 세포외 기질 제조 방법 및 바이오잉크 - Google Patents

Abstract

본 발명은 무세제 탈세포화 ECM 제조 방법, 분말 형태 및 액체 형태의 무세제 탈세포화 ECM, 일차 바이오잉크의 제조 방법, 일차 바이오잉크, 혈관 바이오잉크의 제조 방법, 혈관 바이오잉크, 일차 바이오잉크 및/또는 혈관 바이오잉크를 포함하는 3차원 구조 및 3차원 구조의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

3D 프린팅을 위한 무세제 탈세포화 세포외 기질 제조 방법 및 바이오잉크

본 발명은 무세제 탈세포화 ECM 제조 방법, 분말 형태 및 액체 형태의 무세제 탈세포화 ECM, 일차 바이오잉크(bioink)의 제조 방법, 일차 바이오잉크, 혈관 바이오잉크의 제조 방법, 혈관 바이오잉크, 일차 바이오잉크 및/또는 혈관 바이오잉크를 포함하는 3차원 구조 및 3차원 구조의 제조 방법에 관한 것이다.

바이오프린팅은 3차원(3D) 조직 작제물의 개발을 위해 다른 성분와 함께 살아있는 세포의 자동화된 침착을 가능하게 한다. 바이오잉크 제형은 합성뿐만 아니라 천연 중합체 예컨대 콜라겐, 젤라틴, 알기네이트, 히알루론산, 피브린 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는 상이한 공급원으로부터 생성된다. 바이오프린팅에 사용되는 기질(matrix) 물질은 세포의 미세 환경을 구성하고 이동, 분화 및 기타 기능을 포함한 세포 과정을 조절할 수 있는 천연 세포외 기질(ECM)의 복잡성을 나타낼 수 없다는 것이 일반적으로 알려져 있다. 따라서 바이오잉크에 ECM이 존재하면 세포-세포 연결이 있는 미세 환경을 재현하는 데 유익한 것으로 간주된다.

국제 특허 출원 WO2017014582는 0.05 내지 60Х10⁶/mL의 세포, 0.1 내지 10 w/v %의 세포 담체 물질, 0.01 내지 1 w/v %의 점도 증진제, 1 내지 30 v/v %의 윤활제 및 0.1 내지 10 w/v %의 구조적 물질을 포함하는 바이오잉크 조성물을 개시한다. 바이오잉크 조성물은 조직 유래 성분 물질을 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 세포 담체 물질은 젤라틴 또는 콜라겐이고, 점도 증진제는 히알루론산 또는 덱스트란이고, 윤활제는 글리세롤이고, 구조적 물질은 피브리노겐 또는 메타크릴레이트화된 젤라틴(GelMa)이다.

문헌은 조직 공학 적용을 위한 최적의 특성을 가진 적절한 바이오잉크 조성물을 선택하는 문제에 관한 많은 간행물을 포함한다. Mohamed Ali 등은 신장에서 추출한 탈세포화 ECM(dECM)을 기반으로 한 바이오잉크 생산에 관한 연구를 수행하였다[1]. 0.5M의 아세트산 및 0.1 mg/mL의 펩신을 사용하는 용해 방법을 이용하여 비교적 낮은 농도(1 내지 3%)의 dECM 하이드로겔을 얻었다. 또한, 광개시제(Irgacure)를 첨가하여 dECM의 메타크릴화 공정을 수행하였다.

후속 연구 그룹은 메타크릴레이트화된 젤라틴 (GelMa) 및 광개시제, 즉 LAP (리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트)를 첨가한 ECM을 사용하여 바이오잉크를 얻으려고 시도하였다[2]. 다른 사람들은 합성 보존제로 폴리카프로락톤(PCL)을 첨가하여 비교적 고농도의 펩신으로 얻은 dECM 하이드로겔을 사용하였다[3].

특허 설명 KR20180125776에는 dECM 분말 및 하이드로겔을 포함하는 바이오잉크 조성물이 기재되어 있다. dECM 분말은 간 조직, 심장 조직, 연골 조직, 골 조직, 지방 조직, 근육 조직, 피부 조직, 점막 상피 조직, 양막 조직, 또는 각막 조직으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, dECM 분말은 0.05 내지 100㎛의 입자 크기를 갖는다. 상기 하이드로겔은 젤라틴, 히알루론산, 덱스트란 및 콜라겐으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.

Falguni 등(2014)은 세포 생착, 생존 및 장기간 기능에 결정적인 단서를 제공할 수 있는 지방질, 연골 및 심장 조직을 포함한 조직 특이적 dECM 바이오잉크를 개발하였다. 바이오프린팅(bioprinting) 방법은 고유한 세포 형태와 기능의 재건을 가능하게 하였다. 프린팅된 세포 구조의 고차 조립은 조직화된 공간 패턴 및 조직 특이적 유전자 발현으로 관찰되었다. 방법론의 핵심 이점은 세포 생착, 생존 및 장기간 기능에 대한 결정적인 단서를 제공하는 조직 특이적 ECM의 적용이었다[3].

바이오잉크의 성분으로 dECM을 얻기 위해 기관의 탈세포화를 수반하는 실험이 많은 연구 그룹에서 연구되어 왔다[4, 5, 7]. 탈세포화에는 주로 Triton X-100 및/또는 도데실 설페이트 (SDS) 세제와 같은 다양한 물질이 사용되었다. KR1020180011607A에는 계면활성제 및 과활성 용액을 함유하는 탈포화 용액으로 간 조직을 처리하는 간의 탈세포화 방법이 기재되어 있다. 계면활성제로 0.5%의 Triton X-100 (Triton X-100)를 사용할 수 있다.

Mohamed Ali와 동료들은 ECM 유래 바이오잉크를 포함하는 광가교성 신장을 제작하였다[1]. 돼지의 전체 신장을 관류법을 통해 탈세포화하고, 산성 용액에 용해시키고, 메타크릴화에 의해 화학적으로 변형시켰다. 결과는 바이오프린팅된 인간 신장 세포가 매우 생존 가능하고 시간이 지남에 따라 성숙함을 보여주었다. 더욱이, 바이오프린팅된 신장 작제물은 천연 신장 조직의 구조적 및 기능적 특성을 나타내었다. 조직 특이적 ECM 유래 바이오잉크는 세포 성숙과 궁극적으로 조직 형성을 향상시킬 수 있다.

Mirmalek-Sani 등(2013)은 인간 줄기 세포와 돼지 췌장 소도를 위한 스캐폴드를 만들기 위해 돼지 췌장의 탈세포화 과정을 제시하였다. 세포 물질은 ECM 단백질과 고유 혈관계를 보존하면서 효과적으로 제거되었다. 또한, 탈세포화 췌장이 세포 부착 및 세포 기능 유지를 지원할 수 있음을 입증하였다[6].

본 발명의 목적은 바이오프린팅에 사용될 수 있는 무세제 dECM을 제공하는 것이다. 문헌 데이터는 탈세포화에 의해 얻은 ECM에서 세제의 잔류 함량 또는 함량을 검정하는 방법에 대한 결과를 제공하지 않는다. 다양한 조직의 탈세포화를 위해 이전에 발표된 절차에서, 세제 제거 단계는 비교적 짧다. dECM에 세제가 없으면 얻은 dECM의 품질에 실질적으로 영향을 미치는 것으로 여겨진다. 출원인이 개발한 절차를 통해 다른 화학 물질을 추가할 필요 없이 거의 모든 세제를 제거할 수 있다. 본 발명의 제2 목적은 점도 증진제를 첨가할 필요 없이 적절한 일관성 및 점도의 바이오잉크를 얻는 것이다.

제1 양태에서, 다음의 단계를 포함하는, 무세제 탈세포화 세포외 기질(dECM) 제조 방법을 제공한다:

- 바람직하게는 기계적 압출에 의한 췌장, 간, 신장, 심장, 피부, 폐, 대장, 소장, 혈액 동맥 및 정맥, 지방 조직 및 태반으로부터 선택된 동물 기원 기관의 기계적 단편화로서, 상기 기관은 동물의 신체로부터 분리되는 기계적 단편화,

- 바람직하게는 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)를 포함하는 완충 세제 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션으로서, 완충 세제 용액은 0.5% 내지 1.5%, 바람직하게는 1%(v/v), 옥톡시놀-9를 포함하고, 상기 세제 용액은 바람직하게는 0.01%(w/v)의 농도로 항균제, 바람직하게는 스트렙토마이신이 보충되고, 상기 인큐베이션은 진탕하면서 실온 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 적어도 72시간 동안 수행되며, 상기 단편화된 기관은 4 내지 12시간마다 새로운 세제 용액으로 옮겨지는 인큐베이션,

- 바람직하게는 1XPBS를 포함하는 제1 완충 세척 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션으로서, 상기 제1 완충 세척 용액은 진탕하면서 항균제, 바람직하게는 스트렙토마이신을 바람직하게는 0.01%(w/v) 농도에서 72시간 동안 실온 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 포함하고, 상기 단편화된 기관은 4 내지 12시간마다 새로운 세척 용액으로 옮겨지는 인큐베이션,

- 바람직하게는 0.0001 내지 0,0003%(w/v), 가장 바람직하게는 0.0002%(w/v)의 농도로, 바람직하게는 DNAse 성능에 적절한 온도에서 적어도 8시간 동안 DNAse를 포함하는 데옥시리보뉴클레아제 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션,

- 바람직하게는 1XPBS를 포함하는 제2 완충 세척 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션으로서, 상기 제2 완충 세척 용액은 진탕하면서 항균제, 바람직하게는 스트렙토마이신을 바람직하게는 0.01%(w/v) 농도에서 72시간 동안 실온 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 포함하고, 상기 단편화된 기관은 4 내지 12시간마다 새로운 세척 용액으로 옮겨지는 인큐베이션,

- 단편화된 기관의 냉동, 및 이 냉동된 단편화된 기관을 단편으로 파쇄함

- 바람직하게는 -32℃에서, 바람직하게는 0.31 mbar(31Pa)의 압력에서 냉동된 단편화된 기관의 냉동 건조함,

- 0.0010 mbar(0.1Pa) 및 -76℃에서 5 내지 15분 동안 선택적 최종 건조함

- 분쇄 및 건조된 생성물을 25 내지 500 μm의 dECM 분말로 분쇄함,

- 바람직하게는 방사선 및/또는 산화에틸렌에 의한 생성물의 선택적 멸균함.

기관의 기계적 단편화는 기관으로부터 세제의 제거를 향상시키고 지방 함량이 낮은 생성물을 생성하여 최종 생성물의 특성을 개선하고, 즉, 점도를 증가시키고 프린팅적성(printability)을 개선한다. DNAse의 첨가는 동물 기원의 기관의 DNA를 제거하는 데 중요하다. 생성된 프린팅된 3차원 구조가 dECM를 DNA와 함께 포함하는 경우, 이식 실험에 더 이상 사용할 수 없다.

바람직하게는, 분쇄 단계는 dECM 분말 내 옥톡시놀-9의 양을 확인하는 단계가 뒤따르고, 바람직하게는 상기 dECM 분말은 옥톡시놀-9의 존재에 대해 확인되기 전에, 바람직하게는 적어도 43,953의 PZ/g dECM의 농도에서 콜라게나제로 처리된다.

바람직하게는, 상기 분쇄 단계 후에 다음의 단계가 뒤따른다:

- 0 내지 10 mg/ml의 펩신이 보충된 염산 용액, 바람직하게는 0.01 M의 염산 용액에 dECM 분말을 용해시키는 단계;

- 실온에서 48 내지 72시간, 바람직하게는 72시간 동안 혼합하는 단계;

- 바람직하게는 0.1 M의 나트륨 염기 및 PBS 용액을 사용하여 얼음 상에서 중화시키는 단계.

제2 양태에서, 무세제 탈세포화 세포외 기질(dECM)의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는, 분말 형태의 무세제 탈세포화 ECM이 제공된다. 바람직하게는, dECM 분말은 멸균되어 있다. 필요한 경우 분말을 방사선 멸균 또는 산화 에틸렌 멸균으로 멸균할 수 있다.

제3 양태에서, 무세제 탈세포화 세포외 기질(dECM)의 제조 방법에 의해 얻을 수 있는, 용액 형태의 무세제 탈세포화 ECM이 제공된다.

제4 양태에서 다음의 단계를 포함하는 일차 바이오잉크의 제조 방법이 제공된다:

- 혼합으로, 본 발명의 제2 양태에 따른 dECM 분말 5 내지 50%(w/v), 바람직하게는 15 내지 25%(w/v), 및 바람직하게는 본 발명의 제3 양태에 따른 dECM 용액 1 내지 10% (w/v), 바람직하게는 8 내지 10% (w/v)을 함유하는 페이스트의 제조

- 적어도 24시간 동안 7 내지 10℃의 온도에서 페이스트의 인큐베이션

- 1.46 내지 7.32%(w/v)의 메타크릴레이트화된 젤라틴, 0.15 내지 1.10%(w/v)의 메타크릴레이트화된 히알루론산 및 5 내지 10%(w/v)의 글리세롤, 및 광개시제, 바람직하게는 0.03 내지 0.17 % (w/v)의 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트의 첨가, 이어서 부드럽게 혼합.

dECM 분말은 원래 냉동 건조에 의해 제조되고 이후에 용해되지 않기 때문에, ECM의 전체 사차 구조를 유지한다. 따라서 dECM 분말과 dECM 용액을 모두 포함하는 페이스트 형태의 dECM을 사용하면 일차 바이오잉크에 적절한 일관성을 제공하고 dECM 분말이 일차 바이오잉크에 용해되지 않기 때문에 ECM의 전체 사차 구조를 유지한다.

제5 양태에서, dECM 페이스트 및 1.46 내지 7.32% (w/v)의 메타크릴레이트화된 젤라틴, 0.15 내지 1.10 % (w/v)의 메타크릴레이트화된 히알루론산 및 5 내지 10% (w/v)의 글리세롤, 및 광개시제, 바람직하게는 0.03 내지 0.17 % (w/v)의 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트를 포함하는 일차 바이오잉크로서, 상기 dECM 페이스트는 본 발명의 제2 양태에 따른 dECM 분말 5 내지 50% (w/v), 바람직하게는 15 내지 25% (w/v), 및 본 발명의 제3 양태에 따른 dECM 용액 1 내지 10% (w/v), 바람직하게는 8 내지 10% (w/v)을 포함하고, 그리고 일차 바이오잉크의 점도는 21/s의 일정한 전단율 및 37℃의 온도에서 콘-플레이트 시스템에서 측정 시 적어도 5 Pa·s인, 일차 바이오잉크를 제공한다.

dECM을 사용하면 신체의 세포외 조건을 재현할 수 있으므로 바이오프린트에 천연 조직의 특성을 부여하여 세포가 분화하도록 자극하고 생존력을 향상시킨다. 또한, 33 내지 37℃의 온도 범위에서 추가적인 열가교 가능성을 통해 바이오잉크의 적절한 점도를 얻고 프린팅된 작제물의 안정적인 3차원 구조를 유지하기 위해서는 세포외 기질이 필요하다.

광개시제를 사용하면 일차 바이오잉크에 함유된 세포에 유독한 화학물질을 이용한 화학적 가교에 비해 세포에 무독성인 가교가 가능하다. 광개시제와 가시광선을 이용한 가교는 열가교에 비해 세포 DNA 손상을 최소화한다. 온도와 빛은 모두 세포에 부정적인 영향을 미쳐 DNA 손상을 일으킨다. 그러나 가시광선으로 가교할 때 이러한 변화는 최소한으로 유지된다.

메타크릴레이트화된 젤라틴(GelMa)은 프린팅된 작제물의 형상화에 사용된다. 또한 소엽 적층분리를 방지하기 위해 필라멘트를 결합하고 세포 및 소도(islet) 생존력을 향상시킨다. GelMa는 젤라틴에 비해 더 높은 온도에서 안정하므로 열가교 중에 유리하다.

메타크릴레이트화 히알루론산(HAMA)은 가교를 통해 3차원 구조를 유지하는데 도움을 준다. 또한 HAMA는 프린팅된 필라멘트의 평탄성, 비단같음, 균질성을 제공하고 세포 배양을 지원한다. 이러한 특징은 메타크릴화되지 않은 히알루론산을 첨가하여 얻을 수 없다.

글리세롤을 사용하면 세포 및 소도 기능성이 개선된다. 또한 바이오잉크의 윤활성을 개선하고 연속 필라멘트의 형성을 가능하게 하며 주사기 또는 믹서에서 바이오잉크 성분의 혼합을 개선하고 프린팅 중 압력 소모를 줄인다.

바람직하게는, 일차 바이오잉크는 다음으로부터 선택된 적어도 하나의 첨가제를 포함한다:: 0.001 내지 0.100 mg/mL, 바람직하게는, 0.007 mg/바이오잉크 mL 농도의 히알루론산, 0.005 내지 0.100 mg/바이오잉크 mL 농도의 라미닌, 바람직하게는, 0.084 mg/mL, 0.001 내지 0.100 mg/mL, 바람직하게는 0.041 mg/바이오잉크 mL 농도의 콜라겐 I, 0.005 내지 0.175 mg/mL, 바람직하게는, 0.122 mg/바이오잉크 mL 농도의 콜라겐 IV, 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 100 mg/바이오잉크 mL 농도의 인간 피브리노겐, 1 내지 2 EPU/바이오잉크 mL 농도의 아프로티닌, 0.05 내지 2 mg/바이오잉크 mL 농도의 폴리소르베이트, 5 내지 55 mg/바이오잉크 mL 농도의 인간 트롬빈, 20 내지 60 mM/바이오잉크 mL 농도의 염화칼슘; 혈관신생촉진 비타민: 1nM 내지 500μM, 바람직하게는 100 μM 농도의 비타민 A, 50 내지 100μM, 바람직하게는 100μM 농도의 비타민 B1, 1 내지 10μM, 바람직하게는 10μM 농도의 비타민 B3, 10 내지 100 mg/바이오잉크 mL 농도의 비타민 B12, 0.1 내지 10 nM, 바람직하게는 10 nM 농도의 비타민 D3, 혈관신생을 지원하는 성장 인자: 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL의 바이오잉크 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/바이오잉크 mL 농도의 FGF, 1 내지 10 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/바이오잉크 mL 농도의 TGF-β, 0 내지 100 ng/mL, 바람직하게는 10 ng/바이오잉크 mL 농도의 인터류킨 (IL)-8, 20 내지 50 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/바이오잉크 mL 농도의 IL-17A.

히알루론산, 콜라겐 I 및 IV 및 라미닌과 같은 상업적 첨가제는 프린팅된 3차원 구조의 기능을 더욱 향상시킨다.

비타민 A - 비타민 A의 대사산물 중 하나인 ATRA(올 트랜스 레틴산(All Trans Retinoic Acid))는 혈관신생촉진 효과가 있다. 이는 혈관신생 이면의 인자(예를 들어, 사이클로옥시게나제-2 (COX-2), 저산소성-유도된 인자 (HIF)-1, C-X-C, 케모카인 수용체 (CXCR)-4, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 안지오텐신 (Ang)-2, -4)의 발현을 개선한다. 더욱이, ATRA는 프로-MMP2 (프로-매트릭스 메탈로프로테이나제-2 - 유형 IV 콜라게나제) 활성을 감소시키는 것으로 입증되었다.

비타민 B1 - 벤포티아민(티아민 유도체)은 단백질 의존성 B-키나제 경로(PKB/Akt)에서 세포자멸사를 억제하고 선조 내피 세포의 증식을 유도하는데 책임이 있다.

비타민 B3 - 니아신은 수용체, 즉 하이드록시카복실산 수용체 2(GPR109A)를 통해 혈관신생을 지원하는 내피 세포 기능을 향상시키고 촉진한다. 또한, 비타민 B3는 시르투인 매개체(SIRT)와 반응하여 혈관(vessel) 형성을 유도하고 지원하는 NAD(+)의 전구체이다.

비타민 B12(코발라민)는 프로스타글란딘 E1, 프로스타사이클린 및 산화질소(NO)의 생성을 유도한다. 이 모든 물질은 혈관신생의 시작에 호의적인 영향을 미친다.

비타민 D3는 시험관 내에서 혈관신생을 자극하도록 설계되었다. 이는 VEGF 및 프로-MMP2 활성의 증가된 발현을 유도한다. 또한 ECFC(내피 콜로니 형성 세포)의 기능에도 영향을 미친다.

VEGF는 내피 세포 사이의 증식, 이동, 포자형성 및 연결 형성을 유도하며, 또한 다양한 프로테아제의 생성을 유도하여 세포외기질(ECM)의 분해에 영향을 미치고 내피 세포의 세포 표면 인테그린을 활성화시킨다.

섬유아세포 성장 인자(FGF)는 내피 세포 이동을 증가시키고 모세관 형태발생을 촉진한다. 또한 내인성 VEGF 생산을 증가시킨다.

변형 성장 인자(TGF-β)는 ECM(프로테오글리칸, 피브로넥틴, 콜라겐)의 형성을 촉진하고 내피 세포의 증식, 이의 이동 및 혈관 형성을 조절한다. TGF-β는 내피 세포와 혈관주위세포의 상호작용을 매개한다.

인터루킨(IL)-8은 CXCR1 및 CXCR2 수용체와 상호작용하여 내피 세포에 강력한 혈관신생촉진 효과를 나타낸다. 그것은 미세 혈관 네트워크의 형성을 자극한다.

IL-17A - 혈관신생, 세포 이동 및 세포골격 재배열을 유도한다.

바람직하게는, 일차 바이오링키는 0.1 내지 10x10⁵/바이오잉크 mL의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x10⁵바이오잉크 mL 농도의 일차 미세혈관 내피 세포, 3 내지 9 x 10⁶/바이오잉크 mL 농도의 동물 또는 인간 유래된 α 세포, 1.1 내지 3.4 x 10⁷/바이오잉크 mL 농도의 동물 또는 인간 유래된 β 세포, 바람직하게는 20,000 iEq/바이오잉크 mL의 양의 동물 또는 인간 유래된 췌장 소도로부터 선택된 하나 이상의 동물 또는 인간 유래된 첨가제를 포함한다.

췌장 소도는 인슐린 생산을 담당한다. 프린팅된 3차원 구조에서 혈관 네트워크의 빠른 형성을 위해 내피 세포가 추가되었다. 일차 미세혈관 내피 세포는 바이오프린팅된 3차원 구조에서 미세혈관의 형성 및 성장을 지원하는 데 사용된다.

제6 양태에서, 다음의 단계를 포함하는 혈관 바이오잉크의 제조 방법이 제공된다:

a) CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액의 선택적 제조로서, 50 내지 65 ℃의 온도, 바람직하게는 60 ℃에서 진탕하면서 미생물학적 젤라틴을 완충 용액에 현탁시키고, 2 내지 5% (v/v)의 카복시메틸 셀룰로스 (CMC) 수용액을 첨가하여 바이오잉크에서 최종 농도 0.2 내지 1% (v/v)의 CMC를 수득하고 그리고 상기 용액을 40℃ 이하의 온도로 냉각시킴으로써 완충 용액, 바람직하게는 PBS 중 미생물학적 젤라틴의 1 내지 2% (w/v) 용액을 제조하는 것을 포함하는, 상기의 선택적 제조

b) 부드럽게 진탕하면서 바람직하게는 방사선에 의해 멸균된, 본 발명의 제2 양태에 따른 dECM 분말을 (i) 단계 a)에서 수득된 CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액 또는 (ii) 완충 용액 또는 (iii) 세포 배지의 용액에 첨가함으로써 5 내지 10% (w/v)의 dECM 용액을 제조함

c) 얻어진 용액을 37℃ 이하의 온도에서 0.5 내지 2.0시간 동안 초음파 처리

d) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 동물 또는 인간 유래된 첨가제의 선택적 첨가: 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/mL 농도의 FGF, 100 및 300 nM, 바람직하게는 100nM 농도의 PGE2, 0.1 내지 10x10⁷개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x106개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 섬유아세포.

제7 양태에서, 다음의 단계를 포함하는 혈관 바이오잉크의 제조 방법이 제공된다:

- a) CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액의 선택적 제조로서, 50 내지 65 ℃의 온도, 바람직하게는 60 ℃에서 진탕하면서 미생물학적 젤라틴을 완충 용액에 현탁시키고, 2 내지 5% (v/v)의 CMC 수용액을 첨가하여 바이오잉크에서 최종 농도 0.2 내지 2% (v/v)의 CMC를 수득하고 그리고 상기 용액을 40℃ 이하의 온도로 냉각시킴으로써 완충 용액, 바람직하게는 PBS 중 미생물학적 젤라틴의 1 내지 5% (w/v) 용액을 제조하는 것을 포함하는, 상기의 선택적 제조

b) 부드럽게 진탕하면서 바람직하게는 방사선에 의해 멸균된, 본 발명의 제2 양태에 따른 dECM 분말을 (i) 단계 a)에서 수득된 CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액 또는 (ii) 완충 용액 또는 (iii) 세포 배지의 용액에 첨가함으로써 2 내지 10% (w/v)의 dECM 용액을 제조함

c) 혼합물을 100℃에서 15 내지 30분 동안 비등시킴

d) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 동물 또는 인간 유래된 첨가제의 선택적 첨가: 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/mL 농도의 FGF, 100 및 300 nM, 바람직하게는 100nM 농도의 PGE2, 0.1 내지 10x10⁷개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x106개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 섬유아세포.

제8 양태에서, 바람직하게는 1 내지 5% (w/v) 농도의 미생물학적 젤라틴 및/또는 0.2 내지 2 % (v/v) 농도의 CMC가 보충된 상기의 본 발명의 제3 양태에 따른 초음파 처리되거나 비등된 dECM 용액을 2 내지 10% (w/v)의 농도로 포함하는 혈관 바이오잉크를 제공한다.

초음파 처리되거나 비등된 dECM은 온도 변화에 따라 물리적 및 화학적 특성을 변경한다. 이 성분는 비교적 낮은 온도(15 내지 20℃)에서 프린팅하는 동안 바이오잉크의 적절한 점도를 보장하고 37℃의 배양 온도에서 느린 액화뿐만 아니라 세포 침윤까지 프린팅된 덕트(duct)를 보존하도록 설계되었다.

미생물학적 젤라틴은 원하는 일관성을 제공하고 세포 생존력을 개선한다. CMC는 점도를 높이고 바이오잉크 일관성을 안정화한다. 파이브로넥틴은 혈관신생을 촉진하고 용량에 따라 증식률에 영향을 미치지 않으면서 형성된 혈관의 신장을 자극한다.

바람직하게는, 혈관 바이오잉크는 하기로부터 선택된 적어도 하나의 동물 또는 인간 유래된 첨가제를 포함한다: 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/mL 농도의 FGF, 100 및 300 nM, 바람직하게는 100nM 농도의 PGE2, 0.1 내지 10x10⁷개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x106개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 섬유아세포.

내피 세포는 혈관을 생성한다. 섬유아세포는 혈관신생 유도 인자를 생성한다. VEGF는 내피 세포 사이의 증식, 이동, 포자 형성 및 연결 형성을 유도한다. 또한, VEGF는 다양한 프로테아제의 생성을 유도함으로써 ECM의 분해에 영향을 미치고 내피 세포의 세포 표면 인테그린을 활성화시킨다. FGF는 내피 세포 이동을 증가시키고 모세관 형태발생을 촉진한다. 또한 내인성 VEGF 생산을 증가시킨다. PGE2 - (R)-1 수용체의 FGF를 활성화(인산화)하여 새로운 혈관의 이동, 증식 및 형성을 유도하도록 설계된 프로스타글란딘 E2.

제9 양태에서, 적어도 3개의 인접한 바이오잉크 층을 포함하는 3차원 구조가 제공되며, 여기서 본 발명의 제8 양태에 따른 혈관 바이오잉크의 층이 본 발명의 제5 양태에 따른 일차 바이오잉크의 2개의 층 사이에 배열된다.

제10 양태에서, 본 발명의 제5 양태에 따른 일차 바이오잉크 및 본 발명의 제8 양태에 따른 혈관 바이오잉크는 5 내지 50 mm/s의 프린팅 속도, 4 내지 300 kPa의 압력 및 4 내지 37℃의 온도에서 3D-바이오프린팅 공정에서 층별로 침착되고, 그리고 침착 동안 또는 이후에 일차 바이오잉크는 적어도 5초 동안 바람직하게는 365 내지 405 nm, 더 바람직하게는 405 nm의 파장의 UV 광 및/또는 가시광선에 노출되는, 방법을 제공한다. 405 nm에서의 가교는 3차원 구조에 함유된 세포에 독성이 없기 때문에 바람직하다.

본 발명은 27x17x2.5 mm 크기의 소엽 모델을 얻을 수 있게 하였다. 3 내지 10분 안에 5개의 층로 구성된 소엽이 프린팅되었다. 또한 30x40x20mm 크기의 기능성 기관 프로토타입의 3D 모델을 얻었다. 모델은 30개의 층로 구성되어 있으며 20 내지 60분 안에 프린팅되었다. 또한 중요하게도, 비등시키거나 초음파 처리된 dECM 사용이 보고된 것은 이번이 처음이다. 본 발명은 프린팅 속도가 바이오잉크의 점도(최대 30mm/s)와 적절하게 상관되어 있기 때문에 짧은 시간에 작제물을 얻을 수 있다. 안정적인 3차원 다공성 구조(30층)를 얻을 수 있으며 37℃의 온도에서 20일 동안 보존할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 일차 바이오잉크는 상대적으로 낮은 농도의 이가큐어(Irgacure)보다 독성이 덜한 광개시제, 즉 LAP를 사용하는 것을 기반으로 한다. 또한, dECM 용액을 얻기 위해 문헌에서 발견된 것보다 적은 양의 펩신이 사용된다.

도 1. dECM 하이드로겔의 특성에 대한 펩신 농도의 영향
도 2. dECM 용액의 농도와 A) 15% (w/v)의 dECM 분말이 보충된 5% (w/v)의 dECM 용액, B) 25% (w/v)의 dECM 분말이 보충된 5% (w/v)의 dECM 용액, C) 15% (w/v)의 dECM 분말이 보충된 8% (w/v)의 dECM 용액, D) 25% (w/v)의 dECM 분말이 보충된 8% (w/v)의 dECM 용액, E) 15% (w/v)의 dECM 분말이 보충된 10% (w/v)의 dECM 용액, F) 25% (w/v)의 dECM 분말이 보충된 10% (w/v)의 dECM 용액의 점도 사이의 관계.
도 3. 미리 결정된 온도에서 5% (w/v)의 dECM 용액 (A, B), 8% (w/v)의 dECM 용액 (C, D) 및 10% (w/v)의 dECM 용액 (E, F)에 대한 동역학 분석.
도 4. 프린팅된 소엽의 흡수성 분석: GelMa, HAMA, Mix.
도 5. A) 비등된 및 B) 초음파 처리된 dECM(r)의 점도.
도 6. A) 혈관화된 소엽 및 B) 프린팅된 작제물의 사진의 3D 모델.
도 7. 췌장의 3D 모델(A, B) 및 프로토타입(C, D)의 혈관계의 시각화.
도 8. A) 실험 시작 및 B) 24시간 인큐베이션 후 췌장 소도의 기능에 대한 글리세롤의 효과.
도 9. A) 실험 시작, B) 24시간 인큐베이션 후 및 C) 48시간 인큐베이션 후 췌장 소도의 기능과 생존력에 대한 상업적 첨가제의 효과.
도 10. A) 실험 시작, B) 24시간 인큐베이션 후, C) 48시간 인큐베이션 후 및 D) 48시간 인큐베이션 후 췌장 소도의 생존력에 메타크릴레이트화된 젤라틴을 첨가하는 효과.
도 11. A) 실험 시작, B) 24시간 인큐베이션 후 및 C) 48시간 인큐베이션 후 췌장 소도의 생존력에 대한 메타크릴레이트화된 히알루론산을 첨가하는 효과.
도 12. A) 실험 시작, B) 24시간 인큐베이션 후, C) 48시간 인큐베이션 후 및 D) 48시간 인큐베이션 후 췌장 소도의 생존력에 대한 다양한 비율의 GelMa 및 HAMA 혼합물의 첨가 효과.
도 13. A) 실험 시작, B) 24시간 인큐베이션 후, C) 48시간 인큐베이션 후 및 D) 48시간 인큐베이션 후 췌장 소도의 생존력에 대한 절단 또는 분쇄된 ECM 분말을 첨가하는 효과.
도 14. A) 실험 시작, B) 24시간 인큐베이션 후 프린팅 후 췌장 소도의 생존력에 대한 일차 바이오잉크에 GelMa 및 HAMA를 추가하는 효과.
도 15. dECM을 바이오프린팅의 원료로 사용하기 위해 dECM 준비의 개별 단계에서 단백질 구조를 제시하는 전자현미경 아래에서 시각화.
A)-C) - SEM(주사 전자현미경) 이미지; A) 탈세포화 전의 천연 조직; B) 탈세포화 후 조직; C) 일차 바이오잉크에서 프린팅된 작제물.
D)-E) - TEM(투과 전자현미경) 이미지; D) 탈세포화 후 조직; E), F) 보존된 콜라겐 사차 구조(가시적인 콜라겐 섬유)가 있는 일차 바이오잉크에서 프린팅된 작제물.

본 발명의 구현예

구현예 1: 무세제 dECM의 제조

A. 췌장의 탈세포화 절차

0.01%(w/v) 스트렙토마이신을 갖는 1x 농축 PBS 용액 중 0.1%(v/v) 암모니아수를 갖는 1%(v/v) Triton X-100 용액을 세포외 기질 (스캐폴드)를 남기면서 췌장 기관에서 세포 구조를 제거하기 위해 제조하였다. 수확 후, 조직 물질은 -80℃에서 냉동되었다. 그 다음 해동 후, 지방 조직의 외층과 주변 막을 기관으로부터 제거하였다. 준비된 췌장은 두 가지 방법으로 처리되었다: 작은 조각(약 1 내지 1.5 cm)으로 절단 및 기계적으로 분쇄(압출 분쇄 방법 사용).

단편화된 조직을 병에 넣고 미리 준비한 Triton X-100 용액에 현탁하였다. 표본을 150 rpm의 일정한 교반에서 4℃의 인큐베이터에 두었다. 4시간에서 12시간마다 세포 분획이 완전히 제거될 때까지 세제를 교체하였다(3 내지 5일). 그 다음 세제를 얻은 스캐폴드에서 세척하였다. 이를 위해, 0.01% (w/v) 스트렙토마이신를 갖는 1 x PBS 용액을 사용하였다. 세척 과정을 150 rpm에서 연속적으로 교반하면서 4℃에서 72시간 동안 수행하였다.

다음의 단계 - 탈세포화는 데옥시리보뉴클레아제 용액(0.12 mM 칼슘 및 마그네슘 이온이 보충된 1x PBS 중 0.0002%(w/v) DNAse)을 투여하는 것으로 구성되었다. 150 rpm으로 교반하면서 37℃에서 8시간 동안 상기 언급된 용액에서 스캐폴드를 배양하였다. 마지막 단계는 표준 조건(4℃; 150 rpm; 72h)에서 0.01%(w/v) 스트렙토마이신을 갖는 1 x PBS 용액으로 다시 세척하는 것을 수반한다. 또한, 1 x 농축 PBS 용액 중 0.1%(v/v) 농도의 암모니아수를 사용하여 세제를 세척하는 것도 테스트하였다. 더욱이, 20 내지 24℃로의 온도 증가가 세척 단계에 미치는 영향을 연구하였다.

탈세포화 과정이 끝난 후, 얻은 스캐폴드를 액체 질소에서 냉동시키고 약 0.5 cm 크기의 조각으로 분쇄하였다. 물질을 -32℃의 온도와 0.31 mbar(31 Pa)의 압력에서 26시간 동안 냉동 건조하였다. 최종 건조 과정은 0.0010 mbar(0.1 Pa)의 압력과 -76℃의 온도에서 10분 동안 지속되었다. 분쇄 및 건조된 지지체는 극저온 밀(mill)을 사용하여 분말로 분쇄되었다. 분쇄 절차는 초당 15번의 충격으로 1분 동안 3번의 사이클을 포함하였다.

얻은 생성물, 즉 "dECM(p)"로 약칭되는 dECM 분말을 특성화하기 위해, 흡입 스프레이 연구를 위한 부속 흡입 챔버가 장착된 레이저 회절 분광계인 Spraytec(Malvern, UK)을 사용하여 유동 구배의 분말 입자 크기 분포를 테스트하였다. 연구된 모든 사례에서, 에어로졸화 후 분석된 분말을 설명하는 파라미터 값은 비슷했으며, 이는 분말을 개별 입자로 분해하기 위해 증가된 기류의 형태로 추가 에너지를 제공할 필요가 없음을 나타낸다. 표 1은 분말 입자의 직경을 설명하는 파라미터 값을 제공하고, 여기서:

Dv (50) - 부피 입자 크기 분포의 중앙값: 누적 부피 분포를 반으로 나누는 입자의 직경, 다시 말해서, 중앙값보다 작거나 큰 모든 입자는 모두 동일한 부피를 갖는다(이 직경보다 작은 입자 샘플 부피의 50%를 구성함).

Dv(10) - 이 직경보다 작은 입자는 샘플 부피의 10%를 구성한다.

Dv(90) - 이 직경보다 작은 입자는 샘플 부피의 90%를 구성한다.

D[3][2] - Sauter 직경은, 부피 대 표면 비율이 분석된 모든 입자의 부피 대 그러한 모든 입자의 총 표면의 비율과 동일한 입자의 직경이다.

D[4][3] - 입자 직경의 4제곱의 합 대 입자 직경의 3제곱의 합의 비율로 정의되는 직경.

dECM 분말의 에어로졸화 후 측정 결과는 분말이 다분산성임을 나타낸다. 부피 입자 직경 분포의 중앙값 - Cyclohaler 유형 흡입기에 대한 기류 공칭에서의 Dv(50)는 148.43±10.14μm이다. 동시에, 전체 샘플 부피의 10%를 초과하지 않는 전체 부피의 가장 작은 입자는 28.23±1.48μm (Dv (10)) 미만의 직경을 갖는 반면, 전체 샘플 부피의 90% 미만의 총 부피를 갖는 입자를 구별하는 직경은 410.10±29.41μm였다. 흡입기에 공급되는 공기 유량을 200 및 270dm³/분으로 증가시키는 것은 부피 입자 크기 분포의 중앙값 또는 Dv (10) 값에 유의한 영향을 미치지 않았다. 약 410.1±29.41μm 내지 498.3±62.7μm의 최대 입자(Dv(90))의 크기의 약간의 증가만 관찰할 수 있다. 그 결과, 분포 폭이 2.57±0.04(100dm³/분 흐름의 경우)에서 3.3±0.4(270dm³/분n 흐름의 경우)로 증가하였다.

B. 탈세포화 방법의 효능

- 생성물의 단백질 특성:

질량 분석 기술을 사용하여, 돼지 췌장의 탈세포화 후 ECM 단백질 조성을 결정하였다. 얻은 결과는 테스트한 샘플에서 콜라겐의 가장 높은 백분율을 분명히 보여주었고, 알파(A)-1 사슬의 콜라겐 유형 1(COL1), 이른바 COL1A1이 다른 검출된 콜라겐 유형에 비해 가장 높은 값을 나타내었다.

또한, 상당한 양의 IV형 및 VI형 콜라겐이 발견되었다. 이것은, 사용된 탈세포화 프로토콜이 췌장 소도 및 β 세포와의 통합 수준이 가장 높은 콜라겐 유형을 보존할 수 있음을 보여준다. 유형 I 및 유형 IV 콜라겐은 췌장 소도의 기능과 생존력을 지원하는 데 가장 효과적이며 췌장 소도 세포의 기능을 기반으로 하는 생물의학 응용 프로그램에서 보충물로 일반적으로 사용된다. 특히, 콜라겐 VI 및 IV는 췌장 소도의 추가 분비 표면 및 기저막에 존재하며 피브로넥틴 활성을 조절한다. 분석된 다른 콜라겐 유형(COL1A2, COL3A1, COL4A2, COL6A1, COL6A2, COL6A3 COL14A1)의 백분율 함량은 조사된 모든 샘플에서 3.5%를 초과하지 않았다.

- 최종 DNA 농도

잔류 DNA 농도를 결정하기 위해, 세 가지 분석이 수행되었다:

(a) 잔류 DNA 농도를 결정하기 위한 PicoGreen.

(b) 나머지 유전 물질의 입자 크기를 결정하기 위한 아가로스 겔 전기영동.

(c) 현미경 영상화 - 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색.

잔류 DNA의 농도가 건조 중량의 mg ECM당 50ng의 이중 가닥 DNA(dsDNA)를 초과하지 않고, 나머지 DNA의 분자가 200개의 염기쌍(bp)을 초과하지 않을 때 탈세포화 과정이 성공적으로 완료된 것이다. 또한, 얻어진 스캐폴드의 현미경 이미지에서 세포 핵의 존재 여부를 평가하였다(하에마톡실린 및 에오신 염색).

건조 물질 중 잔류 DNA의 농도는 평균 0.077ng/mg이었다. 조사된 모든 샘플에서 잔류 DNA 함량은 0.15 ng/mg 미만이었다. 분석은 잔류 DNA의 단리에 사용되는 DNeasy Blood & Tissue Kit 키트, 및 단리된 유전 물질의 농도를 결정하기 위한 Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent and Kits를 사용하여 수행되었다.

아가로스 겔 전기영동을 사용하여 신호가 발견되지 않았다. 모든 샘플은 검출 수준 미만이었고, 이는 ECM에 200bp보다 큰 입자 형태의 잔류 DNA가 없음을 분명히 입증한다.

현미경 검사에서는 유전 물질이 없었고 탈세포화 과정 후에 세포 핵도 보이지 않았다.

- Triton X-100 잔류물 및 이의 효과적인 검출 및 제거 방법

비교를 위해, 0.5%(w/v) SDS를 사용한 탈세포화를 수행하였다. 그러나 결과는 최종 생성물에 남아 있는 세제의 양이 많아 만족스럽지 못하였다. ECM 분말은 그것을 용해시키려고 시도했을 때 높은 발포화 수준을 보여주었다. 이것은 Triton X-100의 사용에서는 관찰되지 않았다.

탈세포화 과정 후 남아있는 Triton X-100의 농도를 검증하기 위해, 최종 생성물 중의 잔류물을 결정하였다.

분석을 위한 샘플 준비:

용해된 dECM의 흰색을 고려해 볼때, 샘플을 3가지 농도의 콜라게나제로 처리하였다: 4.3953 PZ 활성 단위/g dECM(p), 43.953 PZ/g dECM(p) 및 87.906 PZ/g dECM(p). 콜라게나제는 150 mL의 링거액 (pH 7.2 내지 7.4), 2.72 mL의 Hepes (1M), 1.125 mL의 NaBicarbonate (7.5%) 및 1.05 mL의 CaCl₂ (1M)를 함유하는 특수 용액에서 준비되었다.

샘플을 1000 rpm에서 진탕하는 일정한 기능으로 37℃에서 24시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 비이온성 세제 Triton X-100의 잔류 농도에 대해 분석하였다. 샘플 A는 단일 콜라게나아제 농도로 dECM을 처리한 결과였다. 샘플 B는 10배 콜라게나아제 농도로 처리되었다. 샘플 C는 20배 콜라게나제 농도(A = 6.977 μg의 Triton X-100/g dECM(p), B = 40.475 μg의 Triton X-100/g dECM(p), C = 39.325 μg의 Triton X-100/g dECM(p))로 처리되었다.

중요하게도, 나머지 Triton X-100의 최고 농도는 43,953 PZ/g dECM의 농도에서 콜라게나제로 처리된 dECM 용액에서 발견되었다. 콜라게나아제 농도의 증가는 더 많은 양의 Triton X-100을 얻지 못했으며, 이는 43,953PZ/g의 dECM 농도가 샘플로부터 남아있는 모든 Triton X-100을 추출하기에 충분함을 나타낸다.

이 세제를 평가하려는 이전에 공개된 시도는 다음과 같은 이유로 실제적인 결과를 얻지 못하였다:

- Triton X-100 분말의 평가는 ECM의 형태가 염료를 흡수하여 결과를 왜곡했기 때문에 불가능하였다. 이 상관관계는 SDS 세제로 탈세포화 후 ECM 분말을 분석하여 입증되었으며, 이는 사용된 세제로 인해 불가능했던 Triton X-100의 존재를 나타낸다.

- 펩신에 용해되고 중화된 dECM은 흰색으로 인해 농도 판독을 방해하였다.

따라서, dECM을 콜라게나제로 처리하는 것은 탈세포화 후 생물학적 물질의 세제 잔류물을 평가하는 지금까지의 유일한 방법이다. 이는 이러한 물질(dECM)이 생존 가능한 세포를 사용한 바이오프린팅 공정에서 사용되어야 하는 경우에 중요하다. 그러한 물질이 인간의 이식에 사용된다면 이것은 결정적이다.

C. 결과

제1 단계에서는, 탈세포화를 위한 췌장 준비 기능에서 탈세포화된 기질의 지방 조성 차이를 분석하였다. 다음의 단계에서는, 췌장 준비 방법에 따른 잔류 DNA의 함량, 콜라겐 함량 및 잔류 세제 Triton X-100의 함량을 분석하였다.

기계적 압출 분쇄 방법을 사용하여, 얻은 세포외 기질의 지방 함량을 크게 줄일 수 있었다. 기계적 압출 분쇄 방법에서, 지방 함량은 절단 방법에서 21.47+/-0.07% (w/w)의 지방 함량의 비교하여 6.24+/-0.07% (w/w)였다. 차이는 통계적으로 유의적이었다(p<0.001). 얻어진 dECM의 낮은 지방 함량은 세포와 췌장 소도의 생존력을 상당히 증가시켰다.

Picogreen으로 테스트한 잔류 DNA의 함량은 기계적 압출 분쇄를 사용할 때 상당히 낮았고, 즉, 0.13 +/- 0.06ng/mg의 조직과 비교하여 0.07+/- 0.07ng/mg이었다(p=0.027). 이는, 두 사례 모두에서 허용 가능한 50ng/mg 값보다 훨씬 낮다.

기계적 압출 분쇄 방법을 사용하여, 얻은 세포외 기질의 Triton X-100 함량을 크게 줄일 수 있었다. 기계적 압출 분쇄 방법에서, 세제 함량은 절단 방법에서 6.53+/-2.34 μg/g에 비해 3.79+/-2.33 μg/g이었다. 차이는 통계적으로 유의적이었다(p=0.008).

제조 방법에 따라 생성된 시험 물질의 콜라겐 함량은 절단법 및 기계적 압출 분쇄의 사용에 따라 차이가 없었다.

Triton을 더 잘 세척하기 위해 환경을 알칼리화하기 위해, 암모니아수를 사용하는 것은 Triton의 세척을 개선하지 못하였다. 그러나 그것은 얻은 콜라겐의 조성에 변화를 가져왔다. 유사하게, 24℃에서의 세척은 Triton의 세척을 개선하는 데 실패했지만, 콜라겐 구조에 대한 손상을 증가시키고, 그 결과 물질의 감염 위험을 나타낼 수 있는 더 높은 DNA 함량 결과를 얻었다. 따라서 최적의 방법은 4℃의 온도에서 72시간 동안 PBS 중 탈세포화 물질을 세척하는 것이었다.

구현예 2: 바이오잉크의 제조

A. dECM(p) 용해

dECM 용액(dECM(r))을 얻기 위해, 펩신과 염산(HCl)을 사용하는 dECM 분말(dECM(p)) 용해 절차가 확립되었다.

dECM 용액을 얻는 절차는 두 부분으로 나누어진다.

(a) dECM의 용해.

펩신(0 내지 10 mg/mL, 바람직하게는 1 mg/mL 농도)을 50 ml의 0.01 M HCl에 용해시킨 후, dECM(p)(0.5 내지 5 g)을 첨가하였다. 이 방법은 1 내지 10%(w/v) 범위의 dECM(r) 농도를 초래하였다. 제조된 용액을 하기 교반 조건을 사용하여 자석 교반기에 놓았다: 약 100℃의 주위 온도. 25℃, 72시간의 용해 시간, 여기서 용액은 교반의 처음 8시간 동안 매시간 교반되었다.

(b) dECM(r)의 중화.

50 mL의 dECM(r)을 얼음(dECM 용액의 원하는 온도는 4 내지 4.5°C임)에서 다음 물질을 사용하여 pH 7.2 내지 7.4로 중화하였다:

- 5 ml의 0.1 M NaOH(0.1 M NaOH의 부피는 중화를 위한 dECM(r) 부피의 1/10과 동일함);

- 5.56 mL의 10xPBS(10xPBS의 부피는 중화를 위한 dECM(r) 부피의 1/9와 동일함);

- 1 x PBS(1 내지 10 ml)의 적절한 부피를 사용하여 dECM 용액을 희석하였다.

dECM(r)의 제조에 적절한 절차를 확인하기 위해, 방사선 멸균 후 분쇄된 상대적 고농도의 dECM(p)가 10%(w/v)이고 다양한 펩신 함량이 있는 용액에 대해 분석을 수행하였다.

다양한 펩신 함량을 가진 dECM 용액을 제조하였다. 1mg/mL 펩신을 함유한 용액은 비교적 높은 균질성을 가졌다: 점도 값의 작은 폭(span). 온도 변화에 따라 탁도의 약간의 변화가 관찰되었다. 다양한 펩신 함량으로 분석된 모든 용해 방법이 dECM(r)의 제조에 사용되었지만, 사용된 1 mg/mL의 양이 최적인 것으로 입증되었다.

B. 바이오잉크의 제조

(a) 일차 바이오잉크를 얻기 위한 조건:

- 방사선 멸균 또는 산화에틸렌 멸균 유무에 관계없이 분쇄되고 절단된 dECM(p)을 갖는 중화된 dECM 용액

- 방사선 멸균 또는 산화에틸렌 멸균 유무에 관계없는 분쇄되고 절단된 dECM(p) 분말

- 0.2 내지 0.5%(w/v) LAP를 갖는 멸균 GelMa 10 내지 20%(w/v)

- 0.2 내지 0.5%(w/v) LAP를 갖는 멸균 HAMA 1 내지 3%(w/v)

- 멸균 글리세롤

- 배양 배지 1: 5 내지 7 v/v, 췌장 소도 20,000 iEq/mL 및 세포주: 내피 세포 1 x 10⁵/mL, 일차 미세혈관 내피 세포 1 x 10⁵/mL, 비타민: A - 100μM, B1 - 100μM, B3 - 10μ, D3 - 10nM, 성장 인자: VEGF - 30 ng/mL, FGF - 20ng/mL, 종양 괴사 인자 (TNF)-α - 10 ng/mL, IL-8 - 10ng/mL, IL-17A - 20ng/mL.

먼저, 중화된 dECM(r) 및 dECM(p)을 적당량 함유한 페이스트를 멸균 금속 스팻툴라(spatula)로 충분히 혼합하여 페이스트를 제조하였다. dECM(p)은 냉동 건조에 의해 제조되었고 이후에 용해되지 않았기 때문에, ECM의 사차 구조를 유지하였다. 수득된 페이스트를 7 내지 10℃의 온도에서 적어도 24시간 동안 방치하였다. 바이오잉크 생산에 페이스트를 사용하기 직전에 멸균 주사기에 넣고 주사기 사이에 혼합하였다. 동시에 GelMa(10 내지 20%(w/v)) 및 HAMA(1 내지 3%(w/v)) 용액을 일반적으로 사용 가능한 절차에 따라 LAP로 제조하였다. 페이스트가 들어 있는 주사기는 피스톤이 없는 다른 주사기에 커넥터로 부착되었으며, 피스톤은 거꾸로 움직여 수직 위치에 안정적으로 배치되었다. 글리세롤, 배양 배지, 성장 인자, 비타민, GelMa 및 HAMA 용액을 연속적으로 첨가하였다. 그 다음 피스톤을 부드럽게 삽입하고 페이스트를 다른 시약과 혼합하였다. 혼합 후, 제조된 바이오잉크를 인큐베이터에 5분간 방치하고 소도 및 세포를 첨가한 후, 다시 혼합하여 카트리지에 도입하였다. 다음 단계에서, 충전된 카트리지를 1500 rpm에서 2분 동안 원심분리하고 약 5분 동안 인큐베이터에 프린팅하기 전에 다시 도입하였다.

얻어진 일차 바이오잉크의 조성은 다음과 같았다: 40-50 % (v/v)의 dECM(r), 2.763 내지 27.692 % (w/v)의 dECM(p), 1.464-7.320 % (w/v)의 GelMa, 0.146-1.098 % (w/v)의 HAMA, 5.0-10.0 % (w/v)의 글리세롤, 0.03- 0.17% (w/v)의 LAP, VEGF - 30 ng/mL, FGF - 20ng/mL, TGF-β - 10ng/mL, IL-8 - 10ng/mL, IL-17A - 20ng/mL, 비타민 A - 100μM, 비타민 B1 - 100μM, 비타민 B3 - 10μM, 비타민 D3 - 10nM, 췌장 소도 - 20000 iEq/mL, 내피 세포 - 1 x 10⁵/mL, 일차 미세혈관 내피 세포 - 1 x 10⁵/mL.

(b) 혈관 바이오잉크

초음파 처리를 사용한 혈관 바이오잉크 생산 과정은 두 단계로 나누어진다:

- 예비 용해 - 적절한 양의 미생물학적 젤라틴을 PBS(1 내지 2%(w/v))에 현탁하고 60℃에서 약 10분 동안 자석 교반기로 교반하였다. 그 후, 일정하게 교반하면서 온도를 낮추고 방사선 멸균 또는 에틸렌 옥사이드 멸균 후 및 없이 분쇄 및 절단된 dECM(p)을 배치(5 내지 10%(w/v))로 첨가하고 용액을 2분마다 추가 교반하였다. 변형에 따라, 미리 제조된 PBS 기반 카복시메틸 셀룰로스(CMC) 용액(2 내지 5%(v/v))을 혼합물에 첨가하였다.

- 초음파 처리: 제조된 ECM 용액이 담긴 병을 얼음이 담긴 비커에 넣은 후, 그 안에 초음파발생기 헤드와 온도 센서를 넣고, 알람으로 신호를 보내는 30℃ 초과의 온도에서 작업을 중지하면서 45% 진폭의 3s 펄스를 사용하여 개발된 절차에 따라 초음파 처리 공정을 수행하였다. 0.5 내지 2.0시간 동안 초음파 처리를 수행하였다.

- 대안적으로, 예비 용해 단계를 생략하고 dECM 분말을 완충 용액 또는 세포 배지 용액에 부드럽게 교반하면서 첨가함으로써 5 내지 10%(w/v)의 dECM 용액을 제조하였다. 다음으로, 초음파 처리 단계를 상기와 같이 수행하였다.

비등시켜 혈관 바이오잉크를 생산하는 과정은 두 단계로 나누어진다:

- 예비 용해 - 적절한 양의 미생물학적 젤라틴을 PBS(1 내지 5%(w/v))에 현탁하고 60℃에서 약 10분 동안 자석 교반기로 교반하였다. 그 후, 일정하게 교반하면서 온도를 낮추고 방사선 멸균 또는 에틸렌 옥사이드 멸균 후 및 없이 분쇄 및 절단된 dECM(p)을 배치(2 내지 10%(w/v))로 첨가하고 용액을 2분마다 추가 교반하였다. 변형에 따라, 미리 제조된 PBS 기반 CMC 용액(2 내지 5%(v/v))을 혼합물에 첨가하였다.

- 비등시킴: PBS 용액에 제조된 ECM 용액 또는 ECM 분말(5 내지 10%(w/v))이 담긴 병을 100℃로 가열된 가열판이 장착된 자석 교반기에 놓고 혼합물을 15 내지 30 분에 걸쳐 비등시켰다.

- 대안적으로, 예비 용해 단계를 생략하고 dECM 분말을 완충 용액 또는 세포 배지 용액에 부드럽게 교반하면서 첨가함으로써 5 내지 10%(w/v)의 dECM 용액을 제조하였다. 다음으로, 초음파 처리 단계를 상기와 같이 수행하였다.

이렇게 제조된 혈관 바이오잉크의 베이스(base)에는 피브로넥틴, 성장인자 및 내피 세포가 보충되었다.

얻어진 초음파 처리된 혈관 바이오잉크의 조성은 다음과 같았다: 5 내지 10 % (w/v), 바람직하게는 7.5 % (w/v)의 dECM(p), 0.2 내지 1 % (v/v)의 CMC, 1 내지 2 % (w/v), 바람직하게는 1 % (w/v)의 미생물학적 젤라틴, 파이브로넥틴 - 100 μg/mL, VEGF - 30 ng/mL, FGF -20ng/mL, PGE2 내지 100nM, 1.5 x 10⁷/mL의 내피 세포 및 3 x 10⁶/mL의 섬유아세포.

얻어진 비등된 혈관 바이오잉크의 조성은 다음과 같았다: 2 내지 10 % (w/v), 바람직하게는 5 % (w/v)의 dECM(p), 0.2 내지 2 % (v/v)의 CMC, 1 내지 5 % (w/v), 바람직하게는 1 % (w/v)의 미생물학적 젤라틴, 파이브로넥틴 - 100 μg/mL, VEGF - 30 ng/mL, FGF -20ng/mL, PGE2 내지 100nM, 1.5 x 10⁷/mL의 내피 세포 및 3 x 10⁶/mL의 섬유아세포.

대안적으로, 혈관 바이오잉크는 완충 용액 또는 세포 배지에서 5 내지 10%(w/v), 바람직하게는 5%(w/v)의 dECM(p)으로 구성되었다.

구현예 3: 일차 바이오잉크의 특성

A. 레올로지

수행된 테스트는 췌장 소엽 모델을 프린팅하기 위해 특정 시스템을 사용할 가능성을 제한하는 인자를 구성하는 특성 파라미터의 값 - 5 Paㆍs 초과의 점도 값을 결정하기 위한 기초 역할을 하였다. dECM 하이드로겔의 특성에 대한 펩신 농도의 영향은 아래에 제시된다.

최적의 특성을 가진 바이오잉크의 조성을 확인하기 위해, dECM 용액 및 페이스트의 점도는 바이오프린팅 중에 존재하는 조건을 나타내기 위해 특별히 개발된 절차에 따라 MCR 72 유량계(Anton Paar)를 사용하여 테스트되었다: 콘-플레이트(cone-plate) 시스템, 21/s의 일정한 전단율 및 37℃의 테스트 온도. 사용된 분말 유형(MS-분쇄 및 멸균, CS - 절단 및 멸균, MNS - 분쇄, 멸균되지 않음, CNS - 절단, 멸균되지 않음) 및 사용된 성분의 농도에 따른 샘플의 차이를 고려한 시스템 레올로지 테스트의 결과는 도 2에 제시된다.

dECM 용액의 농도가 증가하면 점도가 증가한다 [도 2]. 얻은 점도 값은 바이오잉크에 적절한 일관성을 부여하는 제제로서 dECM(r)을 사용하기에는 너무 낮은 것 같다. 고려 중인 각 경우에 멸균 처리된 dECM(p)으로 얻은 용액은 비멸균 분말 용액보다 점도 값이 더 낮았다. 더 낮은 dECM(r) 농도에서 분쇄 분말과 절단 분말을 사용할 때 용액 일관성에서 약간의 차이가 관찰되었다. 10%(w/v)의 경우, 분쇄 분말 dECM(r)은 절단 dECM(p)로부터 제조된 dECM(r)보다 약간 더 점성이 있었다.

결과의 요약은, dECM 페이스트의 사용이 적절한 일관성을 갖는 바이오잉크 베이스를 얻기 위해 필요함을 보여준다. 요약의 모든 시스템은 프린팅 중에 사용할 수 있는 범위 내의 점도를 가지고 있다. 더욱이, 멸균 후 멸균 분말을 사용하여 세포 및 소도가 있는 성분의 혼합물을 바이오프린팅하는 데 사용하는 것이 편리한 것 같다.

일차 바이오잉크(페이스트)에 글리세롤을 첨가하면 문헌 데이터와 달리 일차 바이오잉크의 점도가 약간 감소하여, 글리세롤의 첨가 시 바이오잉크의 점도가 증가한다고 보고하였다. 페이스트에 첨가된 각각의 제제는 점도 변화를 유도하였다. 세포 및 소도의 구조 또는 생존력의 유지를 지원하는 물질을 첨가하면, 페이스트의 유동능 변화는 무시할 수 있을 정도로 미미한다. dECM의 페이스트는 일차 바이오잉크를 생산하고 특정 바이오잉크가 프린팅에 사용될 수 있는지 여부를 결정하기 위한 기초를 구성하였다.

B. 바이오잉크 고화 방법

- 가교제를 사용하는 프린팅물의 가교

하기 표는 일차 바이오잉크에 사용되는 가교제의 조성 차이를 나타낸 것이다[표 6].

위와 같은 시스템의 가교성 테스트는 365 내지 405nm 범위의 파장을 가진 빛을 사용하여 수행되었으며 긍정적인 결과를 보였다[표 7].

공정 후 또는 바이오프린팅 공정 동안의 가교 결과 분석은, 365nm 및 405nm 파장 광의 사용 모두가 의도한 효과, 즉 하이드로겔 형태가 액체에서 고체로 변화하는 것을 달성했음을 보여주었다. 그러나 바이오잉크는 세포와 미생물을 함유하고 있어 가시광선만 사용할 수 있다. 따라서 가장 바람직한 가교 방법은 405 nm 파장의 빛을 이용하는 것이다.

dECM 페이스트에 보충 화학 물질을 추가하면 평활화된 형상의 필라멘트 표면을 초래하였다. 또한, GelMa와 HAMA를 추가할 때 바이오잉크의 통기 증가가 확인되었으며 이 효과는 HAMA에서 가장 강력하였다.

- 열 겔화

겔화 공정의 강도는 광범위한 온도 및 그 영향에 대한 노출 시간에 걸쳐 전문 장비를 사용하여 용액 탁도의 식별을 사용하여 테스트되었다. 도 3은 dECM 용액 가교 테스트 결과의 예를 보여준다. 5%(w/v)의 경우, 25 내지 37℃ 범위 내에서 온도 증가에 의해 생성된 테스트된 모든 시스템에서 약간의 흡광도 증가가 관찰되었다. 분쇄 및 멸균 분말의 사용은 dECM 용액의 탁도를 감소시켰다. 절단 분말 용액에 대해 더 높은 dECM(r) 농도(8 및 10%(w/v))의 경우, 동일한 멸균 상관 관계가 얻어졌지만 분쇄 분말의 경우 반대였다. 8% 및 10%(w/v)의 dECM(r) 모두는, 온도가 증가함에 따라 탁도가 약간 증가하였다. 10% dECM(r)은 비교적 높은 탁도를 보였고 테스트된 온도 범위에서 안정적이었다.

37℃의 일정한 온도에서 겔화의 동역학에 기초하여, 37℃의 온도에 노출 시간을 증가시킬 때 탁도의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 분쇄된 멸균 분말의 dECM(r)은 가장 낮은 흡광도 값을 갖는 반면, 절단된 비멸균 분말 용액은 모든 dECM(r) 농도에서 가장 높은 탁도를 나타낸다.

C. 글루코스 확산으로 예시되는 바이오잉크 성분 투과성

소위 구동력, 즉 글루코스 농도가 증가함에 따라 지연 시간과 평형 상태에 도달하는 시간이 감소하고 확산도가 증가한다. 표 8에 제시된 데이터는, 일차 바이오잉크로 얻은 막의 확산도가 4%(w/v) 알기네이트(Alg4)로 얻은 것과 유사하다는 것을 보여준다.

D. 흡광도

얻어진 바이오잉크의 유용성을 평가하기 위해, 인체 내부 조건을모방하여 특별히 제조된 완충액을 이용하여 프린팅된 소엽의 흡수성 분석을 수행하였다. 처음 15분 동안, 프린팅된 작제물의 중량이 약간 증가한 후 특정 수준에서 감소 및 안정화가 관찰되었다. 다음의 단계에서는, SBF 완충액 환경에서 열화 현상을 연구하기 위해 프린팅된 소엽의 시간에 따른 중량 변화를 관찰하였다[도 4].

구현예 4: 혈관 바이오잉크의 특성

A. 레올로지

비등된 dECM(r)은 초음파 처리된 것보다 훨씬 더 높은 점도 값을 갖는다. 그러나 초음파 처리 후 혈관 바이오잉크의 적절한 안정성으로 인해, 이 방법이 혈관 덕트 프린팅에 더 바람직한 것으로 결정되었다.

B. 겔화

25 내지 37℃ 범위의 온도 증가와 37℃의 온도에 대한 노출 시간은 비등되고 초음파 처리된 dECM 농도가 약간 감소한다.

구현예 5: 세포와 미생물의 생존력에 대한 바이오프린팅 동안 사용된 압력의 영향

섬유아세포(세포주 3T3-L1 및 HFF-1) 및 췌장 소도에 대한 생존력 테스트를 수행하였다. 이를 위해, 직경 0.2 및 0.6 mm의 바늘을 사용하여 췌장 세포/소도에 15kPa에서 100kPa 범위의 압력을 가하였다. 수행된 테스트 결과는, 압출법을 사용하여 3D 바이오프린팅 중에 유도된 전단력이 세포 및 미생물 생존력에 상당한 변화를 일으키는 것임을 보여준다.

생존 가능하고 기능적인 생물학적 3차원 구조를 얻기 위해서는, 바늘의 압력과 직경이 특정 세포 유형과 일치할 필요가 있었다. 그러나, 바람직하게는 30 kPa 이하의 압력이 가해졌다.

구현예 5: 프린팅적성

일차 바이오잉크를 사용한 프린팅물은 다음 파라미터를 사용하여 이루어졌다: 압력: 4 내지 100 kPa, 프린팅 속도: 5 내지 40 mm/s, 온도: 프린트헤드 - 10 내지 37℃; 프린트베드- 4 내지 37℃, 바늘 직경: 100 nm 내지 1 mm. 혈관 바이오잉크를 사용한 프린팅물은 다음 파라미터를 사용하여 이루어졌다: 압력: 5 내지 100 kPa, 프린팅 속도: 5 내지 40 mm/s, 온도: 프린트헤드 - 10 내지 37℃; 프린트베드- 4 내지 37℃, 바늘 직경: 100 nm 내지 1 mm.

- 소엽

혈관이 제공된 췌장 소엽을 프린팅하는 데 약 3분이 소요되었다. 도 6은 혈관화된 소엽의 3D 모델과 프린팅된 작제물의 사진을 보여준다. SEM은 측면 표면의 형태와 프린팅된 소엽의 단면을 식별하는 데 사용되었다. 소엽의 실질적인 다공성 뒤에 있는 바이오잉크 필라멘트의 느슨한 배열이 관찰되었다. 또한 단면분석에 기초하여, 혈관을 모방한 특허 덕트가 공급되는 3차원 다공성 구조의 층화를 확인하였다.

- 혈관화된 3차원 구조

특허 덕트 네트워크가 제공되는 바이오닉 췌장의 프로토타입을 프린팅하는 데 약 30분이 걸렸다. 소엽의 경우와 마찬가지로, 특허 덕트의 네트워크가 제공되는 프린팅된 작제물의 고다공성 구조에서 바이오잉크 필라멘트의 느슨한 배열이 관찰되었다.

프린팅된 혈관계는 핵 자기 공명 영상을 사용하여 평가되었다. 만들어진 3D 재구축은 무너지거나 해부되는 경향이 없는 특허 덕트를 보여준다.

구현예 5: 프린팅된 소엽의 세포독성

일차 바이오잉크의 세포독성을 평가하기 위해 섬유아세포주(3T3)에 대한 MTT 검정을 수행하였다. 결과는 최대 추출물 농도에서 대조군의 %로 제시된다[표 14]. 추출물에 대한 노출 시간은 24시간이었고 밀도가 1x10⁵/mL인 세포를 플레이팅하였다. 두 검정 모두는 테스트된 세포주에 대해 세포독성을 나타내지 않았다.

구현예 6: 췌장 소도(islet)/세포의 기능 및 생존력에 대한 개별 바이오잉크 성분의 영향.

일차 바이오잉크의 개별 성분이 췌장 소도의 활력과 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해 글루코스 자극 테스트를 수행하였다.

- 글리세롤

그 특성으로 인해, 바이오잉크에 5%(w/v) 및 10%(w/v) 글리세롤을 추가하면 일차 바이오잉크의 프린팅적성이 개선되었다. 췌장 소도 기능에 미치는 영향을 평가하기 위해, 글리세롤을 5% 또는 10% 농도로 배양 배지에 첨가하고 췌장 소도를 그 안에서 24시간 동안 인큐베이션하였다[도 8]. 두 경우, 모두 췌장 소도의 기능은 배양 배지 단독의 췌장 소도에 비해 훨씬 우수하다.

- 상업적으로 입수가능한 단백질 보충물

췌장 소도의 기능과 생존력에 대한 세포외 기질 단백질을 추가하는 효과를 테스트하였다. 이를 위해, 0.007 mg/mL 히알루론산, 0.041 mg/mL 콜라겐 I, 0.122 mg/mL 콜라겐 IV 및 0.084 mg/mL 라미닌으로 구성된 용액을 제조하고 이를 배양 배지에 첨가하였다. 두 유형의 히알루론산: 고분자량 또는 저분자량으로 실험을 수행하였고, 이를 배양 배지에 첨가하고 48시간 동안 그 안에서 소도를 인큐베이션하였다[도 9]. 고(H) 및 저(L) 분자량 히알루론산 변이체 모두에서, 췌장 소도는 어떤 보충물로 처리하지 않은 췌장 소도와 유사한 수준에서 기능적이었다.

- GelMA

바이오잉크의 성분으로서 프린팅물의 적절한 가교를 보장하는 메타크릴레이트화된 젤라틴이 소도의 생존력에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 테스트하였다. 이를 위해, 7.8% v/v의 GelMa를 배양 배지에 첨가하고 72시간 동안 소도를 인큐베이션하였다[도 10]. GelMa가 첨가된 배지에서 성장한 소도는 측정 시간에 따라 유사하거나 더 많은 양의 인슐린을 분비했으며, 이는 소도의 생존력에 대해 주어진 농도에서 이 화합물의 유리한 효과를 나타낸다.

- HAMA

바이오잉크의 성분으로서 프린팅물의 적절한 가교를 보장하는 메타크릴레이트화된 히알루론산이 소도의 생존력에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 테스트하였다. 이를 위해, 0.78% v/v의 HAMA를 배양 배지에 첨가하고 48시간 동안 소도를 인큐베이션하였다[도 11]. HAMA가 있는 배지에서 성장한 소도는 대조군 소도보다 더 적은 양의 인슐린을 분비했으며, 이는 소도의 생존력에 대한 테스트 농도의 화합물의 역효과를 나타낼 수 있다.

- GelMA 및 HAMA

바이오잉크의 성분으로서 프린팅물의 적절한 가교를 보장하는 메타크릴레이트화된 젤라틴과 메타크릴레이트화된 히알루론산의 혼합물이 소도의 생존력에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 테스트하였다. 이를 위해, 4.68% v/v GelMa 및 0.312% v/v HAMA (G3:2H) 또는 3.12% v/v GelMa 및 0.468% v/v HAMA (G2:3H)를 배양 배지에 첨가하고 72시간 동안 소도를 인큐베이션하였다[도 12]. G3:2H 비율의 혼합물이 첨가된 배지에서 성장한 소도은 측정 시점에 따라 대조군 소도와 비교하여 더 많거나 더 적은 양의 인슐린을 분비하였다. 혼합물의 이 변형은 소도의 생존력에 유리한 영향을 미치는 것으로 보였다. G2:3H 비율의 혼합물이 첨가된 배지에서 성장한 소도는 대조군 소도보다 상당히 적은 인슐린을 분비했으며, 이는 소도의 생존력에 대한 주어진 농도의 GelMa 및 HAMA 혼합물의 역효과를 나타낸다.

- ECM 분말

탈세포화를 통해 얻은 ECM이 소도의 생존력에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 테스트하였다. 이를 위해, 탈세포화 동안 3.33% v/v의 절단 또는 분쇄된 ECM을 배양 배지에 첨가하고 소도를 72시간 동안 인큐베이션하였다[도 13]. 13]. 분쇄된 ECM이 첨가된 배지에서 성장한 소도는 24시간 동안 소도의 인슐린 분비에 유리한 영향을 미쳤다. 절단된 ECM이 추가된 배지는 인슐린 분비를 상당히 감소시켰으며, 이는 소도 생존력에 대한 역효과를 나타낼 수 있다.

구현예 7: 바이오프린팅 후 췌장 소도의 생존력

3D 바이오프린팅 후 췌장 소도의 생존력을 평가하기 위해 3가지 바이오잉크를 선택하였다: 메타크릴레이트화된 젤라틴, 메타크릴레이트화된 히알루론산, 메타크릴레이트화된 젤라틴과 메타크릴레이트화된 히알루론산의 혼합물.

이를 위해, 7.8% v/v GelMa 또는 0.78% v/v HAMA 또는 4.68% v/v GelMa와 0.312% v/v HAMA (MIX)의 혼합물을 일차 바이오잉크에 첨가하였다. 프린팅 후, 소도가 있는 소엽을 배양 배지에서 24시간 동안 인큐베이션하였다[도 14].

GelMa가 첨가된 일차 바이오잉크로 프린팅된 소엽의 소도는 프린팅 공정 후에 생성된 최고 수준의 인슐린을 보여 췌장 소도의 생존 및 기능에 대한 이 성분의 유리한 효과를 나타낸다. 바이오잉크에 HAMA 및 GelMa와 HAMA의 혼합물을 첨가하면 배지에서 성장한 대조군 소도(3D 바이오프린팅되지 않음)과 비교하여 소도에서 생성된 인슐린 수준이 약간 감소하였다. GelMa만 첨가한 바이오잉크에 대한 결과는 주어진 글루코스 농도에서 가장 높은 소도의 활성을 나타내었지만, 프린팅된 구조는 가장 덜 안정적이고 배양 배지에서 가장 빨리 붕해되었다. 따라서 최적의 용액은 바이오프린팅 공정에 메타크릴레이트화된 젤라틴과 메타크릴레이트화된 히알루론산의 혼합물을 사용하는 것이었다. 이 조합을 통해 적절한 바이오프린팅 파라미터와 프린팅된 모델의 안정성을 유지하면서 생존가능하고 기능적인 췌장 소도를 보존할 수 있었다.

구현예 8: 일차 바이오잉크에서 보존된 dECM의 사차 구조 확인.

일차 바이오잉크를 포함하는 프린팅된 구조에서 ECM의 사차 구조의 보존을 시각화하고 확인하기 위해, dECM 제조의 개별 단계에서 단백질 구조의 전자 현미경검사를 사용한 시각화(바이오프린팅에 사용하기 위해)를 수행하였다 (도 15). 일차 바이오잉크를 포함하는 프린팅된 작제물(E 및 F)은 가시적인 콜라겐 섬유를 갖는 콜라겐 사차 구조를 나타내었다.

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[7] Brown, B. N., Freund, J. M., Han, L., Rubin, J. P., Reing, J. E., Jeffries, E. M., ?? Badylak, S. F. (2011). Comparison of Three Methods for the Derivation of a Biologic Scaffold Composed of Adipose Tissue Extracellular Matrix. Tissue Engineering Part C: Methods, 17(4), 411-421. doi:10.1089/ten.tec.2010.0342

Claims (15)

1. 다음의 단계를 포함하는, 무세제 탈세포화 세포외 기질(dECM) 제조 방법:
   - 바람직하게는 기계적 압출에 의한 췌장, 간, 신장, 심장, 피부, 폐, 대장, 소장, 혈액 동맥 및 정맥, 지방 조직 및 태반으로부터 선택된 동물 기원 기관의 기계적 단편화로서, 상기 기관은 동물의 신체로부터 분리되는 기계적 단편화,
   - 바람직하게는 1XPBS를 포함하는 완충 세제 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션으로서, 완충 세제 용액은 0.5% 내지 1.5%, 바람직하게는 1%(v/v), 옥톡시놀-9를 포함하고, 상기 세제 용액은 바람직하게는 0.01%(w/v)의 농도로 항균제, 바람직하게는 스트렙토마이신이 보충되고, 상기 인큐베이션은 진탕하면서 실온 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 적어도 72시간 동안 수행되며, 상기 단편화된 기관은 4 내지 12시간마다 새로운 세제 용액으로 옮겨지는 인큐베이션,
   - 바람직하게는 1XPBS를 포함하는 제1 완충 세척 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션으로서, 상기 제1 완충 세척 용액은 진탕하면서 항균제, 바람직하게는 스트렙토마이신을 바람직하게는 0.01%(w/v) 농도에서 72시간 동안 실온 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 포함하고, 상기 단편화된 기관은 4 내지 12시간마다 새로운 세척 용액으로 옮겨지는 인큐베이션,
   - 바람직하게는 0.0001 내지 0,0003%(w/v), 가장 바람직하게는 0.0002%(w/v)의 농도로, 바람직하게는 DNAse 성능에 적절한 온도에서 적어도 8시간 동안 DNAse를 포함하는 데옥시리보뉴클레아제 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션,
   - 바람직하게는 1XPBS를 포함하는 제2 완충 세척 용액에서 단편화된 기관의 인큐베이션으로서, 상기 제2 완충 세척 용액은 진탕하면서 항균제, 바람직하게는 스트렙토마이신을 바람직하게는 0.01%(w/v) 농도에서 72시간 동안 실온 미만의 온도, 바람직하게는 4℃에서 포함하고, 상기 단편화된 기관은 4 내지 12시간마다 새로운 세척 용액으로 옮겨지는 인큐베이션,
   - 단편화된 기관의 냉동, 및 이 냉동된 단편화된 기관을 단편으로 파쇄함,
   - 바람직하게는 -32℃에서, 바람직하게는 0.31 mbar(31Pa)의 압력에서 냉동된 단편화된 기관의 냉동 건조함,
   - 0.0010 mbar(0.1Pa) 및 -76℃에서 5 내지 15분 동안 선택적 최종 건조함,
   - 분쇄 및 건조된 생성물을 25 내지 500 μm의 dECM 분말로 분쇄함,
   - 바람직하게는 방사선 및/또는 산화에틸렌에 의한 생성물의 선택적 멸균함.
2. 제1항에 있어서, 분쇄 단계는 dECM 분말 내 옥톡시놀-9의 양을 확인하는 단계가 뒤따르고, 바람직하게는 상기 dECM 분말은 옥톡시놀-9의 존재에 대해 확인되기 전에, 바람직하게는 43,953의 PZ/g dECM의 농도에서 콜라게나제로 처리되는, 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 분쇄 단계 후에 다음의 단계가 뒤따르는, 방법:
   - 0 내지 10 mg/ml의 펩신이 보충된 염산 용액, 바람직하게는 0.01 M의 염산 용액에 dECM 분말을 용해시키는 단계;
   - 실온에서 48 내지 72시간, 바람직하게는 72시간 동안 혼합하는 단계;
   - 바람직하게는 0.1 M의 나트륨 염기 및 PBS 용액을 사용하여 얼음 상에서 중화시키는 단계.
4. 제1항 또는 제2항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는 분말 형태의 무세제 탈세포화 ECM.
5. 제3항에 따른 방법에 의해 얻을 수 있는, 용액 형태의 무세제 탈세포화 ECM.
6. 다음의 단계를 포함하는, 일차 바이오잉크의 제조 방법:
   - 혼합으로, 제4항에 따른 dECM 분말 5 내지 50%(w/v), 바람직하게는 15 내지 25%(w/v), 및 바람직하게는 제5항에 따른 dECM 용액 1 내지 10% (w/v), 바람직하게는 8 내지 10% (w/v)을 함유하는 페이스트의 제조
   - 적어도 24시간 동안 7 내지 10℃의 온도에서 페이스트의 인큐베이션
   - 1.46 내지 7.32%(w/v)의 메타크릴레이트화된 젤라틴, 0.15 내지 1.10%(w/v)의 메타크릴레이트화된 히알루론산 및 5 내지 10%(w/v)의 글리세롤, 및 광개시제, 바람직하게는 0.03 내지 0.17 % (w/v)의 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트의 첨가, 이어서 부드럽게 혼합.
7. dECM 페이스트 및 1.46 내지 7.32% (w/v)의 메타크릴레이트화된 젤라틴, 0.15 내지 1.10 % (w/v)의 메타크릴레이트화된 히알루론산 및 5 내지 10% (w/v)의 글리세롤, 및 광개시제, 바람직하게는 0.03 내지 0.17 % (w/v)의 리튬 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트를 포함하는 일차 바이오잉크로서, 상기 dECM 페이스트는 제 4항에 따른 dECM 분말 5 내지 50% (w/v), 바람직하게는 15 내지 25% (w/v), 및 제5항에 따른 dECM 용액 1 내지 10% (w/v), 바람직하게는 8 내지 10% (w/v)을 포함하고, 그리고 일차 바이오잉크의 점도는 21/s의 일정한 전단율 및 37℃의 온도에서 콘-플레이트 시스템에서 측정 시 적어도 5 Pa·s인, 일차 바이오잉크.
8. 제7항에 있어서, 하기로부터 적어도 하나의 첨가제를 포함하는, 일차 바이오잉크: 0.001 내지 0.100 mg/mL, 바람직하게는, 0.007 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 히알루론산, 0.005 내지 0.100 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 라미닌, 바람직하게는, 0.084 mg/mL, 0.001 내지 0.100 mg/mL, 바람직하게는 0.041 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 콜라겐 I, 0.005 내지 0.175 mg/mL, 바람직하게는, 0.122 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 콜라겐 IV, 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 100 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 인간 피브리노겐, 1 내지 2 EPU/일차 바이오잉크 mL 농도의 아프로티닌, 0.05 내지 2 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 폴리소르베이트, 5 내지 55 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 인간 트롬빈, 20 내지 60 mM/일차 바이오잉크 mL 농도의 염화칼슘; 혈관신생촉진 비타민: 1nM 내지 500μM, 바람직하게는 100 μM 농도의 비타민 A, 50 내지 100μM, 바람직하게는 100μM 농도의 비타민 B1, 1 내지 10μM, 바람직하게는 10μM 농도의 비타민 B3, 10 내지 100 mg/일차 바이오잉크 mL 농도의 비타민 B12, 0.1 내지 10 nM, 바람직하게는 10 nM 농도의 비타민 D3, 혈관신생을 지원하는 성장 인자: 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL의 일차 바이오잉크 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/일차 바이오잉크 mL 농도의 FGF, 1 내지 10 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/일차 바이오잉크 mL 농도의 TGF-β, 0 내지 100 ng/mL, 바람직하게는 10 ng/일차 바이오잉크 mL 농도의 인터류킨 (IL)-8, 20 내지 50 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/일차 바이오잉크 mL 농도의 IL-17A.
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 0.1 내지 10x10⁵/일차 바이오잉크 mL의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x10⁵/일차 바이오잉크 mL 농도의 일차 미세혈관 내피 세포, 3 내지 9 x 10⁶/바이오잉크 mL 농도의 동물 또는 인간 유래된 α 세포, 1.1 내지 3.4 x 10⁷/바이오잉크 mL 농도의 동물 또는 인간 유래된 β 세포, 바람직하게는 20,000 iEq/일차 바이오잉크 mL의 양의 동물 또는 인간 유래된 췌장 소도로부터 선택된 하나 이상의 동물 또는 인간 유래된 첨가제를 포함하는, 방법.
10. 다음의 단계를 포함하는, 혈관 바이오잉크의 제조 방법:
    a) CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액의 선택적 제조로서, 50 내지 65 ℃의 온도, 바람직하게는 60 ℃에서 진탕하면서 미생물학적 젤라틴을 완충 용액에 현탁시키고, 2 내지 5% (v/v)의 카복시메틸 셀룰로스 (CMC) 수용액을 첨가하여 혈관 바이오잉크에서 최종 농도 0.2 내지 1% (v/v)의 CMC를 수득하고 그리고 상기 용액을 40℃ 이하의 온도로 냉각시킴으로써 완충 용액, 바람직하게는 PBS 중 미생물학적 젤라틴의 1 내지 2% (w/v) 용액을 제조하는 것을 포함하는, 상기의 선택적 제조
    b) 부드럽게 진탕하면서 제1항 또는 제2항에 따라 얻을 수 있는, 바람직하게는 방사선에 의해 멸균된 dECM 분말을 (i) 단계 a)에서 수득된 CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액 또는 (ii) 완충 용액 또는 (iii) 세포 배지의 용액에 첨가함으로써 5 내지 10% (w/v)의 dECM 용액을 제조함
    c) 얻어진 용액을 37℃ 이하의 온도에서 0.5 내지 2.0시간 동안 초음파 처리
    d) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 동물 또는 인간 유래된 첨가제의 선택적 첨가: 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/mL 농도의 FGF, 100 및 300 nM, 바람직하게는 100nM 농도의 PGE2, 0.1 내지 10x10⁷개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x106개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 섬유아세포.
11. 다음의 단계를 포함하는 혈관 바이오잉크의 제조 방법:
    a) CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액의 선택적 제조로서, 50 내지 65 ℃의 온도, 바람직하게는 60 ℃에서 진탕하면서 미생물학적 젤라틴을 완충 용액에 현탁시키고, 2 내지 5% (v/v)의 카복시메틸 셀룰로스 (CMC) 수용액을 첨가하여 혈관 바이오잉크에서 최종 농도 0.2 내지 1% (v/v)의 CMC를 수득하고 그리고 상기 용액을 40℃ 이하의 온도로 냉각시킴으로써 완충 용액, 바람직하게는 PBS 중 미생물학적 젤라틴의 1 내지 2% (w/v) 용액을 제조하는 것을 포함하는, 상기의 선택적 제조
    b) 부드럽게 진탕하면서 제1항 또는 제2항에 따라 얻을 수 있는, 바람직하게는 방사선에 의해 멸균된 dECM 분말을 (i) 단계 a)에서 수득된 CMC가 보충된 미생물학적 젤라틴의 용액 또는 (ii) 완충 용액 또는 (iii) 세포 배지의 용액에 첨가함으로써 5 내지 10% (w/v)의 dECM 용액을 제조함
    c) 혼합물을 100℃에서 15 내지 30분 동안 비등시킴
    d) 하기로부터 선택된 적어도 하나의 동물 또는 인간 유래된 첨가제의 선택적 첨가: 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/mL 농도의 FGF, 100 및 300 nM, 바람직하게는 100nM 농도의 PGE2, 0.1 내지 10x10⁷개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x106개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 섬유아세포.
12. 혈관 바이오잉크로서, 바람직하게는 1 내지 5% (w/v) 농도의 미생물학적 젤라틴 및/또는 0.2 내지 2 % (v/v) 농도의 CMC가 보충된 제5항에 따른 초음파 처리되거나 비등된 dECM 용액을 2 내지 10% (w/v)의 농도로 포함하는, 혈관 바이오잉크.
13. 제12항에 있어서, 하기로부터 선택된 적어도 하나의 동물 또는 인간 유래된 첨가제를 포함하는, 혈관 바이오잉크: 3 내지 300 μg/mL, 바람직하게는 100 μg/mL 농도의 파이브로넥틴, 10 내지 30 ng/mL, 바람직하게는 30 ng/mL 농도의 VEGF, 10 내지 20 ng/mL, 바람직하게는 20 ng/mL 농도의 FGF, 100 및 300 nM, 바람직하게는 100nM 농도의 PGE2, 0.1 내지 10x10⁷개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 내피 세포, 0.1 내지 10x106개의 세포/mL의 혈관 바이오잉크의 밀도의 섬유아세포.
14. 적어도 3개의 인접한 바이오잉크 층을 포함하는 3차원 구조로서, 제12항 또는 제13항에 따른 혈관 바이오잉크의 층은 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 일차 바이오잉크의 2개 층 사이에 배열되는, 3차원 구조.
15. 3차원 구조의 제조 방법으로서, 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 일차 바이오잉크 및 제12항 또는 제13항에 따른 혈관 바이오잉크는 5 내지 50 mm/s의 프린팅 속도, 4 내지 300 kPa의 압력 및 4 내지 37℃의 온도에서 3D-바이오프린팅 공정에서 층별로 침착되고, 그리고 침착 동안 또는 이후에 일차 바이오잉크는 적어도 5초 동안 바람직하게는 365 내지 405 nm, 더 바람직하게는 405 nm의 파장의 UV 광 및/또는 가시광선에 노출되는, 방법.

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