WO2009154344A1 - 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법 - Google Patents

조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법 Download PDF

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Definitions

  • natural hyaluronic acid is multi-modal in proportion to molecular weight, it does not have species specificity and has no tissue or organ specificity, and is known to exhibit excellent biocompatibility when implanted or injected into a living body regardless of its origin.
  • Figure 4 is a graph showing the number of cells growing in the support of the present invention.
  • the freeze-dried support is first partially cross-linked with collagen for 30 minutes under UV (250 nm, 15 cm distance from UV light), and then the support is ethanol / EDC ⁇ 91-99 / 1-9 (V / V).
  • the crosslinked solution is impregnated with the mixed solution.
  • the amount of the EDC is less than 1% by volume compared to ethanol, the role of the crosslinking agent is insufficient, and when more than 9% by volume, the crosslinking does not proceed anymore, and thus a large amount of the uncrosslinking agent does not participate in the reaction. It can be a waste.
  • the cross-linked support is exchanged with distilled water for 1 day and washed several times to remove the uncrosslinked agent that did not participate in the cross-linking and then lyophilized.

Abstract

본 발명은 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 콜라겐과 히알루론산을 산성 용액에 용해하여 혼합용액을 제조하는 (a)단계 및 상기 혼합용액에 가교제를 첨가하여 가교시킨 다음 동결 건조시키는 (b)단계를 포함하거나, 또는 상기 동결 건조시킨 지지체에 UV가교와 가교제를 사용하여 2차 가교시키는 (c)단계를 더 포함한다. 상기 본 발명은 생체적합성의 3차원 골격 또는 외곽구조를 조직 손실 부위에서 환자에게 이식하여 생체 내에서 조직 수복을 유도하며, 특히 관절 연골의 재생에 유리한 다공성 지지체 조성물로서, 혈액 적합성, 조직 적합성, 세포간 기질 형성능, 세포 부착능 중에서 하나 이상의 특성을 지닌다.

Description

조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법
본 발명은 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법에 관한 것으로, 콜라겐과 히알루론산을 산성 용액에 용해하여 혼합용액을 제조하는 (a)단계 및 상기 혼합용액에 가교제를 첨가하여 가교시킨 다음 동결 건조시키는 (b)단계를 포함하거나, 또는 상기 동결 건조시킨 지지체에 UV가교와 가교제를 사용하여 2차 가교시키는 (c)단계를 더 포함한다.
상기 본 발명은 생체적합성의 3차원 골격 또는 외곽구조를 조직 손실 부위에서 환자에게 이식하여 생체 내에서 조직 수복을 유도하며, 특히 관절 연골의 재생에 유리한 다공성 지지체 조성물로서, 혈액 적합성, 조직 적합성, 세포간 기질 형성능, 세포 부착능 중에서 하나 이상의 특성을 지닌다.
최근 장기(臟器)가 필요한 환자 수의 급증과 이를 대체할 이식재의 결핍으로 인해 조직을 재구축하는 이른바 조직공학이 주목을 받고 있다.
조직공학에서는 생체 친화성을 갖는 재료를 바탕으로 세포가 성장할 수 있는 골격 즉 지지체를 제조 한 다음, 손상된 체내에 직접 이식을 해 조직을 수복하거나 그 지지체에 손상된 조직 세포를 배양하여 이식을 하는 방법을 사용한다.
이러한 골격 구조물(지지체)이 갖추어야 할 조건으로는 생체 적합성 이외에도 높은 밀도의 세포 점착을 가능하게 하는 큰 표면적과 생체내로의 이식 후에 혈관의 형성 및 영양분, 성장인자, 호르몬 등의 물질 전달을 가능하게 하는 큰 공극의 크기와 공극들 사이의 높은 상호 연결성을 가지고 있어야 한다. 또한 조직 세포의 유착과 증식이 잘 되어야 하고 분화된 세포의 기능이 보전되어야 하며, 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응이 없고, 일정기간이 지난 후 스스로 분해되어 이물질로 남지 않아야 한다.
조직 수복용 다공성 지지체를 제조하기 위한 생분해성 고분자 재료로는 합성 고분자인 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리 D,L-락트산-co-글리콜산{poly(D,L-lactide-co-glycolide;PLGA)}등의 폴리에스테르와 폴리카프로락톤, 폴리하이드록시 부티레이트 등이 사용되고 있으며, 천연 고분자로는 콜라겐, 히알루론산, 키토산, 젤라틴 등이 주로 사용되고 있다.
히알루론산은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자로 분자량이 50,000~10,000,000Da 또는 그 이상인 다당류이다. 히알루론산은 생체 결합조직의 기본물질로, 주로 포유동물의 피부, 관절의 활액, 눈의 초자체액, 탯줄, 혈청, 닭 벼슬 등에 분포해 있으며, 연쇄구균이나 간균류의 협막 등에도 존재하는 것으로 알려져 있다.
천연 히알루론산은 분자량에 비례한 다분성이지만, 종간 특이성을 갖지 않으며 또한 조직이나 장기특이성을 갖지 않아, 그 유래에 관계없이 생체에 이식 또는 주입한 경우에 우수한 생체적합성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
최종적으로 제재용으로 사용하기 위한 히알루론산이나 그에 관한 염기는 학술적으로 폭넓게 게시되어 있다. 히알루론산은 그자체로 비면역체이며, 점성과 친수성을 가지기 때문에 지난 수년 동안 안과용 눈물이나 관절의 유동체액 또는 안과수술시 보조매체로 사용되어 왔다.
이러한 우수한 생체 적합성으로 인해 조직 수복용 재료로써 히알루론산을 가교 결합시켜 다공성의 지지체를 제조하여 체외 또는 체내 이식하려는 시도를 하고 있다.
그러나, 생체 친화성이 높은 히알루론산은 가교결합하에서도 물성이 현저히 낮으며, 쉽게 분해가 되는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 개선하고자, 레하코바 등(Rehakova, M. et al., J. Biomed Mater Res. 30:369-372, 1996)은 콜라겐에 글라이올살 가교제를 첨가하고 히알루론산을 혼합하여 스캐폴드를 제조하였고, 토미하타 등(Kenji Tomihata, Biomaterials. 18:189-195,1997)은 히알루론산에 에폭시 반응기를 가지는 가교제를 첨가하여 히알루론산의 물성을 개선하고자 하였으며, 구로야나기 등(Kuroyanagi et al., Artificial Organs. 28:182-188 2004)은 히알루론산 지지체에 세포 점착력이 우수한 콜라겐을 침지하여 지지체를 제조하는 방법을 제시하기도 하였다. 이러한 상기의 노력에도 불구하고 분해 기간이 2주 또는 3주를 상회하는 것으로 확인되었다.
또한, 대한민국 공개특허 제2007-0089490호에서는 산성조건하에서 콜라겐과 히알루론산 각각의 용액을 제조한 후 두 용액의 응집체를 형성하고 동결건조 하여 지지체를 제조하는 방법을 제시하였으나, 히알루론산 용액과 콜라겐 용액을 각각 제조하고 다시 혼합해야 하는 번거로움이 있으며, 12~36시간 동안 장시간 응집화 함으로써 지지체를 장시간에 걸쳐 제조해야 하는 문제가 있었다.
따라서, 본 발명은 이러한 점을 감안하여 이루어진 것으로, 손상된 조직을 효과적으로 재생하기 위하여 연장된 생분해 기간과 생체 친화성을 갖는 조직 수복용 다공성 지지체로서 히알루론산을 조직 수복용 기초재로 하고, 세포 점착력이 우수하다는 콜라겐을 동시에 혼합하여 두 용액을 제조하고 다시 각각의 용액을 혼합하는 번거로움을 피하며, 하나 또는 둘이상의 가교제로 가교함으로써 단시간에 제조가 가능하며 한 달 이상 쉽게 분해가 되지 않고, 체외에서의 세포 배양과 이식 후의 조직 재생에 적합한 물성을 지닌 지지체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 콜라겐과 히알루론산을 산성 용액에 용해하여 혼합용액을 제조하는 (a)단계 및 상기 혼합용액에 가교제를 첨가하여 가교시킨 다음 동결 건조시키는 (b)단계를 포함하거나, 또는 상기 동결 건조시킨 지지체에 UV가교와 가교제를 사용하여 2차 가교시키는 (c)단계를 더 포함하는 것이 특징이다.
상기 본 발명은 생체적합성의 3차원 골격 또는 외곽구조를 조직 손실 부위에서 환자에게 이식하여 생체 내에서 조직 수복을 유도하며, 특히 관절 연골의 재생에 유리한 다공성 지지체 조성물로서, 혈액 적합성, 조직 적합성, 세포간 기질 형성능, 세포 부착능 중에서 하나 이상의 특성을 지닌다.
도 1은 본 발명의 다공성 히알루론산/콜라겐 지지체 표면 사진이다.
도 2는 본 발명의 가교제와 콜라겐 함량에 따른 지지체의 물성 그래프이다.
도 3은 본 발명의 히알루론산/콜라겐 지지체의 효소에 의한 분해 그래프이다.
도 4는 본 발명의 지지체에서 성장하는 세포의 수를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 지지체내 세포가 부착되어 성장하고 있는 SEM사진이다.
본 발명은 콜라겐과 히알루론산을 산성 용액에 용해하여 혼합용액을 제조하는 (a)단계 및 상기 혼합용액에 가교제를 첨가하여 가교시킨 다음 동결 건조시키는 (b)단계를 포함하거나, 또는 상기 동결 건조시킨 지지체에 UV가교와 가교제를 사용하여 2차 가교시키는 (c)단계를 더 포함하는 생분해성 고분자로 이루어진 다공성 지지체의 제조방법이다.
상기 본 발명의 생분해성 고분자 지지체는 천연 고분자인 히알루론산과 콜라겐으로 구성되어지는 천연 고분자를 포함한다.
상기 천연 고분자인 히알루론산은 분자량이 100,000~5,000,000 정도가 바람직하나 분자량에 상관없이 사용할 수 있다. 히알루론산은 히알루론산과 콜라겐의 전체 중량의 70~95% 중량비율로 포함되는 것이 바람직하다. 만일 히알루론산의 함량이 70% 이하이면 제조된 지지체의 물리적 강도가 약해지며, 95% 이상이 되면 혼합용액을 다루기에 부적합하다.
상기 히알루론산은 천연 고분자로써 연골의 구성성분의 하나로 생체 적합성을 갖으며, 조직 생성 시 세포의 이동에 유리하고, 생체 내 효소에 의해 완전 분해된다.
또한, 상기 콜라겐은 아텔로 콜라겐으로서 고분자인 아텔로 콜라겐은 분자량이 1,000~20,000 정도인 것을 사용하는 것이 바람직하며, 분자량에 상관없이 사용할 수 있다. 아텔로 콜라겐은 히알루론산과 콜라겐의 전체 중량의 5~30% 중량비율로 포함되는 것이 바람직하며 만일 함량이 5% 이하이면 지지체의 물리적 강도가 약해지며, 30% 이상이면 혼합용액을 다루기 어렵다.
상기 아텔로 콜라겐은 콜라겐의 면역 반응을 일으키는 텔로 부분을 제거하여 체내 면역반응을 일으키는 요소를 제거하였으며, 조직 생성 시 세포의 부착에 유리하고, 지지체 제조 시 물리적 골격을 유지하게 된다.
상기 (a)단계에서 콜라겐과 히알루론산의 혼합용액 제조를 위해서는, 우선 증류수에 염산, 황산 등의 산을 첨가하여 pH 3.0~4.0으로 하고 콜라겐을 최종 용액의 0.1~1.0중량%가 되도록 첨가하여 콜라겐 용액을 제조한다. 물성 향상을 위해서는 0.5%가 가장 적당하다. 이 용액에 각각의 용액을 따로 제조하여 혼합하는 번거로움을 피하기 위해 직접 히알루론산을 1~2중량%가 되도록 혼합하고 균질기를 이용하여 히알루론산/콜라겐 혼합용액을 제조한다.
상기 (b)단계에서는 상기의 혼합용액에 가교제를 0.1~1중량%가 되도록 혼합을 한 후 일정한 형태의 몰드에 혼합용액을 주입한다. 용액이 담긴 몰드를 25~35℃에서 10분~1시간 예비 가교한 후 가교된 용액을 동결 건조기에서 동결 건조 한다. 만약 혼합되는 가교제의 양이 0.1중량%이하일 경우 가교가 약하여 지지체가 쉽게 물에 풀어지게 되며, 가교시키는 온도가 40℃ 이상이게 되면 마찬가지 현상이 나타나게 된다. 가교제가 혼합된 용액을 플라스틱재질의 몰드에 부어 -40℃에서 동결 건조 한다.
상기 가교제는 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether:EGDGE), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether:BDDE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 및 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상이 바람직하다.
또한, 본 발명에서는 상기 동결 건조시킨 지지체에 UV가교와 가교제를 사용하여 2차 가교시키는 (c)단계를 더 포함하여 순도를 높힐 수 있다.
상기 (c)단계에서는 동결 건조된 지지체를 먼저 UV(250nm, UV등과의 거리 15cm)에서 30분간 콜라겐을 부분가교를 시키고 다시 지지체를 에탄올/EDC{91~99/1~9(V/V)} 혼합된 용액에 함침하여 2차 가교시킨다. 상기 EDC의 양이 에탄올에 비하여 1부피% 이하일 경우 가교제로써의 가교 역할이 미비해지고, 9부피% 이상일 경우에는 더 이상 가교가 진행되지 않아 반응에 참여하지 않은 미가교제가 다량이므로, 비용적인 측면에서도 낭비일 수 있다. 가교된 지지체는 1일간 증류수를 교환하며 수 회 수세하여 가교에 참여하지 않은 미가교제를 제거 한 후 다시 동결 건조한다.
이렇게 얻어진 본 발명의 다공성 지지체는 공극의 크기가 50~300μm이 바람직하다.
이하 실시예에서 본 발명을 보다 상세히 설명하되, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 국한되는 것은 아니다.
실시예
1) 히알루론산/콜라겐 지지체 제조
히알루론산/아텔로 콜라겐 지지체를 제조하기 앞서, 먼저 증류수에 1 N HCl로 pH를 3.5로 맞추고 콜라겐을 농도별로 최종 용액의 0.1, 0.3, 0.5중량%가 되도록 첨가한 후 히알루론산을 이 용액에 중량비율로 1.5% 첨가하고 균일하게 용해시키기 위해 균질 혼합기를 이용하여 예비 균일 혼합을 하고, 다시 강제교반기(mechanical stirrer)로 일정시간 혼합을 하였다.
상기 용액에 히알루론산과 콜라겐의 관능기를 가교시키는 가교제 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether:EGDGE)를 혼합용액에서 0.5 중량%가 되도록 상기 혼합용액에 균일하게 혼합하여 일정 몰드에 분주하고 30℃의 온도에서 30분간 유지하여 반응시킨 후 -40℃로 냉각시켜 동결 건조 하였다.
상기 동결 건조된 히알루론산/아텔로 콜라겐 지지체는 다시 콜라겐의 부분 가교를 위해 UV로 30분간 조사 한 후 지지체를 에탄올/EDC 95/5(V/V) 혼합용액에 함침하여 가교시킨다. 가교된 지지체는 1일간 증류수를 교환하며 수 회 수세하여 가교에 참여하지 않은 미가교제를 제거 한 후 다시 동결 건조하여 일정한 다공크기와 높은 다공 연결성을 갖는 지지체를 제조하였다. 제조된 지지체는 SEM을 통해 다공크기 약 100㎛의 크기를 갖는 것을 확인하였다.(도 1 참조)
2) 지지체의 기계적 성질 확인
본 발명의 조성물은 조직 수복을 위해 제조되어진 조성물 내로 조직 및 혈관이 성장하여 분해 될 때까지 외부로부터의 압력에 충분히 견디기 위한 기계적 특성을 가져야 하므로, 기계적 강도를 확인하는 실험을 통해 기계적 성질을 확인하였다.
먼저, 고분자 및 가교제 성분들의 농도 또는 가감에 따른 기계적 강도를 확인하기 위해 콜라겐의 최종농도 각각은 0.1%, 0.3%, 0.5%를 함유하면서, 히알루론산의 최종농도는 1.5%를 함유하는 고분자 용액들을 각각 제조한 후 인장시험을 위해 제조된 일정한 형태의 몰드에 부은 후 동결 건조하고 UV경화를 한 후 증류수를 이용하여 수회 수세하고 다시 동결 건조 하였다.
또한 상기의 고분자 용액에 히알루론산을 가교시키기 위한 1차 가교제 EGDGE와 2차 가교제 EDC에 의한 기계적 강도 향상 여부를 확인 하였다.
제조되어진 지지체는 인스트론(Instron) 인장기기에 설치하여 인장시험을 시행하였다. 측정방법은 dog-bone형태의 지지체를 그립(grip)사이에 위치시키고 고정시킨 후, 1mm/min 의 cross-head speed로 인장시험을 시행하였으며, 최대응력(maximum stress)값을 구하였다.
가교제에 따른 기계적 인장강도를 확인한 결과, 도 2에서와 같이, 콜라겐 농도 0.5%를 갖는 히알루론산-콜라겐 지지체에서 높은 물성강도를 확인하였고, EGDGE 1차 가교제만을 사용한 지지체 보다 에탄올/EDC 2차 가교제를 사용한 지지체에서 약간 높은 물성강도를 확인하였다.
3) 연골 지지체의 예비 분해 test
연골 재생용 지지체로 사용하기 위해서는 최소 1달 이상의 분해 기간을 갖아야 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 실험에서는 콜라겐의 농도별로 제조되어진 지지체에 대해 in vitro분해 실험을 실시하였다.
콜라겐 농도별로 일정한 크기의 디스크 형태를 갖는 지지체(직경:20mm, 높이:5mm)를 50ml 폴리스티렌 튜브에 넣은 다음 30ml의 PBS(phosphate buffered saline)에 히알루론산을 분해할 수 있는 히알루로니다아제와 콜라겐을 분해하는 콜라게나제를 각각 채웠다. 튜브에 담겨진 지지체는 50rpm, 37.5℃로 유지된 진탕배양기(shaking incubator)에서 shaking 하였다. 일정 기간에 걸쳐 지지체의 분해되는 시점과 형상을 관찰하였으며 남아 있는 지지체는 무게를 측정하였다. 5주에 걸친 in vitro 분해 실험 결과 지지체 초기 무게의 60~70%를 유지하며 분해되지 않은 것을 확인하였다(도 3 참조).
4) 연골 지지체의 in vitro 세포 배양 test
본 실험에서 콜라겐 농도별로 제조된 히알루론산/콜라겐 지지체의 세포 부착 및 성장 거동을 고찰하기 위해 조직세포 배양 실험을 하였다. 연골세포(immortalized human costal chondrocyte cell line C-28/12, Beth israel Deaconess Medical Center, USA)를 이용하여 각 지지체 내에서의 세포 점착 및 증식거동을 조사하였다. 먼저 37℃, 5% CO2 분위기를 유지하고 있는 세포 배양기내에서 175cm2 조직배양플라스크(tissue culture flask)에 배양된 세포들을 trypsin-EDTA로 불리하여 세포의 수를 산출하였다. 배양액은 10% FBS(fetal bovine serum), 페니실린, 젠타마이신이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)을 연골세포에 사용하였다.
제조된 디스크 형태의 지지체에 연골세포를 분주하고 37℃, 5% CO2 분위기의 세포배양기내에서 일정기간 배양하였다. 세포 배양액은 2일 간격으로 신선한 배양액으로 교체하여 주었으며, 일정기간 배양 후 지지체내 점착 및 증식되어지는 세포들을 MTT분석, H&E 염색, SEM을 통해 분석되었다.
MTT분석법은 세포가 각각 배양되고 있는 지지체가 포함된 배양액에 일정기간 후 MTT용액을 첨가하고 살아있는 세포로부터 기인되는 포마잔 결정을 형성하고 이어 DMSO용액을 첨가하여 초음파 세척기에서 포마잔 결정을 용해시켜 주었다. 이용액을 570nm에서 광밀도를 측정하였다. 지지체 내에서 성장하는 세포의 분포도를 확인하는 방법으로 H&E 염색을 하기위해 배양중이던 지지체를 10% 포르말린 용액에 고정 후 헤마톡실린과 에오신으로 염색하고 절편기를 이용하여 얇은 박편을 제조 후 현미경을 이용하여 확인하였다. 또한 지지체내 부착되어있는 세포들의 형태는 SEM을 통해 직접 관찰하였다. 2주간의 세포 배양 결과 콜라겐의 농도가 증가할수록 세포 증식능력이 우수한 것을 확인하였으며, 콜라겐 농도 0.3, 0.5%에서는 유사한 것을 확인하였다(도 4 참조). 또한, 지지체에 배양되는 세포를 SEM을 통해 관찰한 결과(도 5), 지지체에 잘 부착되어 성장하는 것을 확인하였다.

Claims (6)

  1. 콜라겐과 히알루론산을 산성 용액에 용해하여 혼합용액을 제조하는 (a)단계; 및
    상기 혼합용액에 가교제를 첨가하여 가교시킨 다음 동결 건조시키는 (b)단계;를 포함하는 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법
  2. 제1항에 있어서,
    상기 동결 건조시킨 지지체에 UV가교와 가교제를 사용하여 2차 가교시키는 (c)단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 콜라겐은 아텔로 콜라겐으로 최종 용액의 0.1~1.0중량%가 되도록 첨가하는 것을 특징으로 하는 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법
  4. 제1항에 있어서,
    상기 가교제는 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether:EGDGE), 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether:BDDE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 디글리세롤폴리글리시딜에테르(diglycerol polyglycidyl ether), 및 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상인 것을 특징으로 하는 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 가교 반응의 조건은 25~35℃의 온도, 반응 시간은 10분~1시간으로 하는 것을 특징으로 하는 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (a)단계에서 산성용액의 pH는 3.0~4.0의 범위인 것을 특징으로 하는 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자 지지체의 제조방법
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