WO2021040141A1 - 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액 - Google Patents

동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액 Download PDF

Info

Publication number
WO2021040141A1
WO2021040141A1 PCT/KR2019/016067 KR2019016067W WO2021040141A1 WO 2021040141 A1 WO2021040141 A1 WO 2021040141A1 KR 2019016067 W KR2019016067 W KR 2019016067W WO 2021040141 A1 WO2021040141 A1 WO 2021040141A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
extracellular matrix
animal fat
igfb
derived
growth factor
Prior art date
Application number
PCT/KR2019/016067
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
신용우
노성래
국민철
김규병
설윤희
신지훈
Original Assignee
주식회사 도프
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 도프 filed Critical 주식회사 도프
Priority to US17/594,602 priority Critical patent/US20220202995A1/en
Priority to CN201980099721.3A priority patent/CN114286694B/zh
Publication of WO2021040141A1 publication Critical patent/WO2021040141A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/40—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. plant or animal extracts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L15/00—Chemical aspects of, or use of materials for, bandages, dressings or absorbent pads
    • A61L15/16—Bandages, dressings or absorbent pads for physiological fluids such as urine or blood, e.g. sanitary towels, tampons
    • A61L15/42—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L15/44—Medicaments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/54—Improvements relating to the production of bulk chemicals using solvents, e.g. supercritical solvents or ionic liquids

Definitions

  • the present invention relates to an animal fat-derived extracellular matrix and an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution, and more particularly, to an animal fat-derived extracellular matrix having very excellent biocompatibility and physiological functions.
  • the extracelluar matrix is a tissue that is mainly responsible for structural support of animals, and plays a very important role as a structural role as a simple intercellular linker and as a regulatory factor for cell physiology such as division, differentiation, and death of cells. can do.
  • the extracellular matrix consists of connective tissue fibers, intangible components, and extracellular fluid.
  • Connective tissue fibers are formed in a triple helix structure, and collagen and elastin are the main components, providing strength and elasticity to the extracellular matrix.
  • the intangible component is a proteoglycan, in which glycosaminoglycans (GAGs) and a core protein are bound, as the main component, and because of the negative charge, it combines with a large amount of water to form a gel in the extracellular matrix.
  • GAGs glycosaminoglycans
  • the extracellular fluid contains ions, fat, glucose, and amino acids, so that cells survive and perform specific functions, and physiological factors such as protease and growth factors exist.
  • Growth factor is a generic term for a polypeptide that promotes various cell division or growth differentiation.
  • Prior literature related to this includes a method for preparing a biocompatible porcine cartilage-derived extracellular matrix membrane with adjustable in vivo degradation rate and physical properties disclosed in Korean Patent No. 10-1772316 (announcement date: Aug. 29, 2017), and the extracellular matrix derived from porcine cartilage.
  • the present invention effectively extracts the extracellular matrix from animal fat, but increases biosafety and biocompatibility by decellularizing and degreasing, and containing a large amount of growth factors capable of regulating the physiological activity of cells, and preparation thereof. It is in providing a way.
  • the present invention provides an animal fat-derived extracellular matrix containing decellularized and degreased, and certain growth factors.
  • the decellularization and degreasing and the inclusion of growth factors may be performed through solvent extraction using a supercritical fluid.
  • solvent extraction using the supercritical fluid may increase biocompatibility by removing and sterilizing lipids remaining in the animal fat.
  • animal fat may be lung adipose tissue extracted through liposuction.
  • the growth factors are AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D.
  • the growth factor may be contained in 0.52 to 11.19 ng per 1 g of the extracellular matrix.
  • the present invention is decellularized and degreased through solvent extraction using a supercritical fluid, 0.1 to 5 parts by weight of an animal fat-derived extracellular matrix containing a certain growth factor; And it contains 95 to 99.9 parts by weight of the dispersion, it provides an animal fat-derived extracellular matrix preservation liquid, characterized in that the filtered.
  • the growth factors are AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, Consisting of PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D, filtered and per 1g of extracellular matrix It may contain 0.21 to 6.86 ng.
  • the growth factor may have a basic fibroblast growth factor (bFGF) content in the range of 40 to 50% through the filtration.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • biocompatibility is greatly increased by degreasing and decellularization, and an extracellular matrix capable of controlling the physiological activity of cells by containing growth factors and a method for producing the same is provided.
  • the extracellular matrix can be effectively obtained through a solvent extraction process using a supercritical fluid.
  • the extracellular matrix in which growth factors are preserved among the components of the extracellular matrix, and it is possible to expect the regulation of cell physiological activity by adjusting the content of growth factors, and it is possible to quickly induce tissue regeneration.
  • the structural characteristics of the extracellular matrix can be maintained as it is, a tissue structure mimetic that can be molded according to the shape of the implantation site can be easily manufactured.
  • the preservation solution containing the extracellular matrix prevents contamination and can be stored for a long time, and the handling property is increased, so that the utility of the extracellular matrix can be greatly increased.
  • FIG. 1 is a process flow diagram of a method for producing an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a process flow diagram of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to another embodiment of the present invention.
  • FIG 3 is an electrophoresis photograph according to the quantitative analysis of protein in an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix derived from animal fat according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a photograph of hematoxylin and eosin staining of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a scanning electron micrograph of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a photograph of an extracellular matrix sample, a 1 wt% dispersion, and an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution prepared by filtration according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing the result of an enzyme-linked immunosorbent assay based on VEGF of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the content of VEGF in a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment.
  • FIG. 10 is a graph showing the DNA content before and after filtration of a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment of the present invention.
  • 11 is an image according to the results of the cytokine antibody array before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 shows the types and intensity of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 shows the types and contents (ng/g) of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
  • the inventors of the present invention believe that conventional methods for extracting an extracellular matrix (ECM) from animal fat are mainly chemical treatment and biological treatment, as well as extracting and processing the extracellular matrix through radiation irradiation, thereby providing biosafety, biocompatible mechanical properties.
  • ECM extracellular matrix
  • the growth factor contained in the extracellular matrix has a problem that can be easily destroyed by chemical treatment, biological treatment, and radiation treatment, and the process uses a large amount of acids and enzymes, and radiation is used.
  • the risk of process control was large and the efficiency was greatly reduced, and thus it was not suitable for effectively obtaining an extracellular matrix.
  • solvent extraction using a supercritical fluid can be effectively extracted through a solvent in a supercritical state without physical change of the object to be extracted, thereby maintaining the mechanical performance properties of the object to be extracted, especially for animal fat under certain conditions.
  • fluid solvent extraction is applied, biostability and biocompatibility are greatly increased due to decellularization and degreasing, and the content of growth factor, which is a unique component of the extracellular matrix, is adjusted to create an extracellular matrix capable of controlling cell physiological activity.
  • the present invention was completed by confirming that it can be obtained effectively.
  • the animal fat-derived extracellular matrix according to the present invention is decellularized and degreased, and contains certain growth factors.
  • the animal fat may be pork fat, but it is preferable that it is lung fat extracted through liposuction.
  • the animal fat is not limited as long as it contains extracellular matrix in the tissue.
  • the decellularization and degreasing may be performed through solvent extraction using a supercritical fluid.
  • the solvent extraction using the supercritical fluid can decellularize and degrease the animal adipose tissue by controlling the pressure, the flow rate introduced into the animal fat tissue to be extracted, the reaction process temperature and time during the production of the supercritical fluid solvent.
  • Solvent extraction using the supercritical fluid may increase biocompatibility by removing and sterilizing blood remaining in the animal fat.
  • Solvent extraction using the supercritical fluid increases the solubility of the supercritical fluid in animal fat by adding ethanol as a co-solvent, while effectively removing and sterilizing blood and contaminants remaining in animal fat.
  • Solvent extraction using the supercritical fluid extracts the extracellular matrix from animal fat, and may contain a certain growth factor in the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix contains growth factors, it is possible to control the physiological activity of cells, and when injected into human tissues in the form of tissue repair materials, it is possible to induce tissue regeneration quickly.
  • the growth factors are AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P -3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF -AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D.
  • the extracellular matrix contains 40 kinds of growth factors excluding fibroblast growth factor-4 (FGF-4) among human growth factors through a solvent extraction process using a supercritical fluid.
  • FGF-4 fibroblast growth factor-4
  • the FGF-4 is removed in the process of decellularizing and degreasing animal fat by solvent extraction using a supercritical fluid, and the extracellular matrix according to an embodiment of the present invention is characterized in that the FGF-4 growth factor is excluded. do.
  • the growth factor may be contained in an amount of 0.52 to 11.19 ng per 1 g of the extracellular matrix.
  • the extracellular matrix obtained through the solvent extraction process using the supercritical fluid contains a certain amount or more of growth factor even after decellularization and degreasing, so that biocompatibility is greatly increased, as well as regulating the physiological activity of cells, and It can induce regeneration quickly.
  • the present invention is decellularized and degreased through solvent extraction using a supercritical fluid, 0.1 to 5 parts by weight of an animal fat-derived extracellular matrix containing a certain growth factor; And it provides an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution comprising 95 to 99.9 parts by weight of the dispersion, and filtered.
  • the extracellular matrix recovered by the solvent extraction method using a supercritical fluid can maintain mechanical properties, but it is not easy to manufacture various applications in a solid state.
  • the extracellular matrix recovered by the solvent extraction method using a supercritical fluid When the extracellular matrix recovered by the solvent extraction method using a supercritical fluid is contained within the above range, it can be stored for a long time without changing the content of the growth factor in the extracellular matrix.
  • the growth factors are AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P -3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF -AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 and VEGF-D.
  • the animal fat-derived extracellular matrix preservation solution contains 40 kinds of growth factors excluding fibroblast growth factor-4 (FGF-4) among human growth factors.
  • FGF-4 fibroblast growth factor-4
  • the growth factor may be filtered and contained in an amount of 0.21 to 6.86 ng per 1 g of the extracellular matrix.
  • the animal fat-derived extracellular matrix preservation solution is filtered to adjust the content of growth factors.
  • the filtration may prevent contamination of the preservative by removing proteins in the extracellular matrix, and may contain growth factors within the above range.
  • the animal fat-derived extracellular matrix preservation solution has a reduced content of growth factors within the above range compared to the animal fat-derived extracellular matrix content, but can effectively preserve the extracellular matrix and greatly increases its utility.
  • the dispersion may be deionized water.
  • the dispersion When the dispersion is selected as deionized water, contamination can be prevented when the extracellular matrix is dispersed, thereby increasing preservability.
  • the filtration may be filtered using a filter having a pore size of 0.2 to 0.45 ⁇ m.
  • the high molecular weight protein remaining in the extracellular matrix can be removed effectively to reduce the risk of contamination, the preservative can be sterilized, and the remaining DNA can be effectively removed.
  • the growth factor may have a basic fibroblast growth factor (bFGF) content in the range of 40 to 50% through the filtration.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the bFGF is included in or bound to a protein, and when the protein is removed by filtration in the preservation solution through the filtration, the content is reduced by filtering together.
  • the present invention provides a method for producing an extracellular matrix derived from animal fat.
  • FIG. 1 is a process flow diagram of a method for producing an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • (4) identifying a growth factor in the extracellular matrix includes.
  • the animal fat is washed and pulverized to prepare adipose tissue (S100).
  • the animal fat may be pork fat, but it is preferable that it is lung fat extracted through liposuction.
  • the animal fat is waste fat derived from the human body
  • contaminants such as residual blood may be removed through washing, and the efficiency of centrifugation may be increased in a subsequent step in the case of pulverization.
  • the prepared adipose tissue is centrifuged and pretreated by removing moisture and lipids (S110).
  • Animal fat can be separated into water in the lower layer and lipid in the upper layer through the centrifugation.
  • solvent extraction process using a supercritical fluid The efficiency can be greatly increased.
  • the adipose tissue pretreated by solvent extraction using a supercritical fluid is decellularized and degreased to recover the extracellular matrix (S120).
  • Solvent extraction using the supercritical fluid may change the solvent extraction conditions in order to decellularize and degrease the adipose tissue.
  • the solvent extraction using the supercritical fluid is prepared as a supercritical fluid by pressurizing carbon dioxide at 200 to 600 bar, and the supercritical fluid at a flow rate of 18 to 70 mL/min, 30 to 35°C
  • the extracellular matrix can be extracted by infiltrating the animal fat for 2 to 12 hours at.
  • the supercritical fluid produced by being pressurized within the above range can penetrate the cell wall of adipose tissue and dissolve the intracellular lipids to degrease, and when penetrating into the adipose tissue at a flow rate within the above range, Cells and can be degreased.
  • Decellularized and degreased extracellular matrix can be effectively obtained by the solvent extraction process using the supercritical fluid, and growth factors present in the extracellular fluid among the extracellular matrix can also be retained in a large amount.
  • an extracellular matrix containing a large amount of growth factors capable of controlling the physiological activity of cells and rapidly inducing tissue regeneration can be obtained.
  • Confirmation of the growth factor is the level of any one growth factor selected from the group consisting of VEGF, bFGF, IGF-1 and EGF among the growth factors by enzyme-linked immunosorbent assay to confirm the content of growth factors.
  • I can.
  • the enzyme-linked immunosorbent assay is very preferable because it is possible to confirm the content of growth factors contained in the extracellular matrix based on any one growth factor selected from the group consisting of VEGF, bFGF, IGF-1, and EGF. As long as it is a method by which the content can be checked, it is not particularly limited.
  • the present invention provides a method for preparing an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution.
  • FIG. 2 is a process flow diagram of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to another embodiment of the present invention.
  • the animal fat tissue is washed and pulverized to prepare adipose tissue (S200).
  • the prepared adipose tissue is centrifuged to remove moisture and lipids to pretreat (S210).
  • the adipose tissue pretreated by solvent extraction using a supercritical fluid is decellularized and degreased to recover the extracellular matrix (S220).
  • the recovered extracellular matrix is dispersed in deionized water to prepare a dispersion (S230).
  • the dispersion is prepared by dispersing in the deionized water, subsequent filtration is easy, and the content of the growth factor can be easily checked to prepare an extracellular matrix preservation solution.
  • the dispersion may be dispersed at 15° C. at a pressure of 15,000 to 25,000 psi using a high pressure homogenizer.
  • the mechanical properties of the extracellular matrix can be maintained, and proteins remaining in the extracellular matrix can be eluted and dispersed into the dispersion.
  • dispersion may be repeated 1 to 5 times depending on the suspended state.
  • the dispersion is filtered (S240).
  • the dispersion is a suspension, there is a risk of contamination and infection because proteins of the extracellular matrix remain.
  • the filtration may be performed by passing the dispersion through a syringe filter having a pore size of 0.2 to 0.45 ⁇ m.
  • the filter within the pore size, proteins remaining together with the extracellular matrix can be effectively removed, the preservation liquid can be maintained in a sterile state, and the remaining DNA can be effectively removed.
  • the growth factor may have a basic fibroblast growth factor (bFGF) content in the range of 40 to 50% through the filtration.
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • the bFGF is contained or bound to a protein, and when the protein is filtered and removed in the preservative through the filtration, the content is reduced by filtering together, so it can be confirmed that the protein in the preservative is removed by confirming the decrease in the content of bFGF.
  • An animal fat-derived extracellular matrix preservation solution with increased biosafety can be prepared.
  • the output of the ultrasonic wave was adjusted to 70% amplitude at 400 W, and the fat was crushed for 6 minutes to obtain adipose tissue.
  • the adipose tissue was maintained at 3° C. using a chiller during sonication.
  • the sonicated adipose tissue was transferred to a centrifuge, centrifuged at 4,000 rpm for 20 minutes, and the water in the lower layer and the lipid in the upper layer were separated and removed.
  • the solid content of the intermediate layer was recovered and placed in the reactor.
  • the reactor was provided with a carbon dioxide cylinder on one side, a cooler and a pump along a line through which carbon dioxide was discharged to pressurize carbon dioxide to prepare a solvent as a supercritical fluid.
  • One side of the carbon dioxide cylinder is provided with an ethanol tank as a common solvent, and a pump is provided in the line through which ethanol is discharged, and the ethanol is joined to the solvent, which is the supercritical fluid, to increase the solubility of the solvent, and to remove contaminants remaining in adipose tissue. It was sterilized and adjusted to exhibit a sterilization effect.
  • the solvent was extracted by introducing a solvent mixed with ethanol as a co-solvent and pressurized to 300 bar into the reactor at a flow rate of 20 mL/min at 32°C.
  • the extraction time was performed from 2 hours to 12 hours, and after the extraction was completed, the vent of the trap chamber provided in the reactor was opened to evaporate and remove the solvent to obtain an extracellular matrix as a white solid.
  • BCA Protein quantitative analysis
  • the total amount of the injected protein was adjusted to 70 ug, and then electrophoresis was performed.
  • FIG 3 is an electrophoresis photograph according to the quantitative analysis of protein in an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • the marker, the fat sample before extraction, and the two samples after extraction were maintained without any change in the band even after extraction.
  • FIG. 4 is a graph showing the amount of DNA remaining in the extracellular matrix derived from animal fat according to an embodiment of the present invention.
  • Table 1 shows the amount of DNA remaining in the extracellular matrix according to the solvent extraction time in the solvent extraction using the supercritical solvent of animal fat. 4 and Table 1, when supercritical extraction was performed for 2 hours, the DNA content was confirmed to be about 70 ng/mg, but when supercritical extraction was performed for 12 hours, the remaining amount of DNA was about 35 ng/mg. As shown, it was confirmed that the DNA content that can cause an immune response can be effectively reduced, and that the intracellular nucleus is destroyed and decellularized.
  • FIG. 5 is a photograph of hematoxylin and eosin staining of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • the cell nucleus could not be observed in the extracellular matrix, and it was confirmed that the cell did not maintain its morphology and thus decellularized.
  • FIG. 6 is a scanning electron micrograph of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • a cell picture of the adipose tissue before extraction is shown on the left on the left, and a scanning electron microscope picture of the tissue after extraction is shown on the right. Shown in.
  • the extracellular matrix sample obtained in Example 1 was added to deionized water in an amount of 1 wt%, mixed, and dispersed at 15° C. at a pressure of 20,000 psi using a high-pressure homogenizer.
  • Dispersion was repeated 5 times to prepare a dispersion.
  • the prepared dispersion was filtered using a syringe filter having a pore size of 0.2 ⁇ m to prepare a transparent animal fat-derived extracellular matrix preservation solution.
  • FIG. 7 is a photograph of an extracellular matrix sample, a 1 wt% dispersion, and an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution prepared by filtration according to an embodiment of the present invention.
  • an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution in a transparent liquid state could be prepared by dispersing an extracellular matrix sample.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay was performed to confirm whether the extracellular matrix obtained according to Example 1 contained growth factors.
  • a 1 wt% dispersion prepared according to Example 2 was prepared, and a washing solution was added to each of the plate wells to be used for washing.
  • the standard solution (Standard) and the sample (Sample) were put into each well and reacted at room temperature for 2 hours.
  • Each well was injected with a detection antibody, incubated at room temperature for 2 hours, and washed.
  • Streptavidin-HRP was injected, incubated for 30 minutes at room temperature, and then washed again.
  • FIG. 8 is a graph showing the result of an enzyme-linked immunosorbent assay based on VEGF of an animal fat-derived extracellular matrix according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a graph showing the content of VEGF in a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment.
  • the DNA content of the preservative according to Example 2 was analyzed before and after filtration.
  • FIG. 10 is a graph showing the DNA content before and after filtration of a dispersion in which an animal fat-derived extracellular matrix is dispersed according to an embodiment of the present invention.
  • Example 1 In order to confirm that the extracellular matrix according to Example 1 contains a large amount of various growth factors, analysis was performed using a Human Growth Factor Antibody Array membrane and Abcam kit.
  • the sample was processed according to the protocol of the kit, and diluted to 1/10 in order to control the concentration of protein present in the sample.
  • a 1 wt% dispersion (Control) and a filter solution were prepared by diluting 1/10, and the membrane (Membrane) was washed with a washing buffer and then blocked at room temperature for 30 minutes.
  • the diluted analysis target solution was applied to a membrane, and after incubation at 4° C. for 24 hours, the analysis target solution was removed with an aspirator.
  • the remaining analysis target solution was washed with a buffer solution, Biotin-Conjugated Anti-Cytokine was injected at room temperature, and after incubation for 2 hours, the liquid was removed and the residue was washed.
  • HRP-Conjugated Streptavidin was injected at room temperature, and after incubation for 2 hours, the liquid was removed and the residue was washed.
  • 11 is an image according to the results of the cytokine antibody array before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
  • the intensity of the signal for the antibody in the image measured through the cytokine array was measured to determine the relative value of how much the corresponding substance was contained in the sample.
  • FIG. 12 shows the types and intensity of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
  • a total of 40 growth factors can be identified in the extracellular matrix obtained through solvent extraction using a supercritical fluid, and the growth factor content decreases after filtration of the preservative containing the extracellular matrix. It was confirmed.
  • FIG. 13 shows the types and contents (ng/g) of growth factors before and after filtration of an animal fat-derived extracellular matrix preservation solution according to an embodiment of the present invention.
  • the extracellular matrix according to Example 1 contains a total of 40 growth factors out of 41 human growth factors, and FGF-4 is removed in the solvent extraction process using a supercritical fluid. .
  • the animal fat-derived extracellular matrix preservative solution prepared according to Example 2 was 0.21 to 6.86 ng per 1 g of extracellular matrix, and it was confirmed that the growth factor was decreased by filtration, and the content of the growth factor in the preservative solution could be adjusted. .
  • bFGF Basic fibroblast growth factor
  • the inventors of the present invention note that a large amount of human fat is discarded according to the recently increased liposuction, and while seeking a way to utilize it, the extraction conditions were adjusted by using a solvent extraction method using a supercritical fluid in adipose tissue. In this case, it was confirmed that the extracellular matrix with increased biosafety and biocompatibility can be obtained by decellularizing and degreasing while maintaining the mechanical properties of the extracellular matrix.
  • biocompatibility is greatly increased by degreasing and decellularization, and an extracellular matrix capable of controlling the physiological activity of cells by containing growth factors and a method for producing the same is provided.
  • the extracellular matrix can be effectively obtained through a solvent extraction process using a supercritical fluid.
  • the extracellular matrix in which growth factors are preserved among the components of the extracellular matrix, and it is possible to expect the regulation of cell physiological activity by adjusting the content of growth factors, and it is possible to quickly induce tissue regeneration.
  • the structural characteristics of the extracellular matrix can be maintained as it is, a tissue structure mimetic that can be molded according to the shape of the implantation site can be easily manufactured.
  • the preservation solution containing the extracellular matrix prevents contamination and can be stored for a long time, and the handling property is increased, so that the utility of the extracellular matrix can be greatly increased.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 탈지 및 탈세포화 되어 생체적합성이 매우 증가되고, 성장인자가 함유되어 세포의 생리활성을 조절할 수 있는 세포외기질 및 이의 제조방법을 제공한다. 또한 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있으며, 세포외기질을 함유하는 보존액은 오염을 방지하여 장시간 보존이 가능하며, 취급성이 증가되어 세포외기질의 활용성을 매우 증가시킬 수 있다.

Description

동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액
본 발명은 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액 에 관한 것으로 보다 상세하게는 매우 우수한 생체 적합성과 생리적 기능을 가지는 동물지방 유래 세포외기질에 관한 것이다.
세포외기질(Extracelluar matrix)은 주로 동물의 구조적 지지 등을 담당하는 조직으로, 단순한 세포 간 연결체로서 구조적인 역할과 함께 세포의 분열과 분화 그리고 사멸과 같은 세포생리 조절인자로 매우 중요한 역할을 수행할 수 있다.
세포외기질은 결합조직섬유와 무형질의 성분, 세포외액으로 이루어진다.
결합조직섬유는 3중 나선구조로 형성되며, 콜라겐과 엘라스틴이 주성분으로 세포외기질에 강도와 탄성을 제공한다.
무형질 성분은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans; GAGs)과 단백질(core protein)이 결합한 프로테오글리칸(proteoglycan)이 주 성분으로 음의 전하 때문에 다량의 물과 결합하여 세포외기질에 겔을 형성한다.
이러한 결합조직섬유와 무형질의 성분은 세포외기질의 완충작용을 돕는다.
세포외액은 이온과 지방, 글루코즈, 아미노산 등이 있어서 세포들이 생존하고 특정기능을 수행하게 하는데 프로타제(protease), 성장인자(growth factor) 등의 생리인자가 존재한다.
성장인자는 각종 세포 분열이나 생장 분화를 촉진하는 폴리펩티드의 총칭이다.
여러 종류가 발견되었으며, 기능도 다양하고, 세포의 신호전달계에 관여하는 것으로 알려져 있다.
생물체의 기본적 구성성분이 되는 영양물질 이외에 세포의 증식, 생물체의 증식 및 발육에 필요한 물질로서 세포가 성장하고 분화하는데 필수적 요소이다.
이를 저장하고 적절하게 공급해 주고 세포가 인식할 수 있는 물리적 환경을 제공할 수 있으면 세포의 생존, 성장, 이동 및 분화 등을 매우 촉진시킬 수 있다.
이러한 세포외기질의 특성을 이용하여 최근에는 세포외기질로부터 유래한 생물지지체 재료가 조직공학과 재생의학에서 널리 이용되고 있다.
특히 세포외기질을 이용한 조직수복제, 드레싱 밴드 등 다양한 생체소재들이 소개되고 있으나, 현재 상용화된 제품은 세포외기질의 일부 구성 성분만을 이용하고 있다.
세포외기질을 추출하기 위하여 다양한 화학적 생물학적 방법이 개발되었으나, 동물 지방조직을 통한 추출과정에서 세포의 생리활성에 가장 중요한 성장인자(growth factor)를 손실하지 않고 그대로 함유하는 세포외기질은 아직 공개된 바가 없다.
이와 관련된 선행문헌으로는 대한민국 특허 제 10-1772316호 (공고일: 2017.08.29.)에 개시된 생체 내 분해속도 및 물성 조절 가능한 생체적합성 돼지연골 유래 세포외기질 막 제조방법 및 상기 돼지연골 유래 세포외기질을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물이 있다.
따라서, 본 발명은 동물지방으로부터 세포외기질을 효과적으로 추출하되 탈세포 및 탈지시켜 생체안전성 및 생체적합성을 증가시키고, 세포의 생리활성을 조절할 수 있는 성장인자를 다량으로 함유하는 세포외기질 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제(들)로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제(들)는 이하의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 본 발명은 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질을 제공한다.
또한 상기 탈세포 및 탈지와 성장인자의 함유는 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수행될 수 있다.
또한 상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 상기 동물지방에 잔류된 지질을 제거하고, 멸균시켜 생체적합성을 증가시킬 수 있다.
또한 상기 동물지방은 지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방조직일 수 있다.
또한 상기 성장인자는 AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어질 수 있다.
또한 상기 성장인자는 세포외기질 1 g 당 0.52 내지 11.19 ng으로 함유될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질 0.1 내지 5 중량부; 및 분산액95 내지 99.9 중량부로 포함하고, 여과된 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제공한다.
또한 상기 성장인자는 AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어지며, 여과되어 세포외기질 1g 당 0.21 내지 6.86 ng으로 함유될 수 있다.
또한 상기 성장인자는 상기 여과를 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소될 수 있다.
본 발명에 따르면, 탈지 및 탈세포화 되어 생체적합성이 매우 증가되고, 성장인자가 함유되어 세포의 생리활성을 조절할 수 있는 세포외기질 및 이의 제조방법을 제공한다.
또한 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있다.
또한 산, 효소처리 및 방사선 처리하지 않아도 멸균되어 세포외기질의 생체안전성을 증가시킬 수 있으며, 탈세포 및 탈지되어 생체적합성을 증가시킬 수 있다.
또한 세포외기질의 성분 중 성장인자가 보존된 세포외기질을 제공하며, 성장인자의 함량을 조절하여 세포 생리활성의 조절을 기대할 수 있으며, 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있다.
또한 세포외기질의 구조적 특성을 그대로 유지할 수 있어서, 이식 부위의 형태에 따라 성형이 가능한 조직 구조 모사체를 쉽게 제조할 수 있다.
또한 인체유래 폐지방을 효과적으로 처리하여 세포외기질을 효과적으로 추출하여 제공할 수 있다.
또한 세포외기질을 함유하는 보존액은 오염을 방지하여 장시간 보존이 가능하며, 취급성이 증가되어 세포외기질의 활용성을 매우 증가시킬 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 특허청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 제조방법의 공정흐름도이다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 공정흐름도이다.
도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 단백질 정량분석에 따른 전기영동 사진이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 DNA잔존량을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 헤마톡실린 및 에오진 염색사진이다
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 주사전자현미경 사진이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외기질 시료, 1 wt% 분산액 및 여과되어 제조된 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 사진이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 VEGF 기준 효소 결합 면역 흡착 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액 내의 VEGF 함량을 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액의 여과 전후의 DNA함량을 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 싸이토카인 항체 어레이 결과에 따른 이미지이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 선명도(intensity)를 나타낸 것이다.
도 13 은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 함량(ng/g)을 나타낸 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것을 달성하는 방법은 첨부된 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다.
그러나 본 발명은 이하에 개시되는 실시예들에 의해 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
또한, 본 발명을 설명함에 있어 관련된 공지 기술 등이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그에 관한 자세한 설명은 생략하기로 한다.
본 발명의 발명자들은 종래 동물지방에서 세포외기질(extracellular matrix; ECM) 을 추출하는 방법들이 주로 화학적 처리 및 생물학적 처리와 함께 방사선 조사를 통하여 세포외기질을 추출하고 처리하여 생체안전성, 생체적합성 기계적 성질 등의 물성을 증가시키고 있으나, 세포외기질이 함유하는 성장인자는 화학적 처리, 생물학적 처리 및 방사선처리에 따라 쉽게 파괴될 수 있는 문제가 있으며, 해당 공정은 다량의 산과 효소를 사용하고, 방사선을 사용하여 공정 제어의 위험성이 크고 효율이 매우 감소되어 세포외기질을 효과적으로 수득하기에 적합하지 않는 것을 확인하였다.
한편 초임계유체를 이용한 용매추출은 초임계상태의 용매를 통하여 추출대상의 물리적 변화 없이 효과적으로 추출하여 추출대상의 기계적 성질(mechanical performance properties)을 유지할 수 있으며, 특히 동물지방에 대하여 일정 조건으로 초임계유체 용매추출을 적용하는 경우 탈세포 및 탈지되어 생체안정성 및 생체적합성이 매우 증가되고, 세포외기질의 특유 성분인 성장인자(growth factor)의 함량이 조절되어 세포 생리활성의 조절이 가능한 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 동물지방 유래 세포외기질은 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유한다.
상기 동물지방은 돼지 지방일 수 있으나, 지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방인 것이 바람직하다.
최근 미용성형을 위한 지방흡입술이 다수 시행되고 있어서 다량의 인체 유래 지방을 획득할 수 있으나, 이러한 지방흡입술에서 줄기세포 및 세포외기질의 유용 물질을 추출하는 경우에는 혈액, 지질 등 불필요한 성분이 함유되어 있어 추출된 인체 지방은 활용이 어렵기 때문에 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 탈세포 및 탈지하여 생체안정성 및 생체적합성을 증가시키는 경우에는 안전하고 효과적으로 인체 이식이 가능하다.
상기 동물지방은 조직 내에 세포외기질을 포함하는 것이면 제한되지 않는다.
상기 탈세포 및 탈지는 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수행될 수 있다.
상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 초임계유체 용매 제조 시 압력, 추출대상인 동물지방 조직에 도입하는 유량, 반응 공정 온도 및 시간이 조절되어 상기 동물지방 조직을 탈세포 및 탈지할 수 있다.
상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 상기 동물지방에 잔류된 혈액을 제거하고, 멸균시켜 생체적합성을 증가시킬 수 있다.
상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 에탄올을 공용매로 첨가하여 동물지방에 대한 초임계유체의 용해도를 증가시키는 한편 동물지방에 잔류하는 혈액 및 오염물질을 효과적으로 제거하고 멸균할 수 있다.
상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 동물지방에서 세포외기질을 추출하며, 상기 세포외기질에서 일정 성장인자가 함유되도록 할 수 있다.
상기 세포외기질이 성장인자를 함유하는 경우에는 세포 생리활성의 조절이 가능하며, 조직수복재 등의 형태로 인체 조직에 투입되는 경우 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있다.
상기 성장인자는 AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어진다.
상기 세포외기질은 초임계유체를 이용한 용매추출 과정을 통하여 인체 성장인자(human growth factor) 중 FGF-4(fibroblast Growth Factor-4)를 제외한 40가지의 성장인자를 함유한다.
상기 FGF-4는 동물지방을 초임계유체를 이용한 용매추출에 따라 탈세포 및 탈지하는 과정에서 제거되며, 본 발명의 실시예에 따른 세포외기질은 상기 FGF-4성장인자가 배제된 것을 특징으로 한다.
상기 성장인자는 세포외기질 1 g 당 0.52 내지 11.19 ng으로 함유될 수 있다.
상기 초임계유체를 이용한 용매추출 과정을 통하여 수득한 세포외기질은 탈세포 및 탈지하여도 일정 함량 이상의 성장인자를 함유하여 생체적합성이 매우 증가될 뿐만 아니라, 세포의 생리활성을 조절하고, 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있다.
상기 동물지방을 상기 초임계유체를 이용한 용매추출 과정이 아닌 산, 효소 처리 및 방사선 처리를 통하여 회수하는 경우 상기 40 종의 성장인자를 모두 회수하기 어려우며, 특히 효소처리 방법은 펩타이드인 성장인자를 쉽게 분해하여 상기 범위 내의 유효 함량을 가지는 세포외기질을 수득할 수 없다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질 0.1 내지 5중량부; 및 분산액 95내지 99.9 중량부로 포함하고, 여과된 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제공한다.
초임계유체를 이용한 용매추출방법으로 회수된 세포외기질은 기계적 특성을 유지할 수 있으나, 고체 상태로 다양한 어플리케이션(applications)을 제조하기에 용이하지 않다.
상기 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수득한 세포외기질을 분산액에 분산시키고 여과하는 경우 분자량이 높은 단백질 제거에 의한 생체안전성 및 생체적합성이 증가되고, 0.1 내지 5 wt% 이하의 세포외기질을 분산액에 분산시켜 취급성이 증가되고 활용성이 매우 증가된다.
상기 범위 내로 초임계유체를 이용한 용매추출방법으로 회수된 세포외기질을 함유하는 경우 세포외기질 내의 성장인자의 함량을 변화시키지 않고 장시간 보존이 가능하다.
상기 성장인자는 AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어진다.
상기 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 인체 성장인자(human growth factor) 중 FGF-4(fibroblast Growth Factor-4)를 제외한 40가지의 성장인자를 함유한다.
상기 성장인자는 여과되어 세포외기질 1g 당 0.21 내지 6.86 ng으로 함유할 수 있다.
상기 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 여과되어 성장인자의 함량이 조절된다.
상기 여과는 세포외기질 내의 단백질을 제거하여 보존액이 오염되는 것을 방지할 수 있으며, 상기 범위 내로 성장인자를 함유할 수 있다.
상기 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 동물지방 유래 세포외기질 함량 대비 상기 범위 내로 성장인자 함량이 감소되나, 세포외기질을 효과적으로 보존할 수 있으며, 활용성을 크게 증가시킨다.
상기 분산액은 탈이온수일 수 있다.
상기 분산액을 탈이온수로 선택하는 경우 세포외기질을 분산시킬 때 오염을 방지하여 보존성을 증가시킬 수 있다.
상기 여과는 0.2내지 0.45 ㎛ 포어 사이즈(pore sizes)의 필터를 사용하여 여과된 것일 수 있다.
상기 범위 내의 필터를 이용하여 세포외기질에 잔류하는 분자량이 높은 단백질을 제거하여 오염 위험성을 효과적으로 감소시킬 수 있고, 보존액을 멸균할 수 있으며, 잔존하는 DNA를 효과적으로 제거할 수 있다.
상기 범위를 벗어나는 경우 보존액 중에 성장인자의 감소되거나, 단백질 외에 세포외기질이 함께 제거될 우려가 있으며, 감염 위험 및 DNA가 잔존하여 생체적합성을 감소시킬 우려가 있다.
상기 성장인자는 상기 여과를 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소될 수 있다.
상기 bFGF 는 단백질에 포함되거나 결합되어 있으며, 상기 여과를 통하여 보존액 중에 단백질을 여과하여 제거하는 경우 함께 여과되어 함량이 감소된다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 동물지방 유래 세포외기질 제조방법을 제공한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 제조방법의 공정흐름도이다.
도 1을 참조하면, 동물지방 유래 세포외기질 제조방법은,
(1) 동물지방을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비하는 단계;
(2) 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리 하는 단계;
(3) 초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수하는 단계; 및
(4) 상기 세포외기질에서 성장인자를 확인하는 단계;를 포함한다.
우선 동물지방을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비한다(S100).
상기 동물지방은 돼지 지방일 수 있으나, 지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방인 것이 바람직하다.
상기 동물지방이 인체에서 유래된 폐지방인 경우에는 세척을 통하여 잔류된 혈액과 같은 오염물질을 제거할 수 있고, 분쇄하는 경우에 이후의 단계에서 원심분리의 효율을 증가시킬 수 있다.
준비된 상기 지방조직(adipose tissue)을 원심분리하고 수분과 지질을 제거하여 전처리 한다(S110).
상기 원심분리를 통하여 동물지방을 하층의 수분과 상층의 지질로 분리할 수 있으며, 하층의 수분 및 상층의 지질을 제거하여 중층의 고형분을 용매추출 하는 경우 이후의 초임계유체를 이용한 용매추출과정의 효율을 크게 증가시킬 수 있다.
초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수한다(S120).
상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하기 위하여 용매추출 조건을 변경할 수 있다.
본 발명의 일시예에서 상기 초임계유체를 이용한 용매추출은 이산화탄소를 200 내지 600 bar로 가압하여 초임계유체로 제조하고, 상기 초임계유체를 18 내지 70 mL/min의 유량으로, 30 내지 35 ℃에서 2 내지 12시간 동안 상기 동물지방에 침투시켜 세포외기질을 추출할 수 있다.
상기 범위로 가압되어 제조된 초임계유체는 지방조직의 세포벽을 침투하여 세포 내 지질을 용해시켜 탈지시킬 수 있으며, 상기 범위 내의 유량으로 지방조직에 침투시키는 경우 세포외기질의 기계적 특성을 유지시키면서, 탈세포 및 탈지시킬 수 있다.
상기 초임계유체를 이용한 용매추출과정은 지방조직에 잔류된 오염물질이 한 번 더 제거되어 오염방지 및 멸균 효과가 증대된다.
상기 세포외기질에서 성장인자를 확인한다(S130).
상기 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 탈세포 및 탈지된 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있으며, 세포외기질 중 세포외액에 존재하는 성장인자 또한 다량으로 잔류시킬 수 있다.
상기 성장인자의 확인과정을 통하여 세포의 생리활성을 조절하고, 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있는 성장인자가 다량으로 함유되어 있는 세포외기질을 수득할 수 있다.
상기 성장인자의 확인은 성장인자 중 VEGF, bFGF, IGF-1 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 성장인자의 수준을 효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent assay)으로 성장인자의 함량을 확인할 수 있다.
상기 효소 결합 면역 흡착 분석은 VEGF, bFGF, IGF-1 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 성장인자를 기준으로 세포외기질이 함유하는 성장인자의 함량을 확인할 수 있어서 매우 바람직하나, 성장인자의 함량을 확인할 수 있는 방법이면 특별하게 제한되지는 않는다.
한편 본 발명의 다른 측면에 따르면, 본 발명은 동물지방 유래 세포외기질 보존액 제조방법을 제공한다.
도 2는 본 발명의 다른 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 공정흐름도이다.
도 2를 참조하면, 동물지방 유래 세포외기질 보존액 제조방법은
(a) 동물지방을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비하는 단계;
(b) 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리 하는 단계;
(c) 초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수하는 단계;
(d) 회수된 세포외기질을 탈이온수에 분산시켜 분산액을 제조하는 단계;
(e) 상기 분산액을 여과하는 단계; 및
(f) 상기 여과된 분산액 중의 성장인자 함량을 확인하는 단계;를 포함한다.
우선 동물지방 조직을 세척하고 분쇄하여 지방조직을 준비한다(S200).
준비된 상기 준비된 상기 지방조직을 원심분리 하여 수분과 지질을 제거하여 전처리한다(S210).
초임계유체를 이용한 용매추출로 전처리된 상기 지방조직을 탈세포 및 탈지하여 세포외기질을 회수한다(S220).
상기 S200 내지 S220은 동물지방 유래 세포외기질 제조방법과 동일한 과정이므로 이하에서 반복되는 설명은 생략하기로 한다.
회수된 상기 세포외기질을 탈이온수에 분산시켜 분산액을 제조한다(S230).
상기 탈이온수에 분산시켜 분산액을 제조하는 경우 이후의 여과가 용이하고, 성장인자의 함량을 쉽게 확인하여 세포외기질 보존액을 제조할 수 있다.
상기 분산은 고압 호모게나이저(High pressure homogenizer)를 사용하여 15 ℃에서 15,000 내지 25,000 psi의 압력으로 분산할 수 있다.
상기 범위 내에서 분산하는 경우 세포외기질의 기계적 특징을 유지하고 세포외기질에 잔류된 단백질이 용출되어 분산액 내로 분산되게 할 수 있다.
이 때 분산은 현탁 상태에 따라 1 내지 5회 반복 수행할 수 있다.
상기 분산액을 여과한다(S240).
상기 분산액은 현탁액으로 세포외기질의 단백질이 잔류되어 있기 때문에 오염 및 감염의 위험이 존재한다.
상기 여과를 통하여 잔류된 단백질을 제거하여 세포외기질 보존액의 오염 및 감염을 방지하여 생체안전성을 증가시킬 수 있으며, 취급성 및 활용성 또한 증가시킬 수 있다.
상기 여과는 상기 분산액을 0.2내지 0.45 ㎛ 포어 사이즈(pore sizes)의 시린지 필터를 통과시켜 여과할 수 있다.
상기 포어 사이즈 내의 필터를 이용하여 세포외기질과 함께 잔류하는 단백질을 효과적으로 제거할 수 있으며, 보존액을 멸균상태로 유지시킬 수 있고, 잔존하는 DNA를 효과적으로 제거할 수 있다.
상기 범위를 벗어나는 경우에는 세포외기질 함량이 감소되어 성장인자가 감소되거나 감염 위험으로 멸균할 수 없으며 잔존하는 DNA 제거가 어렵다.
상기 여과된 분산액 중의 성장인자 함량을 확인한다(S250).
상기 여과를 통하여 상기 성장인자는 상기 여과를 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소될 수 있다.
상기 bFGF 는 단백질에 포함되거나 결합되어 있으며, 상기 여과를 통하여 보존액 중에 단백질을 여과하여 제거하는 경우 함께 여과되어 함량이 감소되기 때문에 상기 bFGF의 함량 감소를 확인하여 보존액 내의 단백질이 제거되는 것을 확인할 수 있으며, 생체안전성이 증가된 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 초임계유체 추출 세포외기질
동물지방으로부터 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 세포외기질을 수득하기 위하여 지방흡입술과정에서 수득한 폐지방을 오염 방지 처리하여 이송한 이후에 지방에 포함된 혈액을 육안으로 완전하게 씻겨 낼 정도로 분액 깔대기를 이용하여 탈이온수를 충분히 주입하여 혼합 후 20분 방치하여 세척하였다. 총 5회 세척을 실시하였다.
세척한 지방을 1000 mL를 플라스크에 담고 교반기를 이용하여 50 rpm으로 분산시킨 후 펌프(120 rpm 펌핑)를 사용하여 일정한 유속으로 초음파 처리 장치를 통과하도록 하여, 전체 지방에 균일하게 초음파가 투과될 수 있도록 하였다.
상기 초음파의 출력은 400 W에서 진폭 70 %로 조절하여 6 분 동안 지방을 분쇄하여 지방조직을 수득하였다.
초음파 처리 동안 칠러(chiller)를 사용하여 지방조직을 3 ℃로 유지하였다.
초음파 처리한 지방조직을 원심분리기로 옮겨 4,000 rpm으로 20 분 동안 원심분리하고 하층의 수분과 상층의 지질을 분리하여 제거하였다.
중층의 고형분을 회수하여 반응기에 배치하였다.
상기 반응기는 일측에 이산화탄소 실린더가 구비되고, 이산화탄소가 배출되는 라인을 따라 냉각기와 펌프가 구비되어 이산화탄소를 가압하여 초임계유체인 용매를 제조하였다.
상기 이산화탄소 실린더 일측에는 공용매인 에탄올 탱크가 구비되고, 에탄올이 배출되는 라인에는 펌프가 구비되어, 상기 에탄올은 상기 초임계유체인 용매에 합류되어 용매의 용해도를 증가시키고, 지방조직에 잔류된 오염물질을 소독하여 멸균 효과를 나타낼 수 있도록 조절하였다.
상기 반응기에 300 bar로 가압되고 공용매인 에탄올과 혼합된 용매를 32 ℃에서 20 mL/min의 유량으로 도입하여 용매추출하였다.
추출시간을 2 시간에서 12 시간까지 수행하고, 추출이 완료된 이후에 반응기에 구비된 트랩챔버의 벤트를 개방하여 용매를 증발시켜 제거하여 흰색 고형분인 세포외기질을 수득하였다.
실험예 1. 세포외기질 물성
초임계유체를 이용한 용매추출에 의하여 수득한 세포외기질에서 단백질 함량을 확인하기 위하여 단백질 정량분석(Bicinchonic Acid Assay; BCA)을 수행하였다.
단백질 정량분석 방법에 따라 전체적으로 주입한 단백질의 함량을 70 ug으로 맞춘 후, 전기영동을 수행하였다.
도 3 은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 단백질 정량분석에 따른 전기영동 사진이다.
도 3을 참조하면, 좌측부터 마커, 추출 전 지방시료, 추출 후 시료 2종이며 추출 후에도 밴드(Band)의 변화가 없이 유지 되었다.
동일한 양의 단백질을 주입했을 때 Band가 유지되므로 초임계 추출 후 탈지되고, 단백질은 변화 없이 유지된 것을 확인하였다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 DNA잔존량을 나타낸 그래프이다.
추출시간 DNA 함량(ng/mg)
2 시간 70.72211
6 시간 31.07875
12 시간 35.60731294
상기 표 1은 동물지방의 초임계용매를 이용한 용매추출에 있어서 용매추출 시간에 따라 세포외기질에 잔존하는 DNA의 함량을 나타낸 것이다. 도 4 및 표1을 참조하면, 2시간 동안 초임계추출을 진행하는 경우 DNA 함량이 약70 ng/mg으로 확인되었으나, 12 시간 동안 초임계추출을 진행하는 경우 약 35 ng/mg의 DNA 잔존량을 나타내어, 면역반응을 일으킬 수 있는 DNA함량을 효과적으로 감소시킬 수 있으며, 세포 내 핵이 파괴되어 탈세포화 된 것을 확인하였다.
한편 초임계유체를 이용한 용매추출에 의하여 수득한 세포외기질이 탈세포화된 것을 확인하기 위하여 헤마톡실린 및 에오진 염색(Hematoxylin and E osin staining)을 수행하였다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 헤마톡실린 및 에오진 염색사진이다.
도 5를 참조하면, 초임계유체를 이용한 용매추출의 효과를 비교하기 위하여 초임계추출 전 지방조직의 염색사진을 좌측에 나타내고 초임계유체를 이용한 용매추출 후 수득한 세포외기질의 염색사진을 우측에 나타내었다.
초임계유체를 이용한 용매추출 후 세포외기질에서는 세포핵을 관찰할 수 없었고 세포가 형태를 유지하지 못하고 있는 것을 확인하여 탈세포된 것을 확인하였다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 주사전자현미경 사진이다.
도 6을 참조하면, 초임계유체를 이용한 용매추출 과정에서 세포의 변화를 확인하기 위하여 좌측에 추출 전 지방조직의 주사전자현미경의 세포사진을 좌측에 나타내고, 추출 후 조직의 주사전자현미경 사진을 우측에 나타내었다.
초임계유체를 이용한 용매추출 후 세포는 모두 제거되었으며, 섬유질 모양이 확인되어 세포외기질이 탈세포된 것을 확인하였다.
실시예 2. 동물지방 유래 세포외기질 보존액 제조
실시예 1에서 수득한 세포외기질 시료를 탈이온수에 1 wt%로 첨가하여 혼합하고, 고압 호모게나이저를 사용하여 15 ℃에서 20,000 psi의 압력으로 분산시켰다.
5회 반복하여 분산시켜 분산액을 제조하였다. 제조한 분산액을 포어 사이즈(Pore size) 0.2 ㎛인 시린지 필터(Syringe Filter)를 사용해 여과하여 투명한 상태의 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제조하였다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 세포외기질 시료, 1 wt% 분산액 및 여과되어 제조된 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 사진이다.
도 7을 참조하면 세포외기질 시료를 분산하여 투명 액체 상태의 동물지방 유래 세포외기질 보존액을 제조할 수 있는 것을 확인하였다.
실험예 2. 성장인자 확인
실시예 1에 따라 수득한 세포외기질이 성장인자를 함유하고 있는지 확인하기 위하여 효소 결합 면역 흡착 분석(Enzyme-Linked Immunosorbent assay; 이하 ELISA)을 수행하였다.
실시예 2에 따라 제조된 1 wt% 분산액 준비하고, 사용할 플레이트 웰(Plate Well) 각각에 세척용액(Washing Solution)을 투입하여 세척하였다. 표준용액(Standard) 및 시료(Sample)를 각 Well에 넣고 상온에서 2 시간 반응시켰다.
미반응 표준용액과 시료를 세척용액으로 세척하였다.
각 웰에 검출항체(Detection Antibody)를 주입하고, 상온에서 2 시간 동안 배양하고 세척하였다.
Streptavidin-HRP를 주입하고, 상온에서 30 분간 배양한 이후에 다시 세척하였다.
TMB Solution을 주입 후 발색될 때까지 배양하고, 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질의 VEGF 기준 효소 결합 면역 흡착 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액 내의 VEGF 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8 및 도 9를 참조하면, 1 wt% 분산액 내 VEGF의 농도는 40.34 pg/ml이고, 실시예 1에 따른 세포외기질 시료 내의 VEGF 함량은 4.03 ng/g인 것을 확인하여 동물지방에 대한 초임계유체를 이용한 용매추출로 수득한 세포외기질 시료에서 성장인자가 존재하는 것을 확인하였다.
실험예 3. 여과에 따른 DNA 함량변화
실시예 2에 따른 보존액의 여과 전후 DNA 함량을 분석하였다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질이 분산된 분산액의 여과 전후의 DNA함량을 나타낸 그래프이다.
도 10을 참조하면, 여과 전 5.57 ng/μl에서 0.13 ng/μl로 감소되어 초임계유체를 이용한 용매추출 방법으로 수득한 세포외기질을 분산시켜 여과하는 경우에 잔존 DNA를 더 감소시킬 수 있는 것을 확인하였다.
실험예 4. 성장인자의 종류 및 함량 확인
실시예 1에 따른 세포외기질에 다양한 성장인자가 다량으로 함유되어 있는 것을 확인하기 위하여 인체 성장인자 항체 어레이(Human Growth Factor Antibody Array) 멤브레인, Abcam 키트를 사용하여 분석을 수행하였다.
시료의 처리는 키트의 프로토콜에 따라 진행하였으며 시료에 존재하는 단백질의 농도를 조절하기 위하여 1/10으로 희석하였다.
한편 실시예 2에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액에 함유되어 있는 성장인장의 종류 및 함량을 확인하기 위하여 싸이토카인 항체 어레이(Cytokine Antibody Array)로 분석하였다.
1 wt% 분산액(Control) 및 여과용액(Filter Solution)을 1/10로 희석하여 준비하고, 멤브레인(Membrane)을 버퍼용액(Washing buffer)으로 세척 후 상온에서 30 분간 대기(Blocking)하였다.
희석한 분석 대상액을 멤브레인(Membrane)에 도포하고, 4 ℃에서, 24 시간 동안 배양 후 아스피레이터로 분석 대상액을 제거하였다.
버퍼용액으로 잔여 분석 대상액을 세척하고, 상온에서 바이오틴-콘쥬게이트 항싸이토카인(Biotin-Conjugated Anti-Cytokine)을 주입하고, 2 시간동안 배양 후 액체를 제거하고 잔여물을 세척하였다.
상온에서 HRP-Conjugated Streptavidin을 주입하고, 2 시간 동안 배양 후 액체를 제거하고 잔여물을 세척하였다.
검출 버퍼(Detection buffer) 도포 후 5분 이내 화학발광 검출 카메라(Chemiluminescence Detection Camera)로 촬영하여 이미지 J 프로그램(ImageJ Program)을 이용해 분석하였다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 싸이토카인 항체 어레이 결과에 따른 이미지이다.
이미지 J 프로그램을 이용하여 도 10 내 흑색 점의 선명도(Intensity)를 측정하였다.
싸이토카인 어레이(Cytokine array)를 통해 측정된 이미지 내 해당 항체에 대한 신호의 세기를 측정하여 시료 내 해당 물질이 얼마나 들어있는지에 대한 상대적 값을 확인하였다.
Positive Control인 VEGF 에 대한 상대적인 값을 기준으로 검출된 나머지 성장인자의 상대값을 환산하여 계산하였다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 선명도(intensity)를 나타낸 것이다.
도 11 및 도 12를 참조하면, 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수득한 세포외기질에서 총 40가지의 성장인자를 확인할 수 있으며, 세포외기질을 함유한 보존액의 여과 후에 성장인자 함량이 감소된 것을 확인하였다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 여과 전후의 성장인자 종류 및 함량(ng/g)을 나타낸 것이다.
도 13을 참조하면, 실시예 1에 따른 세포외기질은 인체 성장인자 41가지 중 총 40가지의 성장인자를 함유하고 있으며, FGF-4는 초임계유체를 이용한 용매추출과정에서 제거되는 것을 확인하였다.
초임계유체를 이용한 용매추출과정의 탈세포 및 탈지효과는 성장인자의 함량에 영향을 미치는 것을 확인하였으며, 초임계유체를 이용한 용매추출과정의 추출조건에 따라 성장인자가 함량 및 종류가 조절된 세포외기질을 수득할 수 있는 것을 확인하였다.
한편 실시예 2에 따라 제조된 동물지방 유래 세포외기질 보존액은 세포외기질 1g 당 0.21 내지 6.86 ng으로 여과에 따라 성장인자가 감소되는 것을 확인하여 보존액 중의 성장인자의 함량을 조절할 수 있는 것을 확인하였다.
또한 성장인자 중 여과과정을 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor)의 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소된 것을 확인하여 1 wt%의 분산액 중에 잔류하는 단백질이 존재하나, 상기 단백질에 포함되어 있는 bFGF가 여과를 통하여 제거되기 때문에 상기 보존액 중의 단백질을 제거할 수 있는 것을 확인하였다.
이는 상기 보존액 중의 단백질을 제거하여 세포외기질 보존액이 감염 및 오염 위험성을 감소시켜 생체안전성을 증가시키고, 여과 과정에서 멸균할 수 있으며, 잔존하는 DNA를 제거할 수 있는 것을 나타내어 동물지방 유래 세포외기질 보존액의 취급성 및 보존성을 증가시킬 수 있는 것을 확인하였다.
본 발명의 발명자들은 최근 증가되는 지방흡입술에 따라 인체지방이 다량으로 폐기되는 점을 주목하고 이를 활용할 수 있는 방안을 모색하던 중 지방조직에 초임계유체를 이용한 용매추출방법을 사용하여 추출조건을 조절하는 경우 세포외기질의 기계적 특성을 유지하면서, 탈세포 및 탈지되어 생체안전성과 생체적합성을 증가시킨 세포외기질을 수득할 수 있는 것을 확인하였다.
특히 초임계유체를 이용한 용매추출에서 세포외기질에 성장인자가 다량으로 잔류하여 세포의 생리활성을 조절하고 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있는 것을 확인하였으며, 초임계유체를 이용한 용매추출과정에서 특정 성장인자가 배제되는 특징을 확인하여 종래 화학적, 생물학적 처리를 통한 세포외기질과 성장인자의 구성이 상이한 세포외기질을 효과적으로 추출할 수 있는 것을 확인하였다.
지금까지 본 발명에 따른 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액에 관한 구체적인 실시예에 관하여 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서는 여러 가지 실시 변형이 가능함은 자명하다.
그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 안 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 한다.
즉, 전술된 실시예는 모든 면에서 예시적인 것이며, 한정적인 것이 아닌 것으로 이해되어야 하며, 본 발명의 범위는 상세한 설명보다는 후술될 특허청구범위에 의하여 나타내어지고, 그 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
본 발명에 따르면, 탈지 및 탈세포화 되어 생체적합성이 매우 증가되고, 성장인자가 함유되어 세포의 생리활성을 조절할 수 있는 세포외기질 및 이의 제조방법을 제공한다.
또한 초임계유체를 이용한 용매추출과정으로 세포외기질을 효과적으로 수득할 수 있다.
또한 산, 효소처리 및 방사선 처리하지 않아도 멸균되어 세포외기질의 생체안전성을 증가시킬 수 있으며, 탈세포 및 탈지되어 생체적합성을 증가시킬 수 있다.
또한 세포외기질의 성분 중 성장인자가 보존된 세포외기질을 제공하며, 성장인자의 함량을 조절하여 세포 생리활성의 조절을 기대할 수 있으며, 조직의 재생을 빠르게 유도할 수 있다.
또한 세포외기질의 구조적 특성을 그대로 유지할 수 있어서, 이식 부위의 형태에 따라 성형이 가능한 조직 구조 모사체를 쉽게 제조할 수 있다.
또한 인체유래 폐지방을 효과적으로 처리하여 세포외기질을 효과적으로 추출하여 제공할 수 있다.
또한 세포외기질을 함유하는 보존액은 오염을 방지하여 장시간 보존이 가능하며, 취급성이 증가되어 세포외기질의 활용성을 매우 증가시킬 수 있다.

Claims (8)

  1. 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탈세포 및 탈지와 성장인자의 함유는 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 수행되는 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 동물지방은
    지방흡입술을 통하여 추출된 폐지방인 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 성장인자는
    AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어진 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 성장인자는
    세포외기질 1 g 당 0.52 내지 11.19 ng으로 함유되는 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질.
  6. 초임계유체를 이용한 용매추출을 통하여 탈세포 및 탈지되고, 일정 성장인자를 함유하는 동물지방 유래 세포외기질 0.1 내지 5 중량부; 및 분산액 95 내지 99.9 중량부로 포함하고, 여과된 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질 보존액.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 성장인자는
    AR, bFGF, b-NGF, EGF, EGFR, FGF-6, FGF-7, GCSF, GDNF, GM-CSF, HB-EGF, HGF, IGFB P-1, IGFB P-2, IGFB P-3, IGFB P-4, IGFB P-6, IGF-I, IGF-ISR, IGF-II, M-CSF, M-CSFR, NT-3, NT-4, PDGFRa, PDGFRb, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PIGF, SCF, SCFR, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, VEGF, VEGFR2, VEGFR3 및 VEGF-D로 이루어지며, 여과되어 세포외기질 1g 당 0.21 내지 6.86 ng으로 함유되는 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질 보존액.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 성장인자는
    상기 여과를 통하여 bFGF(Basic fibroblast growth factor) 함량이 40 내지 50 % 범위로 감소된 것을 특징으로 하는 동물지방 유래 세포외기질 보존액.
PCT/KR2019/016067 2019-08-27 2019-11-21 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액 WO2021040141A1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/594,602 US20220202995A1 (en) 2019-08-27 2019-11-21 Animal fat-derived extracellular matrix, and preservation solution of animal fat-derived extracellular matrix
CN201980099721.3A CN114286694B (zh) 2019-08-27 2019-11-21 动物脂肪源性细胞外基质及动物脂肪源性细胞外基质保存液

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2019-0105041 2019-08-27
KR1020190105041 2019-08-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021040141A1 true WO2021040141A1 (ko) 2021-03-04

Family

ID=74684256

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2019/016067 WO2021040141A1 (ko) 2019-08-27 2019-11-21 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220202995A1 (ko)
CN (1) CN114286694B (ko)
WO (1) WO2021040141A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116036355B (zh) * 2022-11-02 2023-08-22 中国人民解放军空军军医大学 一种人脂肪脱细胞外基质膜及其制备方法与应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06304242A (ja) * 1993-04-27 1994-11-01 Nitta Gelatin Inc コラーゲン−リン酸カルシウム複合材料およびその用途
JP2007105081A (ja) * 2005-10-11 2007-04-26 Japan Health Science Foundation 超臨界二酸化炭素による移植用生体組織の脱細胞処理
KR20090131432A (ko) * 2008-06-18 2009-12-29 주식회사 바이오폴 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자지지체의 제조방법
US20120189588A1 (en) * 2009-08-11 2012-07-26 The Johns Hopkins University Compositions and Methods for Implantation of Processed Adipose Tissue and Processed Adipose Tissue Products
KR20140084265A (ko) * 2011-10-28 2014-07-04 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 뼈 지혈용 비-수성 조성물, 그의 사용 방법 및 제조 방법

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2511365A4 (en) * 2009-10-23 2013-07-03 Rnl Bio Co Ltd METHOD FOR INDUCING MIGRATION OF ADULT STEM CELLS DERIVED FROM ADIPOSE TISSUE
US8936651B2 (en) * 2013-03-14 2015-01-20 Ethicon, Inc. Decellularized omentum matrix and uses thereof
KR101495281B1 (ko) * 2014-01-10 2015-02-24 (주)안트로젠 피부 재생 또는 상처 치유를 위한 중간엽 줄기세포-하이드로겔-생분해성 또는 중간엽 줄기세포-하이드로겔-비분해성 지지체 조성물
CN106399234A (zh) * 2016-08-31 2017-02-15 肖锷 脂肪组织的处理方法及间充质干细胞、处理后单个脂肪细胞和细胞外基质
CN107164298A (zh) * 2017-06-02 2017-09-15 广州新诚生物科技有限公司 超临界流体技术制备软组织去细胞基质的方法
KR101982760B1 (ko) * 2017-06-13 2019-05-28 한국과학기술연구원 초임계 유체-유기용매 시스템을 이용한 탈세포화 조직 기반의 하이드로겔의 제조방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH06304242A (ja) * 1993-04-27 1994-11-01 Nitta Gelatin Inc コラーゲン−リン酸カルシウム複合材料およびその用途
JP2007105081A (ja) * 2005-10-11 2007-04-26 Japan Health Science Foundation 超臨界二酸化炭素による移植用生体組織の脱細胞処理
KR20090131432A (ko) * 2008-06-18 2009-12-29 주식회사 바이오폴 조직 수복용 다공성 히알루론산-콜라겐 천연 고분자지지체의 제조방법
US20120189588A1 (en) * 2009-08-11 2012-07-26 The Johns Hopkins University Compositions and Methods for Implantation of Processed Adipose Tissue and Processed Adipose Tissue Products
KR20140084265A (ko) * 2011-10-28 2014-07-04 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 뼈 지혈용 비-수성 조성물, 그의 사용 방법 및 제조 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN114286694A (zh) 2022-04-05
CN114286694B (zh) 2023-06-20
US20220202995A1 (en) 2022-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2016209062A1 (en) Two-component bioink, 3d biomaterial comprising the same and method for preparing the same
WO2021235767A1 (ko) 불가사리로부터 콜라겐 펩타이드를 얻는 방법, 불가사리 유래 콜라겐 펩타이드를 포함하는 탄성 리포좀 및 이를 포함하는 화장료 조성물
WO2011142543A2 (ko) 아텔로콜라겐 분리방법 및 개질된 아텔로콜라겐 제조방법 그리고 이를 이용하여 제조된 아텔로콜라겐 및 콜라겐 기반 매트릭스
WO2018194253A1 (ko) 생체 조직 투명화용 조성물 및 이를 사용한 생체 조직의 투명화 방법
WO2020111868A1 (ko) 인체 유래 성분을 함유하고 조직 특이적 세포 분화 효과를 갖는 3d 프린팅 바이오 잉크 조성물 및 그 제조방법
WO2021040141A1 (ko) 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액
WO2017026878A1 (ko) 근골격계 전구세포 유도용 배지 조성물 및 근골격계 전구세포를 포함하는 근골격계 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2016043547A1 (ko) 조직 수복용 조성물 및 이의 제조방법
WO2017014431A1 (ko) 생분해성 고분자를 포함하는 마이크로파티클의 제조방법
WO2022005098A1 (ko) 폐 오가노이드 배양용 조성물의 제조 방법, 그 조성물 및 이를 이용한 오가노이드 배양 방법
WO2013137664A1 (ko) 무세포 진피조직 이식체
WO2021033990A1 (ko) 유도만능줄기세포-유래 중간엽 줄기세포 전구세포로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 비알콜성 지방간염의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020111678A1 (ko) 초임계유체를 이용한 세포외기질 추출방법 및 이에 따라 제조된 조직 재생용 세포외기질 생체소재
WO2021025533A1 (ko) 골격근 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 피부상태 개선용 조성물
WO2023085812A1 (ko) 탈세포 자궁 조직 유래 세포외기질을 포함하는 조성물 및 이의 용도
WO2022235088A1 (ko) 3차원 스페로이드형 세포 응집체 유래 세포외소포를 포함하는 신경 재생 촉진 조성물
WO2022014769A1 (ko) 수화형태 무세포화 피부대체재 및 그 제조방법
WO2020004698A1 (ko) 세포배양용 배지 조성물 제조방법, 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물(쉘드줄기세포) 제조방법, 이를 이용한 항관절염 치료용 조성물, 이를 이용한 항염증 치료용 조성물 및 세포재생 치료용 조성물
WO2021085775A1 (ko) 골 무기질 성분을 함유하는 복합 탈회골 조성물 및 그 제조공정
WO2021256723A1 (ko) 1 mm 이하 크기 생체 시료의 투명화 전처리 방법 및 이를 포함하는 생체 시료의 투명화 방법
WO2022158816A1 (ko) 줄기세포 유래 엑소좀, 히알루론산, 및 bdde를 포함하는 피부 주름개선용 필러 조성물 및 이의 제조 방법
WO2015199416A1 (ko) 피부 또는 혈관 조직 손상 치료용 약학 조성물 및 이의 이용
WO2021075864A2 (ko) 머츄어링을 통한 고농도 사이토카인 함유 항노화 에센스 생산방법 및 그에 따른 사이토카인 생산 시스템 모듈
WO2022149944A1 (ko) 오가노이드 배양을 위한 탈세포 지방 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법
KR20210025460A (ko) 동물지방 유래 세포외기질 및 동물지방 유래 세포외기질 보존액

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19942790

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

32PN Ep: public notification in the ep bulletin as address of the adressee cannot be established

Free format text: NOTING OF LOSS OF RIGHTS PURSUANT TO RULE 112(1) EPC (EPO FORM 1205 DATED 01/07/2022)

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19942790

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1