WO2020004698A1 - 세포배양용 배지 조성물 제조방법, 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물(쉘드줄기세포) 제조방법, 이를 이용한 항관절염 치료용 조성물, 이를 이용한 항염증 치료용 조성물 및 세포재생 치료용 조성물 - Google Patents

세포배양용 배지 조성물 제조방법, 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물(쉘드줄기세포) 제조방법, 이를 이용한 항관절염 치료용 조성물, 이를 이용한 항염증 치료용 조성물 및 세포재생 치료용 조성물 Download PDF

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박정은
이혜진
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Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a cell culture medium composition, and more specifically, a method for producing a cell culture medium composition and a cell which can increase the yield by culturing a large amount of stem cells, and can increase the yield of an effective ingredient in stem cells.
  • the present invention relates to a method for preparing a culture medium composition and a method for producing stem cell lysate extracts using the stem cell active ingredient 3 low extraction method, an anti-inflammatory treatment composition and a composition for treating cell regeneration.
  • Stem cells are undifferentiated cells with the ability to differentiate into various types of body tissues, and many studies have been conducted using them because of their ability to differentiate into various tissue cells.
  • stem cells adult stem cells can be easily obtained from areas such as fat, bone marrow, re-blood, or placenta, and have fewer ethical problems than embryonic stem cells. A lot is done.
  • Treatment for injecting adult stem cells directly is limited to self-treatment for reasons such as immune rejection.
  • one method would be to destroy the stem cells to destroy the immunogenic cell membranes that cause immune rejection.
  • the inventors of the present invention have established the concept of the stem cell lysate extract for the first time and applied for the original patent.
  • the advantage of the original patent is the universality that can be used by anyone by removing the cell membrane attached to the immunogenic reaction causing the immune rejection reaction, the reason for mass cultivation is established, and as a result, the popularization and industrialization of stem cells can be achieved.
  • an object of the present invention is to cultivate a large amount of stem cells, the stem cell mass culture medium composition method for increasing the yield of cells, and stem cell effective ingredient that can increase the collection rate of stem cell active ingredient It is to provide a method for producing a stem cell lysate extract using the 3 low extraction method.
  • the cell culture medium composition production method of the present invention is characterized in that it comprises a basic medium, hyaluronic acid, and an additive composition.
  • the additive composition is glycine, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, hydroxyproline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, vitamin C, vitamin B1, vitamin B12, vitamin E, selenium, characterized in that it comprises a transferrin.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F12, DMEM-F12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium)
  • G-MEM Glasgow's Minimal Essential Medium
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • MacCoy's 5A medium AmnioMax, AminoMax II complete Medium
  • Chang's Medium MesemCult-XF Medium The basic medium, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal Essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium) , G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium),
  • the additive composition includes hyaluronic acid at a concentration of 10 ⁇ g / ml, glycine at a concentration of 1 ng / ml, histidine at a concentration of 1 ng / ml, and isoleucine at 1 ng relative to the medium composition.
  • the methionine is contained at a concentration of 1ng / ml
  • the phenylalanine is included at a concentration of 1ng / ml
  • the proline is contained at a concentration of 10ng / ml
  • the hydroxyproline is 5ng / ML
  • the serine is contained at a concentration of 1ng / ml
  • the threonine is included at a concentration of 1ng / ml
  • the tryptophan is contained at a concentration of 1ng / ml
  • the tyrosine is 1ng / ml Is contained at a concentration of 2 ng / ml
  • the bFGF is contained at a concentration of 9 ⁇ g / ml
  • the EGF is contained at a concentration of 1.5 ⁇ g / ml
  • the VEGF is 1 ⁇ g / ml.
  • the KGF at a concentration of 1.2 ⁇ g / ml HGF is included at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml
  • the TGF is included at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml
  • the vitamin C is included at a concentration of 2 ⁇ g / ml
  • the vitamin B1 is 0.5 ⁇ g / ml.
  • the vitamin B12 is contained in a concentration of 3 ⁇ g / ml
  • the vitamin E is included in a concentration of 500 ⁇ g / ml
  • the selenium is included in a concentration of 1.8 ⁇ g / ml
  • the transferrin Is characterized in that it is included at a concentration of 12 ⁇ m / ml.
  • the method for preparing a stem cell lysate extract using the stem cell mass culture method and the stem cell active ingredient 3 low extraction method the first step of extracting the stem cells, the stem cells extracted in the medium of the medium composition described above
  • the sixth step of filtering and the sixth step is always characterized in that it comprises a seventh step of storing or utilizing the lyophilized filtered material.
  • the body portion 10 is blocked and the outside is formed inside the space, the first container portion 12 is provided in the body portion 10 and opened upward, and the first The second container portion 14 is formed in a relatively small size with respect to the first container portion 12, the second container portion 14 is provided in the first container portion 12 and the upper side is opened to insert the stem cells therein, and the second A crushed portion 16 for crushing stem cells in the container portion 14, a valve 18 to control the flow of air into the body portion 10, and sucks air in the body portion 10
  • the stem cell active ingredient extracting apparatus including the pump 20 is used, and the stem cells are introduced into the second container after being added to the storage solution.
  • Another embodiment of the present invention is characterized in that the anti-inflammatory composition using the stem cell lysate extract.
  • Another embodiment of the present invention is characterized in that the cell regeneration therapeutic composition using the stem cell lysate extract.
  • Another embodiment of the present invention is characterized in that the anti-arthritis composition using the stem cell lysate extract.
  • the stem cells When extracting the active ingredient of the stem cells, the stem cells are broken in three low environments, such as low temperature, low pressure, storage, there is an advantage that can prevent damage to the active ingredient of the stem cells.
  • the stem cell lysate extract using the two methods has the advantage that can be used by anyone, since the cell membrane attached to the immunogenicity causing the immunorejection reaction is completely removed, thereby making it possible to popularize and industrialize the stem cells.
  • FIG. 1 is a view showing a stem cell active ingredient three bottom extraction apparatus according to the present invention.
  • FIG. 3 is a diagram illustrating the toxicity of a substance to cells by measuring stem cell crushing component extracts on chondrocytes for 24 hours of culture and measuring cell viability.
  • FIG. 5 shows that the inhibitory effect of NO production induced after treatment with stem cell lysate extracts on chondrocytes induced by IL-1 ⁇ treatment was correlated with the inhibition of expression of iNOS and COX-2.
  • Figure 6 confirms that chondrocytes treated with stem cell lysate extracts inhibit the migration of NF- ⁇ B proteins by IL-1 ⁇ into the nucleus.
  • Figure 7 by treating the stem cell crushed extract to chondrocytes inflamed by IL-1 ⁇ Figures confirming iMAPKs activity.
  • FIG. 8 is a diagram confirming the anti-inflammatory effect of the present stem cell extract through genetic expression.
  • FIG. 9 is a diagram confirming the cartilage forming effect through the gene of sox-9 involved in the development of cartilage formation.
  • FIG. 10 is a view showing the expression of significant cytotoxicity as a result of treatment of the stem cell lysate extract according to the present invention by concentration.
  • FIG. 11 is a diagram showing the expression of cytotoxicity as a result of treating the stem cell lysate extract according to the present invention simultaneously with LPS.
  • FIG. 12 is a view showing a change in cell morphology of the stem cell lysate extract according to the present invention treated with LPS.
  • Figure 13 shows the change in the concentration of nitric oxide as a result of treating the stem cell lysate extract according to the present invention with LPS.
  • Figure 14 shows the iNOS and COX-2 protein expression changes as a result of treatment with stem cell lysate extract LPS according to the present invention.
  • Figure 15 shows the change in TNF ⁇ as a result of treatment of LPS with stem cell lysate extract according to the present invention
  • Figure 16 shows the changes in IL-1 ⁇ as a result of treatment with stem cell lysate extract LPS according to the present invention.
  • body portion 12 first container portion
  • valve 20 pump
  • the stem cell active ingredient extracting apparatus of the present invention as shown in Figure 1, the body portion 10 and the inside is formed in the space and the interior is blocked, the space is provided inside the body portion 10 and upwards It is formed in a relatively small size with respect to the opening of the first container portion 12 and the first container portion 12, is provided in the first container portion 12, the upper side is opened to insert the stem cells therein
  • it may be configured to include a pump 20 for sucking the air in the body portion 10.
  • the present invention extraction device is provided with a body portion (10). As shown in Figure 1, the body portion 10 is provided with a sealed space therein to block the outside and the inside.
  • a first vessel portion 12 is provided inside the body portion 10.
  • the first container portion 12 is formed so that a space is provided therein and an upper portion thereof is opened.
  • the first container portion 12 is loaded with ice to serve to lower the temperature of the stem cells in the second container portion 14 to be described below.
  • the second container part 14 is provided inside the first container part 12.
  • the second container portion 14 is formed such that the space is provided inside and the upper portion is opened similarly to the first container portion 12.
  • the second container part 14 may be formed in a relatively smaller size than the first container part 12, and the second container part 14 may be loaded in the first container part 12. have. Stem cells may be loaded in the second container part 14.
  • the present invention may be further provided with a crushing portion 16.
  • the crushing unit 16 serves to crush the stem cells loaded in the second container unit 14 using ultrasonic waves.
  • the present invention is provided with a flow path through which the outside and air flow, and a valve 18 for selectively blocking the flow of air through the flow path is provided.
  • the other end of the flow path is provided with a pump 20 to discharge the air inside the body portion 10 to the outside to make the inside of the body portion 10 in a vacuum state.
  • the stem cells introduced into the second container may be put in a stock solution so that the stem cells are expanded. That is, the stem cells are put in a stock solution such as distilled water so that the stem cells are expanded by osmotic pressure so that they can be broken by a small impact.
  • the medium composition for stem cell mass culture and the medium composition method of the present invention will be described in detail.
  • a new medium is prepared to increase cell yield, and when the cells are crushed, more effective ingredients can be obtained.
  • the medium is a known medium commonly used in the culture of animal cells, for example, Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), Minimal Essential Medium (MEM), Basic Medium Eagle (BME), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A Medium, AmnioMax, AminoMaxII complete Medium, Chang's Medium MesemCult-XF Medium, etc., but is not particularly limited thereto.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal Essential Medium
  • BME Basic Medium Eagle
  • RPMI 1640 F-10, F12, DMEM-F12, ⁇ -MEM ( ⁇ -Minimal Essential Medium), G-MEM (Glasgow's Minimal Essential Medium
  • the additive composition is hyaluronic acid, glycine, histidine, isoleucine, methionine, phenylalanine, proline, hydroxyproline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine, valine, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, vitamin C, vitamin B1 And vitamin B12, vitamin E, selenium and transferrin.
  • hyaluronic acid is included in the additive composition.
  • the hyaluronic acid serves as a scaffold during cell culture, and may be included at a concentration of 10 ⁇ g / ml with respect to the medium composition.
  • the additive composition includes glycine.
  • the glycine is a amino acid that serves as a nutrient to the growth of the cell, it may be included in a concentration of 1ng / ml with respect to the medium composition.
  • the additive composition includes histidine.
  • the histidine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes isoleucine.
  • the isoleucine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes methionine.
  • the methionine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes phenylalanine.
  • the phenylalanine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes proline
  • the proline is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 10 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes hydroxyproline.
  • the hydroxyproline is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 5 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes serine
  • the serine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes threonine.
  • the threonine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes tryptophan
  • the tryptophan is an amino acid that serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes tyrosine.
  • the tyrosine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 1 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes valine
  • the valine is an amino acid, which serves as a nutrient for cell growth, and may be included at a concentration of 2 ng / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes bFGF.
  • the bFGF helps to grow the cells to be cultured, and may be included at a concentration of 9 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes EGF.
  • the EGF helps growth of the cultured cells, and may be included at a concentration of 1.5 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes VEGF.
  • the VEGF helps growth of the cultured cells, and may be included at a concentration of 1 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes KGF.
  • the KGF helps growth of the cultured cells, and may be included at a concentration of 1.2 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes HGF.
  • the HGF helps to grow the cultured cells, and may be included at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes TGF.
  • the TGF helps to grow the cultured cells, and may be included at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes vitamin C.
  • the vitamin C assists the growth of the cultured cells, and may be included at a concentration of 2 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes vitamin B1.
  • the vitamin B1 assists the growth of the cultured cells, and may be included at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes vitamin B12.
  • the vitamin B12 helps to grow the cells to be cultured, and may be included at a concentration of 3 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes vitamin E.
  • the vitamin E assists the growth of the cultured cells, and may be included at a concentration of 500 ⁇ g / ml relative to the medium composition.
  • the additive composition includes selenium.
  • the selenium is to help the activity of the cell, it may be included in a concentration of 1.8 ⁇ g / ml with respect to the medium composition.
  • the additive composition includes transferrin.
  • the transferrin is to help the cell activity, it may be included in a concentration of 12 ⁇ m / ml with respect to the medium composition.
  • Step 1 Stem cells are extracted from any one of human body fat, bone marrow, umbilical cord blood or placenta.
  • the fat is collected by liposuction and then purified by enzyme treatment and centrifugation several times to separate fat stem cells.
  • Second step The isolated stem cells are cultured using a medium made using the above-described mass culture medium composition of the present invention.
  • the stem cell mass culture medium composition is used, the growth rate of stem cells is increased to increase the yield of stem cells.
  • Step 4 Once the cells have grown to sufficient density, remove the cells from the plate. Stem cells are isolated and washed several times using saline or PBS (phosphate buffer saline). Cell counting is used to measure the number of cells and to produce a constant concentration of suspension.
  • saline or PBS phosphate buffer saline
  • the fifth step Remove supernatant and add extender to allow stem cell membrane to break. Ultrasonic wave is added and the cells are crushed by the stem cell active ingredient 3 low extraction method. When the microscope confirms that all the stem cells are broken, the shredding is terminated. Through the process of the three low extraction method, the effective cell membrane disruption in a short time to maintain most of the active ingredients such as growth factors and cell active material inside the stem cells.
  • Step 6 The hypotonic extender and stem cell disruption mixtures contain cell membrane residues along with various growth factors and cell activators that are the stem cell contents. Unnecessary cell membrane residues are removed by centrifugation and microfilter. At this time, the immunogenicity causing the immunorejection reaction attached to the cell membrane is removed, and the stem cell active ingredient that anyone can use is extracted.
  • stem cell lysate extracts also known as shelled stem cells.
  • FBS Factors 1112 parts by weight of FBS was added to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and cultured with stem cells in a medium containing 0.6 parts by weight of penicillin as an antibiotic. Factors were extracted.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells are cultured in a medium mixed with 20 parts by weight of serum containing nutrients without 100 parts of Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), and grown according to the above-described procedure. Extracted.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 5 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium in which 10 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 was mixed with 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and the effective factors were extracted.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 15 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 20 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 25 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 30 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 35 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 in 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 40 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 45 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Stem cells were cultured in a medium mixed with 50 parts by weight of the additive composition of the present invention shown in Table 1 to 100 parts by weight of DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), and grown according to the above-described procedure, and extracted the effective factors.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Example 11 and Example 12 can be confirmed that the increase efficiency is relatively low, the yield efficiency is low.
  • Example 1 After cell disruption Total protein (mg / ml) 50.48 ⁇ 1.07 181.12 ⁇ 1.45 961.53 ⁇ 2.03 2002.13 ⁇ 2.82 After cell disruption TGF (pg / ml) 13.06 ⁇ 1.85 113.76 ⁇ 2.22 124.84 ⁇ 2.01 230.90 ⁇ 2.24 After cell disruption VEGF (pg / ml) 110.01 ⁇ 3.52 350.07 ⁇ 2.68 721.04 ⁇ 4.27 1902.35 ⁇ 3.59 After cell disruption KGF (pg / ml) 9.37 ⁇ 0.25 55.63 ⁇ 0.47 105.97 ⁇ 0.49 460.04 ⁇ 0.52 After cell disruption Procollagen (ng / ml) 83.10 ⁇ 1.43 261.26 ⁇ 4.61 451.10 ⁇ 2.08 1498.66 ⁇ 16.42
  • Example 3 As shown in Table 3, it can be confirmed that the detection amount of the active ingredient of the cell is high as a result of Example 6. In addition, it can be expected that the detected amount will be higher than those of Example 1 and Comparative Example 1 in the case of Examples 3 to 10 that the yield is similar or larger than that of Example 1.
  • the cartilage of Wistar rat female rats was recollected, cultured in DMEM medium containing 10% FBS, and confirmed to be chondrocytes using CD44, a specific marker of chondrocytes (cultivation conditions 37 ° 5% CO 2 ).
  • CD44 a specific marker of chondrocytes, was used to identify chondrocytes.
  • COX-2 A type of protein, a substance whose activity increases due to inflammatory factors and then decreases as inflammation disappears.
  • the inhibition of NO production induced by IL-1 ⁇ treatment is associated with the inhibition of the expression of iNOS and COX-2.
  • NF- ⁇ B pathway a major inflammatory signaling pathway induced by IL-1 ⁇ , by inhibiting IL-1 ⁇ -induced NF- ⁇ B protein migration into the nucleus. It was confirmed that it can be done.
  • the anti-inflammatory effect of stem cell disruption component extract is achieved through the inhibition of p38 MAPK signaling.
  • MMPs are major proteins involved in catabolism of cartilage tissues, and the expression of MMP-13 was significantly increased when IL-1 ⁇ was treated, but the expression was decreased when stem cell lysate extracts were treated. It confirmed that it became.
  • T-stem Stem cell disrupted extract
  • RAW 246.7 mouse macrophages
  • Stem cell lysate extract was treated with mouse macrophage (RAW 246.7) for 24 hours to 2 ⁇ g / ml, and confirmed the change in cell morphology.
  • Mouse macrophage cells (RAW 246.7) pretreated with LPS, a production-inducing factor, were treated for 24 hours at 0.4 ⁇ g / ml to 2 ⁇ g / ml, and then griess assay. Nitric oxide concentration was confirmed.
  • nitric oxide was increased by LPS stimulation.
  • the concentration of nitric oxide was statistically significant in the group treated with LPS and the stem cell lysate extract compared to the group treated with only LPS.
  • Mouse macrophage cells (RAW 246.7) pretreated with 1 ⁇ g / ml of LPS, an inflammation-inducing factor, were treated with test substance stem cell lysate extracts at concentrations of 1 ⁇ g / ml and 2 ⁇ g / ml for 24 hours, followed by western blot analysis. Inflammatory enzymes iNOS and COX2 protein expression was confirmed.
  • Mouse macrophage cells (RAW 246.7) pretreated with 1 ⁇ g / ml of LPS, an inflammation-inducing factor, were treated with stem cell lysate extracts at concentrations of 1 ⁇ g / ml and 2 ⁇ g / ml for 24 hours, followed by inflammatory cytokines by ELISA assay. Production (TNF ⁇ , IL-1 ⁇ ) was confirmed.
  • Efficacy of the active ingredient of the stem cell crush extract according to the present invention is as follows.
  • the cause of dementia is caused by the degeneration of beta-amyloid toxic protein and tau protein.
  • tau protein an enzyme that produces beta amyloid in brain tissues of mice.
  • the mesenchymal stem cells are Alzheimer's disease, which inhibits the progression of dementia and reduces the amount of beta amyloid toxic protein that causes dementia.
  • the removed stem cell active ingredient is a dense substance that can be used to treat dementia.
  • the yield through the present invention the yield of the active ingredient is increased, it can be used as a less effective and effective therapeutic agent than using the existing stem cells themselves.
  • the gum disease is caused by inflammation of the tooth roots and bones of the gums, gums, etc.
  • the stem cells of the present invention can help stem cells to regenerate the gums, gum bone crushed extract.
  • stem cell growth factors can be used as a gum treatment because it helps promote inflammation, bone, cartilage, gum cell regeneration, and wound healing.
  • collagen networks that resemble procollagen and reticulum bind cells and cells firmly to each other. It can be used as a treatment for gum disease because it provides adhesion and provides an environment that helps many parts of the human body such as blood vessels, bones and joints to function.
  • the cell yield through the present invention the yield of the active ingredient is increased, it can be used as a less effective and effective therapeutic agent than using the existing stem cells themselves.
  • joints and periarthritis are caused by periarticular inflammation, such as aging, injury, stem cell crush extract of the present invention can be used as a gum treatment because it helps to inhibit inflammation, bone, cartilage, gum cell regeneration, wound healing regeneration have.
  • the collagen network which looks like a procollagen network, firmly bonds cells to each other and provides an environment that helps cells form and function in many parts of the body, including blood vessels, bones, and joints. It can be used as a therapeutic for.
  • the cell yield through the present invention the yield of the active ingredient is increased, it can be used as a less effective and effective therapeutic agent than using the existing stem cells themselves.
  • VEGF growth factor of the stem cell crush extract according to the present invention helps hair follicle growth, stimulates KGF and hair roots to help strengthen hair, It can be used as a therapeutic agent.
  • the cell yield through the present invention the yield of the active ingredient is increased, it can be used as a less effective and effective therapeutic agent than using the existing stem cells themselves.
  • the causes of skin aging are various, such as environmental factors, genetic factors, KGF, new cell production (collagen) function of the stem cell crush extract of the present invention, wrinkle prevention, recovery, skin protection, young skin maintenance and UV stimulation defense It can be used as a skin treatment because it helps the skin and the elastic collagen network to adhere the cells and cells firmly to each other, thereby helping skin elasticity.
  • the cell yield through the present invention the yield of the active ingredient is increased, it can be used as a less effective and effective therapeutic agent than using the existing stem cells themselves.

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Abstract

본 발명은 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법에 관한 것으로 한다. 세포 배양용 배지 조성물은, 기본배지와, 히알루론산과, 첨가조성물을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다. 본 발명은 줄기세포의 유효성분을 추출할 때 저온, 저압, 저장이라는 3저 환경에서 줄기세포의 파쇄가 이루어지기 때문에 줄기세포의 유효성분이 손상되는 것을 방지할 수 있는 이점이 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 다른 실시예인 줄기세포 대량배양용 배지 조성법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법의 구성은, 줄기세포를 추출하는 제 1단계와, 배지조성물의 배지에 상기 추출된 줄기세포를 배양하는 제 2단계와, 상기 줄기세포를 계대배양하는 제 3단계와, 상기 배양된 줄기세포에서 세포를 획득하는 제 4단계와, 상기 획득된 세포를 파쇄하는 제 5단계와, 상기 파쇄된 물질을 여과하는 제 6단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.

Description

세포배양용 배지 조성물 제조방법, 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물(쉘드줄기세포) 제조방법, 이를 이용한 항관절염 치료용 조성물, 이를 이용한 항염증 치료용 조성물 및 세포재생 치료용 조성물
본 발명은 세포배양용 배지 조성물 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포를 대량으로 배양하여 수득률을 높일 수 있고, 줄기세포 내의 유효성분 수득률을 높일 수 있는 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법, 이를 이용한 항염증 치료용 조성물 및 세포재생 치료용 조성물에 관한 것이다.
줄기세포(stem cell)는 여러 종류의 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 미분화 세포로, 다양한 조직 세포로 분화할 수 있는 능력 때문에 이를 이용한 연구가 많이 행해지고 있다. 줄기세포 중 성체 줄기세포는 지방, 골수, 재대혈 또는 태반 등과 같은 부위에서 쉽게 얻을 수 있으며, 배아 줄기세포에 비해 윤리적 문제가 적고, 사용자 본인의 세포를 이용하면 면역거부반응도 적기 때문에 이를 이용한 연구가 많이 이루어지고 있다.
성체 줄기세포를 바로 주입하는 치료는 면역거부반응 등의 이유로 자가치료에 한정된다. 이 자가치료의 한계를 뛰어넘기 위해서는 줄기세포를 파쇄하여 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 붙어 있는 세포막을 제거하는 것이 하나의 방법이 될 수 있다. 본원발명의 발명자는 상기 줄기세포파쇄추출물의 개념을 처음으로 정립하고 그 원천 특허를 출원한 바 있다. 그 원천 특허의 장점은 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 붙어 있는 세포막을 제거함으로써 누구나 사용이 가능한 범용성이 있기 때문에 대량배양을 할 이유가 성립되고, 그 결과 줄기세포의 대중화와 산업화를 이룰 수 있다.
그래서, 줄기세포의 대중화와 산업화를 이루기 위해서 줄기세포의 대량배양에 유용한 방법과 그 유효성분을 추출하는 방법의 지속적인 연구 및 개발이 요구되고 있다.
상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 줄기세포를 대량으로 배양하여, 세포의 수득을 높이는 줄기세포 대량배양용 배지 조성법과, 줄기세포 유효성분 수집율을 높일 수 있는 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법을 제공하는 것이다.
상술한 목적을 달성하기 위한 것으로, 본 발명인 세포 배양용 배지 조성물 제조방법은, 기본배지와, 히알루론산과, 첨가조성물을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 첨가조성물은, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, 비타민C, 비타민B1, 비타민B12, 비타민E, 셀레늄, 트랜스페린을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 기본배지는, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium MesemCult-XF Medium 중 어느 하나인 것을 특징으로 한다.
상기 첨가조성물은 상기 배지조성물에 대하여 히알루론산은 10㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 글리신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 히스티딘은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 이소류신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 메티오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 페닐알라닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 프롤린은 10ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 히드록시프롤린은 5ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 세린은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 트레오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 트립토판은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 티로신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 발린은 2ng/㎖의 농도로 포함되고, 상기 bFGF는 9㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 EGF는 1.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 VEGF는 1㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 KGF는 1.2㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 HGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 TGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민C는2㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민B1는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민B12는 3㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 비타민E는 500㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 셀레늄은 1.8㎍/㎖의 농도로 포함되고, 상기 트랜스페린은 12㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 한다.
그리고, 줄기세포 대량배양용 배지 조성법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법은, 줄기세포를 추출하는 제 1단계와, 상술한 배지조성물의 배지에 상기 추출된 줄기세포를 배양하는 제 2단계와, 상기 줄기세포를 계대배양하는 제 3단계와, 상기 배양된 줄기세포에서 세포를 획득하는 제 4단계와, 상기 획득된 세포를 파쇄하는 제 5단계와, 상기 파쇄된 물질을 여과하는 제 6단계와, 상시 6단계 여과된 물질을 동결건조하여 보관 하거나 활용하는 7단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 한다.
상기 제 5단계에서, 내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부(10)와, 상기 몸체부(10) 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부(12)와, 상기 제 1용기부(12)에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부(12) 내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부(14)와, 상기 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부(16)와, 상기 몸체부(10) 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브(18)와, 상기 몸체부(10) 내부에서 공기를 흡입하는 펌프(20)를 포함하는 줄기세포 유효성분 추출장치를 이용하고, 상기 줄기세포는 저장성 용액에 투입후 상기 제 2용기부에 투입하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예인 줄기세포파쇄추출물을 이용한 항염증 치료용 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예인 줄기세포파쇄추출물을 이용한 세포재생 치료용 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예인 줄기세포파쇄추출물을 이용한 항관절염 치료용 조성물인 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의한 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법의 효과는 다음과 같다.
혈청을 사용하지 않아 안정하며, 스캐폴드를 사용하여 배양이 증대되어 줄기세포의 유효인자의 수득률이 높아지는 이점이 있다.
줄기세포의 유효성분을 추출할 때 저온, 저압, 저장이라는 3저 환경에서 줄기세포의 파쇄가 이루어지기 때문에 줄기세포의 유효성분이 손상되는 것을 방지할 수 있는 이점이 있다.
그리고, 상기 두 가지 방법을 이용한 줄기세포파쇄추출물은 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 붙은 세포막이 완전히 제거되어 누구나 사용이 가능한 범용성이 있어서 줄기세포의 대중화와 산업화를 이룰 수 있는 이점이 있다.
도 1은 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분 3저 추출장치를 보인 도면.
도 2는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물의 항 관절염 효과를 확인하기 위하여 연골세포의 특정마커인 CD44를 이용하여 연골세포임을 확인하는 도면.
도 3은 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 농도별 처리하여 24시간 배양, 세포생존율을 측정하여 물질의 세포에 대한 독성을 확인하는 도면.
도 4는 연골세포에 IL-1α를 처리해 염증을 일으킨 후, 염증을 일으킨 연골세포에 줄기세포파쇄추출물을 농도별 처리하여 염증매개 인자인 NO생성 억제를 확인한 도면.
도 5는 IL-1α 처리로 유도된 연골세포에 줄기세포파쇄추출물을 처리한 후 유도된 NO의 생성 억제 효과는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와 연관을 확인한 도면.
도 6은 줄기세포파쇄추출물을 처리한 연골세포는 IL-1α에 의한 NF-κB 단백질이 핵내로 이동되는 것을 억제하는 것을 확인한 도면.
도 7은 IL-1α 에 의해 염증이 발생한 연골세포에 줄기세포파쇄추출물을 처리하여 iMAPKs 활성을 확인한 도면.
도 8은 유전학적 발현을 통해 본 줄기세포추출물의 항염증 효과 확인하는 도면.
도 9는 연골 형성 발달에 관여하는 sox-9의 유전자를 통해 연골형성 효과를 확인하는 도면.
도 10은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 농도별 처리한 결과 유의한 세포 독성의 발현 유무를 보인 도면.
도 11은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 동시에 처리한 결과 세포 독성의 발현유무를 보인 도면.
도 12는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 세포 형태의 변화를 보인 도면.
도 13은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 산화질소 농도의 변화를 보인 도면.
도 14는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 iNOS 및 COX-2 단백질 발현 변화를 보인 도면.
도 15는 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 TNFα의 변화를 보인 도면
도 16은 본 발명에 의한 줄기세포파쇄추출물을 LPS와 처리한 결과 IL-1β의 변화를 보인 도면.
10: 몸체부 12: 제 1용기부
14: 제 2용기부 16: 파쇄부
18: 밸브 20: 펌프
이하, 본 발명에 의한 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법의 바람직한 실시예가 첨부된 도면을 참고하여 상세하게 설명한다.
먼저, 본 발명인 줄기세포 유효성분 추출장치는 도 1에 도시된 바와 같이, 내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부(10)와, 상기 몸체부(10) 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부(12)와, 상기 제 1용기부(12)에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부(12) 내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부(14)와, 상기 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부(16)와, 상기 몸체부(10) 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브(18)와, 상기 몸체부(10) 내부에서 공기를 흡입하는 펌프(20)를 포함하여 구성될 수 있다.
먼저, 본 발명인 추출장치에는 몸체부(10)가 마련된다. 상기 몸체부(10)는 도 1에 도시된 바와 같이, 내부에 밀폐된 공간이 마련되어 외부와 내부가 차단되도록 한다.
상기 몸체부(10) 내부에는, 제 1용기부(12)가 마련된다. 상기 제 1용기부(12)는 내부에 공간이 마련되고 상부가 개방되도록 형성된다. 상기 제 1용기부(12)에는 얼음이 적재되어 아래에서 설명될 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포의 온도를 낮게 만드는 역할을 한다.
상기 제 1용기부(12) 내부에는 제 2용기부(14)가 마련된다. 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12)와 마찬가지로 내부에 공간이 마련되고 상부가 개방되도록 형성된다. 특히, 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12) 보다 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 2용기부(14)는 상기 제 1용기부(12) 내부에 적재될 수 있다. 상기 제 2용기부(14)에는 줄기세포가 적재될 수 있다.
그리고, 본 발명에는 파쇄부(16)가 더 마련될 수 있다. 상기 파쇄부(16)는 상기 제 2용기부(14) 내부에 적재되는 줄기세포를 초음파를 이용하여 파쇄하는 역할을 한다.
또한, 본 발명에는 외부와 공기가 유동되는 유로가 마련되며, 상기 유로를 통한 공기의 흐름을 선택적으로 차단하는 밸브(18)가 마련된다. 상기 유로의 타단에는 펌프(20)가 마련되어 상기 몸체부(10) 내부의 공기를 외부로 배출시켜 상기 몸체부(10) 내부를 진공 상태로 만들 수 있다.
또한, 상기 제 2용기부에 투입되는 줄기세포는 저장액에 넣어 상기 줄기세포가 팽창되도록 할 수 있다. 즉, 상기 줄기세포를 증류수 같은 저장액에 넣어 상기 줄기세포가 삼투압에 의하여 팽창되도록 하여 작은 충격으로 파쇄되도록 할 수 있다.
그리고, 본 발명에 의한 줄기세포 대량배양용 배지조성물 및 의 배지조성방법에 대해 상세하게 설명한다.
본 발명에서는 새로운 배지를 제조하여 세포수득량을 높이고, 세포를 파쇄하였을 때 유효성분을 더욱 많이 수득할 수 있도록 한다.
상기 배지는 기본 배지는 동물 세포의 배양에 통상적으로 사용되는 공지의 배지들로서, 예컨대 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium MesemCult-XF Medium 등일 수 있으나, 특별히 이에 한정되지 아니한다.
그리고, 상기 배지에 첨가조성물을 추가한다. 상기 첨가조성물은 히알루론산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, 비타민C, 비타민B1, 비타민B12, 비타민E, 셀레늄, 트랜스페린을 포함하여 구성될 수 있다.
먼저, 상기 첨가조성물 중 히알루론산이 포함된다. 상기 히알루론산은 세포배양시 스캐폴드 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 10㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
그리고, 상기 첨가조성물에는 글리신이 포함된다. 상기 글리신은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 히스티딘이 포함된다 상기 히스티딘은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 이소류신이 포함된다 상기 이소류신은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 메티오닌이 포함된다 상기 메티오닌은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 페닐알라닌이 포함된다 상기 페닐알라닌은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 프롤린 포함된다 상기 프롤린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 10ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 히드록시프롤린이 포함된다 상기 히드록시프롤린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 5ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 세린이 포함된다 상기 세린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 트레오닌이 포함된다 상기 트레오닌은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 트립토판이 포함된다 상기 트립토판은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 티로신이 포함된다 상기 티로신은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 발린이 포함된다 상기 발린은 아미노산으로 세포의 성장에 영양성분 역할을 하는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 2ng/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
*그리고, 상기 첨가조성물에는 bFGF가 포함된다. 상기 bFGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 9㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 EGF가 포함된다. 상기 EGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 VEGF가 포함된다. 상기 VEGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 KGF가 포함된다. 상기 KGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1.2㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 HGF가 포함된다. 상기 HGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 0.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 TGF가 포함된다. 상기 TGF는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 0.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
그리고, 상기 첨가조성물에는 비타민C가 포함된다. 상기 비타민C는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 2㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 비타민B1가 포함된다. 상기 비타민B1는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 0.5㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 비타민B12가 포함된다. 상기 비타민B12는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 3㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 비타민E가 포함된다. 상기 비타민E는 배양되는 세포의 성장을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 500㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
그리고, 상기 첨가조성물에는 셀레늄이 포함된다. 상기 셀레늄은 세포의 활성을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 1.8㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
상기 첨가조성물에는 트랜스페린이 포함된다. 상기 트랜스페린은 세포의 활성을 돕는 것으로, 상기 배지조성물에 대하여 12㎍/㎖의 농도로 포함될 수 있다.
그리고, 본 발명에 의한 줄기세포 유효성분 추출장치를 이용하여 세포배양용 배지 조성물 제조방법 및 세포배양용 배지 조성물 제조방법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법에 대해 설명한다.
제 1단계: 줄기세포를 인체의 지방, 골수, 제대혈 또는 태반 중 어느 하나에서 추출한다. 본원발명에서는 지방흡입술로 지방을 수거한 후 효소처리와 여러번 원심분리를 통하여 정제하여 지방줄기세포를 분리한다.
제 2단계: 상기 분리된 줄기세포를 상술한 본원발명의 대량배양용 배지조성물을 사용하여 만든 배지를 이용하여 배양한다. 상기 줄기세포 대량배양용 배지조성물을 이용하게 되면 줄기세포의 성장속도를 높여 줄기세포의 수득율이 높아진다.
제 3단계; 줄기세포가 배양된 배양액을 제거한 다음 줄기세포를 분리하고 세포부유액을 수득하여 계대배양한다.
제 4단계: 세포가 충분한 밀도로 자라면 세포를 플레이트에서 분리한다. 줄기세포를 분리한 후 생리식염수 또는 PBS(phosphate buffer saline)를 이용하여 수차례 세척한다. Cell counting 기로 세포수를 측정하여 항상 일정한 농도의 부유액을 만든다.
제 5단계; 줄기세포막의 파쇄가 가능하도록 상등액을 제거하고 증량제를 첨가한다. 초음파를 가하여 줄기세포 유효성분 3저 추출법으로 세포를 파쇄한다. 현미경을 통해 줄기세포가 전부 파쇄된 것이 확인되면 파쇄를 종료한다. 상기 3저 추출법의 과정을 거치면 단시간 내 효과적인 세포막 파쇄를 하여 줄기세포 내부의 성장인자와 세포활성물질 등 유효성분의 대부분이 유지된다.
제 6단계: 저장성 증량제와 줄기세포 파쇄 혼합물에는 줄기세포 내용물인 다양한 성장인자, 세포활성물질과 함께 세포막 잔여물이 존재한다. 그 중 필요하지 않은 세포막 잔여물을 원심분리 및 미세필터를 사용하여 제거한다. 이 때 세포막에 붙어있는 면역거부반응을 일으키는 면역원성이 제거되어 누구나 사용 가능한 줄기세포 유효성분이 추출된다.
*
제 7단계; 상기를 거쳐 만든 줄기세포 파쇄추출물을 냉동 보관하거나 동결 건조하여 보관하고, 활용한다.
상기 단계를 거쳐 얻은 유효성분들을 줄기세포파쇄추출물이라 하며 일명 쉘드줄기세포(Shelled Stem Cell)라 한다.
이하, 본 발명에 의한 첨가조성물에 의한 줄기세포 대량배양용 배지 조성물을 이용하여 줄기세포의 파쇄추출물 유효성분 추출하여 실험한 결과를 나타낸 것이다.
[ 비교예 1 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 혈청으로 FBS가 11,12중량부 첨가되고, 항생제로 penicillin이 0.6중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정에 의하여 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 2 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 혈청이 포함되지 않고 영양성분들이 함유된 세럼(serum) 20중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 3 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 5중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 4 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 10중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 5 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 15중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 6 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 20중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 7 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 25중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 8 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 30중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 9 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 35중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 10 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 40중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 11 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 45중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
[ 실시예 12 ]
DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium) 100중량부에 표 1에 나타난 본 발명의 첨가조성물을 50중량부 혼합한 배지에 줄기세포를 배양하고, 이를 상술한 과정을 따라 성장시키고, 유효인자를 추출하였다.
분류 종류 농도
스캐폴드 히알루론산 10 ㎍/㎖
아미노산 글리신 1 ng/㎖
히스티딘 1 ng/㎖
이소류신 1 ng/㎖
메티오닌 1 ng/㎖
페닐알라닌 1 ng/㎖
프롤린 10 ng/㎖
히드록시프롤린 5 ng/㎖
세린 1 ng/㎖
트레오닌 1 ng/㎖
트립토판 1 ng/㎖
티로신 1 ng/㎖
발린 2 ng/㎖
성장인자 bFGF 9 ㎍/㎖
EGF 1.5 ㎍/㎖
VEGF 1 ㎍/㎖
KGF 1.2 ㎍/㎖
HGF 0.5 ㎍/㎖
TGF 0.5 ㎍/㎖
비타민 비타민C 2 ㎍/㎖
비타민B1 0.5 ㎍/㎖
비타민B12 3 ㎍/㎖
비타민E 500 ㎍/㎖
미량원소 셀레늄 1.8 ng/㎖
트랜스페린 12 ㎍/㎖
다음으로, 본 발명에 의한 세포 배양용 배지 조성물에 의한 세포를 배양한 결과 세포가 수득된 양을 비교한 실험결과를 설명한다.
측정형태 세포파쇄 전 수득
검출량(평균)0 군 세포수득량(개/ml)
대조군 1.1x10^4
비교예 1 2.3x10^5
실시예 1 8.7x10^5
실시예 2 8.6x10^5
실시예 3 8.9x10^5
실시예 4 9.3x10^5
실시예 5 9.7x10^5
실시예 6 1.2x10^6
실시예 7 1.5x10^6
실시예 8 1.8x10^6
실시예 9 2.1x10^6
실시예10 2.4x10^6
실시예11 2.5x10^6
실시예12 2.5x10^6
표 2에 나타난 바와 같이, 실시예 2 내지 실시예 12의 결과 세포의 수득량이 높음을 확인할 수 있다. 다만, 실시예 2의 경우 혈청을 투입하는 실시예 1과 근사하며, 실시예 11 및 실시예 12는 증가율이 상대적으로 낮아 수득 효율이 떨어지는 것을 확인할 수 있다.
다음으로, 본 발명에 의한 세포 배양용 배지 조성물에 의한 세포를 배양한 결과 수득된 세포를 파쇄한 결과 유효성분의 검출량을 비교한 실험결과를 설명한다. 특히, 실시예 1과 비교하여 첨가조성물의 추가량이 동일한 실시예 6을 비교하였다.
측정형태 검출량 (평균)
군 대조군 비교예 1 실시예 1 실시예 6
세포파쇄 후 총단백 (mg/ml) 50.48 ±1.07 181.12 ±1.45 961.53 ±2.03 2002.13±2.82
세포파쇄 후 TGF(pg/ml) 13.06±1.85 113.76±2.22 124.84±2.01 230.90±2.24
세포파쇄 후 VEGF(pg/ml) 110.01±3.52 350.07±2.68 721.04±4.27 1902.35±3.59
세포파쇄 후 KGF(pg/ml) 9.37±0.25 55.63±0.47 105.97±0.49 460.04±0.52
세포파쇄 후 프로콜라겐(ng/ml) 83.10±1.43 261.26±4.61 451.10±2.08 1498.66±16.42
표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 6의 결과 세포의 유효성분의 검출량이 높음을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 1과 비교하여 수득량이 유사하거나 큰 실시예 3 내지 실시예 10의 경우 실시예 1 및 비교예 1에 비하여 검출량이 높을 것임을 예상할 수 있다.
이하 줄기세포파쇄추출물이 연골세포에 작용하여 항 관절염 및 연골 재생 효과를 확인하는 시험을 상세하게 설명한다.
1-1. 관절연골세포의 분리 및 배양
시험 전, Wistar rat 계 암컷 흰쥐의 연골을 재취하여 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양 후, 연골세포의 특정마커인 CD44를 이용해 연골세포 임을 확인한다.(배양조건 37°5% CO2 )
1-2. 결과
연골세포의 특정마커인 CD44를 이용하여 연골세포임을 확인하였다.
2-1. 세포독성 및 NO생성 억제효과
1) 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 농도별 처리하여 24시간 배양, 세포생존율을 측정하여 물질의 세포에 대한 독성을 확인한다.
2) 연골세포에 IL-1α를 처리해 염증을 일으킨다.
3) 염증을 일으킨 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 농도별 처리하여 염증매개 인자인 NO생성 억제를 확인한다.(*NO;Nitric Oxide)
2-2. 결과
1) 농도별 처리하여 세포생존율을 측정한 결과, 20 ng까지의 농도에서 세포독성을 나타내지 않았다. (농도 0,5,10,20 ng/ml)
2) 염증유도물질인 IL-1α를 처리한 세포에서는 NO가 증가함 확인하였다. 염증을 유도한 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 처리한 결과 20ng/ml의 농도에서 약 30%의 염증억제 반응을 확인하였다.(농도 염증유도안한세포, 염증유도한세포, 5,10,20ng)
3-1. iNOS, COX-2 및 NF-kB 발현 변화
1) IL-1α 처리한 연골세포에 양성대조군인 Carprofen(비스테로이드성 물질)과 줄기세포파쇄성분추출물의 적용하여 NO생성과 COX-2, NF-kB 발현의 연관성을 확인한다.
NO: 염증이 발생하였을 때 증가하는 수치
COX-2 : 일종의 단백질, 염증인자에 의해 활성이 증가했다가 염증이 사라짐에 따라 감소하는 물질
2) 염증을 일으킨 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물의 처리가 NF-κB의 발현에 미치는 영향을 확인한다.
3-2. 결과
1) IL-1α 처리로 유도된 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 처리한 결과
IL-1α 처리로 유도된 NO의 생성 억제 효과는 iNOS와 COX-2의 발현 억제와 연관이 있음을 의미한다.
2) 줄기세포파쇄성분추추물을 처리한 연골세포는 IL-1α에 의한 NF-κB 단백질이 핵내로 이동되는 것을 억제함으로써 IL-1α에 의해 유도되는 주요 염증 신호전달 경로인 NF-κB pathway를 차단 할 수 있음을 확인하였다.
4. iMAPKs 활성에 미치는 영향
1) IL-1α 에 의해 염증이 발생한 연골세포에 줄기세포파쇄성분추출물을 처리하여 iMAPKs 활성을 확인한다.
1)항염증 기전확인
줄기세포파쇄성분추출물의 항염증 효능이 p38 MAPK 신호전달 억제를 통하여 이루어짐을 의미한다.
*5-1. 연골형성 및 발달에 관여하는 인자 qPCR 측정
1) 유전학적 발현을 통해 본 줄기세포성분추출물의 항염즘 효과 확인한다.
2）연골 형성 발달에 관여하는 sox-9의 유전자를 통해 연골형성을 확인한다.
5-2. 결과
1) MMPs는 연골조직의 이화작용에 관여하는 주요 단백질로서, IL-1α(염증유발물질)를 처리했을 때 MMP-13의 유전자 발현이 크게 증가되었으나, 줄기세포파쇄성분추출물의 처리 시 발현이 감소되는 것을 확인하였다.
2) 연골 형성 및 발달에 관여하는 SOX-9의 유전자도 줄기세포파쇄성분추출물의 농도별 처리에 따라 유전자 발현이 증가되는 것을 확인하였다.
이하 줄기세포파쇄추출물이 항염증 작용 효과를 확인하는 시험을 상세하게 설명한다.
1-1. 세포독성평가
1) 줄기세포파쇄추출물(T-stem)을 0.1㎍/ml부터 3㎍/ml의 농도로 마우스 대식세포 (RAW 246.7)에 24시간 동안 처리하였다.
2) 줄기세포파쇄추출물과 LPS 동시에 처리하였다.
1-2. 결과
1) 도 10에 도시된 바와 같이, 줄기세포파쇄추출물 단독으로 농도별 처리결과, 통계적으로 유의한 세포 독성이 나타나지 않았다.
2) 도 11에 도시된 바와 같이, 마우스 대식세포의 염증반응 유발물질인 Lipopolysaccharide (LPS) 1㎍/ml과 함께 줄기세포파쇄추출물을 처리한 결과 세포 독성이 나타나지 않았다.
2-1. 세포형태변화
줄기세포파쇄추출물을 2㎍/ml을 마우스 대식세포 (RAW 246.7)에 24시간 처리한 후, 세포형태 변화를 확인하였다.
2-2. 결과
염증유발인자인 LPS 1㎍/ml을 처리한 그룹에서 대조군 그룹에 비해 대식세포의 활성화가 비교적 증가함을 확인하였다.
도 12에 도시된 바와 같이, 줄기세포파쇄추출물과 LPS 1㎍/ml을 함께 처리한 세포에서 LPS 1㎍/ml를 단독으로 처리한 그룹에 비해 대식세포의 활성화가 비교적 적게 발생하였다.
3-1. 산화질소
생성염증유발인자인 LPS 1㎍/ml를 전처리한 마우스 대식세포(RAW 246.7)에 줄기세포파쇄추출물을 0.4㎍/ml에서 2㎍/ml까지 농도로 24시간 처리한 후, griess assay를 통해 세포의 산화질소농도를 확인하였다.
*3-2. 결과
LPS 자극에 의해 산화질소의 생성이 증가하였다.
도 13에 도시된 바와 같이, LPS만 처리한 그룹에 비해 LPS와 줄기세포파쇄추출물을 같이 처리한 그룹에서 산화질소의 농도가 통계적으로 유의한 감소를 확인하였다.
*4-1. iNOS 및 COX-2 단백질 발현 변화
염증유발인자인 LPS 1㎍/ml를 전처리한 마우스 대식세포(RAW 246.7)에 시험물질 줄기세포파쇄추출물을 1㎍/ml과 2㎍/ml의 농도로 24시간 처리한 후, western blot 분석을 통해 염증성 효소 iNOS와 COX2 단백질 발현을 확인하였다.
4-2. 결과
도 14에 도시된 바와 같이, LPS만 처리한 그룹에 비해 시험물질 T-STEM을 같이 처리한 그룹에서 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2 단백질 발현이 감소함을 확인하였다.
5-1. 염증성 사이토카인 생성
염증유발인자인 LPS 1㎍/ml를 전처리한 마우스 대식세포(RAW 246.7)에 줄기세포파쇄추출물을 1㎍/ml과 2㎍/ml의 농도로 24시간 처리한 후, ELISA 분석법을 통해염증성 사이토카인 생성(TNFα, IL-1β)을 확인하였다.
5-2. 결과
LPS 자극에 의해 염증성 사이토카인의 생성량이 증가함을 확인하였다.
도 15 및 도 16에 도시된 바와 같이, 시험물질 줄기세포파쇄추출물 처리에 의해 염증성 사이토카인의 감소를 관찰하였다.
본 발명에 의한 줄기세포 파쇄추출물의 유효성분의 효능은 다음과 같다.
먼저, 치매의 원인은 베타아밀로이드 독성단백질과 타우 단백질의 변성으로 발생되는데, 제대혈유래 중간엽 줄기세포를 알츠하이머병 생쥐의 양쪽 해마에 반복 이식했을 때 기억력 향상, 뇌 내 베타 아밀로이드의 양을 감소시키며, 생쥐의 뇌조직에서 베타 아밀로이드를 생성시키는 효소인 β -secretase1의 양이 감소되고, 미세아교세포의 염증성 시토카인의 분비가 억제되고 항염증 시토카인의 분비가 증가됨을 확인된다. 위 결과들로 인해 타우 단백질의 과인산화도 억제된다.
따라서, 중간엽 줄기세포가 알츠하이며 치매의 진행을 억제시키고, 치매의 원인이 되는 베타아밀로이드 독성단백질의 양을 감소시킨다는 결과가 있어, 줄기세포파쇄성분추출물(쉘드줄기세포)은 면역거부반응을 제거한 줄기세포 유효성분이 밀집되어있는 물질로 치매치료에 사용될 수 있을 것이다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다.
그리고, 잇몸병은 치아뿌리와 잇몸의 뼈, 잇몸 등에 염증이 생김으로 인해 발병되는데, 본 발명의 줄기세포의 파쇄추출물이 잇몸, 잇몸뼈를 재생할 수 있도록 줄기세포가 도움이 될 수 있다.
즉, 줄기세포 성장인자들이 염증억제, 뼈, 연골, 잇몸세포 재생, 상처치유재생 촉진 도움을 주므로 잇몸치료제로 사용될 수 있다, 특히, 프로콜라겐, 그물망처럼 생긴 콜라겐 네트워크가 세포와 세포를 서로 단단하게 접착시켜주며, 세포가 만들어지고 혈관, 뼈, 관절 등 인체의 많은 부분이 제 기능을 하도록 도와주는 환경 제공을 제공하므로 잇몸병치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다.
그리고, 관절 및 관절주위염은 노화, 부상 등 관절주위 염증으로 인해 발생되는데, 본 발명의 줄기세포 파쇄추출물이 염증억제, 뼈, 연골, 잇몸세포 재생, 상처치유재생 촉진 도움을 주므로 잇몸치료제로 사용될 수 있다. 프로콜라겐 그물망처럼 생긴 콜라겐 네트워크가 세포와 세포를 서로 단단하게 접착시켜주며, 세포가 만들어지고 혈관, 뼈, 관절 등 인체의 많은 부분이 제 기능을 하도록 도와주는 환경 제공을 제공하므로, 관절염 및 관절주위염의 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다.
그리고, 탈모의 원인은 환경적요인, 유전적요인 등 다양한데, 본 발명에 의한 줄기세포 파쇄추출물 중 VEGF 성장인자가 모낭성장에 도움을 주고, KGF 및 모근을 자극하여 모발 강화에 도움을 주므로 탈모의 치료제로 사용될 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다.
그리고, 피부노화의 원인은 환경적 요인, 유전적 요인 등 다양한데, 본 발명인 줄기세포 파쇄추출물 중 KGF, 새로운 세포생성(콜라겐)기능을 통해 주름방지, 회복, 피부보호, 젊은피부유지 및 UV자극방어하는데 도움을 주고, 그물망처럼 생긴 콜라겐 네트워크가 세포와 세포를 서로 단단하게 접착시켜주어, 피부탄력에 도움을 주므로 피부치료제로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명을 통해 세포 수득률, 유효성분의 수득률을 높였으므로, 기존 줄기세포 자체를 사용하는 것보다 위험성이 적고 효과가 뛰어난 치료제로 사용될 수 있다.
이와 같이, 상술한 본 발명의 기술적 구성은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자가 본 발명의 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시 될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다.
그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌것으로서 이해되어야 하고, 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위에 나타나며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

  1. 기본배지;
    히알루론산; 및
    첨가조성물을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성물 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 첨가조성물은,
    글리신, 히스티딘, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 히드록시프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린, bFGF, EGF, VEGF, KGF, HGF, TGF, 비타민C, 비타민B1, 비타민B12, 비타민E, 셀레늄, 트랜스페린을 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성물 제조방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 기본배지는,
    DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F12, DMEM-F12, α-MEM(α-Minimal Essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium), IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), MacCoy's 5A 배지, AmnioMax, AminoMaxⅡ complete Medium, Chang's Medium MesemCult-XF Medium 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성물 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서,
    상기 첨가조성물은 상기 배지조성물에 대하여 히알루론산은 10㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 글리신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 히스티딘은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 이소류신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 메티오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 페닐알라닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 프롤린은 10ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 히드록시프롤린은 5ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 세린은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 트레오닌은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 트립토판은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 티로신은 1ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 발린은 2ng/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 bFGF는 9㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 EGF는 1.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 VEGF는 1㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 KGF는 1.2㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 HGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 TGF는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 비타민C는2㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 비타민B1는 0.5㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 비타민B12는 3㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 비타민E는 500㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 셀레늄은 1.8㎍/㎖의 농도로 포함되고,
    상기 트랜스페린은 12㎍/㎖의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 배지 조성법을 이용한 줄기세포파쇄추출 제조방법.
  5. 줄기세포를 추출하는 제 1단계;
    제 1항의 배지조성물의 배지에 상기 추출된 줄기세포를 배양하는 제 2단계;
    상기 줄기세포를 계대배양하는 제 3단계;
    상기 배양된 줄기세포에서 세포를 획득하는 제 4단계;
    상기 획득된 세포를 파쇄하는 제 5단계; 및
    상기 파쇄된 물질을 여과하는 제 6단계;
    상시 6단계 여과된 물질을 동결건조하여 보관 하거나 활용하는 7단계;
    를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 줄기세포 대량배양용 배지 조성법과 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 제 5단계에서,
    내부에 공간이 형성되는 외부와 내부가 차단되는 몸체부(10)와,
    상기 몸체부(10) 내부에 마련되고 상방이 개구되는 제 1용기부(12)와,
    상기 제 1용기부(12)에 대해 상대적으로 작은 크기로 형성되며, 상기 제 1용기부(12) 내에 마련되며 상방이 개구되어 내부에 줄기세포가 투입되는 제 2용기부(14)와,
    상기 제 2용기부(14) 내부의 줄기세포를 파쇄하는 파쇄부(16)와, 상기 몸체부(10) 내부로 공기의 유동을 단속하는 밸브(18)와, 상기 몸체부(10) 내부에서 공기를 흡입하는 펌프(20)를 포함하는 줄기세포 유효성분 추출장치를 이용하고,
    상기 줄기세포는 저장성 용액에 투입후 상기 제 2용기부에 투입하는 것을 특징으로 하는 줄기세포 유효성분 3저 추출법을 이용한 줄기세포파쇄추출물 제조방법.
  7. 제 5항의 줄기세포파쇄추출물을 이용한 항염증 치료용 조성물.
  8. 제 5항의 줄기세포파쇄추출물을 이용한 세포재생 치료용 조성물.
  9. 제 5항의 줄기세포파쇄추출물을 이용한 항관절염 치료용 조성물.
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