KR20130099927A - 인간 다분화능 세포 배양을 위한 단순화된 기본 배지 - Google Patents

인간 다분화능 세포 배양을 위한 단순화된 기본 배지 Download PDF

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Abstract

다분화능 세포 생존, 증식, 클로닝 및 유도를 지지하는 완전 규정 배지와 이 배지를 포함하는 방법 및 조성물에 관해 기재한다. 규정된 이종물질 비함유 조건 하에 성체 개체로부터 iPS 세포를 유도하는 방법에 관해서도 기재한다.

Description

인간 다분화능 세포 배양을 위한 단순화된 기본 배지{SIMPLIFIED BASIC MEDIA FOR HUMAN PLURIPOTENT CELL CULTURE}
관련 출원에 대한 상호 참조
적용되지 않음
연방 정부 지원 연구 또는 개발에 관한 언급
본 발명은 미국 국립보건원에 의해 허여된 ES017166 하에 정부 지원에 의해 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
배아 줄기(embryonic stem: ES) 세포 및 유도 만능 줄기(induced pluripotent stem cell: iPS) 세포와 같은 다분화능 세포는 3개 모두의 1차 배엽의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 갖는다(Thomson, et al., Science 282, 1145-1147 (1998)). 다분화능 세포의 놀라운 발달 잠재력은 기초 연구 및 임상적 적용에 유용한 것으로 입증되었다. 증식 배지, 플레이트 코팅 및 기타 조건 등의 인간 다분화능 세포 배양을 위한 수많은 기본적 방법이 개발되었고 개량되었다(Ludwig et al., Nat. Biotechnol 24, 185-187 (2006); Ludwig et al., Nat. Methods 3, 637-646 (2006)). 예를 들어, 인간 ES 세포는 초기에는 뮤린(murine) 배아 섬유아세포(MEF) 피더 세포(feeder cell) 상에서 우태 혈청(FBS) 함유 배지에서 배양되었지만, 지금은 완전 규정 배지뿐만 아니라 규정 단백질 매트릭스가 이용 가능하다(Ludwig et al., Nat. Biotechnol 24, 185-187 (2006)).
지난 십년에 걸쳐, 다분화능 세포 배양법이 크게 발전하였다. 다분화능 세포의 생존 및 증식을 위한 기본 영양분 및 성장 인자를 제공하고 세포가 어떻게 성장하여 분화할지를 직접 결정하는 몇 종의 증식 배지가 개발되었다. TeSRTM은 복수의 배양 계대를 통해 피더 세포 또는 조건 배지(conditioned medium) 부재 하에 미분화 상태로 다분화능 세포 유지를 지지하는 최초의 규정 배지 중 하나였다(Ludwig et al., Nat. Methods 3, 637-646 (2006); 미국 특허 제7,449,334호, 이들 각각은 그 전체가 기재된 것처럼 본원에 참고문헌으로 포함됨). TeSRTM은 그 자체가 52종의 성분을 함유하는 기본 배지 DMEM/F12 이외에도 18종의 성분을 포함한다(표 1).
다분화능 세포 배양에 이용 가능한 다종 다양한 증식 배지는 연구 결과의 비일관성의 원인이 되고 있다. 완전 규정 배지를 비롯하여 다분화능 세포 유도 및 성장을 위해 현재 사용되고 있는 배지는 다양한 방식으로 다분화능 세포에 영향을 줄 수 있는 성분들을 포함하고 있다. 여기에 기재된 본 발명 이전에는, 각각의 배지 성분이 단독으로 또는 다른 성분들과 조합하여 세포 배양에 있어서의 생존력, 다분화성 또는 분화와 같은 다양한 다분화능 세포 기능에 영향을 미친다는 것이 알려지지 않았다.
예를 들어, 대부분의 배지에 존재하는 가장 풍부한 단백질 성분인 알부민은 지질 캐리어이며, 따라서 결합된 지질을 통해 분화 또는 다분화성의 유지에 영향을 줄 수 있다. 알부민과 그 결합된 지질의 특성이 이것이 인간 다분화능 세포 배양에 사용될 수 있는지를 결정한다. 그러나, 알부민 특성은, 재조합 유전 물질로부터 제조된 경우라도 그 공급원에 따라 크게 달라서, 동등한 다른 조건 하에 수행된 실험들 간의 편차에 기여한다. 또한, 클로닝된 인간 혈청 알부민이 이용 가능하지만, 이것은 비교적 높은 가격으로 인해 통상적인 실험에는 거의 이용되지 않는다.
배지로부터 알부민을 제거하기 위한 노력은 성공적이지 않은 것으로 판명되었다. TeSR 중에 존재하는 알부민 또는 임의의 다른 성장 인자의 생략은 세포 생존력, 성장 및 다분화성의 감소와 같은 인간 ESC 배양 효율의 큰 감소를 초래하였다(Ludwig et al., Nat. Biotechnol 24, 185-187 (2006)).
신약 개발, 테스트 및 이식 요법을 위해 다분화능 세포의 잠재력을 충분히 활용하기 위해서는, 완전히 규정된 조건, 이상적으로는 이종물질 비함유(xeno-free) 조건 하에서의 이들 세포의 유도 및 증식이 바람직하다. 따라서 당업계에는 다분화능 세포 배양 조건에 대한 컨트롤을 유지하기 위해 비일관성을 도입하는 성분들을 함유하지 않는 배지에 대한 필요성을 충족할 필요가 있다. 구체적으로, 당업계에는 특정 배양 목적에 있어서 중요한 다분화능 세포 기능을 지지하는 성분들만을 포함하는 다분화능 세포 배양 배지가 요구된다.
본 발명은 일반적으로 다분화능 세포를 유도하고 배양하기 위한 배지, 조성물 및 방법에 관한 것이고, 더 특히 다분화능 세포를 위한 완전 규정 배지에 관한 것이다.
제1 양태에서, 본 발명은 다분화능 세포의 생존력, 성장 및 다분화성을 지지하는 무알부민 배지로서 요약된다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 셀레늄을 포함한다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 NODAL을 포함한다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 트랜스페린을 포함한다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)를 포함한다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 단지 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)를 각각 다분화능 줄기 세포 생존력을 지지하기에 충분한 양으로 포함한다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 단지 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 다분화능 줄기 세포 증식을 지지하기에 충분한 양으로 포함한다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 다분화능 세포의 계대, 동결, 증식, 다분화성, 유도 및 클로닝 후의 생존력을 지지한다.
제1 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 이종물질 비함유이다.
제2 양태에서, 본 발명은 규정 배지에서 다분화능 줄기 세포를 배양하는 방법으로서 요약된다. 제2 양태의 몇몇 실시형태에서, 다분화능 세포를 배양하는 데 사용되는 배지는 단지 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린 및 FGF를 각각 다분화능 세포 생존력을 지지하기에 충분한 양으로 포함한다. 제2 양태의 몇몇 실시형태에서, 다분화능 세포를 배양하는 데 사용되는 배지는 단지 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 다분화능 줄기 세포 증식을 지지하기에 충분한 양으로 포함한다. 제2 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 다분화능 세포의 장기간에 걸친 성장, 다분화성, 클로닝, 동결 또는 유도를 지지하는 규정 인자를 포함한다. 제2 양태의 몇몇 실시형태에서, 다분화능 세포를 배양하는 데 사용되는 배지는 이종물질 비함유이다.
제3 양태에서, 본 발명은 β-머캅토에탄올 및 알부민을 실질적으로 포함하지 않는 배지 중의 다분화능 세포의 시험관내 세포 배양 조성물에 관한 것이다, 제3 양태의 몇몇 실시형태에서, 배양 조성물은 섬유아세포 피더 세포, 조건 배지 및 이종물질 오염을 포함하지 않는다.
제4 양태에서, 본 발명은 완전 규정 조건 하에 성체 개체(adult individual)로부터 iPS 세포를 유도하는 방법으로서 요약된다. 이 방법은 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린 및 FGF를 모두 생존력을 유지하기에 충분한 양으로 포함하는 배지에서 성체 개체로부터 체세포를 배양하는 단계 및 예컨대 iPS 세포를 유도하기 위해 규정 조건 하에 세포를 리프로그래밍(reprogramming)하는 단계를 포함한다.
제4 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 리프로그래밍 과정의 일부에서 또는 전부에서 TGF-β를 포함한다.
제4 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 부티레이트를 포함한다.
제4 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 하이드로코티손을 포함한다.
제4 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 이종물질 비함유이다.
제5 양태에서, 본 발명은 무알부민 배지 중에서 다분화능 줄기 세포를 클로닝하는 방법으로서 요약된다. 이 방법은 다분화능 줄기 세포 클로닝을 지지하는 무알부민 배지 중에서 클로닝 밀도로 다분화능 줄기 세포를 플레이팅하는 단계를 포함한다.
제5 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 ROCK 억제제를 포함한다.
제5 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 블레비스타틴을 포함한다.
제5 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 단지 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 다분화능 줄기 세포 클로닝을 지지하기에 충분한 양으로 포함한다.
제6 양태에서, 본 발명은 무알부민 배지 중에서 다분화능 줄기 세포를 냉동보존(cryopreserve)하는 방법으로서 요약된다. 이 방법은 무알부민 배지 중에서 다분화능 줄기 세포를 동결시키는 단계를 포함한다.
제6 양태의 몇몇 실시형태에서, 배지는 단지 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린; TGF-β와 NODAL 중 하나, 및 디메틸 설폭시드(DMSO)를 포함한다.
제7 양태에서, 본 발명은 무알부민 조건 하에 유도된 iPS 세포로서 요약된다. 알부민 부재 하에 유도된 iPS 세포는 내인성 알부민 오염을 포함하지 않는다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 다분화능 세포를 유도, 배양 및 사용하기 위한 다양한 용도에 유용하다. 본 발명의 목적은 의도된 배양 목적을 지지하는 인자로 한정된 다분화능 세포를 위한 단기 및 장기 배양 조건을 규정하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 미분화 상태의 배양 세포의 비율을 최대로 하는 다분화능 세포를 위한 배양 조건을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다양한 조건이 다분화능 세포에 어떻게 영향을 주는지 관찰하고 다양한 배지 환경에서 이전에 보고된 실험과 비교하는 데 필요한 플랫폼으로서 이용될 수 있는 배지를 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 특징들과 다른 특징들, 목적들 및 이점들은 후술하는 상세한 설명으로부터 더 잘 이해될 것이다. 상세한 설명에서는 본원의 일부를 형성하는 첨부된 도면을 인용하였으며, 여기에서는 본 발명의 실시형태가 제한 없이 예시된다. 바람직한 실시형태의 설명은 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니며, 모든 변경예, 균등예 및 대안예를 커버하기 위한 것이다. 따라서, 본 발명의 범위를 해석하기 위해서는 본원에 인용된 청구범위를 참조해야 한다.
후술하는 상세한 설명을 고려할 때 본 발명이 더 잘 이해될 것이고 상기에 기재된 것 이외의 특징, 양태 및 이점이 명백해질 것이다. 그러한 상세한 설명은 하기 도면을 인용한다.
도 1a∼1e는 배양에 있어서의 인간 ES 세포 생존 및 자기 재생을 위한 배지 요소를 예시한다. 도 1a는 다양한 배지 중에 플레이팅된 개별화된 세포에 대한 24시간 생존 지수를 예시한다. 배지 약어는 표 1에 기재된 바와 같다. 인슐린 및 섬유아세포 성장 인자(IF), 소 혈청 알부민(BSA), 베타-머캅토에탄올(BME)의 존재는 "+"로 표시되어 있고, 부재는 "-"로 표시되어 있다. 도 1b는 다양한 배지 중에 플레이팅된 개별화된 세포에 대한 24시간 및 96시간 생존 지수를 예시한다. 인슐린 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 첨가는 "+"로 표시되어 있고, 제거는 "-"로 표시되어 있다. 도 1c는 비타민 C 함유 TeSRTM 배지, 비타민 C 비함유 TeSRTM 배지(TeSRTM-LAA), 또는 DF5 배지 중에서 배양된 개별화된 세포에 대한 24시간 또는 129시간 생존 지수를 예시한다. 도 1d는 DF5, 셀레늄 첨가 DF5(DF5+셀레늄), DF12, 또는 셀레늄 제거 DF12(DF12-셀레늄) 중에서의 각각의 3회 계대 후의 세포 증식을 예시한다. 도 1e는 12종의 상이한 기본 배지의 비교 분석을 예시한다.
도 2a∼2f는 DF5S에 의한 인간 ES 세포 및 iPS 세포 배양 조건의 최적화를 예시한다. 도 2a는 DF5S(아래쪽) 또는 TeSRTM(위쪽)에서 저밀도로(∼1,500개 세포/cm2) 시딩되고 상이한 O2 및 CO2 농도(O15C5: 15% O2 및 5% CO2; O15C10: 15% O2 및 10% CO2; O5C10: 5% O2 및 10% CO2)에서 배양된 개별화된 세포에 대한 생존 지수를 도시한다. 세포 생존력은 24시간 및 124시간째 조사되었다. 도 2b는 소분자 HA100 존재 하(+HA100) 또는 부재 하에 다양한 배지 중에서 배양된 H1 세포의 클로닝 효율을 도시한다(CM100: 100 ng/ml의 FGF를 포함한 조건 배지). 도 2c는 다양한 배지 중에서의 포피 섬유아세포로부터 유도된 iPS 세포 및 H1 세포의 클로닝 효율을 도시한다. 도 2d는 다양한 배지 중에서의 포피 섬유아세포로부터 유도된 iPS 세포의 클로닝 효율을 도시한다. DF5S trFe는 홀로트랜스페린이 첨가된 DF5S 배지를 나타낸다. 도 2e는 HA100(10 μM, 24시간), 블레비스타틴(10 μM, 4시간), 또는 Y27632(10 μM, 24시간) 존재 하에 다양한 배지 중에서 배양된 H1 세포의 클로닝 효율을 이들 인자 부재 하의 클로닝 효율(대조군)과 비교하여 예시한다. *는 p<0.05를 나타낸다. 도 2f는 정상 산소(진회색 막대) 또는 저산소(연회색 막대) 조건 하에서의 조건 배지(CM), ROCK 억제제(HA100) 함유 CM, ROCK 억제제 함유 TeSR, 및 ROCK 억제제 함유 E8 중에서의 H1 세포의 클로닝 효율을 예시한다. 오차 막대는 평균의 표준 오차를 나타내고; *는 p<0.05를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, L-아스코르브산, FGF2, 및 TGF-β 또는 NODAL(본원에서 각각 "E8(TGF-β)" 및 "E8(NODAL)"로 칭함)이 보충된 DMEM/F12에서의 다분화능 세포 성장 및 유전자 발현을 예시한다. 도 3a는 TeSRTM(진회색 선) 또는 E8(TGF-β(연회색 선) 중에서 유지된 H1 ES 세포(위쪽) 및 iPS 세포(아래쪽)의 증식 배수를 예시한다. 도 3b는 E8(TGF-β) 중에서 배양된 H1 ES 세포 및 TeSRTM 중에서 배양된 H1 ES 세포의 전체 유전자 발현을 예시한다. TeSR 또는 E8(TGFβ) 배지 중에서 3회 계대 동안 유지된 H1 세포의 RNA를 Illumina Genome Analyzer GAIIX를 이용한 RNA-seq로 분석하였다(전체 유전자 발현 상관관계 R = 0.954 (Spearman Correlation)).
도 4a∼4f는 규정 조건 하에서의 iPS 세포 유도를 예시한다. 도 4a는 다양한 섬유아세포 성장 인자(FGF)가 첨가된 DF5SFe 기초 배지 중에서의 포피 섬유아세포의 증식을 FBS 함유 배지 중에서의 증식과 비교하여 예시한다. 도 4b는 하이드로코티손이 보충된 다양한 배지 중에서의 섬유아세포 성장을 도시한다. 도 4c는 다분화성 마커 OCT4(왼쪽) 및 SSEA4(오른쪽)의 발현을 도시한다. 도 4d는 포피 섬유아세포, hES 세포, 피더 세포 상에서 유도된 iPS 세포(iPS 세포(피더)), 및 E8 배지 중에서 유도된 iPS 세포(iPS 세포(E8))에 의한 선택된 유전자의 발현을 예시한다. 모든 세포는 RNA 분석 전에 E8(TGFβ) 배지 중에서 유지되었으며, 단, 섬유아세포는 하이드로코티손을 포함한 E8 중에서 유지되었다. 도 4e는 E8(TGFβ) 배지 중에서 유도된 인간 ES 및 iPS 세포의 전체 유전자 발현을 예시한다(R = 0.955). 도 4f는 E8(TGFβ) 배지 중에서 유도된 MEF 및 iPS 세포 상에서 유도된 iPS 세포의 전체 유전자 발현을 예시한다.
도 5a∼5c는 iPS 세포 유도를 위한 배지 개량을 예시한다. 도 5a는 FGF 없이 TGF-β, 하이드로코티손, TGF-β 및 하이드로코티손, 또는 TGF-β 및 하이드로코티손이 보충된 DF5SFe 배지 중에서의 포피(진회색 막대) 및 PRPF8-2 성체 섬유아세포(연회색 막대)의 증식을 도시한다. 도 5b는 포피 섬유아세포의 리프로그래밍에 대한 TGF-β 및 부티레이트의 영향을 예시한다. 초기 리프로그래밍 트랜스펙션으로부터 4∼5주 후, 형질전환 세포 및 본래의(true) iPS 세포에 대한 콜로니수를 스코어링하고 iPS 콜로니 대 비-iPS 세포 콜로니의 비를 계산하였다.
도 6a 및 6b는 2차 계대 없이 완전 규정 조건 하에서의 성체 섬유아세포로부터의 iPS 세포의 유도를 예시한다. 도 6a는 리프로그래밍 프로토콜의 예를 예시한다. 도 6b는 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, L-아스코르브산, FGF2, 및 TGF-β 또는 NODAL이 보충된 DMEM/F12("E8") 중에서 20회 계대 동안 유지된 iPSC 세포주의 유세포 분석에 의해 측정된 다분화성 마커 OCT4 및 SSEA4의 발현을 예시한다. 음영 피크: OCT4(왼쪽) 및 SSEA4(오른쪽)에 특이적인 항체로 염색(왼쪽); 비음영 피크: 마우스 IgG 대조군 항체.
도 7a∼7c는 다양한 배지 중에서의 인간 섬유아세포의 리프로그래밍 효율을 예시한다. 도 7a는 마우스 섬유아세포 피더 세포(MEF)를 사용한 또는 E8에 기초한 배지 중에서의 리프로그래밍에 적용된 80,000개 섬유아세포당 iPS 세포 콜로니의 수를 예시한다. 효율을 개선하기 위해, 양 조건에 100 μM의 부티르산나트륨을 첨가하였다. 도 7b는 TeSRTM 중에서 또는 E8에 기초한 배지 중에서의 리프로그래밍에 적용된 80,000개 섬유아세포당 iPS 세포 콜로니의 수를 예시한다. 도 7c는 완전 규정 조건 하에서의 포피 섬유아세포의 리프로그래밍 효율에 대한 TGF-β 및 부티레이트 노출 시간의 영향을 예시한다. 섬유아세포를, 100 μM 부티레이트 존재 또는 부재 하에, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, L-아스코르브산 및 FGF2가 보충된 DMEM/F12(TGF-β 비함유 E8) 또는 E8 중에서 리프로그래밍하였다. 모든 조건에 대한 리프로그래밍 효율은 리프로그래밍 30일 후에 분석하였다. *는 p<0.05를 나타낸다.
본 발명은 다양한 변형 형태 및 대안 형태로 실시가 가능하지만, 그 예시적인 실시형태를 도면을 이용하여 예로서 기재하였고 본원에서 상세히 설명하였다. 그러나, 예시적인 실시형태의 설명은 본 발명을 개시된 특정 형태에 한정하려는 의도는 아니며, 그와는 반대로 그 의도는 본 발명의 사상 및 범위를 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 것에 속하는 모든 변경예, 균등예 및 대안예를 커버하려는 것이다.
본 발명은 다분화능 세포의 배양에 필수적이라고 생각되었던 특정 배지 성분이 특정 배양 목적을 달성하기 위해 조제되는 다분화능 세포 배양 배지로부터 생략될 수 있다는 본 발명자들의 관찰에 관한 것이다.
본원에서 사용될 때, 용어 "다분화능 세포(pluripotent cell)"는 3개의 모든 배엽 세포로 분화될 수 있는 세포를 의미한다. 다분화능 세포의 예는 배아 줄기 세포 및 유도 만능 줄기(iPS) 세포를 포함한다. 본원에서 사용될 때, "iPS 세포"는, 본원에 기재된 바와 같이, 기원의 그 개개의 분화된 체세포와 유전적으로 실질적으로 동일하고 ES 세포와 같이 다분화능이 더 큰 세포와 유사한 특성을 나타내는 세포를 의미한다. 이 세포는 비다분화능 세포(예를 들어, 다능 세포(multipotent cell) 또는 체세포)를 리프로그래밍함으로써 얻을 수 있다.
본 발명은 특정 배양 목적에 필수적이지 않은 인자를 포함하지 않는 새로운 배지에 관한 것이다. 배양 목적의 예는 세포 생존, 계대배양, 증식, 다분화성, 클로닝 및 iPS 세포 유도를 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로, 본 발명은 무알부민 배지에 관한 것이다.
명확히 하자면, "계대(배양)(passaging)"와 "클로닝(cloning)"은 상이한 방법이다. "계대"는 배양 용기에서 특정 밀도까지 배양되어 응집체를 이루고 그 후 새로운 배양 용기로 옮겨지는 세포 분열 과정을 말한다. 이들 응집체는 임의의 수, 전형적으로 100∼1,000개 세포를 포함할 수 있으며, 배양 상태에서 증식을 쉽게 개시한다. 이와는 달리, "클로닝"은 하나의 개별 ES 세포로부터 인간 ES 세포 콜로니를 성장시킴으로써 클론 콜로니를 개시시키는 것을 말한다. 본원에서 사용될 때, "클로닝 효율"은 새로운 세포 콜로니를 형성하는 개별화된 세포의 수를 배양 상태로 플레이팅된 개별화된 세포의 수로 나눈 것을 의미한다. 클로닝 효율은 배양 조건에 따라 크게 달라진다. 예를 들어, MATRIGEL® 상에서의 규정 조건 및 이종물질 비함유 조건 하에서의 인간 ES 세포의 클로닝 효율은 매우 낮은 반면(즉, 약 0.1% 미만), 섬유아세포 조건 배지를 이용하여 배양한 이들 세포의 클로닝 효율은 여전히 낮긴 하지만(즉, 약 2% 미만) 클론 ES 세포 콜로니를 개시시킬 정도로는 충분히 높다.
현재 사용되고 있는 특정 배지 성분은 배양 세포에 손상을 주거나 분화를 유도할 수 있다. 예를 들어, β-머캅토에탄올은 배양된 다분화능 세포에 손상을 주어 심지어 사멸시킬 수 있다. 혈청 배지 첨가제, 예컨대 소 혈청 알부민(BSA) 또는 우태 혈청(FCS)은 배양된 다분화능 세포의 분화를 유도할 수 있다. 또한, 상업적으로 입수 가능한 혈청 성분은 동일한 공급원으로부터 공급된 것이라도 그 조성이 크게 다를 수 있어서 예측할 수 없는 배양 편차를 도입할 수 있다. 본원에 기재된 배지는 대부분의 통상적인 다분화능 세포 배양 배지 중에 존재하는 손상성, 분화성 및 비규정 인자를 실질적으로 포함하지 않는다. 개시된 배지는 단기의 다분화능 세포 생존을 지지하는 것(예를 들어 24시간, 단기 증식, 예를 들어, 4∼5일), 장기간에 걸친 배양 기간 동안 다분화능 세포를 유지하는 것(예를 들어 3개월 동안 25회 초과의 계대) 및 렌티바이러스 및 에피솜 벡터를 사용하여 태아 및 성체 섬유아세포로부터 iPS 세포를 유도하는 것과 같은 다양한 배양 목적을 위해 성공적으로 사용되었다.
특정 세포 배양 목적을 위해 특이적으로 조정된 신규한 최소 배지를 개발하였다. 염, 비타민, 글루코스원, 미네랄 및 아미노산과 같은 다양한 배지 성분들을, 이들 각각이 생존, 성장 또는 다분화성에 미치는 영향을 확인하기 위해 단독으로 또는 조합으로 테스트하였다. 신규한 생존 어세이(survival assay)를 개발하여, 해리 후 다분화능 세포 생존에 어떤 성분이 필수적인지를 확인하기 위해 이용하였다. 신규한 배지를 증식을 지지하고 다분화성을 유지할 수 있는 그 능력에 대해 테스트하였다. 또한 이들 배지를, 각각의 배지가 단일 세포 및 그 클로닝 효율에 어떻게 영향을 미치는지를 결정하기 위한 클로닝 어세이에 이용하였다. 본원에 기재된 각각의 새로운 배지에 대한 성분들의 완전한 리스트를 표 1에 기재하였다(연한 음영 영역과 진한 음영 영역은 배지 중의 성분의 존재를 나타내고, 체크 무늬 영역은 상호 교환 가능한 성분을 나타내며, 무늬가 없는 영역은 배지 중의 성분의 부재를 나타낸다).
Figure pct00001
본원에 기재된 다양한 배지는 기본 성분들로부터 제조될 수 있다. 대안으로, 당업자는 개시된 신규한 배지를 제조하기 위해 출발 물질로서 기본 배지를 이용하는 것의 유익한 효율을 이해할 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "기본 배지(basal medium)"는 특수한 배지 첨가제를 필요로 하지 않는 단세포 유기체 및 세포의 성장을 지지하는 배지를 의미한다. 전형적인 기본 배지 성분은 당업계에 알려져 있고, 염, 아미노산, 비타민 및 탄소원(예를 들어, 글루코스)을 포함한다. pH 인디케이터 페놀 레드와 같이 배지의 기본 특성을 바꾸지 않지만 달리 바람직한 다른 성분들도 포함될 수 있다. 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle medium):뉴트리언트 믹스쳐(Nutrient Mixture) F-12(DMEM/F12)가 포유동물 세포 배양을 위한 적절한 증식 배지를 제조하는 데 일반적으로 사용되는 기본 배지이다. DMEM/F12의 성분들의 전체 리스트는 하기 표 2에 기재되어 있다.
Figure pct00002
달리 정의하지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자가 일반적으로 이해하고 있는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료는 본원에 기재한 것이다.
본 발명의 실시형태를 기재하고 청구범위를 작성함에 있어서, 이하의 용어를 후술하는 정의에 따라 사용할 것이다.
본원에서 사용될 때, "약"은 언급된 농도 범위의 5% 이내 또는 언급된 시간 프레임의 5% 이내를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "실질적으로 무혈청의"는 배지가 혈청 또는 혈청 대체물질을 포함하지 않거나 배지가 혈청 또는 혈청 대체물질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 예를 들어, 실질적으로 무혈청의 배지는 약 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% 또는 1% 미만의 혈청을 포함할 수 있으며, 이때 배지의 배양 능력은 여전히 관찰된다.
본원에서 사용될 때, 용어 "규정 배양 배지(defined culture medium)" 또는 "규정 배지(defined medium)"는 각각의 배지 성분의 실체 및 양이 알려진 배지를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "실질적으로 ∼로 이루어진 배지"는 특정 성분을 포함하고 경우에 따라 그 기본 특성에 실질적으로 영향을 주지 않는 다른 성분을 포함하는 배지를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "유효량"은 본 발명에 따라 특정한 세포 효과를 일으키는 데 충분한 양을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "생존(력)(viability)"은 생존하고 있는 상태를 의미한다. 생존 가능한 다분화능 세포는 세포 플레이트 표면에 부착하여 세포막의 파괴 없이는 염료 프로피듐 요오다이드에 의해 염색되지 않는다. 단기 생존력은 세포를 배양액에 플레이팅한 후 처음 24시간에 관한 것이다. 일반적으로, 세포는 그 시간 내에 증식하지 않는다.
본원에서 사용될 때, "단기 성장(short-term growth)"은 배양액 중에서의 4∼5일 동안의 세포 증식을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "장기간에 걸친 성장(extended growth)"은 5회 이상의 계대 동안의 성장을 의미한다. 일반적으로, 배지를 20회 초과의 계대(약 2∼3개월) 동안 다분화능 세포 성장을 지지할 수 있는 그 능력에 대해 테스트한다.
본원에서 사용될 때, "장기 배양(long-term growth)"은 15회 초과의 계대(약 2개월의 배양)를 의미한다.
본원에서 사용될 때, "다분화성(pluripotency)"은 3개 배엽 모두의 세포로 분화할 수 있는 세포의 능력을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "클로닝(cloning)"은 출발 배양물로부터, 이상적으로는 단일 다분화능 세포로부터 또는 적어도 매우 적은 수의 세포로부터 세포 배양을 개시하는 과정을 의미한다. 미분화 다분화능 세포의 클론 배양을 가능하게 하는 배양 조건은 정상적인 다분화능 세포 배양 및 증식에 요구되는 모든 조건을 가장 요구하는 조건일 수 있다.
본원에서 사용될 때, "iPS 세포 유도"는 다분화능이 아닌 세포를 다분화능이 되도록 리프로그래밍하는 것을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "이종물질 비함유(xeno-free)"는 배양된 세포의 것 이외의 다른 임의의 세포 또는 다른 종류의 세포 생성물을 포함하지 않는 배양 조건을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "정상 산소 조건(normoxic condition)"은 약 20%의 산소를 포함하는 조건을 의미한다.
본원에서 사용될 때, "저산소 조건(hypoxic condition)"은 약 20% 미만의 산소, 예를 들어 약 5%의 산소를 포함하는 조건을 의미한다.
본 발명은 후술하는 비한정적인 실시예를 고려할 때 더 충분히 이해될 것이다.
[실시예]
실시예 1: 다분화능 세포 생존 어세이
500 ㎕의 다양한 테스트 배지를 세포를 첨가하기 전에 12웰 플레이트의 각각의 웰에 로딩하였다. 부착성 다분화능 세포를 TrypLE(Invitrogen)를 사용하여 5분 동안 또는 배양 플레이트로부터 세포가 완전히 떨어질 때까지 해리시켰다. 배양물에 동일 부피의 배지를 첨가함으로써 TrypLE를 중화시켰다. 세포를 카운팅하고 세척하고 새로운 배지에 300,000∼1,000,000개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 이 세포 용액 약 100 ㎕를 12웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 5% O2 및 10% CO2로 37℃에서 인큐베이션하였다. 0.4 ml의 TrypLE를 사용하여 다양한 시점에 세포를 다시 해리시키고, 그 후 이것을 동일 부피의 DMEM 중 10% FBS로 중화시켰다. 세포를 유세포분석법으로 카운팅하였다. 5,000 카운트 브라이트 비드를 내부 대조군으로서 각각의 샘플에 첨가하였다(각각의 샘플에 대해 약 200개의 비드가 카운팅되었다). 모든 실험은 삼중으로 수행하였다.
실시예 2: 생존 및 단기 성장을 위한 성장 인자
TeSR 배지는 기본 배지 중에 존재하는 것 이외에도, 6종의 성장 인자, 즉 섬유아세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β), γ-아미노부티르산(GABA), 피페콜산, 염화리튬(LiCl) 및 인슐린을 포함한다(표 1). 이들 6종의 성장 인자를 제외한 모든 TeSRTM 성분들을 포함하는 기본 영양 배지(NM)를 제조하였다. 약 2×105개의 H1 ES 세포를 해리시키고 Matrigel 상에 플레이팅하였다. 24시간 후 생존 지수를 측정하였다. NM 단독은 해리 후 세포 생존을 지지할 수 없었다. NM으로의 인슐린의 첨가는 TeSRTM에서 관찰되는 것과 유사한 세포 생존을 유도하였으나, 세포 성장을 지지하지 않았다(도 1a). 인슐린(20 ㎕/ml) 및 FGF2(100 ng/ml) 둘 다의 첨가는 세포 생존을 지지하였고, 추가로 96시간 후에 세포 성장을 유도하였으며, 이것은 TeSRTM 배지를 사용할 때 관찰되는 것과 유사하였다(도 1b). 따라서, FGF 및 인슐린이 보충된 NM은 인간 ES 세포 배양을 지지한다. 상기에 기재한 것과 같이 보충된 12종의 상이한 기본 영양 배지는 세포 생존 및 성장을 지지할 수 있었다(도 1e).
실시예 3: L-아스코르브산은 단기 증식을 지지한다.
NM은 11종의 영양 성분, 즉 DMEM/F12, 미량 원소 B, 미량 원소 C, L-아스코르브산, 티아민, 셀레늄, L-글루타민, BSA, BME, 중탄산나트륨(NaHCO3) 및 트랜스페린을 포함한다(표 1). DMEM/F12는 기본 배지로서의 역할을 하며, NaHCO3는 pH를 조절하기 위해 사용된다. 인슐린 및 FGF가 존재하는 경우에 다른 영양 성분이 필수적인지를 확인하기 위해, 각각의 인자를 DMEM/F12, NaHCO3, 인슐린 및 FGF에 개별적으로 첨가하였다. 영양 인자 중 어느 것도 계대 후의 생존에 필수적이지 않았으나, L-아스코르브산(64 mg/L)은 계대 후의 세포 증식에 필요하였다(도 1c). 비타민 C로서 알려진 L-아스코르브산은 주요 항산화제이고 여러 효소의 보조인자이다. 하이드록시프롤린은 부분적으로 L-아스코르브산을 대체할 수 있다. DMEM/F12, NaHCO3, L-아스코르브산, 인슐린 및 FGF(규정 인자 5, "DF5", 표 1) 중에 플레이팅된 인간 ES 세포는 TeSR로 플레이팅된 인간 ES 세포와 유사한 모폴로지(morphology)를 유지하였다.
실시예 4: 장기간에 걸친 계대를 위한 배지 성분
DF5는 단 1회 계대 동안만 세포 성장을 지지하였다. 2회 계대 후, 세포는 잘 부착하지 못하였고, 결국 사멸하였다(도 1c). 세포는 NM+인슐린+FGF(데이터는 제시되지 않음) 및 DF12(도 1d, 표 1) 중에서 계대될 수 있었으며, 이는 NM+인슐린+FGF 및 DF12 중에 존재하는 1종 이상의 인자가 장기간에 걸친 계대에 중요하다는 것을 시사한다. NM 중에 존재하는 각각의 영양 인자를 DF5에 개별적으로 첨가하여, 복수의 계대 후의 세포 증식을 지지할 수 있는 그 능력을 판단하였다. 셀레늄 단독의 첨가는 복수의 계대를 통한 세포 증식을 지지하기에 충분하였다(도 1d, DF5+셀레늄, "DF5S," 표 1).
H1 세포를 증식시키기 위해 DF5S를 사용하였다. DF5S 중에서 배양한 세포는 TeSRTM 중에서 배양한 세포보다 더 잘 분화하는 경향이 있었다. 그러나, H1 세포는 몇주 동안 성장할 수 있었고(15회 초과의 계대), 이 기간 동안 세포는 인간 ES 세포 모폴로지와 높은 수준의 OCT4 발현을 유지하였다(도 1e, 도 1f). NODAL(100 ng/ml) 또는 TGF-β(2 ng/ml)가 첨가된 DF5S 중에서 배양한 H1 세포는 DF5S 중에서 배양한 H1 세포에 비해 현저히 더 높은 수준의 NANOG mRNA를 발현하였다. DF5S+NODAL은 또한, 다분화성 마커 OCT4의 높은 수준의 발현에 의해 확인되는 바와 같이, 2종의 테스트된 인간 iPS 세포주의 다분화성을 지지하였다. NODAL 또는 TGF-β가 첨가된 DF5S 중에서 배양된 모든 세포(hES 세포 및 iPS 세포)는 장기 계대 후에 정상적인 핵형을 유지하였다.
실시예 5: 저산소는 세포 성장 및 클로닝을 개선한다.
H1 세포는 TeSRTM 중에서 배양된 세포에 비해 DF5S 중에서 더 잘 성장한다(도 1c 및 2a). 다분화능 세포 성장 조건을 최적화하기 위해, 다양한 삼투압 농도, pH, 산소 수치 및 CO2 수치를 갖는 DF5S 중에서 세포를 배양하였다. 어세이 민감도를 증가시키기 위해, 단지 5,000개의 세포를 각각의 웰에 시딩하고, 생존(24시간) 및 증식(124시간)에 대해 분석하였다. O2 및 CO2 수치가 달라질 때 최대 개선이 관찰되었다. 정상적인 배양 조건은 약 15%의 산소 및 5%의 CO2 를 이용한다(O15C5). 더 높은 수치의 CO2는 종종 24시간 후 생존율을 약간 더 높였다. 더 낮은 산소 수치는 DF5S 및 TeSRTM 둘 다에서 세포 성장을 증가시켰다. 10% CO2와 15% O2(O15C10) 및 10% CO2 및 5% 산소(O5C10)는 세포 생존을 증가시켰다(도 2a). 세포는 더 높은 O2 수치(O15C5 및 O15C10)에서 번성하지 못한 반면, 더 낮은 산소 수치(O5C10)에서 증식하였다(도 2a). DF5S 중의 세포는 TeSRTM 중에서 배양된 세포에 비해 더 빨리 성장하였으며, 5% O2 및 10% CO2에서 가장 빨리 성장하였다(도 2a). 산소 수치를 2%로 더 감소시키자 5% O2에 비해 세포 성장이 감소하였다.
다양한 산소 및 CO2 농도에서의 클로닝 효율을 측정하기 위해, 500개 세포를 각각의 웰에 시딩하였다. 낮은 수치의 산소에서도, 클로닝 효율이 클로닝 시의 다양한 조건의 영향을 확인할 수 없을 정도로 너무 낮았다(<2%). 클로닝 효율을 증가시키는 것으로 알려진 ROCK 억제제인 HA100을, 산소 및 CO2 농도를 테스트하기 위해 클로닝 효율을 증가시키는 데 사용하였다. 클로닝을 위한 최상의 배지인 것으로 알려진 조건 배지(CM)를 대조군으로서 사용하였다. HA100의 첨가는 O5C10 및 O15C5 둘 다에서 CM 중에서의 클로닝 효율을 현저히 개선시켰으며, 클로닝 효율은 O15C5보다 O5C10에서 더 높았다(도 2b). DF5S 중에서의 세포의 클로닝 효율은 양 조건 하에서의 CM 중의 세포의 클로닝 효율과 비슷하였다(도 2b).
세포 생존에 대한 저산소 조건의 긍정적 영향으로 인해, 후속 실시예 중 일부는 세포를 저밀도로 유지하였을 때 저산소 조건을 이용한다. 그러나, 세포를 저세포 밀도로 배양하지 않았을 경우, 실험을 정상 산소 및 저산소 조건 둘 다에서 수행하였다(도 2b).
실시예 6: 개선된 iPS 세포 클로닝 효율
DF5S가 클로닝 효율에 어떻게 영향을 주는지 확인하기 위해, 2개의 iPS 세포주를 DF5S 중에서 배양하고, HA100 존재 하에 클로닝 밀도(12웰 플레이트 웰당 약 500개 세포)로 플레이팅하였다. DF5S 중에서 배양한 iPS 세포의 클로닝 효율은 TeSRTM 또는 CM 중에서 배양한 iPS 세포의 클로닝 효율보다 낮았으며(도 2c), 이는 클로닝 효율을 향상시키는 인자가 TeSRTM 배지 중에 존재하지만, DF5S 중에는 존재하지 않음을 시사한다. 그 인자를 확인하기 위해, 개개의 TeSRTM 성분들을 DF5S에 개별적으로 첨가하여, 클로닝 효율에 미치는 영향에 대해 테스트하였다. DF5S에 홀로-트랜스페린을 첨가하는 것(DF5SFe)은 TeSRTM을 사용하는 것과 유사한 클로닝 효율을 유도하였다(도 2d). 트랜스페린은 또한 DF5S 배지 중에서의 H1 세포의 클로닝 효율의 현저한 개선을 이끌었다.
인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, L-아스코르브산, FGF, 및 TGF-β(또는 NODAL)이 보충된 DMEM/F12("E8") 중의 ROCK 억제제인 HA100 및 Y27632, 및 블레비스타틴은 H1 세포의 클로닝 효율을 증가시켰으며(도 2e), 이것은 트랜스페린의 첨가 및 저산소 조건 하에서의 배양에 의해 추가로 증가되었다(도 2f). 세포는 25회 초과의 계대 후에 정상적인 핵형을 유지하였다.
실시예 7: NODAL 및 TGF-β는 무알부민 배지 중에서의 H1 및 iPS 세포 다분화성의 장기 유지를 지지한다.
실시예 3에 기재된 바와 같이, H1, H9 및 iPS 세포와 같은 인간 다분화능 세포를 DF5S 중에서 성장시켜 15회 이상 계대하였으나, 분화되는 경향을 보여, DF5S 중에서의 다분화성을 유지하기 위해 특별한 주의가 필요하였다. TeSRTM 중에서 다분화성이 더 쉽게 유지될 수 있기 때문에, TeSRTM 중에 존재하는 성장 인자를, H1 세포를 배양하는 데 사용되는 DF5SFe에 개별적으로 첨가하였으며, 상기 세포는 장기 다분화성을 지지하는 인자를 확인하기 위해 분화되지 않은 채 DF5S 중에서 미리 배양된 것이었다. 컨플루언시(confluency)에 도달한 지 약 1일 후에 세포를 계대하여 세포 분화를 촉진하고 유세포 분석에 의해 측정된 Oct4 발현을 다분화성의 인디케이터로서 이용하였다.
DF5SFe 중에서 배양한 인간 다분화능 세포는 길게 생장하여 서로를 따라 일렬로 늘어서서, 분화되기 직전에 "방추"와 같은 모양이 되었다. 이러한 표현형은 신경 분화 개시 시에 종종 관찰되며, 이것은 일반적으로 TGF-β BMP 경로에 의해 억제된다. 따라서, TGF-β 경로의 재조합 단백질을 장기 다분화성을 지지할 수 있는 그 능력에 대해 테스트하였다. TeSRTM 농도로 사용된 NODAL이 보충된 DF5SFe("E8 (NODAL)")은 높은 수준의 Oct4 발현을 유지시켰다. TeSRTM 농도(0.6 ng/ml)로 사용된 TGF-β가 보충된 DF5SFe("E8(TGF-β)")는 낮은 수준의 Oct4 발현을 지지하였으나, 더 높은 농도(1 ng/ml)로 사용되었을 때 높은 수준의 Oct4 발현을 유지할 수 있었다.
H1 및 H9와 같은 인간 ES 세포주는 FBS, 피더 세포 및 넉아웃 혈청 대체물질과 같은 각종 복잡한 배양 성분들에의 노출을 포함하는 배양 이력을 갖는다. 이들 성분에의 노출은 이들 성분들에 대한 의존성을 발생시키고, 그 결과 단순화된 배지에 대한 세포 반응을 변경한다고 생각할 수 있다. 배양 이력은, 유도 조건이 덜 복잡하기 때문에, 리프로그래밍된 체세포로부터 유도된 iPS 세포의 경우 그 역할이 덜 중요할 수 있다. 따라서, DF5SFe 중에서 배양한 2종의 오리지널 렌티바이러스 iPS 세포주(Yu, et al., Science 318:1917 (2007))를 사용하여 다양한 인자들을 테스트하였다. 1회 계대 동안 세포를 MEF 플레이트로부터 DF5SFe 배지로 바로 옮기고, 그 후 다양한 성장 인자 조건으로 계대하였다. DF5SFe로의 TGF-β(2 ng/ml) 또는 NODAL(100 ng/ml)의 첨가(각각 "E8(TGF-β)" 및 "E8(NODAL)")는 iPS 세포의 장기 다분화성을 지지하였다. 다분화성 표면 마커 SSEA4, SSEA3, Tra-1-60 및 Tra-1-81 또한 발현되었다. 정상 핵형을 갖는 세포는 20회 초과의 계대 동안 꾸준히 유지되었다. 이 세포는 중증 복합 면역결핍(SCID) 마우스로 주입한 지 5∼7주 후 테라토마를 형성할 수 있었다.
E8(TGF-β) 및 E8(NODAL)은 25회 초과의 계대 동안(약 3개월) 테스트된 모든 다분화능 세포, 즉 2종의 인간 ES 세포주(H1 및 H9) 및 5종의 iPSC 세포주의 다분화성을 지지하였으며, 분화의 징후는 없었다(도 3). E8 배지 중에서 배양한 H1 ES 세포는 TeSRTM 중에서 배양한 H1 ES 세포와 비교하여 유사한 유전자 발현 프로파일을 갖는다(도 3b).
실시예 8: 무알부민 배지 중에서의 iPS 세포의 유도
이용 가능한 리프로그래밍 프로토콜은, 세포를 UM100(미국 특허 제7,439,064호, 이 문헌은 본원에 그 전체가 기재된 바와 같이 본원에 포함됨) 또는 CM으로 교환하기 전에, 바이러스 트랜스덕션 또는 전기천공 후 처음 몇일 내에 FBS 중에서 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 이전의 실시예에 기재된 단순화된 배지를 리프로그래밍을 지지할 수 있는 그 능력에 대해 테스트하였다. ES 유도 체세포는 FBS 함유 배지 중에서의 처음 2일의 배양을 이용하거나 이용하지 않아도 렌티바이러스 또는 에피솜 벡터를 사용하여 DF5S 배지 중에서 효율적으로 리프로그래밍될 수 있었다. 그러나, DF5S는 Nanog, Oct4, Sox2 및 Lin28을 사용할 때 1차 포피 세포의 리프로그래밍을 지지하지 않았다. DF5SFe는 개량된 렌티바이러스를 사용할 때 Matrigel 또는 MEF 상에서의 포피 세포 및 성체 세포의 리프로그래밍을 지지하였으며(Ebert et al., Nature 457(7227):277-280 (2009), 이 문헌은 그 전체가 본원에 기재된 것과 같이 본원에 포함됨), 이때 세포는 처음에 FBS 함유 배지 중에서 인큐베이션된 것이었다. DF5SFe는 리프로그래밍을 지지함에 있어서 CM만큼 효과적이었지만, FBS에의 초기 노출은 리프로그래밍에 중요한 것으로 보였다.
포피 세포는 FBS 배지보다 DF5SFe 중에서 훨씬 더 느리게 성장한다. 1차 포피 세포 성장을 도울 수 있는 성장 인자를 확인하기 위해, FBS 중에 포함된 개개의 성장 인자들을 테스트하였다. FGF 성장 인자 패밀리는 몇 종의 멤버를 포함하며, 이들 중 1종 이상은 섬유아세포 배양에 통상적으로 이용된다. DF5SFe는 100 ng/ml의 제브라피쉬(zebrafish) 재조합 FGF2를 포함한다. 각각의 FGF 패밀리 멤버를 포피 세포 성장을 지지할 수 있는 그 능력에 대해 테스트하였다. 포피 세포를 배양 플레이트의 웰에 분액하여 FGF가 없는 DF5SFe 중에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 각각의 유형의 FGF를 96시간 동안 100 ng/ml로 첨가하였다. FGF1, zFGF2, FGF4, FGF6 및 FGF9는 포피 세포 성장을 가장 효과적으로 지지하였으나, FBS 함유 배지뿐만 아니라 어느 것도 세포 성장을 지지하지 못하였다(도 4a). 비-FGF 패밀리 멤버 성장 인자가 FBS에서 관찰되는 것과 유사한 포피 세포 성장을 촉진할 수 있는지를 확인하기 위해, 몇 종의 공지된 섬유아세포 성장 촉진 인자를 테스트하였다. FBS를 대체하기 위해 DF5SFe에 첨가된 하이드로코티손(도 4b), 그 유도체 및 덱사메타손은 세포 성장을 현저히 개선시켰다. DF5SFe+하이드로코티손("DF5SFeC")은 또한 iPS 세포 클로닝 효율을 개선시켰다.
DF5S에 기초한 배지가 무바이러스 iPS 세포 유도에 이용될 수 있는지를 확인하기 위해, 본원에 그 전체가 기재된 것과 같이 본원에 참고문헌으로서 포함되는 문헌[Yu et al., Science 324:797 (2009)]에 기재된 바와 같이 저산소 조건(O5C10)에서 무바이러스 에피솜 벡터를 사용하여 포피 세포를 리프로그래밍하였다. 플라스미드 조합 #4(pEP4EP2SCK2MEN2L 및 pEP4EO2SET2K, 표 3), #6(pEP4EO2SEN2L, pEP4EO2SET2K 및 pEP4EO2SEM2K, 표 3) 및 #19(pEP4EO2SEN2K, pEP4EO2SET2K 및 pCEP4-M2L, 표 3)를 사용하였으며, 2차 계대 후 106개 세포로부터 2개의 클론을 단리하였다.
Figure pct00003
플라스미드 조합 #6 및 #19를 리프로그래밍에 사용하였다. 핵으로의 플라스미드 진입을 향상시키기 위해, ENBA mRNA를 플라스미드 DNA와 함께 전기천공하였다. 약 100만개의 세포를 2개의 6웰 플레이트의 DF5SFeC 중에 옮겨 5일 동안 배양하였다. 그 후, 배지를 DF5SFe로 교체하고 18∼25일 동안 더 배양하였다. 일부 웰의 세포를 상이한 시점에 1:6의 비를 이용하여 2차로 계대하였다. 플라스미드 조합 #19는 플라스미드 조합 #6보다 더 많은 콜로니를 생성시켰으나, 이들 중 대부분은 전형적인 인간 ES 세포 모폴로지를 닮지 않았다. 약 25일 후, 인간 ES 세포 유사 클로니가 두 플라스미드 조합에 대한 1차 플레이트 상에 나타났으며, 플라스미드 조합 #19를 사용할 때 100만개 포피 세포당 리프로그래밍 세포의 추정수가 24개, 플라스미드 조합 #6을 사용할 때 100만개 포피 세포당 리프로그래밍 세포의 추정수가 8개였다. 인간 ES 세포 유사 콜로니의 수는 2차 계대 플레이트 후에 현저히 증가하였고, 각각의 플라스미드 조합에 대해 100만개 포피 세포당 추정수가 500개 미만이었다. 2차 계대 플레이트 상의 iPS 세포 콜로니의 증가는 아마도 1차 플레이트 상에서의 iPS 세포의 분열에 기인하는 것으로 생각된다. 어떤 경우에는, 1차 플레이트는 전형적인 인간 ES 세포 모폴로지를 닮은 어떠한 콜로니도 갖지 않았으나, 다수의 iPS 세포는 2차 계대 후 출현하였으며, 이는 일부 iPS 세포는 확인할 수 없음을 시사하는 것이며, 이는 아마도 이들이 체세포와 혼합되었기 때문일 것이다.
DF5SFe 중에서 유도된 iPS 세포 콜로니의 세포는 단지 2회 계대 후에 분화하기 시작하였다. 1차 플레이트로부터 6개의 iPS 세포 콜로니를 픽킹하여 Nodal 함유 DF5SFeN(E8(NODAL))으로 바로 옮겼다. 이들 세포를 E8(Nodal) 중에서 15회 초과의 계대 동안 유지하였으며, 이때 이들 세포는 TeSRTM을 사용할 때 관찰되는 것과 유사한 ES 세포 유사 모폴로지를 유지하였다. 세포는 정상적인 핵형을 가졌고 Oct4 및 SSEA4를 발현하였으며(도 4c), 주입한 지 5∼7주 후 SCID 마우스에서 테라토마를 형성하였다.
또한, 포피 섬유아세포를 E8 배지 중에서 리프로그래밍하였다. E8 배지 중에서 유도된 iPS 세포의 전체 유전자 발현은 H1 세포(도 4d 및 4e) 또는 피더 세포 상에서 유도된 iPS 세포(도 4d 및 4F)와 유사하였다. 다분화성 마커는 ES 세포와 iPS 세포 둘 다에서 많이 발현되었으나, 섬유아세포 특이적 마커 유전자는 발현되지 않았다(도 4d). 또한, iPS 세포를 다양한 전략법을 이용하여, 예를 들어 렌티바이러스 또는 에피솜 벡터를 이용하여 E8 배지 중에서 유도할 수 있었다.
실시예 9: 무알부민 배지 중에서의 환자 세포주로부터의 iPS 세포의 유도
성체 도너로부터의 세포를 단순화된 배지 중에서 무바이러스 에피솜 벡터를 사용하여 리프로그래밍할 수 있는지를 확인하기 위해, 환자 세포주 OAT 또는 PRPT8 세포 200만개를 EBNA mRNA와 함께 플라스미드 조합 #4 또는 #6과 전기천공하여 2개의 10 cm 플레이트 상에 옮겼다. 리프로그래밍을 최대화하기 위해, FBS 함유 배지를 처음 6일 동안 사용하였다. 일정한 성체 세포 유지 조건에 맞추기 위해, 세포를 O15C5에서 유지하였다. 그 후, 배지를 DF5SFe로 교체하여 14∼21일 동안 더 배양하였다. 한 플레이트의 세포를 상이한 시점에 1:2의 비로 계대하였다. 플라스미드 조합 #6은 #4보다 더 많은 콜로니(100만개 세포당 약 5개)를 생성하였으나, 세포의 대부분이 전형적인 인간 ES 세포 모폴로지를 닮지 않았다. 약 22일 후, 플라스미드 조합 #4에 대한 1차 플레이트 상에 인간 ES 세포 유사 콜로니가 출현하였다. 플라스미드 조합 #6이 사용되었을 때 2차 계대 플레이트 상에 더 많은 인간 ES 세포 유사 콜로니가 출현하였으며, 이때 100만개 세포당 콜로니 추정수가 약 40개였다. 플라스미드 조합 #4를 사용하였을 때에는 iPS 세포가 생성되지 않았다. 1차 플레이트 상에 다른 조밀하게 군집화된 세포의 중간부에 iPS 세포 콜로니가 출현하였으며, 이것은 그 경계 넘어 증식할 수 없었다. 그러나, 2차 플레이트 상의 콜로니는 콜로니 단리에 적합한 큰 크기로 증식하였다. 콜로니를 픽킹하여 TeSRTM로 바로 옮겼으며, 32개의 픽킹 콜로니가 생존하여 ES 세포 모폴로지를 나타내었다. 유전자 분석은 이들 콜로니가 OAT 세포주로부터 유도되어 정상적인 핵형을 나타내었음을 확인시켜 주었다.
성체 세포 리프로그래밍 효율을 향상시키기 위해, TGF-β를 리프로그래밍 배지에 첨가하였다. iPS 클론은 현저히 증가하지 않았으나, 총 콜로니수는 현저히 증가하였다. 하이드로코티손 제거 시에 배지로부터 TGF-β를 제거하였을 때, iPS 세포 콜로니의 수가 현저히 증가하였으며, 이는 TGF-β가 이 과정의 처음 몇일 내에 리프로그래밍을 지지한다는 것을 시사한다.
다수의 외관상의 비-iPS 콜로니는 2차 계대 후에 iPS 클론을 생성할 수 있으며, 이는 iPS 세포 유도가 주변 세포에 의해 억제될 수 있음을 시사한다. 이 효과를 극복할 수 있는 그 능력을 테스트하기 위해 몇 종의 시약을 테스트하였다. 부티레이트는 리프로그래밍 효율을 개선시켰다. TGF-β 및 부티레이트 둘 다를 배지에 첨가하였을 때 포피 세포의 리프로그래밍 효율의 약 10배 증가가 관찰되었다(도 5b). TGF-β는 리프로그래밍의 초기 단계 중에 긍정적인 효과를 나타내는 것으로 보였지만, 부티레이트는 후기 단계에서 긍정적인 역할을 하였다. TGF-β 첨가는 리프로그래밍 중에 콜로니 수 증가를 초래하였으나, 본래의 iPS 세포 콜로니의 수는 적게 유지되었다. 부티레이트는 콜로니 수를 증가시키지 않았으나, 본래의 iPS 세포 대 비-iPS 세포 콜로니의 비를 현저히 개선시켰다(도 5c).
TGF-β 및 부티레이트의 사용은 에피솜 벡터 시스템을 이용하여 완전히 규정된 조건 하에 성체 개체로부터 체세포의 성공적인 리프로그래밍을 가능하게 하였다. iPS 세포를 1×106개 PRPF8-2 세포 중 1∼100개 및 100,000개 세포(GRC 1-29) 중 1개의 효율로 3개의 독립적 성체 체세포주(OAT, GRC M1-29 및 PRPF8-2)로부터 유도하였다.
실시예 10: 완전 규정 조건에서의 성체 개체로부터의 iPS 세포의 유도
남성 성체 도너의 피부로부터 생검을 취하여, 항생제 및 항진균제를 포함하는 행크 완충 염 용액(Hank's Buffered Salt Solution: HBSS)으로 세척하여, 2 ml의 0.25% 트립신/EDTA(표 4) 또는 TrypLE 셀렉트 중에서 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 샘플을 3회 헹구었고 2차 헹굼 후에 트립신 억제제를 사용하였다(표 4). 멸균 핀셋을 사용하여 진피와 표피를 분리하였다. 진피를 작은 조각으로 절단하여, 실온에서 소정의 효소를 포함한 0.75 ml의 효소 용액(표 4) 중에서 3시간 동안 인큐베이션하였다(12웰 또는 24웰 플레이트). 약 35분 후, 조직 구조가 분해하기 시작하였다. 10 ㎕/ml의 폴리비닐피롤리돈(PVP)을 함유한 동일 부피의 배지를 첨가하고, 약 10회 피펫팅 업/다운으로 조직을 물리적으로 해체시켰다. 샘플을 실온에서 400g로 10분 동안 원심분리하고 새로운 배지/PVP로 2회 세척하였다. 상청액을 버리고, 펠릿을 3 ml의 완전 배지에 재현탁시키고, 1 ml의 세포 현탁액을 웰당 3 ㎍의 비트로넥틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 웰로 옮겼다. 플레이트를 37℃에서 5% CO2로 인큐베이션하였고, 배지를 매일 교환하였다. 섬유아세포는 플레이트에 부착하였지만, 배지를 교환할 때 비부착성 세포 및 잔해는 제거되었다.
Figure pct00004
20일 후, 전기천공을 이용하여 리프로그래밍 플라스미드를 섬유아세포로 도입하였다. 다음 25일 내에, 다수의 iPS 콜로니가 출현하였고 추가 분석을 위해 픽킹하였다. 리프로그래밍 효율은, 2차 계대 없이, 전기천공된 섬유아세포 100만개당 약 10개였다. 벡터가 없는 세포주를 단리하기 위해 iPS 세포를 추가로 계대하였다.
실시예 11: 2차 계대 없이 무알부민 배지 중에서 성체 개체로부터 iPS 세포를 유도함
도 6a에 예시된 일반 프로토콜에 따라, E8(인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, L-아스코르브산, FGF2 및 TGF-β(또는 NODAL)가 보충된 DMEM/F12) 중에서 성체 섬유아세포를 리프로그래밍하였다. 20회 초과의 계대 동안 E8 중에서 유지된 리프로그래밍된 iPS 세포주는 지속적으로 다분화성 마커 OCT4 및 SSEA4를 발현하였다(도 6b).
E8 배지는 마우스 섬유아세포 피더 세포(MEF)(도 7a) 또는 TeSRTM(도 7b)를 이용할 때의 리프로그래밍 효율에 비해 리프로그래밍 효율을 현저히 향상시켰다. 부티레이트(100 μM)는 TGF-β 존재 하에(E8) 또는 TGF-β 부재 하에(TGF-β 비함유 E8, 즉 DF5SFe) 리프로그래밍 효율을 추가로 향상시켰다(도 7c).
실시예 12: 무알부민 배지 중에서의 다분화능 줄기 세포의 냉동보존
실질적으로 상기에 기재된 것과 같이, 다분화능 세포를 6웰 플레이트 내의 E8 배지 중에서 배양하였다. 각각의 웰로부터 배양 배지를 흡인하고, 세포를 1.0 mL의 EDTA/PBS(PBS 중 0.5 mM EDTA, 삼투압 농도 340)로 2회 세척하였다. 그 후 세포를 37℃에서 EDTA/PBS 중에서 5분 동안 인큐베이션하였다. PBS/EDTA를 제거하고, 세포를 1 ml의 E8 배지로 신속히 헹구었다. 그 후, 세포를 동일 부피의 20% 디메틸 설폭시드(DMSO) 및 E8 배지(최종 농도: E8 배지 중 10% DMSO) 중에 재현탁시키고, 크라이오제닉 바이알에 분액하여 넣고 CRYOBOXTM를 이용하여 -80℃에서 동결시켰다. 그 후, 세포를 액체 질소 탱크로 옮겼다.
본 발명을 현재 가장 실용적이고 바람직한 실시형태인 것으로 간주되는 양태와 관련하여 설명하였다. 그러나, 본 발명은 예를 들어 제시된 것이고, 개시된 실시형태로 한정하고자 의도한 것은 아니다. 따라서, 당업자는 첨부된 청구범위에 개시된 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 모든 변경예 및 대안적인 구성을 포함하는 것으로 의도된다는 것을 이해할 것이다.

Claims (29)

  1. 다분화능 줄기 세포의 증식을 지지하는 무알부민 배지.
  2. 제1항에 있어서, 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 다분화능 줄기 세포 증식을 지지하기에 충분한 양으로 포함하는 배지.
  3. 다분화능 줄기 세포의 배양 방법으로서,
    매트릭스 상에 다분화능 줄기 세포를 위치시키는 단계; 및
    상기 세포를 다분화능 줄기 세포 증식을 지지하는 무알부민 배지와 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 배지가 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 다분화능 줄기 세포 증식을 지지하기에 충분한 양으로 포함하는 것인 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 매트릭스가 라미닌을 포함하는 것인 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 매트릭스가 비트로넥틴을 포함하는 것인 방법.
  7. 제3항에 있어서, 상기 세포를 저산소 조건 하에 상기 배지와 접촉시키는 것인 방법.
  8. 제3항에 있어서, 상기 다분화능 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  9. 제3항에 있어서, 상기 다분화능 줄기 세포가 유도 만능 줄기 세포인 방법.
  10. 제3항에 있어서, 상기 다분화능 줄기 세포가 인간 세포인 방법.
  11. 다분화능 줄기 세포의 클로닝 방법으로서, 다분화능 줄기 세포 클로닝을 지지하는 무알부민 배지 중에 클로닝 밀도로 다분화능 줄기 세포를 플레이팅하는 단계를 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 배지가 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 다분화능 줄기 세포 클로닝을 지지하기에 충분한 양으로 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 배지가 ROCK 억제제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 ROCK 억제제가 HA100 및 Y27632로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 배지가 블레비스타틴을 추가로 포함하는 것인 방법.
  16. 다분화능 줄기 세포를 냉동보존하는 방법으로서, 다분화능 줄기 세포를 무알부민 배지 중에서 동결시키는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 배지가 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 다분화능 줄기 세포 증식을 지지하기에 충분한 양으로 포함하는 것인 방법.
  18. 규정 조건(defined condition) 하에 유도 만능 줄기(induced pluripotent stem: iPS) 세포를 유도하는 방법으로서, iPS 세포를 유도하기 위해 체세포 리프로그래밍을 지지하는 무알부민 배지 중에서 체세포를 리프로그래밍하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 배지가 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나를 각각 iPS 세포 유도를 지지하기에 충분한 양으로 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 리프로그래밍 단계가 상기 세포를 TGF-β와 5∼10일 동안 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    5∼10일 후 TGF-β를 제거하는 단계; 및
    상기 세포를 실질적으로 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 및 트랜스페린으로 이루어진 배지와 접촉시키는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제18항에 있어서, 상기 리프로그래밍 단계가 상기 세포를 하이드로코티손과 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  23. 제18항에 있어서, 상기 리프로그래밍 단계가 상기 세포를 부티레이트와 접촉시키는 것을 포함하는 것인 방법.
  24. 제18항에 있어서, iPS 세포를 이종물질 비함유(xeno-free) 조건 하에 유도하는 것인 방법.
  25. 제18항에 있어서, 상기 체세포가 성체 체세포인 방법.
  26. 제18항에 있어서, 상기 리프로그래밍 단계가 바이러스 벡터를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  27. 제18항에 있어서, 상기 리프로그래밍 단계가 에피솜 벡터를 사용하는 것을 포함하는 것인 방법.
  28. 각각 장기(long-term) 다분화능 줄기 세포 배양을 지지하기에 충분한 양의, 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나로 실질적으로 이루어진, 다분화능 줄기 세포의 장기 배양을 지지하는 무알부민 증식 배지.
  29. 다분화능 줄기 세포의 배양 방법으로서,
    다분화능 줄기 세포를 매트릭스 상에 위치시키는 단계; 및
    상기 세포를, 각각 장기 다분화능 줄기 세포 배양을 지지하기에 충분한 양의, 물, 염, 아미노산, 비타민, 탄소원, 인슐린, FGF, 셀레늄, 트랜스페린, 및 TGF-β와 NODAL 중 하나로 실질적으로 이루어진 무알부민 배지와 접촉시키는 단계
    를 포함하는 방법.
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