JP6336976B2 - 多能性幹細胞の増殖促進因子のスクリーニング法 - Google Patents
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Description
a)L−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地において、フィーダー細胞を培養し、生成した馴化培地を回収する工程、及び
b)回収した馴化培地に含まれる、多能性幹細胞に対する増殖促進因子を検出する工程、
を含む方法。
本実施例では、以下のように、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞;フィーダー細胞)上で維持培養した未分化ヒトiPS細胞を、ビトロネクチン(VTN−N)でコーティングした培養ウェル中、フィーダー細胞の非存在下に移行し、MEF馴化栄養培地の存在下で培養した。
iPSアカデミアジャパン株式会社(日本、京都)より入手した201B7細胞株(Takahashi K., et al., Cell 131, 1-12 (2007))をヒトiPS細胞(未分化ヒトiPS細胞)として使用した。ヒトiPS細胞は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞MEF(フィーダー細胞)を播いたプラスチック培養ディッシュの上で維持培養した。培養には、DMEM/F12培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F−12 Ham; Sigma D6421)に終濃度20%のKNOCKOUTTM SR(KnockOutTM Serum Replacement(KSR); GIBCO社)、0.1 mM NEAA(non−essential amino acids; 非必須アミノ酸)、2 mM L−グルタミン、5 ng/ml ヒトFGF2(塩基性FGF又はbFGFとも称される)及び0.1 mM 2−メルカプトエタノールを添加して調製した培地を用い、37℃にてCO2インキュベーター内で培養した(5%CO2濃度)。継代は6〜7日毎に行った。継代の際には、解離液(コラゲナーゼ溶液)を用いて、ヒトiPS細胞のコロニーをフィーダー細胞層から解離し、ピペット操作で20〜50個程度の小塊にした後、新しいフィーダー細胞層の上に播いた。
馴化培地(CM)は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞)を用いて無血清培地から調製した。マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞MEFを、MEF用培地(10%FBSを添加したDMEM培地)中に約500,000 細胞/直径60mmディッシュの細胞密度で播種した。細胞を少なくとも16時間培養した後、PBS(−)、次いで無血清培地で洗浄し、培地を同じ無血清培地に置換した。用いた無血清培地の組成は以下の通りである。
・無血清培地A+ITS(DMEM/F12培地、64mg/L 2−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、543mg/L 炭酸水素ナトリウム、1% ITS(インスリン−トランスフェリン−セレン; Life technologies社))
無血清培地には、馴化前に、増殖因子として100μg/L ヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加した(FGF+TGF添加)。並行して、増殖因子を添加しない無血清培地を用いた馴化培地の調製も行った。
本実施例の1.でビトロネクチン(VTN−N)でコーティングされた培養ディッシュに播種したiPS細胞に、本実施例の2.で調製したMEF馴化培地を2ml加えた。増殖因子としてヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加せずに調製したMEF馴化培地には、この段階で100μg/L ヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加した。iPS細胞をMEF馴化培地で37℃、5%CO2濃度で5日間培養した。
無血清培地として、無血清培地A(DMEM/F12、64mg/L 2−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、543mg/L 炭酸水素ナトリウム)を使用し、増殖因子を加えずにMEF馴化培地を調製し、それをiPS細胞に添加して培養に用いる際に1% ITS(インスリン−トランスフェリン−セレン)、100μg/L ヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加したこと以外は、実施例1と同様にして無血清馴化培地でiPS細胞を培養した。
実施例1と同様にしてiPS細胞を調製し、ビトロネクチン(VTN−N)でコーティングされた培養ディッシュに播種したiPS細胞に、MEFにより馴化していない無血清培地A+ITS(DMEM/F12、64mg/L 2−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、543mg/L 炭酸水素ナトリウム、1% ITS(インスリン−トランスフェリン−セレン; Life technologies社))を添加した。さらに100μg/L ヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加し、実施例1と同様にしてiPS細胞を培養した。
無血清培地として、無血清培地B+ITS(DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、2mM L−グルタミン、0.1mM NEAA(non−essential amino acids; 非必須アミノ酸)、1% ITS(インスリン−トランスフェリン−セレン)、0.1mM β−メルカプトエタノール)を使用し、増殖因子として100μg/L ヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加して(FGF+TGF添加)馴化を行ったこと以外は、実施例1と同様にして無血清馴化培地でiPS細胞を培養した。また、MEFにより馴化していない無血清培地B+ITSを用いて、比較例2と同様に100μg/L ヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加してiPS細胞を培養した実験も行った。
本実施例では、以下のように、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞MEF(フィーダー細胞)上で維持培養した未分化ヒトiPS細胞を、マトリゲル、ビトロネクチン(VTN−N)、又はPCM−DMでコーティングした培養ウェル中、フィーダー細胞の非存在下に移行し、MEF細胞馴化栄養培地の存在下で培養した。PCM−DMは、ヒト脱落膜由来の間葉系細胞の細胞外マトリクス(D. Kanematsu et al: Differentiation, 82, 77-88, 2011)である。
iPSアカデミアジャパン株式会社より入手した201B7細胞株をヒトiPS細胞(未分化ヒトiPS細胞)として使用した。ヒトiPS細胞は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞MEF(フィーダー細胞)を播いたプラスチック培養ディッシュの上で維持培養した。培養には、DMEM/F12培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F−12 Ham; Sigma D6421)に終濃度20%のKNOCKOUTTM SR(KnockOutTM Serum Replacement (KSR); GIBCO社)、0.1 mM NEAA(non−essential amino acids; 非必須アミノ酸)、2 mM L−グルタミン、5 ng/ml ヒトFGF2(bFGF又はFGF2とも称される)及び0.1 mM 2−メルカプトエタノールを添加して調製した培地を用い、37℃にてCO2インキュベーター内で培養した(5%CO2濃度)。継代は6〜7日毎に行った。継代の際には、解離液(コラゲナーゼ溶液)を用いて、ヒトiPS細胞のコロニーをフィーダー細胞層から解離し、ピペット操作で20〜50個程度の小塊にした後、新しいフィーダー細胞層の上に播いた。
馴化培地(CM)は、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞)を用いて無血清培地から調製した。マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞(MEF細胞)を、MEF用培地(10%FBSを添加したDMEM培地)中に約500,000 細胞/直径60mmディッシュの細胞密度で播種した。細胞を少なくとも16時間培養した後、PBS(−)、次いで1% ITS、100μg/L ヒトFGF2及び2μg/L TGF−β1を添加した無血清培地A(DMEM/F12培地、64mg/L 2−リン酸アスコルビン酸マグネシウム、及び543mg/L 炭酸水素ナトリウム)(基本培地Aとも呼ぶ)で洗浄し、培地を同じ無血清培地に置換した。
マトリゲルでの培養ディッシュのコーティングは、Life technologies社のプロトコールに従い、マトリゲル(登録商標)(BD社)の、DMEM/F12での30倍希釈液で、室温にて1時間インキュベートすることにより実施した。
本実施例の1.において調製及び回収しMEF細胞を除去したiPS細胞を、本実施例の3.で調製したマトリゲル、ビトロネクチン、又はPCM−DMのそれぞれでコーティングされたプラスチック培養ディッシュに、4分の1に分け(1/4分割)、播種した。培地として、本実施例の2.で調製した無血清培地A+ITS+FGF+TGFのMEF馴化培地を用いて、培養を行った(5%CO2濃度、37℃、5日間)。
実施例2に従って調製した、マトリゲル又はPCM−DMでコーティングしたプラスチック培養ディッシュを用いた、MEFにより馴化した培地(無血清培地A+ITS+FGF+TGF)及びMEFにより馴化していない培地(無血清培地A+ITS+FGF+TGF)におけるiPS細胞の培養を、5継代にわたって継続した。その間の細胞増殖率を比較した結果を図3に示す。無血清培地A+ITS+FGF+TGFのMEF馴化培地を用いてiPS細胞を培養した場合、馴化していない培地を用いた場合と比べて、約300倍高い増殖効率が示された。
実施例2に従って調製した、ビトロネクチンでコーティングしたプラスチック培養ディッシュを用いた、MEFにより馴化した培地(無血清培地A+ITS+FGF+TGF)及びMEFにより馴化していない培地(無血清培地A+ITS+FGF+TGF)におけるiPS細胞の培養を、4継代にわたって継続した。対照として、MEFをフィーダー細胞として用いたiPS細胞の培養(オンフィーダー培養)、及びMEF−CMにおけるiPS細胞の培養も行った。対照のMEF−CMは、DMEM/F12培地(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture F−12 Ham; Sigma D6421)に終濃度20%のKNOCKOUTTM SR(KnockOutTM Serum Replacement(KSR); GIBCO社)を添加して調製した培地において、MEFを37℃にて5%CO2濃度で培養した後、培地を回収することにより、調製した。
実施例1においてITS及び増殖因子を加えた培地で調製した馴化培地(図1A)と、比較例1においてITS及び増殖因子を含まない培地で調製した馴化培地(図1D)について、馴化しない培地をコントロールとしてそれぞれの培地中に分泌されたタンパク質の解析を二次元ゲル電気泳動により行った。まずそれぞれの培地1mlからアセトン沈殿によりタンパク質を回収した。それぞれの回収したタンパク質を、膨潤バッファーに懸濁し、固定化pH勾配ゲルReadyStrip IPGストリップ(pH3−10、11cm; Bio−Rad)に添加して等電点電気泳動装置Protean(登録商標) IEF cell (Bio−Rad)により50V、20℃で12時間膨潤後、等電点電気泳動を行った。その後、ReadyStrip IPGストリップをSDS−PAGE平衡化バッファー(2% DTT含有)中で10分間、次いでSDS−PAGE平衡化バッファー(2.5% ヨードアセトアミド含有)で10分間振盪後、SDS−PAGEによりタンパク質を展開した。実施例1においてITS及び増殖因子を加えた培地で調製した馴化培地では40個、比較例1においてITS及び増殖因子を含まない培地で調製した馴化培地では12個のMEF由来の分泌タンパク質のスポットを検出することができた。このことから、実施例1においてITS及び増殖因子を加えた培地で調製した馴化培地(図1A)には、増殖促進に寄与するタンパク質が含まれることが示された。
1.MEF馴化培地を用いた無フィーダー培養
実施例2の「1.ヒトiPS細胞の調製」の記載に従って、マイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞MEF(フィーダー細胞)上でヒトiPS細胞を培養し(オンフィーダー培養)、回収し、MEFを除去した。
・実施例2の「2.馴化培地の調製」の記載に従って調製した、無血清培地A+ITS+FGF+TGFのMEF馴化培地(図5中、E8−CM)
・実施例4の記載に従って調製したMEF−CM
・mTeSRTM1培地(modified Tenneille Serum Replacer 1)(STEMCELL Technologies)
対照として、DMEM/F12培地に終濃度20%のKNOCKOUTTM SR、0.1 mM NEAA、2 mM L−グルタミン、5 ng/ml ヒトFGF2及び0.1 mM 2−メルカプトエタノールを添加して調製した培地中でのオンフィーダー培養のみを行う試験も実施した。(図5中、KSR) なおマトリゲルでの培養ディッシュのコーティングは、実施例2の「3.基質コーティング培養ディッシュの調製」の記載に従って行った。
培地として、DMEM/F12培地に終濃度20%のKNOCKOUTTM SR、0.1 mM NEAA、2 mM L−グルタミン、5 ng/ml ヒトFGF2及び0.1 mM 2−メルカプトエタノールを添加して調製した培地に代えて、無血清培地A+ITS+FGF+TGFを使用したこと以外は、実施例2の「1.ヒトiPS細胞の調製」の記載に従ってマイトマイシン処理により不活性化したマウス胎児線維芽細胞MEF(フィーダー細胞)上でヒトiPS細胞を培養し(オンフィーダー培養)、回収し、MEFを除去した。
アクリル酸2−(ジエチルアミノ)エチルを基本骨格とする温度感受性ハイドロゲルでコートした培養ディッシュを作製した(Zhang et al., Nature Communications, (2013) 4, Article number: 1335)。具体的には、N−メチル−2−ピロリドン中に、N−アクリロイル−N’−プロピルピペラジン、2,2’−(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)モノアクリルアミド、架橋剤及び光重合開始剤を溶解した混合溶液を、3−(トリメトキシシリル)プロピルメタクリレートで予め処理したプラスチック培養ディッシュに添加し、365nmのUV光を30分照射した後、50℃で一晩放置した。その後、エタノール、アセトンで順次洗浄し、風乾した。
Claims (15)
- 多能性幹細胞に対する増殖促進因子をスクリーニングする方法であって、
a)L−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地において、フィーダー細胞を培養し、生成した馴化培地を回収する工程、及び
b)回収した馴化培地に含まれる、多能性幹細胞に対する増殖促進因子を検出する工程、
を含む方法。 - 前記無血清培地が、L−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含む、DMEM/F12培地である、請求項1に記載の方法。
- フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加して行う、請求項1に記載の方法。
- 増殖因子がFGF2及び/又はTGF−β1である、請求項3に記載の方法。
- フィーダー細胞が、マウス胎児線維芽細胞である、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- L−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地でフィーダー細胞を培養することにより生成された馴化培地において、多能性幹細胞を無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法。
- 前記無血清培地が、L−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含む、DMEM/F12培地である、請求項7に記載の方法。
- フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加して行う、請求項7又は8に記載の方法。
- フィーダー細胞の培養を、前記無血清培地に増殖因子を添加せずに行い、かつ、多能性幹細胞の無フィーダー培養を、前記馴化培地に増殖因子を添加して行う、請求項7又は8に記載の方法。
- 増殖因子がFGF2及び/又はTGF−β1である、請求項9又は10に記載の方法。
- フィーダー細胞が、マウス胎児線維芽細胞である、請求項7〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 多能性幹細胞がES細胞又はiPS細胞である、請求項7〜12のいずれか1項に記載の方法。
- L−アスコルビン酸、インスリン、トランスフェリン、セレン、及び炭酸水素ナトリウムを含み、血清及び血清代替物を含まない無血清培地を用いてフィーダー細胞上で培養した多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下に移行して無フィーダー培養することを含む、多能性幹細胞の増殖方法。
- 前記無血清培地がアルブミンを含まない、請求項14に記載の方法。
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