JP2005333904A - 羊膜由来因子による胚性幹細胞の培養方法 - Google Patents

羊膜由来因子による胚性幹細胞の培養方法 Download PDF

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Abstract

【課題】臨床応用可能な胚性幹細胞の分化誘導法を提供すること。
【解決手段】羊膜由来因子の存在下で胚性幹細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞の培養方法、及び当該培養方法により得られる細胞培養物、羊膜由来因子を含有してなる胚性幹細胞の培養剤・培養用キット。胚性幹細胞の培養に有用な活性を指標に、当該活性活性を有する羊膜由来因子をスクリーニングする方法、及び当該スクリーニング方法により得られる羊膜細胞由来の因子。胚性幹細胞の培養に有用な羊膜細胞の作製方法、及び当該作製方法により得られる羊膜細胞など。
【選択図】なし

Description

本発明は、羊膜由来因子を用いる胚性幹細胞の培養方法、羊膜由来因子を含有する胚性幹細胞の培養剤・培養用キット、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来因子のスクリーニング方法、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜細胞の作製方法などに関する。
胚性幹細胞は、パーキンソン病や糖尿病に対する細胞移植への細胞ソースの有力な候補である。しかし、マウス、ヒトの霊長類に由来する胚性幹細胞も培養および分化誘導にマウス由来の支持細胞（ストローマ細胞）との共存が必要であることが多く、このことが臨床応答へ向けての大きな障壁となっている。
最近、本発明者らは、マウスやサルの胚性幹細胞から高効率で神経細胞へ分化誘導する方法（ＳＤＩＡ法）を開発した（特許文献１〜２、非特許文献１〜４参照）。この方法を用いて、パーキンソン病の移植治療への応用が期待されるドパミン分泌神経細胞、筋萎縮性側索硬化症への治療応用が想定されている運動ニューロンの試験管内産生にマウス、サルの胚性幹細胞から成功している（特許文献１〜２、非特許文献１〜４参照）。
しかし、ヒトへの応用を長期的な視野に入れた場合、このＳＤＩＡ法の大きな問題点の一つは、マウス骨髄由来のストローマ細胞（ＰＡ６細胞）を分化誘導の際に胚性幹細胞と共培養する必要があることである。現在までのところ、ＰＡ６細胞などのストローマ細胞の不在下では、胚性幹細胞の神経分化を効率良く行うことができない。しかし、マウス由来の細胞との共培養をするため、たとえヒト胚性幹細胞を用いて産生した神経細胞であっても、移植の安全性（異種細胞や病原体の混入などの点）では、異種移植と同様のリスクを負うことになり、臨床応用への大きな障害となる。
また、胚性幹細胞に関するその他の分化誘導方法としては、レチノイン酸を用いる方法が知られているが（非特許文献５参照）、この方法には、ドパミン神経の分化誘導率が極めて低いという問題点があった。また、ＥＳ細胞の凝集培養から分化させた神経前駆細胞を選択培地を用いて選択培養する方法についても知られていたが（非特許文献６参照）、この方法は、ＳＤＩＡ法の２〜３倍の時間を要するという問題点があった。
以上のような背景から、胚性幹細胞の培養により得られた細胞の移植の安全性を確保すると同時に、胚性幹細胞を特定の機能細胞、例えば神経細胞に効率的に分化誘導できる方法の開発が切望されていた。
国際公開WO01/088100号パンフレット 国際公開WO03/042384号パンフレット Kawasakiら, Neuron, vol.28, p.31-40 (2000) Kawasakiら, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, vol.99, p.1580-1585 (2002) Mizusekiら, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, vol.100, p.5828-5833 (2003) Ootoら, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., vol.44, p.2689-2693 (2003) Bainら, Dev. Biol., vol.168, p.342-357 (1995) LeeらNature Biotech., vol.18, p.675-679 (2000)
従って、本発明の目的は、胚性幹細胞の培養、例えば分化誘導により得られる細胞の臨床応用を可能とする、より実用性の高い方法を開発することである。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、羊膜に存在する因子が、胚性幹細胞の培養、例えば分化誘導、増殖に有用であることを見出した。羊膜は、拒絶反応が生じ難いこと、容易に入手可能であること、および臨床での使用実績があり安全性が高いなどの利点があるため、胚性幹細胞の培養剤として非常に有用であると考えられる。以上の知見に基づき、本発明者らは、羊膜由来因子の存在下で胚性幹細胞を培養することを着想し、本発明を完成した。即ち、本発明は下記の通りである：
（１）羊膜由来因子の存在下で胚性幹細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞の培養方法；
（２）胚性幹細胞を無血清培地で培養する、上記（１）の方法；
（３）羊膜由来因子と胚性幹細胞の両方が同種の哺乳動物に由来するものである、上記（１）又は（２）の方法；
（４）羊膜由来因子がヒト由来のものである、上記（３）の方法；
（５）胚性幹細胞の分化誘導方法である、上記（１）の方法；
（６）神経系細胞が分化誘導される、上記（５）の方法；
（７）神経系細胞がカテコールアミン分泌神経細胞である、上記（６）の方法；
（８）神経系細胞がチロシン水酸化酵素陽性細胞である、上記（６）の方法；
（９）胚性幹細胞の増殖方法である、上記（１）又は（２）の方法；
（１０）羊膜由来因子が無細胞組織の形態で提供されるものである、上記（１）の方法；
（１１）上記（１）〜（１０）のいずれかの方法により得られうる細胞培養物；
（１２）胚性幹細胞の分化誘導活性を指標に、当該活性を有する羊膜由来因子をスクリーニングする方法；
（１３）分化誘導活性が、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性である、上記（１１）の方法；
（１４）胚性幹細胞の増殖活性を指標に、当該活性を有する羊膜由来因子をスクリーニングする方法；
（１５）上記（１２）又は（１４）の方法により得られうる羊膜由来因子；
（１６）羊膜由来因子を含有してなる、胚性幹細胞の培養剤；
（１７）羊膜由来因子が、胚性幹細胞の分化誘導活性を有するものである、上記（１６）の剤；
（１８）分化誘導活性が、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性である、上記（１７）の剤；
（１９）羊膜由来因子が、胚性幹細胞の増殖活性を有するものである、上記（１６）の剤；
（２０）羊膜由来因子がヒト由来のものである、上記（１６）の剤；
（２１）凍結保存された形態である、上記（１６）又は（２０）の剤；
（２２）羊膜由来因子が無細胞組織の形態で提供されるものである、上記（１６）又は（２０）の剤；
（２３）以下、（ｉ）、（ｉｉ）を含む、胚性幹細胞培養用キット：
（ｉ）羊膜由来因子を含有してなる、胚性幹細胞の培養剤、並びに
（ｉｉ）胚性幹細胞の培養に使用すべき、又は使用されうることを記載する説明書；
（２４）胚性幹細胞の分化誘導活性を指標に、当該活性を有する羊膜細胞を作製する方法；
（２５）分化誘導活性が、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性である、上記（２４）の方法；
（２６）胚性幹細胞の増殖活性を指標に、当該活性を有する羊膜細胞を作製する方法。
本発明によれば、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減することが可能になるため、細胞移植の臨床応用という観点から有用である。また、羊膜は、拒絶反応が生じ難いこと、容易に入手可能であること、および臨床での使用実績があり安全性が高いなどの利点があるため、本発明は実用性が高いという利点を有する。さらに、本発明によれば、これら特徴を有しつつ、胚性幹細胞から神経系細胞を効率的に分化誘導することが可能となるため、パーキンソン病等の神経変性疾患の治療という観点から有用である。
本発明は、羊膜由来因子の存在下で胚性幹細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞の培養方法を提供する。
「胚性幹細胞（ＥＳ細胞）」とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、生体を構成するすべての細胞に分化しうる多分化能を有する細胞をいう。
胚性幹細胞としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物に由来する細胞を使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。
具体的には、本発明の方法で用いられる胚性幹細胞としては、例えば、着床以前の初期胚を培養することによって樹立した哺乳動物等の胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞Ｉ」と省略）、体細胞の核を核移植することによって作製された初期胚を培養することによって樹立した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩ」と省略）、および胚性幹細胞Ｉ又はＩＩの胚性幹細胞の染色体上の遺伝子を遺伝子工学の手法を用いて改変した胚性幹細胞（以下、「胚性幹細胞ＩＩＩ」と省略）が挙げられる。
より具体的には、胚性幹細胞Ｉとしては、初期胚を構成する内部細胞塊より樹立された胚性幹細胞、始原生殖細胞から樹立されたＥＧ細胞、着床以前の初期胚の多分化能を有する細胞集団（例えば、原始外胚葉）から単離した細胞、あるいはその細胞を培養することによって得られる細胞などが挙げられる。
胚性幹細胞Ｉは、着床以前の初期胚を、文献 (Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994)) に記載された方法に従って培養することにより調製することができる。
胚性幹細胞ＩＩは、例えば、Wilmutら (Nature, 385, 810 (1997))、Cibelliら (Science, 280, 1256 (1998))、入谷明ら（蛋白質核酸酵素, 44, 892 (1999)）、Baguisiら (Nature Biotechnology, 17, 456 (1999))、Wakayamaら (Nature, 394, 369 (1998); Nature Genetics, 22, 127 (1999); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 14984 (1999))、RideoutIIIら (Nature Genetics, 24, 109 (2000)) 等によって報告された方法を用いることにより、例えば以下のように作製することができる。
哺乳類動物細胞の核を摘出後初期化（核を再び発生を繰り返すことができるような状態に戻す操作）し、除核した哺乳動物の未受精卵に注入する方法を用いて発生を開始させ、発生を開始した卵を培養することによって、他の体細胞の核を有し、かつ正常な発生を開始した卵が得られる。
体細胞の核を初期化する方法としては複数の方法が知られている。例えば、核を提供する側の細胞を培養している培地を、５〜３０％、好ましくは１０％の仔ウシ胎児血清を含む培地（例えば、Ｍ２培地）から３〜１０日、好ましくは５日間、０〜１％、好ましくは０．５％の仔ウシ胎児血清を含む貧栄養培地に変えて培養することで細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導することで初期化することができる。
また、同種の哺乳動物の除核した未受精卵に、核を提供する側の細胞の核を注入し、数時間、好ましくは約１〜６時間培養することで初期化することができる。
初期化された核は除核された未受精卵中で発生を開始することが可能となる。初期化された核を除核された未受精卵中で発生を開始させる方法としては複数の方法が知られている。細胞周期を休止期状態（Ｇ０期もしくはＧ１期）に誘導し初期化した核を、電気融合法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植することで卵子を活性化し発生を開始させることができる。
同種の哺乳動物の除核した未受精卵に核を注入することで初期化した核を、再度マイクロマニピュレーターを用いた方法などによって同種の哺乳動物の除核した未受精卵に移植し、卵子活性化物質（例えば、ストロンチウムなど）で刺激後、細胞分裂の阻害物質（例えば、サイトカラシンＢなど）で処理し第二極体の放出を抑制することで発生を開始させることができる。この方法は、哺乳動物が、例えばマウスなどの場合に好適である。
いったん発生を開始した卵が得られれば、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995) 等に記載の公知の方法を用い、胚性幹細胞を取得することができる。
胚性幹細胞ＩＩＩは、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。胚性幹細胞ＩＩＩの作製に際して改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、組織適合性抗原の遺伝子、神経系細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995) 等に記載の方法を用い、行なうことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）のゲノム遺伝子を単離し、単離したゲノム遺伝子を用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製したターゲットベクターを胚性幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離する方法としては、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) やCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)等に記載された公知の方法があげられる。また、ゲノムＤＮＡライブラリースクリーニングシステム (Genome Systems製)やUniversal GenomeWalkerTM Kits (CLONTECH製)などを用いることにより、標的遺伝子のゲノム遺伝子を単離することができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); バイオマニュアルシリーズ８ジーンターゲッティング，ＥＳ細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社 (1995)等に記載の方法にしたがって作製することができる。なお、ターゲットベクターは、リプレースメント型、インサーション型いずれでも用いることができ、また、選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、ポリＡ選択などの方法を用いることができる
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーション法やＰＣＲ法等があげられる。
また、胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES-1、KhES-2 及び KhES-3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。
「羊膜由来因子の存在下」で胚性幹細胞を培養するとは、羊膜から得られる因子を少なくとも含有する培地中で胚性幹細胞を培養することをいう。
本発明の培養方法で用いられる培地は、動物細胞の培養に用いられる培地を基礎培地として調製することができる。基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、およびこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地であれば特に限定されない。
本発明の培養方法で用いられる培地は、血清含有培地、無血清培地であり得るが、異種成分の排除による細胞移植の安全性の確保という観点からは、無血清培地が好ましい。ここで、無血清培地とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味し、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地は無血清培地に該当するものとする。かかる無血清培地としては、例えば、市販のKNOCKOUTTM SRを適量（例えば、１-20％）添加した無血清培地、インスリンおよびトランスフェリンを添加した無血清培地（例えば、CHO-S-SFM II（GIBCO BRL社製）、Hybridoma-SFM（GIBCO BRL社製）、eRDF Dry Powdered Media（GIBCOBRL社製）、UltraCULTURETM（BioWhittaker社製）、UltraDOMATM（BioWhittaker社製）、UltraCHOTM（BioWhittaker社製）、UltraMDCKTM（BioWhittakeｒ社製）、ITPSG培地（Cytotechnology, 5, S17 (1991)）、ITSFn培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 457 (1980)）、mN3培地（Mech. Dev. 59, 89 (1996) など）、細胞由来の因子を添加した培地（例えば、多能性奇形癌腫細胞ＰＳＡ１の培養上清を添加した培地（Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 7634 (1981)）などが挙げられる。
また、本発明の培養方法で用いられる培地は、必要に応じてその他の成分、例えば、アミノ酸、ピルビン酸、２−メルカプトエタノール、サイトカイン、増殖因子等を適切な濃度で含有していてもよい。
胚性幹細胞の培養で用いられる培養器は、細胞培養用であれば特に限定されないが、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、デッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用デッシュ、マルチデッシュ、マイクロプレート、マイクロウエルプレート、マルチプレート、マルチウエルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、ローラーボトルが挙げられる。
本発明の培養方法をより具体的に述べれば、羊膜由来因子の存在下での胚性幹細胞の培養を実現する手段の一つは、羊膜又はその加工物の存在下での胚性幹細胞の培養であり得る。
羊膜又はその加工物としては、例えば温血動物、好ましくは哺乳動物に由来するものを使用できる。哺乳動物としては、例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、ヒトが挙げられる。
別の局面では、羊膜又はその加工物としては、本発明の培養方法で用いられる胚性幹細胞と同種の哺乳動物に由来するものを使用できる。
羊膜は、自体公知の方法により調製できる。なお、羊膜としては、帝王切開により無菌的に採取されたものが好ましい。採取された羊膜を、抗生物質を含有する生理食塩水で洗浄し、血液成分や絨毛膜を除去した後、適切な大きさに切り分け、適当な緩衝液中で保存する。なお、羊膜を採取する被験体は、感染症（例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、梅毒、ヒト免疫不全ウイルス）が陰性であることが好ましい。感染症の有無は、自体公知の方法、例えば、血清検査により確認できる。
羊膜加工物は、上記の通り得られる羊膜を任意の処理に付することで調製できる。羊膜加工物を調製するための処理としては、例えば、ＥＤＴＡ溶液による細胞成分の除去、放射線（例えば、γ線）照射、羊膜の変性（例えば、凍結・融解による羊膜細胞の死滅化処理）、脱水（例えば、凍結乾燥法）、並びにこれらの組合せなどが挙げられる。
好ましい羊膜加工物としては、羊膜から細胞を除去したもの、即ち、無細胞組織を挙げることができる。無細胞組織は、自体公知の方法、例えば、ＥＤＴＡ、蛋白分解酵素を用いて、羊膜から細胞を除去することで調製できる。また、羊膜として無細胞組織を用いる場合、胚性幹細胞は、羊膜由来の活性因子が多量に吸着している羊膜内腔側との接触下で培養するのが好ましい。このとき、羊膜の無細胞組織は、胚性幹細胞との接着を強化するために、コーティング剤により予め処理されていてもよい。コーティング剤としては、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リジン、フィブロネクチン、ラミニンが挙げられる。
また、羊膜又はその加工物としては、凍結保存、例えば、凍結乾燥されていたものを、解凍して使用できる。なお、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来の活性因子は、長期の凍結保存後に解凍されたものであってもその活性が保持されることが確認されている。従って、本発明の培養方法で用いられる羊膜又はその加工物は、凍結処理により長期保存されたものであっても使用できるという利点を有する。
羊膜又はその加工物について、凍結保存の温度は、特に限定されず任意に設定し得るが、例えば０℃〜−１００℃、好ましくは−２０℃〜−８０℃であり得る。また、凍結保存可能な期間は、胚性幹細胞の培養に有用な活性を完全に消失しない期間である限り特に限定されないが、例えば、−８０℃保存では、３年以下、好ましくは１年以下、より好ましくは半年以下の期間であり得る。羊膜又はその加工物の凍結・解凍処理は、自体公知の方法により行うことができる。
より具体的には、羊膜又はその加工物の存在下で胚性幹細胞を培養する方法としては、例えば、回収した胚性幹細胞を適切な培地（例えば、Glasgow MEM培地500 mlに5%のKNOCKOUTTM SR、100×非必須アミノ酸溶液 (Gibco製) 5 ml、100×ピルビン酸 (Sigma製) 5 mlおよび１×10-1 M 2-メルカプトエタノール0.5mlを添加した培地）に懸濁し、羊膜の無細胞組織を内腔側を上にして貼り付けた培養器に、数十〜数百細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種し、３〜２０日間３７℃で数％、好ましくは５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターにて培養する方法が挙げられる。
また、羊膜由来因子の存在下での胚性幹細胞の培養を実現する別の手段としては、羊膜細胞の存在下での胚性幹細胞の培養が挙げられる。後述の実施例により、羊膜の無細胞組織の内腔側に、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来の活性因子が多量に吸着しているという知見が得られている。このことは、かかる活性因子が羊膜細胞により産生されていることを強く示唆する。
「羊膜細胞」とは、羊膜に存在する細胞をいい、例えば、羊膜の上皮細胞、間質細胞から調製される初代培養細胞、当該初代培養細胞から誘導された細胞株などが挙げられる。胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来の活性因子（例えば、胚性幹細胞の分化誘導活性及び／又は増殖活性を有する因子）を産生する羊膜細胞は、後述の方法により作製できる。
羊膜細胞としては、例えば温血動物、好ましくは、上述した哺乳動物に由来する細胞を使用できる。
別の局面では、羊膜細胞としては、本発明の培養方法で用いられる胚性幹細胞と同種の哺乳動物に由来する細胞を使用できる。
羊膜細胞の存在下での胚性幹細胞の培養は、胚性幹細胞と羊膜細胞とが接触下の状態、あるいは非接触下の状態、好ましくは接触下の状態で行うことができる。なお、羊膜細胞を用いる胚性幹細胞の培養は、羊膜細胞を用いること以外は、羊膜又はその加工物を用いる培養と同様の条件で行うことができる。
さらに、羊膜由来因子の存在下での胚性幹細胞の培養を実現する他の手段としては、羊膜由来因子を含有する可溶化抽出液を添加した培地での胚性幹細胞の培養が挙げられる。後述の実施例により、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来因子は、羊膜の無細胞組織の内腔側に多量に吸着又は結合しているという知見が得られている。このことは、かかる羊膜由来因子が疎水性物質又は細胞外マトリックス結合物質であることを示唆する。従って、この羊膜由来因子は、有機溶媒、可溶化剤（例えば、界面活性剤）、又はポリアニオン性高分子（例えば、ヘパリン）などによる処理、あるいは細胞外マトリックス分解処理（例えば、へパリナーゼなどによる処理）などの自体公知の方法により抽出できる。
羊膜由来因子は、例えば、羊膜又はその加工物、あるいは羊膜細胞を、上述の通り有機溶媒等で処理することで抽出できる。なお、羊膜由来因子は精製される必要はなく、未精製の画分の状態で、本発明の培養方法に使用できる。なお、抽出した画分が、胚性幹細胞の培養に有用な活性を有するか否かは、胚性幹細胞の培養に使用することで確認できる。
本発明の培養方法により得られる細胞培養物もまた、本発明により提供される。本発明の細胞培養物は、好ましくは、胚性幹細胞が由来する哺乳動物以外の哺乳動物に由来する成分を実質的に含有しない。また、本発明の細胞培養物は、培養において羊膜成分が使用されているため、移植に際し、拒絶反応を生じ難く、さらに、安全性が高いという利点を有する。
一実施形態では、本発明の培養方法は、胚性幹細胞の分化誘導方法であり得る。本発明の分化誘導方法は、胚性幹細胞の分化を引き起こすものである限り特に限定されないが、例えば、胚性幹細胞を外胚葉系細胞に分化させることができる。外胚葉系細胞としては、例えば、神経系細胞、表皮系細胞、感覚器系細胞、色素細胞、神経堤由来間葉細胞が挙げられる。
本発明の分化誘導方法では、神経系細胞への分化効率をより向上させるため、既知の外胚葉系細胞への分化誘導物質を併用できる。このような分化誘導物質としては、後述の神経系細胞への分化誘導物質に加え、例えば、Ｗｎｔ阻害剤（Nature Biotechnology, 20, 1240-1245 (2002)）を挙げることができる。
好ましくは、本発明の分化誘導方法では、胚性幹細胞から神経系細胞への分化が誘導できる。
また、本発明の分化誘導方法では、好ましくは、特異的な分化誘導の達成という観点から、胚性幹細胞は無血清培地で培養される。
さらに、本発明の分化誘導方法では、神経系細胞への分化効率をより向上させるため、既知の神経系細胞への分化誘導物質を併用できる。このような分化誘導物質としては、例えば、ＮＧＦ（Biochem. Biophys. Res. Commun., 199, 552 (1994)）、レチノイン酸（Dev. Biol., 168, 342 (1995); J.Neurosci., 16, 1056 (1996)）、ＦＧＦ（Genes & Development, 15, 3023-8 (2003)）、ＢＭＰ阻害因子（Nature, 376, 333-336 (1995)）、ＩＧＦ（Genes & Development, 15, 3023-8 (2003)）が挙げられる。勿論、これら分化誘導物質の非存在下でも、神経系細胞への分化が可能である。
本発明の方法により分化誘導された神経系細胞は、Ｓｏｘ−１陽性のコロニー率が実質的に約１００％であること特徴の一つとする。また、本発明の分化誘導方法のさらなる特徴は、Ｓｏｘ−１陽性のコロニー中、約８０％以上、例えば約８０％〜９０％の神経系細胞がＮＣＡＭ陽性細胞であることである。
具体的には、本発明の方法により分化誘導できる神経系細胞としては、例えば、神経幹細胞、神経細胞、神経管の細胞、神経堤の細胞などが挙げられる。
神経細胞 (neuron) とは、他の神経細胞あるいは刺激受容細胞からの刺激を受け別の神経細胞、筋あるいは腺細胞に刺激を伝える機能を有する細胞をいう。神経細胞は、神経細胞が産生する神経伝達物質の違いにより分類することができ、例えば、分泌する神経伝達物質などの違いで分類されている。これらの神経伝達物質で分類される神経細胞としては、例えば、ドパミン分泌神経細胞、アセチルコリン分泌神経細胞、セロトニン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞、グルタミン酸分泌神経細胞などがあげられる。ドパミン分泌神経細胞、ノルアドレナリン分泌神経細胞、アドレナリン分泌神経細胞を総称してカテコールアミン分泌神経細胞と呼ぶ。
本発明の方法により分化誘導された神経細胞は、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）陽性のコロニー率が約５０％以上、例えば、約５０％〜約７０％であることを特徴の一つとする。また、本発明の分化誘導方法のさらなる特徴は、ＴＨ陽性のコロニー中、約３割の神経細胞がＴＨ陽性細胞であることである。
本発明の分化誘導方法は、神経細胞への分化のために用いることができるが、神経細胞の中でも好ましくは、カテコールアミン分泌神経細胞（例えば、ドパミン分泌神経細胞）への分化のために用いることができる。
神経幹細胞とは、神経細胞、アストロサイト (astrocyte) およびオリゴデンドロサイト (oligodendrocyte) に分化しうる能力を有し、かつ自己複製能力を有する細胞をいい、脳内において神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトを供給する機能を有している。従って、神経幹細胞であることを確認する方法としては、実際に脳に移植してその分化能を確認する方法、インビトロで神経幹細胞を神経細胞、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化誘導させて確認する方法などが挙げられる (Mol. Cell. Neuroscience, 8, 389 (1997); Science, 283, 534 (1999))。また、このような機能を有した神経幹細胞は、神経前駆細胞での発現が確認されている細胞骨格蛋白質ネスチンを認識する抗ネスチン抗体で染色可能である (Science, 276, 66 (1997))。従って、抗ネスチン抗体で染色することにより神経幹細胞を確認することもできる。
本発明の分化誘導方法により得られる細胞培養物もまた、本発明により提供される。なお、当該細胞培養物は、本発明の培養方法により得られる上述の細胞培養物と同様の特徴を有する。
本発明の分化調節方法により得られた細胞は、神経系細胞の障害に基づく疾患の治療薬、又はその他の原因による神経損傷において神経系細胞を補充するためなどに用いることができる。神経系細胞の障害に基づく疾患としては、パーキンソン病、ハンチントン舞踏病、アルツハイマー病、虚血性脳疾患、てんかん、脳外傷、脊髄損傷、運動神経疾患、神経変性疾患、網膜色素変性症、内耳性難聴、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、神経毒物の障害に起因する疾患などが挙げられる。
また、本発明の分化調節方法により得られた細胞、例えば神経系細胞の障害に基づく疾患の治療薬として用いる場合、当該細胞の純度を高めた後に被験体に移植することが好ましい。
細胞の純度を高める方法は、公知となっている細胞分離精製の方法であればいずれも用いることができるが、例えば、フローサイトメーターを用いる方法（例えば、Antibodies - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、Int. Immunol., 10, 275 (1998)参照）、パニング法（例えば、Monoclonal Antibodies: principles and practice, Third Edition, Acad. Press (1993)、Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Pressat Oxford University Press (1996)、J. Immunol., 141, 2797 (1988)参照）、ショ糖濃度の密度差を利用する細胞分画法（例えば、組織培養の技術（第三版），朝倉書店（１９９６）参照）が挙げられる。
本発明の分化細胞の純度を高める方法は、上述のような胚性幹細胞を分化誘導して得られた神経系細胞、特に神経細胞を、抗癌剤を含む培地中で培養する工程を含む。これにより、未分化な状態の細胞を除去することができ、より純度の高い分化細胞を得ることが可能で、医薬としてより好適となる。即ち、抗癌剤で処理することにより、目的とする分化細胞以外の細胞、例えば未分化な細胞を除去することができる。
ここで、抗癌剤としては、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル、アドリアマイシン、アラＣまたはメトトレキセートなどがあげられる。これら抗癌剤は、分化誘導した細胞よりも未分化な状態の細胞に、より細胞毒性を示す濃度で用いることが好ましい。具体的には、上述の４に記載した方法にしたがい、これら抗癌剤を用いた培養を行い、至適濃度を決定することができ、例えば、これら抗癌剤を生体に用いる日本薬局方記載の濃度の１００分の１〜１倍の濃度で含む培地を用い、５％の二酸化炭素を通気したＣＯ２インキュベーターで、３７℃で数時間、好ましくは２時間培養する方法をあげることできる。
ここで使用する培地としては、分化誘導した細胞を培養することが可能な培地であればいかなるものも用いることができる。具体的には、上述の培地等を挙げることができる。
また、移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞、又は染色体上の遺伝子を改変した胚性幹細胞を用いることで当該問題を克服できる。
また、体細胞の核を核移植した胚性幹細胞を用いて分化誘導することで、体細胞を提供した個体の神経細胞を得ることができる。このような個体の細胞は、その細胞自身が移植医療として有効のみならず、既存の薬物がその個体に有効か否かを判断する診断材料としても有用である。さらに、分化誘導した細胞を長期に培養することで酸化ストレスや老化に対する感受性の判定が可能であり、他の個体由来の細胞と機能や寿命を比較することで神経変性疾患等の疾患に対する個体のリスクを評価することができ、それら評価データは将来の発病率が高いと診断される疾患の効果的な予防法を提供するために有用である。
胚性幹細胞から分化誘導された神経細胞は、自体公知の方法により、患者の疾患部位に移植できる（例えば、Nature Neuroscience, 2, 1137 (1999) 参照）。
別の実施形態では、本発明の培養方法は、胚性幹細胞の増殖方法であり得る。本発明の増殖方法は、胚性幹細胞数の増加を引き起こすものである限り特に限定されないが、好ましくは、未分化状態を維持しつつ胚性幹細胞数の増加を引き起こすものであり得る。
本発明の増殖方法では、好ましくは、未分化状態の維持のため、胚性幹細胞は無血清培地で培養される。
また、本発明の増殖方法では、未分化状態の維持のため、分化抑制物質を併用することもできる。このような分化抑制物質としては、例えば、ＬＩＦ（leukaemia inhibitory fator）（Development, 110, 1341 (1990)；Dev. Biol., 141, 344 (1990)）、ＧＳＫ３阻害剤（Nature Medicine, 10, 55-63 (2003)）が挙げられる。勿論、これら分化抑制物質の非存在下でも、未分化状態の維持が可能である。
本発明の増殖方法は、胚性幹細胞数を未分化状態のまま増加させ、ひいては本発明の分化誘導方法と併用することで、より多くの移植用細胞を得ることを可能とする。
本発明の増殖方法により得られる細胞培養物もまた、本発明により提供される。なお、当該細胞培養物は、本発明の培養方法により得られる上述の細胞培養物と同様の特徴を有する。
また、本発明は、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来の活性因子、例えば、胚性幹細胞の分化誘導活性及び／又は増殖活性を指標に、当該活性を有する羊膜由来因子をスクリーニングする方法、及び当該方法により得られうる羊膜由来因子を提供する。
羊膜由来の活性因子は、例えば、羊膜の無細胞組織を出発原料とし、培地中に添加した際の、胚性幹細胞の分化誘導活性又は増殖活性を指標として精製することができる。精製方法としては、例えば、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、陰イオン交換クロマトグラフィー法、陽イオン交換クロマトグラフィー法、疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィー法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法、あるいはこれら方法の組合せが挙げられる。
また、羊膜由来の活性因子は、発現クローニングの方法を用いて、羊膜細胞より得ることができる（Molecular Cloning (第２版)、Current protocols in Molecular Biology (第3版), Acad. Press (1993)、Antibody Engineering: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1996)）。
具体的には、羊膜細胞よりｃＤＮＡを調製し、該ｃＤＮＡを適当な発現ベクターのプロモーターの下流に挿入することにより、組換えベクターを作製し、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。該組換えベクターを、該発現ベクターに適合した宿主細胞に導入することにより、羊膜細胞が生産する遺伝子産物を産生する形質転換体を得、分化誘導活性又は増殖活性を有する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択する。選択した該形質転換体に導入したｃＤＮＡにコードされている遺伝子配列を決定することにより、分化誘導活性又は増殖活性を有する因子を取得することができる。
本スクリーニング方法で用いられる宿主細胞としては、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性を有していない細胞であれば如何なる細胞でも用いることができる。このような細胞としては、例えば、CHO細胞、MDCK細胞、ラット繊維芽細胞3Y1、COS細胞が挙げられる。
ｃＤＮＡの作製に用いられる細胞としては、胚性幹細胞の分化誘導活性又は増殖活性を有する上述の羊膜細胞が用いられる。
ｃＤＮＡライブラリーは、自体公知の方法により作製できる。なお、作製したｃＤＮＡライブラリーをそのまま用いてもよいが、目的とする遺伝子を濃縮するために、胚性幹細胞の分化誘導活性又は増殖活性を有していない細胞のｍＲＮＡを用い、サブトラクション法 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5783 (1988)) を行なって作製したｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。
組換えベクターの宿主細胞への導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法、リポフェクション法が挙げられる。
以上のようにして得られる形質転換体を培地に培養することにより、導入したｃＤＮＡがコードする遺伝子産物を発現させることができる。形質転換体を培地に培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行うことができる。例えば、培地としては、一般に使用されているＲＰＭＩ１６４０培地、αＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ培地、１９９培地またはこれら培地に牛胎児血清等を添加した培地等を用いることができる。培養は、通常ｐＨ６〜８、３０〜４０℃、５％ＣＯ２存在下等の条件下で１〜７日間行われる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ペニシリン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
本発明のスクリーニング方法では、胚性幹細胞と形質転換体との共培養を行なうことで、胚性幹細胞の分化誘導活性又は増殖活性を有する遺伝子産物を産生する形質転換体を選択することができる。選択した形質転換体に導入したｃＤＮＡの単離、および単離したｃＤＮＡの遺伝子配列の決定は、自体公知の方法により行うことができる。
本発明のスクリーニング方法は、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来の活性因子のスクリーニングを可能にするため有用である。また、当該スクリーニング方法により得られる羊膜由来因子は、胚性幹細胞の培養培地における添加物として有用である。
さらに、本発明は、羊膜由来因子を含有してなる、胚性幹細胞の培養剤を提供する。
本発明の培養剤は、胚性幹細胞の培養のために、羊膜由来因子を直接的又は間接的に提供し得るものである限り特に限定されない。
一実施形態では、本発明の培養剤は、羊膜由来因子が付着している生物学的有形物、又は羊膜由来因子を含有する溶液である。羊膜由来因子が付着している生物学的有形物は、生物由来材料（例えば、細胞、組織）に羊膜由来因子が付着しているものである限り限定されず、例えば、羊膜又はその加工物（例えば、無細胞組織）、羊膜細胞が挙げられる。羊膜由来因子を含有する溶液としては、例えば、有機溶媒抽出液、可溶化剤（例えば、界面活性剤）抽出液、ポリアニオン抽出液、細胞外マトリックスの酵素分解抽出液が挙げられる。また、羊膜由来の活性因子が単離された場合には、かかる活性因子から実質的になる培養剤を提供することも可能となる。
別の実施形態では、本発明の培養剤は、羊膜由来因子が付着している生物学的有形物、又は羊膜由来因子を含有する抽出液と、基材との組合せの形態で提供される。具体的には、本培養剤は、上述した羊膜由来因子の種々の形態を、基材に接着、固定又は被覆した、あるいは染み込ませた形態で提供される。基材は、有形物を接着、固定又は被覆可能か、あるいは液体を含浸可能なものである限り限定されず、例えば、上述した培養器の他、培養シート（例えば、多孔性膜等のカルチャーインサート）、ビーズ、中空糸、高分子ゲルが挙げられる。
さらに、本発明の培養剤は、凍結保存、例えば、凍結乾燥された形態で提供されてもよい。なお、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜由来の活性因子は、長期の凍結保存後に解凍されたものであってもその活性が保持されることが確認されている。従って、本発明の培養剤は、凍結処理により長期保存されたものであっても使用できるという利点を有する。
本発明の培養剤について、凍結保存の温度は、特に限定されず任意に設定し得るが、例えば０℃〜−１００℃、好ましくは−２０℃〜−８０℃であり得る。また、凍結保存可能な期間は、胚性幹細胞の培養に有用な活性を完全に消失しない期間である限り特に限定されないが、例えば、−８０℃では３年以下、好ましくは１年以下、より好ましくは半年以下の期間であり得る。
一実施形態では、本発明の培養剤は、胚性幹細胞の分化誘導活性を有する羊膜由来因子を含有する、胚性幹細胞の分化誘導剤であり得る。本発明の分化誘導剤は、上述した外胚葉系細胞への分化誘導物質、好ましくは神経系細胞への分化誘導物質をさらに含有することもできる。
別の実施形態では、本発明の培養剤は、胚性幹細胞の増殖活性を有する羊膜由来因子を含有する、胚性幹細胞の増殖剤であり得る。本発明の増殖剤は、上述した分化抑制物質をさらに含有することもできる。
本発明の培養剤は、胚性幹細胞の培養、例えば、胚性幹細胞の分化誘導のため、及び／又は胚性幹細胞の増殖などに有用である。
また、本発明は、（ｉ）本発明の培養剤、並びに（ｉｉ）胚性幹細胞の培養に使用すべき、又は使用されうることを記載する説明書、を含む胚性幹細胞培養用キットを提供する。
本発明のキットにおいて、培養剤が、基材に接着、固定又は被覆した、あるいは染み込ませた形態で提供されない場合には、かかる基材を本発明のキットに含めることもできる。
本発明の培養用キットはまた、上記に加え、胚性幹細胞用の培地、培地添加物などをさらに含んで構成される。
一実施形態では、本発明の培養用キットは、（ｉ）本発明の培養剤、並びに（ｉｉ）胚性幹細胞の外胚葉系細胞への分化誘導に使用すべき、又は使用されうることを記載する説明書、及び／又は外胚葉系細胞マーカーに対する抗体、を含む、胚性幹細胞の分化誘導用キットであり得る。
外胚葉系細胞マーカーに対する抗体としては、胚性幹細胞の外胚葉系細胞への分化を確認できる抗体である限り限定されず、例えば、神経系細胞マーカーに対する抗体であり得る。神経系細胞マーカーに対する抗体としては、胚性幹細胞の神経系細胞への分化を確認できる抗体である限り限定されず、例えば、ＮＣＡＭ、ＴｕＪ１、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、セロトニン、ネスチン、ＭＡＰ２、ＭＡＰ２ａｂ、ＮｅｕＮ、ＧＡＢＡ、グルタメート、ＣｈＡＴに対する抗体が挙げられる。
また、外胚葉系細胞マーカーに対する抗体としては、表皮系細胞マーカー（例えば、サイトケラチン）、感覚器細胞マーカー（例えば、ＲＰＥ、ロドプシン）、色素細胞マーカー（例えば、ＴＲＰ−１）、神経堤由来間葉系細胞（例えば、ＳＭＡ）に対する抗体なども挙げることができる。
本発明のキットに含まれる抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいずれであってもよく、周知の免疫学的手法により作製することができる。また、抗体は、完全な抗体分子だけでなく、マーカーに対する抗原結合部位（ＣＤＲ）を有する限りいかなるフラグメントであってもよく、例えば、Fab、F(ab')2、scFv、minibody等が挙げられる。なお、本発明のキットに含まれる抗体は、検出可能な標識性物質（例えば、蛍光物質）により標識されていてもよい。
例えば、ポリクローナル抗体は、抗原として上記マーカーを（必要に応じて、ウシ血清アルブミン、ＫＬＨ（Keyhole Limpet Hemocyanin）等のキャリア蛋白質に架橋した複合体とすることもできる）、市販のアジュバント（例えば、完全または不完全フロイントアジュバント）とともに、動物の皮下あるいは腹腔内に２〜３週間おきに２〜４回程度投与し（部分採血した血清の抗体価を公知の抗原抗体反応により測定し、その上昇を確認しておく）、最終免疫から約３〜１０日後に全血を採取して抗血清を精製することにより取得できる。抗原を投与する動物としては、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ハムスターなどの哺乳動物が挙げられる。
また、モノクローナル抗体は、細胞融合法により作製したハイブリドーマから得ることができる。例えば、マウスに上記抗原を市販のアジュバントと共に２〜４回皮下あるいは腹腔内に投与し、最終投与の３日後に脾臓あるいはリンパ節を採取し、白血球を採取する。この白血球と骨髄腫細胞（例えば、NS-1, P3X63Ag8など）を細胞融合して該因子に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得る。細胞融合はＰＥＧ法でも電圧パルス法であってもよい。所望のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、周知のＥＩＡまたはＲＩＡ法等を用いて抗原と特異的に結合する抗体を、培養上清中から検出することにより選択できる。モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマの培養は、インビトロ、またはマウスもしくはラット、好ましくはマウス腹水中等のインビボで行うことができ、抗体はそれぞれハイブリドーマの培養上清および動物の腹水から取得することができる。
本発明の分化誘導用キットは、好ましくは神経系細胞への分化誘導用キットであり得る。この場合、当該キットは、神経系細胞マーカーに対する抗体を含むことができる。
また、本発明の分化誘導用キットは、上述した外胚葉系細胞への分化誘導物質、好ましくは神経系細胞への分化誘導物質に加え、後述する胚性幹細胞マーカーに対する抗体をさらに含有することもできる。
本発明のキットは、マーカーに対する抗体を検出可能な手段をさらに含むことができる。マーカーに対する抗体を検出可能な手段としては、例えば、標識性物質（例えば、蛍光物質、発色物質）、マーカーに対する２次抗体などが挙げられる。
別の実施形態では、本発明の培養用キットは、（ｉ）本発明の培養剤、並びに（ｉｉ）胚性幹細胞の増殖に使用すべき、又は使用されうることを記載する説明書、及び／又は胚性幹細胞マーカーに対する抗体、を含む、胚性幹細胞の増殖用キットであり得る。
胚性幹細胞マーカーに対する抗体は、胚性幹細胞の維持状態を確認できる抗体である限り限定されず、例えば、ＳＳＥＡ−１、アルカリホスファターゼ、Ｎａｎｏｇに対する抗体が挙げられる。
本発明の増殖用キットは、上述した胚性幹細胞の分化抑制物質をさらに含有することもできる。
本発明のキットは、胚性幹細胞の培養、特に、胚性幹細胞の分化誘導及び／又は増殖に関する簡便な手段の提供を可能にするため有用である。
本発明はまた、胚性幹細胞の培養に有用な羊膜細胞を作製する方法、及び当該方法により作製された羊膜細胞に関する。本発明の作製方法は、胚性幹細胞の培養に有用な活性、例えば、胚性幹細胞の分化誘導活性及び／又は増殖活性を指標に、当該活性を有する羊膜細胞を作製することを特徴とする。
羊膜細胞は、自体公知の方法により作製できる（例えば、Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc. (2001); 機能細胞の分離と培養，丸善書店（１９８７）参照）。例えば、羊膜の初代培養細胞は、ＥＤＴＡ、蛋白分解酵素などの処理剤を用いて、羊膜から細胞を剥離、回収することで調製できる。
また、羊膜細胞株は、自体公知の方法により樹立できる（例えば、Current Protocols in Cell Biology, John Wiley & Sons, Inc. (2001); 機能細胞の分離と培養，丸善書店（１９８７）参照）。例えば、樹立方法としては、ウイルス、化学発癌剤、放射線による処理、及び初代培養細胞の中から無制限な増殖能を獲得した細胞を単離する方法等が挙げられる。
樹立された細胞株は、当該細胞株の存在下で胚性幹細胞を培養することにより、胚性幹細胞の培養に有用な活性、例えば、胚性幹細胞の分化誘導活性及び／又は増殖活性を有するか否かが確認される。
本方法により作製される羊膜細胞は、胚性幹細胞の培養、例えば、胚性幹細胞の分化誘導及び／又は増殖のために有用である。
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが、実施例は本発明の単なる例示を示すものにすぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
実施例１：ヒト羊膜組織の調製
全身合併症のない帝王切開予定の妊婦で、血清検査で感染症が陰性である者から、胎盤の使用につき、文書による同意を得た上で、帝王切開で取り出された胎盤から、羊膜を無菌的に採取した。採取した羊膜を、抗生物質を含有する生理食塩水で洗浄し、血液成分や絨毛膜を除去した後、適切な大きさに切り分け、抗生物質を添加した５０％グリセロール/ＤＭＥＭ中でディープフリーザーにて急速凍結した後に、−８０℃の専用冷蔵庫で保存した。
実施例２：羊膜の無細胞組織支持プレートの作製
凍結保存（７ヶ月間）した羊膜を解凍後、０．０２％ＥＤＴＡ中にて３７℃で２時間反応させることにより羊膜から細胞を除去し、羊膜の無細胞組織を調製した。次いで、６ウェルプレート（１ウェルの直径：３．５ｃｍ）に多孔性膜のカルチャーインサートを挿入し、多孔性膜のカルチャーインサート上に羊膜の無細胞組織の内腔側を上にして載せた。次いで、ＥＳ細胞の接着を促進する目的で、羊膜の無細胞組織を、ゼラチン又はフィブロネクチンで予めコーティングした。
実施例３：羊膜由来因子存在下でのＥＳ細胞の培養
本実施例では、ＥＳ細胞として、神経マーカーＳｏｘ１遺伝子にＧＦＰ（green fluorescent protein）を相同組換えにてノックインしたマウスＥＳ細胞（以下、必要に応じて、Ｓｏｘ１/ＧＦＰ−ｍＥＳ細胞と省略。Naure Biotechnology Vol. 21: 183-186 (2003) 参照）を用いた。ＥＳ細胞の維持培養には、１％ウシ胎児血清、１０％ＫＳＲ（Knockout Serum Replacement）、ＬＩＦを添加した無フィーダー細胞による通常の培養法を用いた（Neuron, Vol. 28: 31-40 (2000)参照）。ＥＳ細胞コロニーをトリプシン・ＥＤＴＡ処理で単細胞にした後、上記１．２．で調製した無細胞組織上に播種し、分化培地（ＧＭＥＭ、１０％ ＫＳＲ,２ｍＭ グルタミン酸、１ｍＭ ピルビン酸、０．１ｍＭ 非必須アミノ酸混合液、０．１ｍＭ ２−メルカプトエタノール; Neuron, Vol. 28: 31-40 (2000)）で培養した。なお、ＥＳ細胞は、１０００−２０００細胞/１ウェルの密度で播種し、３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートした。
その結果、培養７日後に、ＥＳ細胞各１個からのコロニー形成が確認された。一方、羊膜の無細胞組織の非存在下で同様の実験を行ったところ、ＥＳ細胞各１個からのコロニー形成は確認されたが、コロニーの大きさは、無細胞組織の存在下での培養に比し劣っていた。このことは、羊膜の無細胞組織がＥＳ細胞の増殖活性を有することを示す。
また、培養７日後に、神経特異的レポーターであるＧＦＰシグナルを、１００％のＥＳ細胞コロニーで観察した。さらに、このコロニー中の細胞のうち、約８−９割の細胞が、抗ＮＣＡＭ抗体（Chemicon製）を用いた蛍光抗体法により、ＮＣＡＭ（汎神経マーカー）陽性であることが明らかとなった。このことは、羊膜の無細胞組織が、ＥＳ細胞の外胚葉系細胞、特に神経系細胞への分化誘導活性を有することを示す。
以上より、羊膜の無細胞組織は、ＥＳ細胞の増殖活性・分化誘導活性を有し、ＥＳ細胞の培養に有用であることが示された。
実施例４：羊膜の無細胞組織存在下での培養によるＥＳ細胞からのチロシン水酸化酵素（ＴＨ）陽性細胞の分化誘導
本実施例では、ＥＳ細胞として、マウスＥＳ細胞（Ｅ１４由来）であるＥＢ５細胞（Nature Genet., 24, 372 (2000)）を用いた。また、ＥＳ細胞の分化誘導は、実施例３と同様に行った。ＥＳ細胞を羊膜の無細胞組織上で１１日間培養した後、コラゲナーゼ処理によりＥＳ細胞のコロニーを単離した。単離したＥＳ細胞コロニーを、ポリＤリジン・ラミニンでコーティングした培養プレート上で分化培地（実施例１参照）中にて２日間培養後、固定し、蛍光抗体法により観察した。抗体としては、抗ＴｕＪ１抗体（Babco製）、抗ＴＨ抗体（Chemicon製）を用いた。
その結果、９８％のＥＳ細胞コロニーが、神経細胞マーカーであるＴｕＪ１陽性であった。また、５４−６４％のＥＳ細胞コロニーが、カテコールアミン分泌神経細胞マーカーであるＴＨ（ドパミン分泌神経細胞マーカーとしても用いられる）陽性であった。さらに、ＴＨ陽性のコロニー中では、約３割の細胞がＴＨ陽性であった。
以上より、羊膜由来因子の存在下での培養により、ＥＳ細胞から、神経系細胞、特にＴＨ陽性細胞が効率良く分化誘導されることが明らかとなった。
本発明によれば、胚性幹細胞の培養により得られる細胞の移植を同種移植のリスクレベルまで軽減することが可能になる。また、羊膜は拒絶反応が生じ難いこと、容易に入手可能であること、および臨床での使用実績があり安全性が高いなどの利点があるため、羊膜由来因子を用いることを特徴とする本発明は、実用性が高いという利点を有する。さらに、本発明によれば、これら特徴を有しつつ、胚性幹細胞から神経系細胞を効率的に分化誘導することが可能となる。

Claims (26)

  1. 羊膜由来因子の存在下で胚性幹細胞を培養することを特徴とする、胚性幹細胞の培養方法。
  2. 胚性幹細胞を無血清培地で培養する、請求項１記載の方法。
  3. 羊膜由来因子と胚性幹細胞の両方が同種の哺乳動物に由来するものである、請求項１又は２記載の方法。
  4. 羊膜由来因子がヒト由来のものである、請求項３記載の方法。
  5. 胚性幹細胞の分化誘導方法である、請求項１記載の方法。
  6. 神経系細胞が分化誘導される、請求項５記載の方法。
  7. 神経系細胞がカテコールアミン分泌神経細胞である、請求項６記載の方法。
  8. 神経系細胞がチロシン水酸化酵素陽性細胞である、請求項６記載の方法。
  9. 胚性幹細胞の増殖方法である、請求項１又は２記載の方法。
  10. 羊膜由来因子が無細胞組織の形態で提供されるものである、請求項１記載の方法。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項記載の方法により得られうる細胞培養物。
  12. 胚性幹細胞の分化誘導活性を指標に、当該活性を有する羊膜由来因子をスクリーニングする方法。
  13. 分化誘導活性が、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性である、請求項１１記載の方法。
  14. 胚性幹細胞の増殖活性を指標に、当該活性を有する羊膜由来因子をスクリーニングする方法。
  15. 請求項１２又は１４記載の方法により得られうる羊膜由来因子。
  16. 羊膜由来因子を含有してなる、胚性幹細胞の培養剤。
  17. 羊膜由来因子が、胚性幹細胞の分化誘導活性を有するものである、請求項１６記載の剤。
  18. 分化誘導活性が、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性である、請求項１７記載の剤。
  19. 羊膜由来因子が、胚性幹細胞の増殖活性を有するものである、請求項１６記載の剤。
  20. 羊膜由来因子がヒト由来のものである、請求項１６記載の剤。
  21. 凍結保存された形態である、請求項１６又は２０記載の剤。
  22. 羊膜由来因子が無細胞組織の形態で提供されるものである、請求項１６又は２０記載の剤。
  23. 以下、（ｉ）、（ｉｉ）を含む、胚性幹細胞培養用キット：
    （ｉ）羊膜由来因子を含有してなる、胚性幹細胞の培養剤、並びに
    （ｉｉ）胚性幹細胞の培養に使用すべき、又は使用されうることを記載する説明書。
  24. 胚性幹細胞の分化誘導活性を指標に、当該活性を有する羊膜細胞を作製する方法。
  25. 分化誘導活性が、胚性幹細胞から神経系細胞を分化誘導する活性である、請求項２４記載の方法。
  26. 胚性幹細胞の増殖活性を指標に、当該活性を有する羊膜細胞を作製する方法。
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