CN105358707A - 筛选多能干细胞生长促进因子的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种使用条件培养基筛选多能干细胞生长促进因子的方法，所述条件培养基由在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞产生；一种通过使用条件培养基的无饲养培养使多能干细胞生长的方法；和一种通过在预先培养过饲养细胞的无血清培养基中实现多能干细胞的无饲养培养的使多能干细胞生长的方法。

Description

筛选多能干细胞生长促进因子的方法
技术领域
本发明涉及一种高效的无饲养层、无血清的细胞培养技术和一种基于此类培养技术的筛选方法。
背景技术
最近对于人多能干细胞如人ES细胞(hESC)和人iPS细胞(hiPSC)的研究为再生医学的实际应用提供了增加的可能性。由于此类细胞具有无限的增殖能力和分化成不同细胞的能力，因而使用多能干细胞的再生医学有望从根本上改变对于难治性疾病、与生活习惯相关的疾病和其他疾病的治疗方法。目前的技术已经能够诱导多能干细胞在体外分化成不同细胞，包括神经细胞、心肌细胞、血液细胞和视网膜细胞。
已主要在使用小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)的饲养细胞层上常规培养人多能干细胞，如hESC和hiPSC。饲养细胞提供了用于维持人多能干细胞向干细胞培养的生长因子。已发现在不同人细胞类型以及MEF中其活性能够维持人多能干细胞的培养(HovattaO.等，Hum.Reprod.,(2003)18,pp.1404-1409；RichardsM.等，Nat.Biotechnol.,(2002)20,pp.933-936；ChengL.等，StemCells,(2003)21,pp.131-142；和RichardsM.等，StemCells,(2003)21,pp.546-556)。然而，在常规技术中，在培养时饲养细胞的制备是费力的，并且在干细胞中存在饲养细胞污染的风险。因而，需要发展替代性的更加安全的技术。
作为不使用MEF的多能干细胞培养技术，已知一种涉及使用来自添加了血清如FBS或血清替代物的培养基的MEF-预制条件培养基(即MEF-CM)的方法和一种使用化学固定的MEF的方法(YueX-S.等，PLoS.ONE,(2012)7,e32707)。此外，还有一种涉及使用不同人细胞(例如成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞和子宫内膜细胞)作为活的饲养细胞而不使用已报道的外源性细胞的方法(HayatoFukusumi和YonehiroKanemura,DevelopmentofFeeder-freeCellCultureTechniqueofHumanES/iPSCells(人ES/iPS细胞无饲养细胞培养技术的开发),JournalofClinicalandExperimentalMedicine,(2011)239,pp.1338-1344)。在这些方法中，使用添加了牛血清或KNOCKOUTTMSR(敲除血清替代物，其是作为能够培养ES/iPS细胞的血清替代物的添加剂)的培养基以培养人多能干细胞。然而，很多添加剂成分包含从牛血清中提取的蛋白。因此，感染性疾病如牛海绵状脑病(BSE)和细胞的病毒污染成为关注的问题。尽管在一些情况下使用人血清，但是人血清不适于实际使用，因为其使用或用量受到限制。
此外，对用于培养的无MEF完全合成培养基(化学上确定的培养基)的研发已被推进(AkopianV.等，InVitroCellDev.Biol.Anim.,(2010)46,pp.247-258；和ChenG.等，Nat.Methods,(2011)8,pp.424-429)。针对功能性蛋白对MEF分泌产物进行了分析(ChinA.C.等，J.Biotechnol.,(2007)130,pp.320-328)。然而，在无饲养层、无血清培养基中稳定培养人多能干细胞仍是困难的，并且一直期待开发一种能够理想生长的技术。
发明概述
发明要解决的问题
本发明的目的是提供一种高效的无饲养层、无血清的细胞培养技术。本发明的另一个目的是提供一种基于此类培养技术筛选生长促进因子的方法。
解决问题的方法
本发明人为了达到上述目的进行了集中的研究。作为结果，他们发现预先使用饲养细胞来条件化能够用于多能干细胞培养的无血清培养基能够制备得到不需要饲养细胞共培养就能够稳定培养多能干细胞并且改善其生长能力的培养基。他们还发现了一种能够通过筛选此类制备得到的培养基有效鉴定多能干细胞生长促进因子的技术。这导致完成了本发明。
此外，本发明人发现多能干细胞的生长能力能够通过使用在含有特定成分的无血清培养基中的多能干细胞的饲养培养，随后通过无饲养培养(feeder-freeculture)得到进一步改善。
具体地，本发明包括下述。
[1]一种筛选多能干细胞生长促进因子的方法，包括：
a)在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞以产生条件培养基并且回收所述条件培养基；和
b)在所回收的条件培养基中检测多能干细胞的生长促进因子。
在所述筛选方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基可以是含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
在所述筛选方法的一个实施方式中，所述饲养细胞的培养优选地通过向所述无血清培养基中加入生长因子实现。在所述筛选方法中加入的生长因子优选FGF2和/或TGF-β1。
在所述筛选方法中，所述饲养细胞可以是小鼠胚胎成纤维细胞。
在所述筛选方法中，所述多能干细胞优选是ES细胞或iPS细胞。
[2]一种制备用于培养多能干细胞的培养基的方法，所述方法包括在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞以产生条件培养基并且回收所述条件培养基。
在所述制备方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基可以是含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
在所述制备方法的一个实施方式中，所述饲养细胞的培养优选地通过向所述无血清培养基中加入生长因子实现。在所述制备方法中加入的生长因子优选FGF2和/或TGF-β1。
在所述制备方法中，所述饲养细胞可以是小鼠胚胎成纤维细胞。
在所述制备方法中，所述多能干细胞优选是ES细胞或iPS细胞。
[3]一种用于培养多能干细胞的条件培养基，其通过根据上述[2]所示的方法制备。
[4]一种多能干细胞的生长方法，所述方法包括在条件培养基中实现多能干细胞的无饲养培养，所述条件培养基通过在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞产生。
在所述生长方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基可以是含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
在所述生长方法的一个实施方式中，所述饲养细胞的培养优选地通过向所述无血清培养基中加入生长因子实现。在另一个实施方式中，通过不向所述无血清培养基中加入生长因子实现所述饲养细胞的培养和通过向所述条件培养基中加入生长因子实现多能干细胞的无饲养培养是优选的。在所述生长方法中加入的生长因子优选FGF2和/或TGF-β1。
在所述生长方法中，所述饲养细胞可以是小鼠胚胎成纤维细胞。
在所述生长方法中，所述多能干细胞优选是ES细胞或iPS细胞。
[5]一种生长多能干细胞的方法，所述方法包括使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基将在饲养细胞上培养的多能干细胞转变成无饲养细胞的培养，并且实现所述多能干细胞的无饲养培养。
在这种方法的一个优选实施方式中，所述无血清培养基优选地不含白蛋白。
本说明书包括在日本专利申请号2013-137206中公开的内容，本申请要求了该申请的优先权。
发明的效果
根据本发明，使用不含血清或血清替代物的无血清培养基能够改善多能干细胞在无饲养培养中的生长能力。此外，根据本发明，能够制备能够筛选促进多能干细胞在无饲养培养中非分化生长的因子的条件培养基。
附图简述
图1代表显示在无饲养培养中无血清MEF条件培养基对iPS细胞生长能力影响的照片。A：在由基础培养基(无血清培养基)A+ITS+FGF2+TGF-β1制备的条件培养基中的生长能力(+++)；B：在基础培养基(无血清培养基)A+ITS+FGF2+TGF-β1(未条件化)中的生长能力(+)；C：在由基础培养基(无血清培养基)A+ITS制备的条件培养基(条件化后，添加FGF2+TGF-β1)中的生长能力(++)；D：在由基础培养基(无血清培养基)A制备的条件培养基(条件化后，添加ITS+FGF2+TGF-β1)中的生长能力(-)；E：在由基础培养基(无血清培养基)B+ITS制备的条件培养基(条件化后，添加FGF2+TGF-β1)中的生长能力(-)；和F：在基础培养基(无血清培养基)B+ITS+FGF2+TGF-β1(未条件化)中的生长能力(-)。
图2代表显示在包被了不同培养基质的塑料培养皿中在无血清条件培养基中人iPS的生长结果。使用(见图2A、B)、玻连蛋白(vitronectin)(见图2C、D)和PCM-DM(见图2E、F)作为培养基质。在A、C和E中，使用未条件化的无血清培养基。在B、D和F中，使用MEF-条件培养基。
图3代表显示在使用MEF-条件无血清培养基或未条件化无血清培养基培养中人iPS细胞生长能力的比较结果的表。
图4显示了通过流式细胞术对在MEF-条件无血清培养基或未条件化无血清培养基中培养的人iPS细胞的非分化标记物进行表达分析的结果。
图5代表显示在由使用含有血清替代物的培养基(B至E)或含有给定成分的无血清培养基(G至J)进行的饲养培养转变为无饲养培养前后人iPS细胞生长能力比较结果的照片。在图5中，生长程度以符号“-”(无生长)或“+”的数量表示。
实施发明的实施方式
以下，对本发明进行更加详细的描述。
本发明涉及一种通过使用饲养细胞条件化无血清培养基制备适于多能干细胞在无饲养培养中生长的培养基的方法。
在本发明上下文中使用的术语“多能干细胞”指具有多能性(多能性)的细胞，其通过体外培养能够分化成构成生命体的任意类型的细胞和能够无限增殖(生长)但同时保持多能性。在本发明中生长的多能干细胞的特定示例包括但不限于胚胎干细胞(ES细胞)、胎儿原始生殖细胞来源的多能干细胞(EG细胞；ShamblottM.J.等，Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,(1998)95,pp.13726-13731)、睾丸来源的多能干细胞(GS细胞；ConradS.,Nature,(2008)456,pp.344-349)和体细胞来源的诱导型多能干细胞(iPS细胞)。在本发明中生长的多能干细胞特别优选ES细胞或iPS细胞。ES细胞是来源于从在称为囊胚的早期胚胎中的内细胞团获得的未分化细胞的培养细胞。iPS细胞是通过将重编程因子引入体细胞以便将体细胞重编程为非分化状态从而赋予其多能性制备的培养细胞。可以使用Oct家族基因(例如Oct3/4)、Klf家族基因(例如Klf4)、Myc家族基因(例如c-Myc)和/或Sox家族基因(例如Sox2)作为重编程因子。多能干细胞可以来源于任意动物物种。例如多能干细胞可以来源于哺乳动物细胞，包括啮齿动物如小鼠、大鼠和仓鼠，灵长类如人、大猩猩和黑猩猩，以及家畜或宠物如犬、猫、家兔、牛、马、绵羊或山羊；并且特别优选来源于人的多能干细胞。多能干细胞，包括ES细胞和iPS细胞，可以是商购获得或提供的细胞，或者是新建立的细胞。或者，可以将刺激触发采集的多能(STAP)细胞作为多能干细胞。STAP细胞是通过向动物细胞施加强烈的外部刺激(应激)制备的多能细胞(Nature,505,641-647,(2014))。
在本发明中，对含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠但不含血清和血清替代物的无血清培养基进行条件化。在本发明中使用的术语“血清”指来源于任意动物(例如人、牛、马或山羊)的血清。术语“血清替代物”指在ES或iPS细胞培养中作为血清(例如FBS)的替代用于维持细胞的非分化状态和其培养的试剂。血清替代物的示例包括KNOCKOUTTMSR(KnockOutTM血清替代物或KSR；Gibco)、StemSure血清替代物(SSR；WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)和N-2添加物(WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)。可以使用不含血清和血清替代物的用于动物细胞培养的任意液体培养基作为基础培养基制备无血清培养基。可以使用的基础培养基的示例包括，但不特别地限于BME培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、GlasgowMEM培养基、改良的MEM锌选择培养基、Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)、培养基199、EagleMEM培养基、αMEM培养基、Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、HamF10培养基、HamF12培养基、RPMI1640培养基、Fischer培养基以及这些培养基任意组合的混合物(例如DMEM/F12培养基(Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12Ham))。当使用此类基础培养基制备无血清培养基时，可以在所述基础培养基中添加L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠。
或者，可以使用不含有血清或血清替代物的液体培养基制备无血清培养基，其中已事先添加了L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠中的至少一种。在这种情况下，可以将不包含在L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠中的在制备得到的培养基中不含的成分加入所述培养基中以制备无血清培养基。或者，可以将L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠(但是其还包含在上述制备得到的培养基中含有的成分)加入所述培养基中以制备无血清培养基。例如，可以使用无血清来源的成分并且添加了胰岛素和转铁蛋白的培养基，包括CHO-S-SFMII(GibcoBRL)、杂交瘤-SFM(GibcoBRL)、eRDF干粉培养基(GibcoBRL)、UltraCULTURETM(BioWhittaker)、UltraDOMATM(BioWhittaker)、UltraCHOTM(BioWhittaker)和UltraMDCKTM(BioWhittaker)。而且，优选地可以使用STEMPRO·hESCSFM(LifeTechnologies)、mTeSR1(Veritas)和TeSR2(Veritas)。优选地可以使用具有非常有限的蛋白成分的基础8TM培养基(LifeTechnologies)。
上文所述的无血清培养基的优选示例是具有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
在本发明中用于制备无血清培养基的培养基可以含有脂肪酸、胶原前体、微量元素、2-巯基乙醇、3'-硫醇甘油或其任意等效物。然而，生长因子之外的蛋白成分的含量优选地要尽可能的低。在本发明的一个实施方式中，所述无血清培养基优选地不含白蛋白。这是因为尽管在无血清培养基中通常加入白蛋白，但是其能够导致批与批之间显著的质量差异，因而是不利的。在本发明的一个实施方式中，用于制备无血清培养基的培养基组分优选地是已知的。当从条件培养基中筛选多能干细胞的生长促进因子时，例如所述培养基组分是已知的是优选的。
当制备无血清培养基时，可以将L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠以溶液、衍生物、盐、试剂混合物等的任意形式加入用于动物细胞培养的培养基中。例如，可以将L-抗坏血酸以衍生物如抗坏血酸基-2-磷酸镁的形式加入培养基。可以以硒盐(例如硒酸钠)的形式将硒加入培养基中。胰岛素和转铁蛋白可以分离自动物(优选地人、小鼠、大鼠、牛、马或山羊)的组织、血清等并且因此是天然存在的，或者胰岛素和转铁蛋白可以是基因工程重组蛋白。可以将胰岛素、转铁蛋白和硒以试剂ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)的形式加入培养基中。ITS是用于细胞生长促进的含有胰岛素、转铁蛋白和硒酸钠的添加剂。
在本发明中待条件化的无血清培养基可以含有脂肪酸或脂质、氨基酸(例如非必需氨基酸)、维生素、生长因子、细胞因子、抗氧剂、2-巯基乙醇、丙酮酸、缓冲剂、无机盐等。例如，当所述无血清培养基含有2-巯基乙醇时，其浓度是不限的，只要所述培养基在此浓度下适于干细胞培养即可，但是例如其可以是约0.05至1.0mM，并且优选地约0.1至0.5mM。
在本发明中，所述培养基是通过在上述无血清培养基中培养饲养细胞条件化的。优选地，首先使用丝裂霉素或γ-射线照射处理饲养细胞以灭活有丝分裂，然后用于条件化。在本发明中使用的饲养细胞是能够在饲养细胞层上(饲养培养)进行多能干细胞培养的细胞。饲养细胞可以是来源于哺乳动物如人、小鼠、大鼠或牛胚胎或组织的成纤维细胞、胎盘细胞、骨髓细胞、子宫内膜细胞或其他细胞。饲养细胞的特定示例包括但不限于小鼠胚胎成纤维细胞(即MEF和STO细胞系)和STO细胞的衍生细胞系(例如稳定地引入新霉素抗性基因表达载体和LIF表达载体的SNL细胞)。
使用饲养细胞条件化的无血清培养基可以含有或不含生长因子。无论所述无血清培养基中是否含有生长因子，在条件化过程中不是必需向所述无血清培养基中加入生长因子。然而，当所述无血清培养基中不含生长因子时，优选添加了生长因子的无血清培养基是优选的并且用于条件化。所述无血清培养基优选地含有但不限于选自下组的至少一种作为生长因子：FGF2(碱性成纤维生长因子)、TGF-β1(转化生长因子-β1)、MCP-1、IL-6、PAI、PEDF、IGFBP-2、LIF和IGFBP-7；以及例如FGF2和/或TGF-β1。FGF2和TGF-β1是特别优选的生长因子。
可以通过培养用于生长的饲养细胞，使用上文所述的无血清培养基更换培养瓶中的培养基并且培养其中的饲养细胞实现使用饲养细胞使培养基条件化。可以通过常规技术实现饲养细胞的培养。在所述无血清培养基中的条件化培养可以在4℃至45℃下(例如25℃至40℃)进行1至72小时(例如8至36小时)实现。所述培养还优选地在4％至10％CO2下实现(例如5％CO2)。
对培养容器没有特别地限制，只要其能够用于细胞培养即可。其示例包括瓶、组织培养瓶、皿、皮氏皿、培养皿、多重皿、微量板、微孔板、多重板、多孔板、分室玻片、板、试管、托盘、培养袋、摇瓶和中空纤维培养容器。
在上文所述的方法中，可以在无血清培养基中培养饲养细胞以使得饲养细胞将生长促进因子等分泌至所述培养基中，从而使所述无血清培养基条件化。可以采用常规技术从饲养细胞中分离和回收所得到的条件培养基。可以通过过滤和/或离心例如1,000rpm离心5分钟并且回收所分离的液体培养基将液体培养基与饲养细胞分离进行条件培养基的回收。在所述条件培养基回收后，可以在无血清培养基中重复进行条件培养(例如2至10次)。
作为所述条件培养基制备程序的特定示例，可以通过培养单层MEF至融合，使用10μg/ml丝裂霉素C处理培养的细胞，使用细胞分离液如胰酶-EDTA分离所述细胞，以3至5x105个细胞每60-mm平皿的细胞密度将回收的MEF接种于培养皿中，培养1至2天，使用上文所述的无血清培养基更换培养皿中的培养基并且在此后每24小时回收一次液体培养基制备条件培养基。
所得到的条件培养基可能适用于作为多能干细胞培养的培养基，并且特别优选地用于无饲养、无血清和无血清替代物培养。在本发明中，“无饲养、无血清和无血清替代物培养”的表达指在无饲养细胞层条件下(即无饲养培养)和在不含血清和不含血清替代物的培养基条件下进行的培养。当在培养基中使用的生长因子或培养基成分不含用于多能干细胞的外源性成分时，此类培养基可以特别优选地作为无外源性成分培养基(即无外源性培养基)。本发明还涉及制备用于多能干细胞培养的条件培养基的此类方法和通过此类方法获得的用于多能干细胞培养的条件培养基。
根据本发明，这样制备的条件培养基可以用于进行多能干细胞的无饲养培养。使用所述条件培养基，多能干细胞在无饲养培养中的生长能力能够显著改善。即，本发明涉及一种使多能干细胞生长的方法，所述方法包括在上述条件培养基中对多能干细胞进行无饲养培养。
将要在所述条件培养基中培养的多能干细胞可以事先采用常规技术维持培养。优选地，使用分离液如胶原酶溶液将已进行维持培养的所述多能干细胞从培养容器中分离，并且其形成由约几十个细胞例如约20至50个细胞形成的小团后回收所述细胞。当在维持培养中使用饲养细胞时，优选地采用常规技术将饲养细胞从回收的多能干细胞中除去。当使用MEF作为饲养细胞进行维持培养时，例如可以通过在明胶包被的培养容器中孵育回收的多能干细胞以使得MEF附着在所述培养容器上并收集在培养基中悬浮的多能干细胞除去MEF。
将这样制备的多能干细胞优选地接种在包被了作为细胞支架的培养基质的培养容器中。在此处也可以使用条件培养基的制备部分描述的培养容器。对培养基质没有特别的限制，只要其能够用于细胞培养即可。培养基质的示例包括明胶、由Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)的小鼠肉瘤生产的Matrigel、层粘连蛋白(例如层粘连蛋白-511、层粘连蛋白-111和层粘连蛋白-332)、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白、E-钙粘蛋白、合成肽、合成聚合物和来源于MEF的细胞外基质、人血清或来源于蜕膜的间充质细胞(PCM-CM)。能够作为培养基质的合成聚合物的示例是水凝胶，例如包含2-(二乙基氨基)丙烯酸乙酯作为骨架的温度敏感性水凝胶(Zhang等，NatureCommunications,2013,4,articlenumber:1335)。可以采用本领域技术人员熟知的常规技术使用此类培养基质包被培养容器。例如，可以通过将培养基质溶液(例如玻连蛋白溶液)加入培养容器并且孵育一段给定的时间(例如1小时)包被所述培养容器。
多能干细胞可以在所述条件培养基中优选地在20℃至40℃(例如35℃至40℃)下培养1小时至7天(例如1至24小时)，但是培养条件不限于此。多能干细胞可以在所述条件培养基中优选地在4％至10％的CO2(例如5％CO2)下培养。多能干细胞的培养可以包括传代培养。
与使用未条件化培养基获得的生长能力相比，这样培养的多能干细胞的生长能力显著改善。在一个优选的实施方式中，在所述条件培养基中生长的所述多能干细胞的数量与在未条件化培养基中生长的细胞数量相比优选地是其10倍或更多、更优选地100倍或更多和更优选地200倍或更多，例如250至300倍。细胞数量的增加可以参照例如第五次传代后计数的细胞数量评估。此外，可以将在所述条件培养基中培养的多能干细胞维持在非分化状态。可以根据非分化标记物(例如SSEA3、SSEA4、Tra1-60、Tra1-81、Oct4、NANOG、SOX2等的基因或蛋白)的表达情况验证所述多能干细胞的非分化状态。
这样制备的条件培养基含有能够促进多能干细胞在非分化状态下生长的物质(即多能干细胞的生长促进因子)，其由饲养细胞如MEF分泌。因此，根据本发明，可以对所述条件培养基进行进一步筛选，以鉴定此类生长促进因子。在筛选中，可以在所述条件培养基中检测多能干细胞生长促进因子，从而鉴定生长促进因子。因此，本发明还提供了一种筛选多能干细胞生长促进因子的方法，所述方法包括回收这样产生的所述条件培养基并检测在回收的条件培养基中含有的多能干细胞生长促进因子。多能干细胞的生长促进因子可以是蛋白或核酸(例如RNA)、氨基酸、肽、糖链或低分子量化合物如代谢产物。
在本发明的筛选方法中，优选地采用任意适宜的技术对回收的条件培养基进行分离和/或纯化，随后鉴定生长促进因子。例如，可以使用电泳如二维电泳、等电电泳或SDS-PAGE，层析技术如高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱或亲和层析，或质谱如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI/TOFMS)或液相色/串联质谱(LC-MS/MS)分离和/或纯化和鉴定生长促进因子。将在所述条件培养基中的成分分析结果与在进行条件化之前的无血清培养基中的培养基成分分析结果进行比较，可以将检测得到的在所述条件培养基中含有的不同的成分作为多能干细胞生长促进因子候选物。因此，用于这种筛选目的时，优选地用于条件化的无血清培养基的所有成分是已知的。
对于检测在所述条件培养基中含有的多能干细胞生长促进因子而言，可以将从所述条件培养基中分离或纯化或鉴定的成分(特别是多能干细胞生长促进因子的候选成分)加入使用多能干细胞培养基培养的多能干细胞培养系统中，然后进行培养。可以对在培养系统中的多能干细胞的生长能力(特别是非分化生长能力)进行考察并与对照进行比较，即未加入相同成分的培养系统，以确定生长能力是否增强。如果生长能力(生长细胞数)增强，例如10倍或更多，和优选地100倍或更多，则表明所述成分是多能干细胞的生长促进因子。本发明的筛选方法可以包括检测条件培养基中的成分对多能干细胞生长促进活性的步骤。可以通过进一步验证非分化标记物(例如SSEA3、SSEA4、Tra1-60、Tra1-81、Oct4、NANOG、SOX2等的基因或蛋白)表达水平的保持情况确定多能干细胞在非分化状态下的生长促进情况(即非分化生长)。
可以将通过本发明的筛选方法获得的多能干细胞生长促进因子加入多能干细胞的培养系统以促进所述多能干细胞的非分化生长。
本发明还提供了一种多能干细胞的生长方法，所述方法包括使用能够用于多能干细胞培养的无血清培养基将在饲养细胞上培养的多能干细胞转变成无饲养细胞的培养，并且实现所述多能干细胞的无饲养培养。在所述多能干细胞生长方法的一个特别优选的实施方式中，将使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠但不含血清或血清替代物的无血清培养基在饲养细胞上培养的多能干细胞转变成无饲养细胞的培养，并且进行所述多能干细胞的无饲养培养。即，根据所述方法，对多能干细胞进行维持培养，同时使用饲养细胞条件化所述无血清培养基，然后对经培养的多能干细胞进行无饲养培养。根据该方法，在无饲养培养中的多能干细胞的生长能力能够进一步被增强。
在这种方法中使用的多能干细胞、饲养细胞、培养条件、程序和其他条件与上文所述的相同。优选使用与上文所述的在所述条件培养基的制备中使用的相似的无血清培养基。
在一个实施方式中，通过使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含精氨酸、血清或血清替代物的无血清培养基在饲养细胞上培养多能干细胞，然后进行所培养的多能干细胞的无饲养培养可以使多能干细胞高效生长。根据这种方法，可以特别优选地使用例如大分子化合物如或合成聚合物培养基质进行无饲养培养。能够作为培养基质的合成聚合物的示例是水凝胶，例如包含2-(二乙基氨基)丙烯酸乙酯作为骨架的温度敏感性水凝胶。例如，可以使用培养容器进行无饲养培养，如内部包被了所述培养基质的培养皿。在饲养细胞上培养多能干细胞，从其中除去所述饲养细胞，并将所述多能干细胞转变成在不含饲养细胞的培养容器中的培养基中培养。这样，可以优选地实现无饲养培养。
在这种方法中，可以使用由含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基制备的条件培养基实现无饲养培养。或者，可以使用任意其他无血清培养基代替条件培养基实现无饲养培养。根据这种方法，甚至在后者改变的情况下，多能干细胞在无饲养培养中的生长(即非分化生长)也能够显著增加。
实施例
在下文中，结合实施例对本发明进行更加详细的描述，但是本发明的技术范围不限于这些实施例。
[实施例1]
在这个实施例中，将已在经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；饲养细胞)中维持培养的非分化人iPS细胞转移至包被了玻连蛋白(VTN-N)的不含饲养细胞的培养皿的孔中，然后在经MEF条件化的营养培养基中培养，如下文所述。
1.人iPS细胞的制备
使用来自iPSAcademiaJapan,Inc.(日本京都)(TakahashiK.等，Cell131,1-12,2007)的201B7细胞系作为人iPS细胞(非分化的人iPS细胞)。在塑料培养皿中对人iPS细胞进行维持培养，其中已接种了经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；饲养细胞)。使用通过在DMEM/F12培养基(经Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12Ham；SigmaD6421)中添加终浓度20％的KNOCKOUTTMSR(KnockOutTM血清替代物或KSR；Gibco)、0.1mMNEAA(非必需氨基酸)、2mML-谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2(称为“碱性FGF”或“bGFG”)和0.1mM2-巯基乙醇制备的培养基在CO2培养箱中在37℃和5％CO2条件下进行培养。每6或7天传代一次。在传代过程中，使用分离液(胶原酶溶液)将人iPS细胞集落与饲养细胞层分离，并通过吹打形成约20至50个细胞的小团，然后接种在新鲜的饲养细胞层上。
使用分离液分离如上文所述在饲养细胞上维持培养的人iPS细胞，经吹打形成约20至50个细胞的小团，并且在300rpm下离心5分钟以回收iPS细胞。在包被了明胶的培养皿上孵育回收的iPS细胞30分钟，从而使MEF粘附在皿上，收集培养基中悬浮的iPS细胞，以除去MEF。随后，将回收的iPS细胞分成4部分(1/4等分)，并将细胞接种在经玻连蛋白(VTN-N；Gibco)包被的塑料培养皿中。通过使用0.5μg/cm2的玻连蛋白溶液在室温下孵育1小时使用玻连蛋白(VTN-N)包被培养皿。
2.条件培养基的制备
使用经丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)由无血清培养基制备条件培养基(CM)。以每60-mm平皿约500,000个细胞的细胞密度将经丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)接种在MEF的培养基中(添加了10％FBS的DMEM培养基)。在细胞孵育至少16小时后，先使用PBS(-)再使用无血清培养基洗涤细胞，并且将培养基换成新鲜的相同无血清培养基。所使用的无血清培养基的成分如下所示。
-无血清培养基A(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁和543mg/L碳酸氢钠)。
-无血清培养基A+ITS(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁、543mg/L碳酸氢钠和1％ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒；LifeTechnologies))。
条件化之前在无血清培养基中添加100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1作为生长因子(添加FGF+TGF)。平行地，使用未添加生长因子的无血清培养基制备另一个条件培养基。
更换培养基，之后在CO2培养箱中在37℃和5％CO2条件下培养24小时后。
培养24小时后回收培养基并且1,000rpm离心5分钟，将所得到的液体培养基(上清液)作为MEF-条件培养基。
3.无饲养细胞的iPS细胞培养
将2ml本实施例第2部分制备的MEF-条件培养基加入接种于本实施例第1部分使用玻连蛋白(VTN-N)包被的培养皿中的iPS细胞中。在这一阶段，将100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1加入已制备但未加入人FGF2或2μg/LTGF-β1作为生长因子的MEF-条件培养基中。在37℃和5％CO2条件下在MEF-条件培养基中培养iPS细胞5天。
使用碱性磷酸酶对培养细胞染色。通过使用10％的甲醛将细胞固定在培养板上，在其中加入1ml一步NBT/BCIP溶液(Pierce)并使其在室温下避光放置30分钟进行染色。
如图1所示，使用无血清培养基A+ITS制备的MEF-条件培养基为iPS细胞提供了较高的生长能力(图1A和C)。尽管当条件化后加入生长因子使得iPS细胞显示出良好的生长能力(图1C)，但是当使用利用添加了生长因子的培养基制备的条件培养基时能够进一步改善iPS细胞的生长能力(图1A)。
[比较实施例1]
如实施例1中所述使用无血清条件培养基培养iPS细胞，不同之处在于使用无血清培养基A(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁和543mg/L碳酸氢钠)作为无血清培养基制备MEF-条件培养基，并且不添加生长因子，然后在将其加入用于iPS细胞培养的培养基中时加入1％ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1。
图1D显示了碱性磷酸酶染色后观察到的结果。在使用不含ITS和生长因子的无血清培养基A制备的MEF-条件培养基中，即使在iPS细胞培养过程中加入ITS、人FGF2和TGF-β1也几乎观察不到iPS细胞的生长。
[比较实施例2]
如实施例1中所述制备iPS细胞。在未使用MEF条件化培养基的情况下，将无血清培养基A+ITS(DMEM/F12培养基、64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁、543mg/L碳酸氢钠和1％ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒；LifeTechnologies))加入接种于包被了玻连蛋白(VTN-N)的培养皿中的iPS细胞中。此外，将100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1加入其中，并且如实施例1所述培养iPS细胞。
图1B显示了碱性磷酸酶染色后观察到的结果。当使用未经MEF条件化的无血清培养基A+ITS培养iPS细胞时，即使当加入生长因子时iPS细胞的生长能力也较低。
[比较实施例3]
如实施例1中所述使用无血清条件培养基培养iPS细胞，不同之处在于使用无血清培养基B+ITS(DMEM(经Dulbecco改良的Eagle培养基)、2mML-谷氨酰胺、0.1mMNEAA(非必需氨基酸)、1％ITS(胰岛素-转铁蛋白-硒)、0.1mMβ-巯基乙醇)作为无血清培养基并加入100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1作为生长因子(添加FGF+TGF)用于条件化。此外，作为另一项实验，使用未经MEF条件化的无血清培养基B+ITS培养iPS细胞，并加入100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1，如同比较实施例2的。
图1显示了经碱性磷酸酶染色后观察到的结果。无论是否存在MEF条件化，在使用无血清培养基B+ITS制备的MEF-条件化培养基(图1E)和未使用MEF条件化的无血清培养基B+ITS(图1F)中均未观察到iPS细胞的生长。该结果表明与使用无血清培养基A+ITS制备的条件培养基不同，iPS细胞的生长促进因子没有分泌进入使用无血清培养基B+ITS制备的条件培养基中。
[实施例2]
在这个实施例中，将已在经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；饲养细胞)中维持培养的非分化人iPS细胞转移至包被了Matrigel、玻连蛋白(VTN-N)或PCM-DM的不含饲养细胞的培养皿的孔中，然后在经MEF条件化的营养培养基中培养，如下文所述。PCM-DM是人蜕膜来源的间充质细胞的细胞外(细胞周围)基质(D.Kanematsu等，Differentiation,82,77-88,2011)。
1.人iPS细胞的制备
使用来自iPSAcademiaJapan,Inc.的201B7细胞系作为人iPS细胞(非分化的人iPS细胞)。在塑料培养皿中对人iPS细胞进行维持培养，其中已接种了已经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；饲养细胞)。使用通过在DMEM/F12培养基(经Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12Ham；SigmaD6421)中添加终浓度20％的KNOCKOUTTMSR(KnockOutTM血清替代物或KSR；Gibco)、0.1mMNEAA(非必需氨基酸)、2mML-谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2(称为“碱性FGF”或“bGFG”)和0.1mM2-巯基乙醇制备的培养基在CO2培养箱中在37℃和5％CO2条件下进行培养。每6或7天传代一次。在传代过程中，使用分离液(胶原酶溶液)将人iPS细胞集落与饲养细胞层分离，并通过吹打形成约20至50个细胞的小团，然后接种在新鲜的饲养细胞层上。
使用分离液分离如上文所述在饲养细胞上维持培养的人iPS细胞，经吹打形成约20至50个细胞的小团，并且在300rpm下离心5分钟以回收iPS细胞。在包被了明胶的培养皿上孵育回收的iPS细胞30分钟，从而使MEF粘附在皿上，收集培养基中悬浮的iPS细胞，以除去MEF。
2.条件培养基的制备
使用经丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)由无血清培养基制备条件培养基(CM)。以每60-mm平皿约500,000个细胞的细胞密度将经丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)接种在MEF的培养基中(添加了10％FBS的DMEM培养基)。在细胞孵育至少16小时后，先使用PBS(-)再使用添加了1％ITS、100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1的无血清培养基A(DMEM/F12培养基，64mg/L抗坏血酸基-2-磷酸镁和543mg/L碳酸氢钠；也将其称为“基础培养基A”)洗涤细胞，并且将培养基换成新鲜的相同无血清培养基。
在CO2培养箱中在37℃和5％CO2条件下培养24小时后更换培养基。培养24小时后回收培养基并重复更换新鲜培养基多达6次。将回收的培养基1,000rpm离心5分钟，并将所得到的液体培养基作为MEF-条件培养基(无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)。
3.包被基质培养皿的制备
根据LifeTechnologies提供的说明，使用经DMEM/F1230倍稀释的(BD)在室温下孵育1小时，用包被培养皿。
根据常规方法制备PCM-DM-包被的培养皿(D.Kanematsu等，Differentiation,82,77-88,2011)。具体地，首先，以3.5×104个细胞/cm2将人蜕膜来源的间充质细胞接种在包被了0.1％明胶的塑料培养皿中，并且培养3天同时保持融合。使用PBS(-)洗涤细胞，然后使用脱氧胆酸(向培养皿中加入0.5％脱氧胆酸钠/10mMTris-HCl(pH8.0)4℃处理30分钟)处理细胞后的细胞以裂解细胞成分。随后，使用PBS(-)洗涤留在培养皿上的细胞外基质成分。
采用与实施例1相同的方法制备玻连蛋白(VTN-N)包被的培养皿。
4.无饲养细胞的iPS细胞培养
将在本实施例第1部分中制备、回收和除去MEF的iPS细胞分成4部分(1/4等分)并且接种在本实施例第3部分制备的包被了Matrigel、玻连蛋白或PCM-DM的塑料培养皿中。使用在本实施例第2部分中由无血清培养基A+ITS+FGF+TGF制备的MEF-条件培养基在5％CO2和37℃条件下培养5天。
平行地，在未使用MEF条件化的相同培养基中培养本实施例第1部分中制备、回收和除去MEF的iPS细胞。
图2显示了碱性磷酸酶染色后观察到的结果。当使用MEF条件培养基进行培养时，在包被了任意培养基质(即Matrigel、玻连蛋白和PCM-DM)的培养皿中iPS细胞的生长能力均增强。
[实施例3]
将根据实施例2使用Matrigel-或PCM-DM包被的塑料培养皿在MEF条件培养基(无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)中和未使用MEF条件化的培养基(无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)中培养的iPS细胞持续传五代。图3显示了对在此类培养中细胞生长速率进行比较的结果。当使用来自无血清培养基A+ITS+FGF+TGF的MEF条件培养基对iPS细胞进行培养时，其生长效率是使用未条件化培养基所达到的约300倍以上。
[实施例4]
将根据实施例2使用玻连蛋白包被的塑料培养皿在MEF条件培养基(无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)中和未使用MEF条件化的培养基(无血清培养基A+ITS+FGF+TGF)中培养的iPS细胞持续传四代。作为对照，使用MEF作为饲养细胞培养iPS细胞(饲养培养)，并且在MEF-CM中培养iPS细胞。通过在DMEM/F12培养基(经Dulbecco改良的Eagle培养基/营养混合物F-12Ham；SigmaD6421)中添加终浓度20％的KNOCKOUTTMSR(KnockOutTM血清替代物或KSR；Gibco)以制备培养基制备对照MEF-CM，在37℃和5％CO2条件下在所得到的培养基中培养MEF，并且回收该培养基。
作为碱性磷酸酶染色的结果，发现iPS细胞是碱性磷酸酶(ALP)-阳性的，并且其在任意培养条件下的培养过程中均保持非分化状态。
在培养后对iPS细胞进行流式细胞术分析。其结果是，发现iPS细胞对非分化标记物SSEA3、SSEA4、Tra1-60和Tra1-81是阳性的(图4)。这表明在上述实施例中描述的在条件化的无血清培养基中培养的显示出生长能力增强的iPS细胞上的非分化标记物的表达状态与在非条件化的无血清培养基、饲养培养或在MEF-CM中培养的情况下相比不存在差异。因此，即使在条件无血清培养基中也没有观察到细胞性状的改变。
而且，进行了RT-qPCR分析并且也观察到了非分化标记物基因Oct4、NANOG和SOX2的表达。
因此，结果显示在MEF-条件无血清培养基中的培养能够增强iPS细胞的生长效率，同时保持其非分化状态。
[实施例5]
通过二维凝胶电泳对实施例1中由添加了ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基(图1A)和比较实施例1中由不含ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基(图1D)中的分泌的蛋白进行了分析，使用未条件化培养基作为对照。首先，通过丙酮沉淀从1ml各培养基中回收蛋白。将回收得到的蛋白混悬于溶胀缓冲液中，加入固相pH梯度凝胶中，ReadyStripIPG胶条(pH3-10,11cm；Bio-Rad)，并使其溶胀12小时，然后在等电聚焦装置ProteanIEF室(Bio-Rad)中于50V和20℃下进行等电聚焦电泳。随后，将ReadyStripIPG胶条在SDS-PAGE平衡缓冲液(含2％DTT)中振荡10分钟，然后在SDS-PAGE平衡缓冲液(含2.5％碘乙酰胺)中振荡10分钟。随后，通过SDS-PAGE将蛋白显色。在实施例1中由添加了ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基中和在比较实施例1中由不含ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基中，分别检测到了40个和12个MEF来源的分泌蛋白的点。这表明在实施例1中由添加了ITS和生长因子的培养基制备的条件培养基(图1A)中含有促进生长的蛋白。
[实施例6]
1.使用MEF条件培养基的无饲养培养
根据实施例2中标题为“1.人iPS细胞的制备”的部分，在经丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；饲养细胞)上培养人iPS细胞(即饲养培养)，回收细胞，然后除去其中的MEF。
将这样制备的人iPS细胞转移至不含饲养细胞的包被了Matrigel的培养皿的孔中，然后使用不同培养基培养(无饲养培养)。使用了下述培养基。
无血清培养基A+ITS+FGF+TGF(DMEM，2mML-谷氨酰胺、0.1mMNEAA、1％ITS和0.1mMβ-巯基乙醇，添加了100μg/L人FGF2和2μg/LTGF-β1)(图5中的E8)。
来自无血清培养基A+ITS+FGF+TGF的MEF-条件培养基，根据实施例2中标题为“2.条件培养基的制备”的部分制备(图5中的E8-CM)。
根据实施例4制备的MEF-CM。
mTeSRTM1培养基(改良的Tenneille血清替代物1)(STEMCELLTechnologies)。
将通过向DMEM/F12培养基中加入终浓度20％的KNOCKOUTTMSR、0.1mMNEAA、2mML-谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2和0.1mM2-巯基乙醇制备的培养基作为对照，并且通过在所制备的培养基中进行饲养培养实施另一项实验(图5中的KSR)。根据实施例2中标题为“3.包被基质的培养皿的制备”的部分使用Matrigel包被培养皿。
根据实施例2中标题为“4.无饲养细胞的iPS细胞培养”的部分描述的程序进行培养和碱性磷酸酶染色，除了培养持续时间为4天以外。
结果如图5A至E所示。在由饲养培养转变为无饲养培养后，在来自无血清培养基A+ITS+FGF+TGF的MEF-条件培养基(E8-CM)中观察到了生长，而在其他培养基中观察到几乎无生长。
2.由饲养培养转变为在含有给定成分的培养基中的无饲养培养
根据实施例2中标题为“1.人iPS细胞的制备”的部分，在经过丝裂霉素处理灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF；饲养细胞)上培养人iPS细胞(即饲养培养)、回收并除去MEF，除了使用无血清培养基A+ITS+FGF+TGF作为培养基代替向DMEM/F12培养基中加入终浓度20％的KNOCKOUTTMSR、0.1mMNEAA、2mML-谷氨酰胺、5ng/ml人FGF2和0.1mM2-巯基乙醇制备的培养基以外。
在这部分中，将这样制备得到的人iPS细胞转移至不含饲养细胞的包被了Matrigel的培养皿的孔中，然后使用在该实施例第1部分中使用的不同培养基无饲养培养，随后进行碱性磷酸酶染色。
其结果是，与在该实施例第1部分中所示的结果相比，在使用任意培养基的无饲养培养中均观察到明显更高的生长能力。
这表明通过使用上述无血清培养基进行饲养培养，然后再将其转变成无饲养培养能够进一步增强多能干细胞的生长能力。
[实施例7]
制备使用包含2-(二乙基氨基)丙烯酸乙酯作为骨架的温度敏感性水凝胶包被的培养皿(Zhang等，NatureCommunications,(2013)4,Articlenumber:1335)。具体地，将N-丙烯酰基-N’-丙基哌嗪、2,2’-(乙撑二氧基)双(乙胺基)单丙烯酰胺、交联剂和光聚合引发剂在N-甲基-2-吡咯烷酮中的混合物加入事先用3-(三甲氧基硅烷)甲基丙烯酸丙酯处理过的塑料培养皿中，对其施加365nm的UV光30分钟，然后将平皿在50℃下放置过夜。此后，先后使用乙醇和丙酮洗涤平皿，随后进行空气干燥。
使用这样制备的水凝胶包被的培养皿代替Matrigel包被的培养皿，将人iPS细胞饲养培养，然后使用根据实施例6第2部分中的不同培养基无饲养培养。其结果是，发现iPS细胞在任何培养基中均显示出较高的生长能力。
工业实用性
本发明能够适用于无饲养、无血清培养多能干细胞。此外，本发明能够用于制备培养人多能干细胞的包含促进多能干细胞生长并且具有较高安全性的生长促进因子的无血清培养基，如无血清的、完全合成培养基。使用此类培养基，可以稳定、高效的实现人多能干细胞无饲养培养。根据本发明，还能够获得能够分离由饲养细胞如MEF分泌的生长促进因子的培养基。此类培养基可以用于筛选对人多能干细胞生长有用的因子。
本申请中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本申请。

Claims (15)

1.一种筛选多能干细胞的生长促进因子的方法，所述方法包括：
a)在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞以产生条件培养基并且回收所述条件培养基；和
b)在所回收的条件培养基中检测多能干细胞的生长促进因子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述无血清培养基是含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述饲养细胞的培养通过将生长因子加入无血清培养基来进行。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述生长因子是FGF2和/或TGF-β1。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的方法，其中所述饲养细胞是小鼠胚胎成纤维细胞。
6.根据权利要求1至5中任意一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。
7.一种多能干细胞的生长方法，所述方法包括在条件培养基中进行多能干细胞的无饲养培养，所述条件培养基是通过在含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基中培养饲养细胞产生。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述无血清培养基是含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠的DMEM/F12培养基。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中所述饲养细胞的培养通过将生长因子加入无血清培养基来进行。
10.根据权利要求7或8所述的方法，其中通过不向所述无血清培养基中加入生长因子来进行所述饲养细胞的培养和通过向所述条件培养基中加入生长因子来进行多能干细胞的无饲养培养。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述生长因子是FGF2和/或TGF-β1。
12.根据权利要求7至11中任意一项所述的方法，其中所述饲养细胞是小鼠胚胎成纤维细胞。
13.根据权利要求7至12中任意一项所述的方法，其中所述多能干细胞是ES细胞或iPS细胞。
14.一种多能干细胞的生长方法，所述方法包括将使用含有L-抗坏血酸、胰岛素、转铁蛋白、硒和碳酸氢钠并且不含血清或血清替代物的无血清培养基在饲养细胞上培养的多能干细胞转移到无饲养细胞的培养物中，并且进行所述多能干细胞的无饲养培养。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述无血清培养基不含白蛋白。
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