JP2010537626A - フィーダ細胞を含まない培地および培養系 - Google Patents
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Abstract
Description
(i)インスリン様成長因子(IGF)アミノ酸配列およびビトロネクチン(VN)アミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質と、
(ii)ヒト成長ホルモン(hGH)、骨形成タンパク質15(BMP−15)、増殖分化因子9(GDF−9)、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質2、Wnt−2b、Wnt−12、成長抑制因子、フェチュイン、ヒト血清アルブミン(HSA)、肝細胞増殖因子(HGF)、形質転換成長因子−α(TGF−α)、形質転換成長因子−β(TGF−β)、神経成長因子、血小板由来成長因子−β(PDGF−β)、PC由来成長因子(プログラヌリン)、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−13およびアクチビン−Aからなる群から選択される1種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子とを含み、
(iii)血清が存在しない、あるいはIGFの不在下では細胞成長をサポートしない非常に少量の血清を含む、細胞培地を提供する。
好ましい実施形態では、細胞培地は、さらに、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、上皮成長因子(EGF)、IGF−I、IGF−IIおよびラミニンからなる群から選択される1種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質を含む。
好ましくは、IGFアミノ酸配列は、IGF−Iアミノ酸配列またはIGF−IIアミノ酸配列である。
好ましい実施形態では、VNアミノ酸配列は、成熟ビトロネクチンのアミノ酸残基1〜64である。
他の好ましい実施形態では、細胞培地は、さらに、IGFがIGF−IおよびIGF−IIから選択される、単離されたIGF含有複合体を含む。
好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約0.1ng/ml〜50μg/mlである。
さらに好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約25ng/ml〜1000ng/mlである。
さらにより好ましくは、該または各フィーダ細胞置換因子の最終濃度は、約250ng/ml〜400ng/mlである。
フィーダ依存性細胞は、増殖にフィーダ細胞を必要とする任意の細胞であることは容易に認められる。限定ではない例として、マウスおよびヒト胚性幹細胞、ヒト胚性生殖細胞、ヒト胚性細胞腫および角化細胞が挙げられる。
第二態様で、本発明は、IGFアミノ酸配列およびVNアミノ酸配列を含む約250ng/ml〜1000ng/mlの合成キメラタンパク質と、約50ng/ml〜l00ng/mlのbFGFと、約25ng/ml〜50ng/mlのアクチビン−Aと、約10μg/ml〜50μg/mlのラミニンとを含む胚性細胞培地を提供する。
より好ましくは、IGFアミノ酸配列は、IGF−Iアミノ酸配列である。
第三態様で、本発明は、培養容器と、第一態様の細胞培地または第二態様の胚性幹細胞培地とを含む細胞培養系を提供する。
より好ましくは、1個以上の細胞は、hES細胞または角化細胞である。
第五態様で、本発明は、第四態様の方法に従って産生される1個以上の細胞と、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
第六態様で、本発明は、第四態様の方法に従って培養される1個以上の細胞を送達する方法であって、第五態様の医薬組成物を個体に送達し、それによって前記個体の1個以上の細胞の再生、細胞移動および/または増殖を促進するステップを含む方法を提供する。
本明細書を通して、内容が他のことを必要としない限り、用語「含む」、および「含んでいる」は、記載された整数または整数の群を含有することを意味し、任意の他の整数または整数の群を排除しないと理解される。
「タンパク質」は、アミノ酸ポリマーを意味する。アミノ酸は、天然でも非天然アミノ酸でもよく、D−またはL−アミノ酸は、それ自体、当該分野でよく理解されている。
他の一般的な実施形態では、1種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子は、表1、表2、表3、表4および表5に挙げられたタンパク質からなる群から選択されてもよい。
有利には、このような成長因子は、血清の不在下で、エクスビボの初代細胞培養において、増殖応答を大きく刺激する。
より好ましくは、IGFアミノ酸配列は、IGF−Iアミノ酸配列である。
好ましい実施形態では、VNアミノ酸配列は、成熟VNのアミノ酸残基1〜64である。
より好ましくは、該リンカー配列は、さらに、1個以上のセリン残基を含む。
好ましい実施形態では、リンカー配列は、Gly4Serを含む。
特に好ましい実施形態では、合成キメラタンパク質は、IGF−Iと、(Gly4Ser)4のリンカー配列と、成熟ビトロネクチンのアミノ酸残基1〜64(以下、IGF−I/1−64VNと称する)とを含む。特に好ましい実施形態では、IGF−I/1−64VNは、単一の連続するタンパク質である。
IGF−Iの追加を包含するさらに他の好ましい実施形態では、細胞培地は、さらに、IGFBPおよびVNを含む。
好ましくは、IGFBPは、IGFBP−3またはIGFBP−5である。
一般的に好ましい実施形態では、該または各単離されたフィーダ細胞置換因子は、細胞生存率、維持、再生および/または増殖をサポートするように改良可能な最終濃度、好ましくは0.1ng/ml〜50μg/mlで存在する。より好ましくは、該単離された各フィーダ細胞置換因子は、0.1ng/ml〜50μg/mlの最終濃度、より好ましくは、1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、l00ng/ml、150ng/ml、200ng/ml、250ng/ml、300ng/ml、350ng/ml、400ng/ml、500ng/ml、600ng/ml、800ng/ml、l000ng/ml、1500ng/ml、さらに好ましくは、2μg/ml、3μg/ml、4μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/ml、45μg/mlおよび50μg/mlで存在しうる。
他の好ましい実施形態では、フィーダ依存性細胞は角化細胞である。
本発明の特に有利な点は、血清を必要としない、あるいは血清を殆ど必要としないフィーダ非依存性細胞培養系であるということである。
適切には、本発明の培地は、他に定義される成分を含んでもよい。限定ではなく、かつ場合によっては任意の成分のものとして、DMEMまたはHam培地のような周知の基本培地、ストレプトマイシンまたはペニシリンのような抗生物質、ヒト血清アルブミン(HSA)、リン脂質(たとえば、ホスファチジルコリン)、スフィンゴミエリン、アクチビン−A、アミノ酸、L−グルタミンのようなサプリメント、β−メルカプトエタノールのような抗酸化剤、カーボネート緩衝液のような緩衝液、HEPESおよび細胞培養の培養器に通常与えられるような二酸化炭素源が挙げられる。
ラミニンは、少なくとも3種の同一ではない鎖(α、βおよびγ鎖)およびα、βおよびγ鎖の様々な組合せから生じる多くの異なるイソ型で構成される真核細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーであることは、当業者によって認められるであろう。異なるラミニンイソ型の限定ではない例として、ラミニン−1、ラミニン−2、ラミニン−3、ラミニン−4、ラミニン−5、ラミニン−5B、ラミニン−6、ラミニン−7、ラミニン−8、ラミニン−9、ラミニン−10、ラミニン−12、ラミニン−13、ラミニン−14およびラミニン−15が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、ラミニンは、本明細書に上述するラミニンイソ型の組合せであることも意図する。さらに、ラミニンは、細胞培地、特にマウス、ブタ、ヒト、ヒツジのような(これらに限定されない)、潜在的に治療用途のある細胞培地に含まれるのに適切な任意の複製起点のものであることも認められるであろう。
好ましい実施形態では、1種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質は、0.1ng/mlから50μg/mlまで、60μg/mlまで、70μg/mlまで、80μg/mlまで、90μg/mlまでまたは100μg/mlまでの最終濃度で存在しうる。好ましくは、1種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質は、0.1ng/ml〜50μg/mlの最終濃度、より好ましくは50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml、1500ng/ml、さらに好ましくは、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml、25μg/ml、30μg/ml、35μg/ml、40μg/mlおよび45μg/mlで存在しうる。
先の記載を考慮すると、任意のタンパク質、特に単離されたフィーダ細胞置換因子は、当業者に知られた任意の適切な手法によって産生されてもよいことを、当業者は容易に認めるであろう。
本明細書で使用される「誘導体」は、たとえば、他の化学的部位の付加、共役または複合によって、あるいは当該分野でよく理解されている翻訳後修飾の技術によって、変化させられている。
ペプチド合成中の非天然アミノ酸および誘導体導入の例として、4−アミノ酪酸、6−アミノへキサン酸、4−アミノ−3−ヒドロキシ−5−フェニルペンタン酸、4−アミノ−3−ヒドロキシ−6−メチルヘプタン酸、t−ブチルグリシン、ノルロイシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、2−チエニルアニリンおよび/またはアミノ酸類のD−異性体の使用が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明のタンパク質は、実質的に純粋な原型であってもよいことが意図される。
組換えタンパク質の製造は、当該分野で周知であり、当業者は、たとえば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING.A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press,1989)(参照により本明細書に組み込まれる)、特にセクション16および17、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、Ausubelら編、(John Wiley & Sons社1995−1999),(参照により本明細書に組み込まれる)、特に第10および16章、およびCURRENT PROTOCOLS IN PROTEIN SCIENCE、Coliganら編、(John Wiley & Sons社1995−1999)(参照により本明細書に組み込まれる)、特に第1、5および6章に記載のような、標準のプロトコルを参照してもよい。
融合パートナーの周知の例として、グルタチオン−S−転移酵素(GST)、ヒトIgGのFc部、マルトース結合タンパク質(MBP)およびヘキサヒスチジン(HIS6)が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、特に、アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質の単離に有用である。アフィニティクロマトグラフィによる融合タンパク質精製の目的のために、アフィニティクロマトグラフィに関連するマトリックスは、それぞれ、グルタチオン−、アミロース−、およびニッケル−またはコバルト−共役樹脂である。該マトリックスの多くは、「キット」形態、たとえば、(HIS6)融合パートナーとともに有用なQIAexpress(商標)システム(Qiagen)、およびPharmacia GST精製システムとして入手可能である。
典型的には、発現構築物は、プロモーターに操作可能にリンクまたは操作可能に結合された、発現されるべき核酸(組換えタンパク質をコード化する)を含む。
構成型または誘導型プロモーターとして、たとえば、テトラサイクリン−抑制型プロモーター、エクジソン−誘導型プロモーター、アルコール−誘導型プロモーターおよびメタロチオネイン−誘導型プロモーターが挙げられる。プロモーターは、天然のプロモーター(たとえば、アルファ結晶性プロモーター、ADHプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)、ヒト伸長因子αプロモーターおよびSV40、CMV、HTLV−誘導プロモーターのようなウィルス性プロモーター)でも、複数のプロモーターの要素を組み合わせた合成ハイブリッドプロモーター(たとえば、SRアルファプロモーター)でもよい。
また、本発明は、本発明の培地および/または系を使用して産生される1種以上の細胞、たとえば、hES細胞および角化細胞(これらに限定されない)と、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物も提供する。
一般的に、本発明の組成物は、要求に応じ、治療的または予防的処置において使用できる。たとえば、hES細胞、角化細胞または角化前駆細胞を含む医薬組成物は、皮膚の再生、傷の治癒、火傷の治癒、および他の皮膚治療のために、治療または美容調剤の形態で適用できる。
特定の実施形態では、医薬組成物は、本発明に従って培養された自己または同種のhES細胞または角化細胞を含む。
用語「スプレー」は、「エアロゾル」または「ミスト」、または一般的に液滴の形での液体懸濁剤と記載される「凝縮物」のような用語を包含し、含むものである。
本発明のフィーダ依存性細胞の増殖のための細胞培地、系および方法の広い適用には、治療的用途を含む。
特定の実施形態では、角化細胞は、本発明に従って培養された自己または同種の角化細胞である。
これらの方法を使用して、細胞移動を刺激することができ、これによって、傷および火傷の治癒、潰瘍のような皮膚病変の修復、自己の皮膚のインビトロ培養によるような組織置換および移植、腎臓および肺のような内臓の再上皮化、および損傷された神経組織の修復を、促進または進行させる。
ヒト胚性幹細胞インビトロ微小環境の分析
材料および方法
マウス胚性線維芽細胞の細胞培養
MEF(SCRC−1046株化細胞,Cryosite,Lane Cove,Sydney,NSW,AUS)を、80cm2の培養フラスコ(Nalge Nunc International,Rochester,NY,USA)で、10%胎児ウシ血清(FBS)(Invitrogen)、2×10−3MのL−グルタミン(Invitrogen)および1000IU/mLのペニシリン/ストレプトマイシン(Invitrogen)を加えた85%ダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(Invitrogen,Mount Waverley,VIC,Australia)を使用して、5%CO2中、37℃で、第6継代に広げた。引き続き、マイトマイシン−C(Sigma−Aldrich,Castle Hill,NSW,AUS)を、MEFを含有するフラスコに加え、細胞を5%CO2中、2.5〜3時間、37℃で培養した。次いで、培養皿(10cm2)(Nalge Nunc International)を0.1%ゼラチン(Sigma−Aldrich)中で最低1時間被覆し、その後、MEFを加えた。1ウェル当たり2.5mLのMEF培養液を含む0.1%ゼラチン(Sigma−Aldrich)が被覆された10cm2(Nalge Nunc International)組織培養皿上に、MEF細胞を20,000個の細胞/cm2で播種した。
BG01V hES細胞(ATTC,Manassa,VA,USA)を、KO−DMEM、0.02μg/uLのbFGF(Chemicon)、2×l0−3MのL−グルタミン、1000IU/mLのペニシリン/ストレプトマイシン、1μL/mLのベータ−メルカプトエタノール、12ng/mLのLIFおよびノックアウト血清代替物(KSR)(Invitrogen)を含有するhES細胞培地中、第6継代マイトマイシン−C不活性化MEF上で培養した。hES細胞を、0.05%トリプシン/EDTA(Invitrogen)を使用して、5%CO2中、37℃、30秒で、10cm2の培養皿に、成長率および密集率に応じて1:1〜1:6で分けた。次いで、細胞をhES細胞培地中に再懸濁し、500〜600gで5分間遠心し、0.1%ゼラチン含有第6継代マイトマイシン−C不活性化MEFフィーダ層を予め塗布された10cm2の培養皿に移した。hES細胞およびフィーダ細胞を、転写後48時間から、毎日再供給した。
KSR対VN:GF−hES含有培地のタンパク質含有量を、10%の均一濃度ポリアクリルアミドゲルを使用して比較した。簡単に述べると、サンプルを、それらの適正な濃度に希釈し、サンプル緩衝液(45mLのTRIS−HCl/ブロモフェノールブルー中50mLのグリセロール/5gのSDS)中で混合し、100℃で10分間変性させた。レーンに、250kDaのAmershamマーカ(Amersham Biosciences,Piscataway,New Jersey,USA)、0.1μLのKSR培地(Invitrogen)および10μLのVN:GF−hES培地を負荷した。1×移動緩衝液(25mMのTris/200mMのグリシン)を用いて、100ボルトで1〜1.5時間、タンパク質を分離した。次いで、GelCode(登録商標)SilverSNAP(登録商標)染色キットII(Pierce,Rockford,IL,USA)を使用して、バンドが見えるようになるまで30分、ゲルを銀染色し、次いでG:BOX chemi(Syngene,Fredrick,Massachusetts,USA)を使用して、可視化した。
ステージ特異的胎児抗原−1(SSEA−1)、腫瘍抑制因子抗原1−81(Tra1−81)および八量体結合転写因子−4(Oct−4)は、hES細胞における多能性のマーカである[1,2]。これらのマーカの存在をモニタリングし、CMが未分化hES細胞から集められたことを確認した。2%パラホルムアルデヒド/抽出緩衝液(pH7.0で0.5%トリトンX−100,0.1MのPipes緩衝液,5mMのMgCl2および1mMのEGTA)を使用して、hES細胞の培養物を10分間固定した。固定化剤を除去し、培養物を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(Sigma−Aldrich)中で5分間、3回洗浄し、過剰のパラホルムアルデヒドを除去した。次いで、培養物を、4%ヤギ血清中、25℃で1時間培養した。この溶液を取り出し、4%ヤギ血清で1:50に希釈したSSEA−1、Tra1−81およびOct−4(Chemicon)に対する一次抗体および培養物を、25℃で1時間培養した。一次抗体を取り出し、洗浄ステップを繰り返した。次いで抗マウス二次抗体(Chemicon)をPBSで1:100に希釈し、1時間培養した。二次抗体を取り出し、洗浄ステップを繰り返し、コロニーをNikon TE−2000蛍光顕微鏡(Nikon,Lidcombe,NSW,AUS)で撮影した。
hES細胞の分化状態をさらに分析するために、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)分析を適用して、Oct−4およびアルカリホスファターゼ(AP)遺伝子の転写産物を検出した。tri試薬およびそれに添付のプロトコル(Sigma−Aldrich)を使用して、RNAをhES細胞コロニーから単離した。次いで、cDNAを産生するためにRNAサンプルをオリゴ−dT18merとハイブリダイズさせた。Oct−4プライマーは、センス,5’−CTTGCTGCAGAAGTGGGTG−GAGGAA−3’(配列番号1)、およびアンチセンス,5’−CTGCAGTGT−GGGTTTCGGG−CA−3’(配列番号2)であった。アルカリホスファターゼプライマーは、センス,5’−TCAGAAGCTCAACACCAACG−3’(配列番号3)、およびアンチセンス,5’−TTGTACGTCTTGGAG−AGGGC−3’(配列番号4)であった。18sRNA内部標準プライマーは、センス,5’−TTCGGAACTGAGGCCATGA−T−3’(配列番号5)、およびアンチセンス,5’−CGAACCTCCGACTTTC−GTTCT−3’(配列番号6)であった。1μgのcDNAを4つのプライマーセットのそれぞれに加え、94℃5分間の最初の変性ステップに供し、次いで94℃で30秒の変性、55℃で30秒のアニーリング、および72℃で30秒の伸展のサイクルを35回行い、次いで72℃で5分間、最後の伸展を行った。次いで、10μLのRT−PCR生成物を、2%アガロースゲル上、100ボルトで1時間分析した。次いで、生成物を、エチジウムブロマイド(Sigma−Adlrich)を使用して視覚化した。
一次元分離のためにBioLogic Duoフローシステム(Bio−rad,Hercules,California,USA)を使用し、および二次元分離のためにBeckman Coulter’s ProteomeLab(商標)PF2D(Beckman Coulter,Gladesville,NSW,AUS)プラットフォームの第2ステージを使用して、二次元液体クロマトグラフィを用いてCMサンプルを分画した。最初に、1.2mLの100%酢酸を使用して、CMをpH4の酸性にし、バルク相SPEフェニル−シリカ収着剤(Alltech−Australia,Dandenong South,VIC,AUS)を用いて濃縮した。簡単に述べると、マトリックスを100%メタノール中で生成し、10cm3の重力流カラム(Bio−rad Laboratories)に注ぎ入れ、0.1%酢酸を含有する3カラム容量の超純水を使用して平衡化した。続いて、疎水性相互作用によって樹脂に結合したタンパク質の入ったカラム(Bio−rad Laboratories)にサンプルを負荷した。次いで、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)(Sigma−Aldrich)を含有する超純水中で、2カラム容量の80%アセトニトリル(ACN)を使用して、結合タンパク質を溶出した。次いで、溶出されたサンプルを、エッペンドルフ濃縮器5301(Eppendorf South Pacific,North Ryde,NSW,AUS)を使用して凍結乾燥した。濃縮されたサンプルを20mMのTris−HClを使用して再構成し、タンパク質濃度を、Coomassie Plusタンパク質アッセイ試薬(Pierce)を使用して測定した。BioLogic DuoFlow高速液体クロマトグラフィシステム(Bio−rad Laboratories)につながれたUNO−Q(Bio−rad Laboratories)アニオン交換クロマトグラフィカラムを使用して、タンパク質サンプルを一次元で分割した。簡単に述べると、塩勾配(20mMのTris−HCLから20mMのTris−HCLを含有する500mMのNaClへ)を使用してポリペプチドを分画し、0.5mL/分の流速を使用して、2分間隔で1mLのフラクションを集めた。
2Dクロマトグラフィワークフローでサンプルを分画すると、400μLの各フラクションを、それらのそれぞれの二次元96ウェルプレートから集め、先に記載したように凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥サンプルを、還元し、アルキル化し、トリプシン消化した。還元は、凍結乾燥タンパク質を100μLの還元緩衝液(0.1MのNH4CO3/20mMのDTT、pH7.9)に再懸濁し、次いで、サンプルを56℃で1時間培養することによって行った。アルキル化は、10μLの50mMヨードアセタミド(Sigma−Aldrich)を還元サンプルに加え、該サンプルを暗所中、37℃で30分培養することによって行った。次いで、タンパク質を、2.2μLのシークエンシンググレードの変性トリプシン(Promega)を使用して消化し、暗所中、37℃で一晩培養した。次いで、マイクロC18ZipTips(Millipore,Bedford,MA,USA)を使用して該サンプルを脱塩し、60%ACN/0.1%TFA中の5mg/mlのアルファ−シアノ−4−ヒドロキシケイ皮酸(CHCA)を用い、マトリックス会合レーザ脱離イオン化(MALDI)プレート上で、ペプチドを直接溶出した。10倍希釈の標準校正混合物を、トリプシン消化物サンプルがスポットされるMALDIプレートの校正体として使用した。使用したサンプルマトリックスは、5mMのリン酸アンモニウムおよび0.1%TFA(Sigma−Aldrich)中の50%アセトニトリル中の濃度が5mg/mlのCHCAであった。次いで、Institute for Molecular Bioscience(St Lucia,QLD,Australia)で、4700プロテオミクスアナライザMALDI−TOF−TOF(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)を使用して、サンプルを分析した。質量分析(MS)スペクトルは、全て、陽性反射体モードで、3200μJ/パルスのレーザエネルギで記録した。MSデータは、4700TOF−TOF MS/MSから得られる各スペクトルについて、1000ショットを蓄積した。TOF−TOFからのMSデータは全て、デフォルト1kV MS/MS方法を使用し、4500μJ/パルスのレーザエネルギで得た。非処理TOF−MSおよびTOF−TOF MS/MSデータから得た情報は、MSDBデータベースの哺乳類エントリを問合わせるために使用し、MASCOTデータベースの照合が自動化されたGPS Explorer(商標)(Applied Biosystems)を用いて行った。ペプチド集団を検索する場合、以下のパラメータを設定した。誤切断(missed cleavage)=2、ペプチドトレランス=+/−0.5、酵素=トリプシン、変動性変性はメチオニンの酸化を含む、固定変性はシステインのカルバミドメチルを含む。ヒットの最高数を選択し、タンパク質スコア、タンパク質スコア信頼区間、総イオンスコア(TIS)および総イオンスコア信頼区間を使用して、タンパク質を分析した。
最初に、一次元フラクションおよび原料サンプル(濃縮調整培地)を、それぞれLC/ESI/MSおよびLC/MSについて、エッペンドルフ濃縮器5301(Eppendorf South Pacific)を使用して凍結乾燥した。次いで、凍結乾燥サンプルを、先に記載したように、還元、アルキル化およびトリプシンで消化した。次いで、液体クロマトグラフィ(LC)用のサンプルを、50/50溶剤A/B(溶剤A0.1%ギ酸)(溶剤B0.1%ギ酸中の90%アセトニトリル)に溶解した。40/60の溶剤A/Bが入ったC18 300Aカラム(150mm×0.5mm×5μmの粒径)(Vydac,Hesperia,California,USA)に、サンプルを流速300μL/分で負荷した。溶剤送達は、Agilent1100Binary HPLCシステム(Agilent,Inc Santa Clara,California,USA)を使用して実施した。
VN:GF−hES培地対KSR含有培地におけるタンパク質含有量
最初にhES細胞を冷凍貯蔵から蘇生させ、次いで20%KSR含有培地を使用して、MEF細胞上で培養した。しかし、重要な因子をマスクすることによって、血清アルブミンのような血清中に豊富に存在するタンパク質は、計画されたプロテオミクス分析を実行できることが認められた。したがって、無血清培地、VN:GF−hESを、細胞の培養のために使用した。KSR対VN:GF−hESの総タンパク質含有量を比較するため、10%等張ポリアクリルアミドゲルを使用するPAGE分析を行った。この分析により、VN:GF−hES(図1、レーン2)は、多数の同定されていないタンパク質を明らかに含有するKSR(図1、レーン1)に比べて、最小限のタンパク質を含有することが明らかになった。
hES細胞は、VN:GF−hES培地を無血清培地として使用した場合、未分化状態で、接着し、増加し、生存することができることはすでに実証されている(Richards2003非公開データ)。分析すべき調整培地(CM)が未分化hES細胞から集められたことを確認するため、細胞の形態学的検査を行った。この実験により、VN:GF−hESで増殖されたhES細胞は、KSR含有培地において成長させたものに類似する、きつく密接したコロニーを維持することが明らかになった(それぞれ図2Fおよび2Bを参照)。さらに、無血清培地で増殖させたMEF細胞は、KSRで増殖されたものに類似する組織形態を示した(それぞれ、図2Eおよび2A)。
現在、hES細胞の多能性を特徴付ける決定的なマーカは存在しない。しかし、hES細胞は、数種のマーカ、たとえば、SSEA−4、Oct−4およびTRAl−81(これらは全て未分化hES細胞に対して特異的である)を発現する。これらのマーカは、まとめて、hES細胞が表現型的に未分化であることを検証するために、日常的に使用される[29]。VN:GF−hES培地で成長させた細胞が未分化であったことを確かめるため、TRA1−81およびOct−4に対する抗体を選択し、hES細胞の分化状態を分析した。Oct−4(緑色)およびTRA1−81(赤色)は両方とも、KSR条件およびVN:GF−hES条件下で培養されたhES細胞上でのタンパク質発現が高いレベルであることを明らかにした(それぞれ、図2Cおよび2G、ならびに図2Dおよび2H)。さらに、蛍光標識された、SSEA−4(未分化細胞によって発現)に対する二次抗体、および蛍光標識された、SSEA−1(未分化細胞によって発現されない)に対する二次抗体を選択し、hES細胞分化状態をさらに分析した。この分析により、SSEA−4は、KSRまたはVN:GF−hES培地のどちらかで培養された細胞上で発現されることが明らかになった(データは示さず)。同様に、SSEA−1は、KSRまたはVN:GF−hES培地のどちらかで培養された細胞上では発現されなかった(データは示さず)。二次抗体のみを用いてhES細胞を培養した場合、免疫反応性は観察されなかった(データは示さず)。
TRA1−81、Oct−4およびSSEA−4の発現はともに、未分化hES細胞コロニーを同定するには確実ではない。したがって、2種の遺伝子、Oct−4およびAP(アルカリホスファターゼ)の発現におけるRT−PCR分析を行い、hES細胞の分化状態をさらに検証した。サンプルが相補的デオキシリボ核酸(cDNA)、またはゲノムデオキシリボ核酸(gDNA)で汚染されていないことを確証するため、ネガティブコントロールのシリーズでは、テンプレートを省略した(データは示さず)。プライマーを遺伝子内で異なるエクソンにアニールするように設計し、したがって、PCR反応中に存在する任意の汚染ゲノムデオキシリボ核酸(gDNA)は、cDNAより大きな分子量バンドになる。この分析により、KSR(図3A)およびVN:GF−hES培地(図3B)で成長させたhES細胞コロニーは、Oct−4、APおよび18sRNA(内部標準コントロールとして含まれる)に関するmRNAを発現したことが明らかになった。さらに、この実験により、プロテオミクス分析のために集められたCMは、未分化hES細胞から集められたということが立証される。
MEF細胞単独(図4Aおよび4B)、およびMEF:hES細胞(図5Aおよび5B)からのCM中に存在するタンパク質を、二次元液体クロマトグラフ分離の新規な形を使用して分離した。この方法は、一次元において塩勾配によってタンパク質を分離することを含んだ。次いで、タンパク質を含有する一次元フラクションを、H2O ACN勾配を採用する二次元分離手法を使用して分析した。次いで、ProteomeLab(商標)ソフトウェアパッケージProteoVueを使用して、タンパク質を視覚化した。タンパク質プロファイルにおける明らかな相違は、MEF細胞単独CM(図4B)とMEF:hES細胞CM(図5B)との間ではっきりしていた。このプロテオミクス手法により、数種のタンパク質がCM中で観察されたが、本明細書ではhES細胞インビトロ微小環境に関連するタンパク質のみを検討する。MEF細胞単独からの合計192個のタンパク質、およびMEF:hES細胞からの247個のタンパク質を、3つの個別の二次元クロマトグラフプロファイルから同定した(それぞれ、図4Bおよび5B)。次いで、これらのタンパク質を単離し、消化し、MALDI−TOF−TOF分析に供した。さらに、MEF CMからの35個のフラクションおよびMEF:hES細胞CMからの38個のフラクションを、それらの一次元分離物から単離し、消化し、LC/ESI/MSに移した(それぞれ、図4Aおよび5A)。さらに、MEF CMからの1個の原料サンプル(濃縮、凍結乾燥およびトリプシン消化されたもの)、およびMEF:hES細胞CMからの1個の原料サンプルを、加工し、LC−MALDIに供した。
MALDI−TOF−TOF、LC/ESI/MSおよびLC−MALDIの三つの方法を使用して、MEF CMおよびMEF:hES細胞CM中のタンパク質を分析した。Mascotデータベースを使用して、CM内に存在するタンパク質を分析し、結果を、7種のタンパク質種である、ECM、膜、核、分泌、分化および成長因子、ならびに血清由来に編成した。さらに、アクセッション番号、分子量、タンパク質スコアおよびイオンスコアを使用して、タンパク質を分類した。MALDI−TOF−TOF結果をタンパク質スコアに関連させた。MEF CM培地に関するMALDI−TOF−TOF結果により、3種のECM、3種の膜、3種の核、1種の細胞質、4種の分泌、ならびに7種の分化および成長因子タンパク質が明らかになった(表1)。さらに、MEF:hES細胞CMに関するMALDI−TOF−TOF結果により、4種の膜、4種の核および6種の分泌タンパク質が明らかになった(表2)。核タンパク質ヘテロ核リボヌクレオタンパク質M(表2)以外の全てのMALDI−TOF−TOF結果は、それらのタンパク質スコアによって測定されたように、未確認であった。LC/ESI/MS結果はイオンスコアに関連する。MEF CMに関するLC/ESI/MS結果により、11種のECM、4種の膜、5種の核、1種の細胞質、3種の分泌および3種の血清由来タンパク質が明らかになった(表1)。さらに、MEF:hES細胞CMに関するLC/ESI/MS結果により、12種のECM、4種の膜、6種の核、6種の細胞質、1種の分泌、および2種の血清由来タンパク質が明らかになった(表2)。また、LC−MALDI結果はイオンスコアに関連する。MEF CMに関するLC−MALDI結果により、1種のECM、1種の膜、2種の細胞質、および1種の分泌タンパク質が明らかになった(表1)。さらに、MEF:hES細胞CMに関するLC−MALDI結果により、1種の細胞質と、2種の分泌タンパク質が明らかになった(表2)。LC/ESI/MS分析によって明らかにされたタンパク質は全て、それらのイオンスコアによって測定されたように、確認され、あるいは広範な相同性を示す。先に記載した三つの分析は、全て、返された結果の妥当性を上げるために行った。
1998年に最初に誘導されて以来[1]、hES細胞は、組織置換および修復のためのインビトロ細胞の最も見込みのある供給源の一つとなっている。しかし、これらの「原始」細胞は、未分化増殖を維持するために、MEF細胞およびウシ血清のような異物由来成分を必要とする。これらの細胞から誘導される生成物を受ける患者は、なんらかの事情で、これらの定義付けが不十分でおよび/または異物由来の培養成分中に存在するかもしれない、「新しい変異体クロイツェルトヤコブ病」のような疾患に感染するかもしれないため、これは大きな問題を有している。しかも、Ajit Varki博士は、これらの異種培養条件において増殖されたhES細胞株が、MEFフィーダ細胞によってもたらされると考えられた、非ヒトシアル酸Neu5Gcを獲得したことを実証した[30]。この発見は、hES細胞が、それらのインビトロ微小環境に存在する因子に対して脆弱であることを明確に実証する。したがって、これらの細胞の治療可能性をかなえるつもりであれば、これらの異物由来成分を現在の培養系からなくすことは、明らかに必要である。
(実施例2)
インビトロで培養された角化細胞により調整された培地のプロテオミクス分析
この実験は、角化細胞インビトロ微小環境の包括的な試験を行うことを目的とした。特に、角化細胞成長に必要なフィーダ細胞によって産生する重要な因子を同定するために、プロテオミクス手法を採用した。さらに、充分に定義され、最小タンパク質含有量を持つ先に記載した無血清培地を利用した。この無血清培地の最小タンパク質含有量は、角化細胞成長をサポートするのに重要な、フィーダ細胞によって分泌される決定的な因子を「マスク」しないという大きな利点を提供する。さらに、血清含有培地は、普通、プロテオミクス分析の前に前加工ステップ、たとえば「Multiple Affinity Removal System」(MARS)(Agilent Technologies)を必要とする。このMARS免疫除法は、血清含有培地からの非常に豊富なタンパク質の除去を含み、これにより、初代角化細胞の自己再生のために重要な候補因子を失う結果となる可能性がある。同様に、「調整」培地の収集において日常使用される手法である、無血清基本培地中での細胞の成長の必要がない。その代わりに、分析すべき培地は、それらの通常の「成長」培地で培養した細胞から集められた。したがって、それらは、栄養が不足したストレス状態にあるというよりも、むしろ活発に成長した。まとめると、インビトロ角化細胞培養微小環境で産生される決定的な因子を同定するために、これらの特徴は、理想的かつ独特な立場を提供する。
初代角化細胞の単離
初代角化細胞を、Goberdhanら(1993)に記載されるように、乳房縮小術および腹壁形成術から得られた中間層皮膚生検体から単離した。簡単に述べると、この方法は、皮膚生検体を0.5cm2片に解体する工程を含み、その後一連の抗生物質洗浄ステップが続いた。次いで、皮膚を、4℃で一晩、0.125%トリプシン(Invitrogen,Mulgrave,VIC,Australia)中で培養した。次いで、表皮を真皮層から分離し、角化細胞を単離した。次いで、角化細胞を、DMEM(Invitrogen)に懸濁し、ろ過(100μm)し、ペレット化した。
新しく単離した角化細胞を、最初に、75cm2フラスコ中、2×106個の細胞の密度で培養し、連続継代のために、75cm2フラスコ当たり2×103個の細胞を播種した。角化細胞を播種する前に、γ線照射された(25Gyの2線量)(Australian Red Cross Blood Service,Brisbane,QLD,Australia)マウスi3T3細胞フィーダ層を、2×106個の細胞で4時間、前播種した。次いで、フィーダ層を3時間血清欠乏させ、次いで播種を行った。角化細胞を、フェノールレッドのないDMEM/HAMS培地(Invitrogen)、0.4μg/mLのヒドロコルチゾン、0.1nMのコレラ毒素、1.8×10−4Mのアデニン、2×10−7Mのトリヨード−1−チロニン、5μg/mLのトランスフェリン、2×10−3Mのグルタミン(Invitrogen)、1000IU/mLのペニシリン、1000μg/mLのストレプトマイシン(Invitrogen)、0.6μg/mLのVN(Promega,Annandale,NSW,Australia)、0.6μg/mLのIGFBP−3(N109D組換え変異体)(Auspep,Parkville,VIC,Australia)、0.2μg/mLのIGF−I(GroPep,Adelaide,SA,Australia)、および0.2μg/mLのEGF(Invitrogen)(VN:GF−Kc)を含有するVN:GF培地で増殖させた。角化細胞培養物を、5%二酸化炭素中37℃で培養し、隔日にVN:GF−Kc培地を再供給した。組織形態およびマーカ発現を使用して、この実験で使用した角化細胞が血清を使用して成長したものと表現型的に類似することを確認した。簡単に述べると、これは、ケラチン6、未分化角化細胞によって発現されたマーカに対する抗体で、培養物をプロービングすることを含んでいた。
本明細書の先に記載した実施例1中の方法を使用して、二次元液体クロマトグラフィを、調整培地サンプルを分画するために使用し、一次元分離のために、BioLogic Duo−flow高速液体クロマトグラフィ(HPLC)(Bio−rad,Hercules,California,USA)を採用し、一方Beckman Coulter’s ProteomeLab(商標)PF2Dプラットフォームの第2ステージを二次元分離のために利用した。
本明細書の先に記載した実施例1中の方法を使用して、フィーダ細胞およびフィーダ細胞角化細胞調整培地サンプル中に存在するタンパク質を、LC/ESI/MSおよびLC−MALDIの2つのLC/MS手段を使用して同定した。
実施例1に記載した手段を使用して、タンパク質のピークを、TOF−TOF分析用の質量分析プレートに移した。
MSおよびMS/MSデータベース分析で得たタンパク質スコア、タンパク質スコア信頼区間、総イオンスコア(TIS)および総イオンスコア信頼区間を使用して、潜在的な一致のリストからのタンパク質をランク付けした。
プロテオミクス分析用のVN:GF−Kc培地を使用して増殖させた第2継代角化細胞上に存在する細胞表面マーカの組織形態および発現
組織形態およびマーカ発現を使用して、分析すべき調整培地が未分化初代角化細胞から集められたことを確認した。現在、培養初代角化細胞が未分化状態を保っているかどうかを測定するための決定的なアッセイはない。しかし、ケラチンマーカは、細胞の増殖性状態、および細胞が基底角化細胞であるか否かに関する有用な情報を得るために使用することができる。したがって、ケラチン6(高増殖性角化細胞中に存在する)、ケラチン14(基底細胞中に存在する)、およびケラチン1/10/11(より分化された、前出の基底細胞中に存在する、データは示さず)を認識する抗体を使用して、プロテオミクス実験用の細胞培養物の分化状態を評価した。この分析により、VN:GF−Kc培地を使用して増殖された細胞は、血清を使用して成長したものと比べ、正常な組織形態を保っていたことが明らかになった(それぞれ、図6BおよびA)。さらに、VN:GF−Kc培地で培養された角化細胞は、ケラチン6および14の発現を継続し(それぞれ、図6CおよびD)、したがって、これらの細胞が、未分化の初代角化細胞組織形態を保っていたことを示唆していた。
フィーダ細胞単独の調整培地、およびフィーダ細胞:角化細胞共培養物からの調製培地に存在するタンパク質(それぞれ、図7AおよびB)を、二次元液体クロマトグラフィ分離の新規な形態を使用して分離した。これには、一次元における塩勾配、次いでアセトニトリル勾配を使用する二次元分離によって、タンパク質を分離することを含んでいた。プラットフォームの一次元分割が乏しいため、一次元の標準Beckman Coulter ProteomeLabを、Bio−rad’s Duo−flow HPLCで置き換えた。ProteoViewソフトウェアを使用して、タンパク質を視覚化した。明らかに、フィーダ細胞単独の調整培地で見出されるスポット数より、フィーダ細胞:角化細胞培養調整培地(図7B)において発現された、明確なタンパク質スポットの数が増加している。さらに、フィーダ細胞単独調整培地(図7A)とフィーダ細胞:角化細胞培養から得られた培地(データは示さず)との間の発現レベルに目に見える変化があるようである。続いて、図7Aに示されている187個のタンパク質スポット、および図7Bに示されている238個のタンパク質スポットを、単離し、消化し、MALDI TOF−TOFを使用して分析した。
最初に、タンパク質スポット上でMALDI−TOF−TOF分析を行った。フィーダ細胞単独またはフィーダ細胞:角化細胞調整培地(CM)に関して、有意なイオンスコアは明らかにならなかった。したがって、2つの液体クロマトグラフィ方法を使用してCMを分析した。該方法は、第一はQTRAP MS/MS系(LC/ESI/MS)(一次元分離からのフラクションで実施)を含み、一方、第2は、LC−MALDI(濃縮CMサンプルで実施)を利用した(表3および4)。次いで、Mascotデータベースを使用して、調整培地中に存在するタンパク質を分析した。LC/ESI/MSおよびLC−MALDI結果を、7種の主な群、細胞外マトリックス(ECM)、膜、核、分泌、血清由来、およびその他のタンパク質/因子に編成した。さらに、アクセッション番号、分子量、総スコアおよびペプチドカウントを使用して、タンパク質を分類した。表3および4に示すタンパク質は全て、それぞれ同定されるか、またはイオンスコアで測定されるような広範な相同性を示す。フィーダ細胞単独の結果は、12種のECM、2種の成長因子、17種のその他のタンパク質、14種の膜タンパク質、10種の核タンパク質、5種の分泌タンパク質、および3種の血清由来タンパク質を明らかにした(表3)。フィーダ細胞:角化細胞の結果は、3種の細胞質タンパク質、22種のECM、30種のその他のタンパク質、21種の膜タンパク質、19種の核タンパク質、9種の分泌タンパク質、および4種の血清由来タンパク質を明らかにした。LCMS結果を、総イオンスコアに関連するランクによって編成した(表4)。
LC−ESI、LC−MALDIおよびMALDI−TOF−TOF分析を使用したタンパク質の同定を、フィーダ細胞単独またはフィーダ細胞:角化細胞調整培地(CM)から得た液体フラクション上で行った。Mascotデータベースを使用して、これらの処理物中に存在するタンパク質を分析した。次いで、潜在的候補および関心のあるタンパク質を、細胞外マトリックス、成長因子およびサイトカイン、分泌および細胞内タンパク質を含む、それらのそれぞれのカテゴリに分離した。コラーゲンI、IVおよびVII、フィブロネクチンI、ラミニンV、TGFsアルファおよびベータ、VEGF、インターロイキン1、10および15、テロメラーゼ結合タンパク質EST IA、およびTra1相同体を含む、両処理物中のタンパク質の間には重なりがあった。しかし、独特のタンパク質は、Wnt−2b、Wnt−12、コラーゲンVおよびVI、骨形成タンパク質1(BMP1)、bFGF、ヒト成長ホルモン(HGH)、FGF3、インスリン、IGF−Iおよび−II、インターロイキン−8、白血病抑制因子および巨核球CSFを含むフィーダ細胞単独処理物中にも観察された。さらに、独特のタンパク質は、フィブロネクチンIII、ラミニンIおよびIII、神経成長因子(NGF)、肝細胞増殖因子(hgf)、PC細胞由来成長因子、血小板由来成長因子ベータ(PDGF)、インターロイキン4および6、PDGF誘発性JEグルコタンパク質、フォリスタチン関連タンパク質5、成長抑制因子、増殖分化因子9およびテロメラーゼ逆転写酵素(表5)を含む、フィーダ細胞:角化細胞処理物中にも観察された。
初代角化細胞に関連する多くの新規な技術が、皮膚欠損の再生および治癒を補助する治療産業のために開発されている[75,76]。しかし、エクスビボでコレラの細胞を増殖するのに使用される技術は、未だ、血清および/またはフィーダ細胞のような定義されていない成分を必要とし、一般的に十分に定義されていない培養系を利用している。未分化角化細胞の単離、樹立および連続増殖をサポートすることができる完全に定義された無血清技術(VN:GF−Kc)は、前進であるものの、該培養手法は、未だ、連続増殖およびインビトロ増大の成功のために、照射i3T3フィーダ層を使用することが必要であった。
(実施例3)
hES細胞の無フィーダおよび無血清成長
hES細胞を以下の培地製剤、1ug/mLのIGF−I/1−64VNキメラタンパク質、0.1ug/mLのbFGF、35ng/mLのアクチビン−Aおよび40μg/mLのラミニンで成長させ、試験した。
本明細書全体を通して、本発明の好ましい実施形態を記載してきたが、本発明は、いずれか一つの実施形態または特定の特徴の集合に限定されるものではない。したがって、本明細書の開示に照らし、本発明の範囲を逸脱しない限り、例示された特定の実施形態において、種々の変形例および変更例がなされうることは、当業者に理解されるであろう。
Claims (34)
- 細胞培地であって、
(i)インスリン様成長因子(IGF)アミノ酸配列およびビトロネクチン(VN)アミノ酸配列を含む合成キメラタンパク質と、
(ii)ヒト成長ホルモン(hGH)、骨形成タンパク質15(BMP−15)、増殖分化因子9(GDF−9)、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質2、Wnt−2b、Wnt−12、成長抑制因子、フェチュイン、ヒト血清アルブミン(HSA)、肝細胞増殖因子(HGF)、形質転換成長因子−α(TGF−α)、TGF−β、神経成長因子、血小板由来成長因子−β(PDGF−β)、PC由来成長因子(プログラヌリン)、インターロイキン(IL)−1、IL−2、IL−4、IL−6、IL−8、IL−10、IL−13およびアクチビン−Aからなる群から選択される1種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子とを含み、かつ、
(iii)血清が存在しない、あるいはIGFの不在下において細胞成長をサポートしない非常に少量の血清を含む、細胞培地。 - 前記1種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子が、hGH、BMP−15、GDP−9、巨核球コロニー刺激因子、分泌フリッツルド関連タンパク質2、Wnt−2b、Wnt−12、成長抑制因子およびアクチビン−Aからなる群から選択される、請求項1に記載の細胞培地。
- 前記1種以上の単離されたフィーダ細胞置換因子がアクチビン−Aである、請求項1または2に記載の細胞培地。
- 前記細胞培地が、さらに、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF)、上皮成長因子(EGF)、IGF−I、IGF−IIおよびラミニンからなる群から選択される1種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記1種以上の追加の生物学的に活性なタンパク質がbFGFおよびラミニンから選択される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記IGFアミノ酸配列がIGF−Iアミノ酸配列またはIGF−IIアミノ酸配列である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記IGFアミノ酸配列がIGF−Iアミノ酸配列である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記VNアミノ酸配列が成熟VNのアミノ酸残基1〜64である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記合成キメラタンパク質が、さらに、1個以上のグリシン残基および1個以上のセリン残基のリンカー配列を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記リンカー配列が(Gly4Ser)4である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 単離されたIGF含有複合体をさらに含み、前記IGFはIGF−IおよびIGF−IIから選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記単離されたIGF含有複合体中にIGF−IIが存在する場合、さらにVNを含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記単離されたIGF含有複合体中にIGF−Iが存在する場合、さらにIGFBPおよびVNを含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記IGFBPが、IGFBP−1、IGFBP−2、IGFBP−3、IGFBP−4、IGFBP−5およびIGFBP−6からなる群から選択されるIGFBPである、請求項1〜13のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記IGFBPがIGFBP−3またはIGFBP−5である、請求項1〜14のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が0.1ng/ml〜50μg/mlである、請求項1〜15のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が約5ng/ml〜1500ng/mlである、請求項1〜16のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が25ng/ml〜1000ng/mlである、請求項1〜17のいずれか一項に記載の細胞培地。
- 前記各フィーダ細胞置換因子の最終濃度が、150ng/ml〜600ng/mlである、請求項1〜18のいずれか一項に記載の細胞培地。
- IGFアミノ酸配列およびVNアミノ酸配列を含む約250ng/ml〜1000ng/mlの合成キメラタンパク質と、約50ng/ml〜l00ng/mlのbFGFと、約25ng/ml〜50ng/mlのアクチビン−Aと、約10μg/ml〜50μg/mlのラミニンとを含む胚性幹細胞培地。
- IGFアミノ酸配列およびVNアミノ酸配列を含む約1000ng/mlの前記合成キメラタンパク質と、約100ng/mlのbFGFと、約35ng/mlのアクチビン−Aと、約40μg/mlの前記ラミニンとを含む、請求項20に記載の胚性幹細胞培地。
- 前記IGFアミノ酸配列がIGF−Iアミノ酸配列またはIGF−IIアミノ酸配列である、請求項20または21に記載の胚性幹細胞培養。
- 前記IGFアミノ酸配列がIGF−Iアミノ酸配列である、請求項20〜22のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地。
- 前記VNアミノ酸配列が成熟VNのアミノ酸残基1〜64である、請求項20〜23のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地。
- 培養容器と、請求項1〜19のいずれか一項に記載の細胞培地または請求項20〜24のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地とを含む細胞培養系。
- 請求項1〜19のいずれか一項に記載の細胞培地、請求項20〜24のいずれか一項に記載の胚性幹細胞培地、あるいは請求項25に記載の培養系において、1個以上の細胞を培養するステップを含む細胞培養方法。
- 前記1個以上の細胞がフィーダ依存性細胞型である、請求項26に記載の方法。
- 前記1個以上の細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項26または27に記載の方法。
- 前記1個以上の細胞が角化細胞である、請求項26または27に記載の方法。
- 請求項26〜29のいずれか一項に記載の方法によって産生された1個以上の細胞と、医薬的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤とを含む医薬組成物。
- 角化細胞、ヒト胚性幹細胞および角化細胞前駆細胞から選択される1個以上の細胞を含む医薬組成物。
- 前記1個以上の細胞がヒト胚性幹細胞である、請求項30または31に記載の医薬組成物。
- 前記1個以上の細胞が角化細胞である、請求項30〜32のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- 請求項26〜29のいずれか一項に記載の方法によって培養された1個以上の細胞を送達する方法であって、請求項30〜33のいずれか一項に記載の医薬組成物を個体に送達することにより、前記個体における1個以上の細胞の再生および/または増殖を促進するステップを含む方法。
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