RU2690498C1 - Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека - Google Patents
Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека Download PDFInfo
- Publication number
- RU2690498C1 RU2690498C1 RU2018118201A RU2018118201A RU2690498C1 RU 2690498 C1 RU2690498 C1 RU 2690498C1 RU 2018118201 A RU2018118201 A RU 2018118201A RU 2018118201 A RU2018118201 A RU 2018118201A RU 2690498 C1 RU2690498 C1 RU 2690498C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- protein
- differentiation
- ipsc
- cells
- medium
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000001777 nootropic effect Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 title claims description 14
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title claims description 13
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 title claims description 7
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title abstract description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 27
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims abstract description 26
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 claims abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 30
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 13
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 10
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims description 10
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 9
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 claims description 9
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 claims description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims description 8
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 claims description 7
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 7
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 5
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 4
- CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 4-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]-3-pyrazolo[1,5-a]pyrimidinyl]quinoline Chemical compound C1CNCCN1C1=CC=C(C2=CN3N=CC(=C3N=C2)C=2C3=CC=CC=C3N=CC=2)C=C1 CDOVNWNANFFLFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 3
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 claims description 3
- FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N purmorphamine Chemical compound C1CCCCC1N1C2=NC(OC=3C4=CC=CC=C4C=CC=3)=NC(NC=3C=CC(=CC=3)N3CCOCC3)=C2N=C1 FYBHCRQFSFYWPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 3
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 abstract description 4
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 abstract description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 abstract description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 abstract description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 26
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 25
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 6
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 6
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 6
- OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N (2,4-dichlorophenyl) benzenesulfonate Chemical compound ClC1=CC(Cl)=CC=C1OS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1 OZFAFGSSMRRTDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 5
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 4
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 4
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 4
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 4
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 4
- 210000003657 middle cerebral artery Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000012749 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Human genes 0.000 description 3
- 108010090047 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Proteins 0.000 description 3
- 102000034615 Glial cell line-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 3
- 108091010837 Glial cell line-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 3
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 3
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 3
- -1 NANOG Proteins 0.000 description 3
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 102000008730 Nestin Human genes 0.000 description 3
- 108010088225 Nestin Proteins 0.000 description 3
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 3
- 101100247004 Rattus norvegicus Qsox1 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 3
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 3
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 3
- 210000005055 nestin Anatomy 0.000 description 3
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 3
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100023635 Alpha-fetoprotein Human genes 0.000 description 2
- 101100210322 Arabidopsis thaliana WIP2 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100037060 Forkhead box protein D3 Human genes 0.000 description 2
- 102100028115 Forkhead box protein P2 Human genes 0.000 description 2
- 102100020997 Fractalkine Human genes 0.000 description 2
- 102100039289 Glial fibrillary acidic protein Human genes 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- 102100034633 Homeobox expressed in ES cells 1 Human genes 0.000 description 2
- 101100373200 Homo sapiens CX3CL1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101001029308 Homo sapiens Forkhead box protein D3 Proteins 0.000 description 2
- 101001059881 Homo sapiens Forkhead box protein P2 Proteins 0.000 description 2
- 101001067288 Homo sapiens Homeobox expressed in ES cells 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000740178 Homo sapiens Sal-like protein 4 Proteins 0.000 description 2
- 101000639970 Homo sapiens Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 2
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 2
- 102100037192 Sal-like protein 4 Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100033927 Sodium- and chloride-dependent GABA transporter 1 Human genes 0.000 description 2
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 2
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960004821 amikacin Drugs 0.000 description 2
- LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N amikacin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](N)C[C@H]([C@@H]([C@H]1O)O[C@@H]1[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)NC(=O)[C@@H](O)CCN)[C@H]1O[C@H](CN)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LKCWBDHBTVXHDL-RMDFUYIESA-N 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000002338 cryopreservative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000254 damaging effect Effects 0.000 description 2
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 2
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 229960003692 gamma aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N gamma-aminobutyric acid Chemical compound NCCCC(O)=O BTCSSZJGUNDROE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002518 glial effect Effects 0.000 description 2
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 2
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000005171 mammalian brain Anatomy 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 239000003590 rho kinase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 230000000946 synaptic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC=CC=C1C(N=[N+]1C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 PKDBCJSWQUOKDO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010058842 Cerebrovascular insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 1
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 102100039486 Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit 4 Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102100028652 Gamma-enolase Human genes 0.000 description 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 229920002683 Glycosaminoglycan Polymers 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000016988 Hemorrhagic Stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000609775 Homo sapiens Dolichyl-diphosphooligosaccharide-protein glycosyltransferase subunit 4 Proteins 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001058231 Homo sapiens Gamma-enolase Proteins 0.000 description 1
- 101001092197 Homo sapiens RNA binding protein fox-1 homolog 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000013016 Hypoglycemia Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 108700021430 Kruppel-Like Factor 4 Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 1
- 108010020004 Microtubule-Associated Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009664 Microtubule-Associated Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100026459 POU domain, class 3, transcription factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710133394 POU domain, class 3, transcription factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 102100035530 RNA binding protein fox-1 homolog 3 Human genes 0.000 description 1
- 102000004874 Synaptophysin Human genes 0.000 description 1
- 108090001076 Synaptophysin Proteins 0.000 description 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 1
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000001773 anti-convulsant effect Effects 0.000 description 1
- 230000002253 anti-ischaemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 229960003965 antiepileptics Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 208000036815 beta tubulin Diseases 0.000 description 1
- 230000003851 biochemical process Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001139 cefazolin Drugs 0.000 description 1
- MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N cefazolin Chemical compound S1C(C)=NN=C1SCC1=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CN3N=NN=C3)[C@H]2SC1 MLYYVTUWGNIJIB-BXKDBHETSA-N 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 1
- 108010017307 cerebrocurin Proteins 0.000 description 1
- 230000001966 cerebroprotective effect Effects 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 102000009854 cortexin Human genes 0.000 description 1
- 108010034906 cortexin Proteins 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001647 drug administration Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003619 fibrillary effect Effects 0.000 description 1
- 210000000245 forearm Anatomy 0.000 description 1
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000548 hind-foot Anatomy 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 1
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 208000006443 lactic acidosis Diseases 0.000 description 1
- 101150111214 lin-28 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000276 neural tube Anatomy 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 230000007971 neurological deficit Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000004007 neuromodulation Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000508 neurotrophic effect Effects 0.000 description 1
- 229940053973 novocaine Drugs 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 230000005868 ontogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 108010057417 polysialyl neural cell adhesion molecule Proteins 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 239000013630 prepared media Substances 0.000 description 1
- MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N procaine Chemical compound CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1 MFDFERRIHVXMIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000007065 protein hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/48—Reproductive organs
- A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
- A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к способу получения белково-пептидной композиции с ноотропными свойствами и включает в себя: забор биоптата кожи, получение культуры фибробластов, криоконсервацию культуры фибробластов, размораживание культуры фибробластов, репрограммирование фибробластов для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), культивирование ИПСК, криоконсервацию ИПСК, размораживание ИПСК, нейрональную дифференцировку ИПСК, получение белково-пептидного комплекса. Получение белково-пептидного комплекса таким способом позволяет избежать иммунологических конфликтов, развитие которых возможно при использовании пептидных композиций ксеногенного происхождения, полученных из тканей мозга свиней, овец и других животных. Кроме того, использование клеточных культур человека позволит получить белково-пептидную композицию, содержащую белки и пептиды с молекулярной массой до 100 кДа, в которую будут включены не только небольшие пептиды, но и полноразмерные белковые нейрональные ростовые и дифференцировочные факторы. Эффективность действия таких факторов заведомо выше, чем у коротких пептидов, а иммуногенность отсутствует. Использование ИПСК в качестве источника получения белково-пептидной композиции позволяет решить проблему дефицита донорского материала и этические вопросы, возникающие при применении для аналогичных целей эмбрионального материала и культур эмбриональных стволовых клеток человека. 3 ил., 4 пр.
Description
В современной медицине нейропептидные лекарственные препараты нашли широкое применение для лечения целого ряда нейродегенеративных заболеваний различного генеза. Препараты представляют собой композицию биологически-активных полипептидов, полученных из тканей головного мозга млекопитающих и обладающих ноотропной и нейрометаболической активностью. Различия в протоколах позволяют получить препараты, обогащенные различными белковыми факторами [Патент (RU 2477637)], которые отличаются по источнику сырья, срокам гестации при заборе, молекулярным массам входящих в него белково-полипептидных фракций, их качественному составу, по эволюционно закрепленным в онтогенезе концентрационным соотношениям белков роста, факторов дифференцировки и сигнальных молекул, по способу применения (парентерально, интратекально, интраназально, субконъюктивально), по безопасности применения (отсутствие токсических, мутагенных, канцерогенных и аллергизирующих свойств), по биологической и фармакологической активности и ее специфичности (ткане- и органоспецифичная, репаративно-регенеративная). В экспериментальных и клинических исследованиях было показано, что такие препараты обладают мультимодальным действием и обеспечивают:
- метаболическую регуляцию - препараты повышают эффективность аэробного энергетического метаболизма мозга, улучшают внутриклеточный синтез белка в развивающемся и стареющем головном мозге;
- нейропротекторное действие - препараты защищают нейроны от повреждающего действия лактацидоза, предотвращают образование свободных радикалов и предотвращают гибель нейронов в условиях гипоксии и ишемии, снижают повреждающее нейротоксическое действие глутамата;
- нейротрофическую активность - препараты оказывают действие аналогичное действию естественных факторов нейронального роста (NGF);
- функциональную нейромодуляцию - препараты оказывают положительное влияние при нарушениях познавательных функций, улучшают концентрацию внимания, процессы запоминания.
К таким препаратам относятся: церебролизин - продукт обработки мозга интактных свиней - средство для лечения болезни Альцгеймера, геморрагического и ишемического инсультов, деменции различного генеза, хронической цереброваскулярной недостаточности, травматических повреждениий головного и спинного мозга фирмы «Ebewe» (Австрия) [РЛС, 2010]; цереброкурин - продукт обработки мозга эмбрионов животных - лекарственное средство при заболеваниях, сопровождающихся нарушением функций центральной нервной системы, фирмы ООО «НИР» (Украина) [РЛС, 2010]; кортексин - препарат полипептидной природы, получаемый путем экстракции из коры головного мозга крупного рогатого скота и свиней, фирмы ООО «Герофарм» (Россия) [РЛС, 2010], обладающий ноотропным, церебропротекторным, противосудорожным и антиоксидантным действием; церебролизат - препарат, повышающий устойчивость ткани головного мозга к интоксикации, гипоксии, гипогликемии, механической травме, фирмы «Микроген» НПО ФГУП (Пммунопрепарат) [РЛС, 2010], обладающий ноотропным действием, представляющий собой гидролизат коры головного мозга крупного рогатого скота.
В целом препараты пептидной природы обладают высокой эффективностью в малых и сверхмалых дозах (физиологическая активность пептидов во много раз превышает активность обычных химических соединений), не вызывают побочных эффектов, легко выводятся из организма без образования токсических продуктов, изменения в биохимических процессах организма, вызванные пептидами, физиологичны и безопасны для человека.
Нейропротекторное и трофическое действие данных препаратов осуществляется за счет специфических пептидов и аминокислот, молекулярной массы не выше 10 кДа, из которых доминирующими и определяющими свойства препарата являются аланин, лейцин и лизин. Наиболее известным и хорошо изученным препаратом группы является церебролизин. Препарат предназначен для внутримышечного, внутривенного введения и обладает невысокой концентрацией биологически активных компонентов, поэтому вводится в организм больного в значительных дозах длительное время [РЛС, 2014]. Разнородность входящих в препарат пептидов (по молекулярной массе, формуле и свойствам) не позволяет с определенностью связать положительные эффекты препарата с конкретной составляющей субстанцией. Действие церебролизина проявляется, прежде всего, преимущественным его влиянием на выраженность очагового неврологического дефекта. Вместе с тем изолированное назначение церебролизина, например, при исходно тяжелых инсультах, сопровождающихся не только очаговой, но и общемозговой симптоматикой, признаками отека мозга, часто оказывается недостаточно эффективным и требует совместного его применения с другими противоишемическими препаратами. Кроме того, выявлена сильная зависимость эффективности церебролизина от адекватности выбранной дозы. Бесконтрольное избыточное повышение дозы церебролизина часто оказывает негативное влияние на темпы и выраженность восстановительных процессов. Таким образом, основными недостатками препарата являются значительная продолжительность курса лечения, низкая активность и специфичность препарата в связи со слабым нейропротективным действием, обладая и низким регенеративным потенциалом для нервной ткани [Кайсарбекова, 2010, РЛС, 2014].
Основная причина, ограничивающая эффективность и безопасность всех существующих нейропептидных препаратов, полученных из головного мозга млекопитающих - это их ксеногенное происхождение. При выделении нейропептидов из тканей головного мозга животных для снижения их иммуногенности (антигенных свойств) прибегают к кислотному или ферментативному гидролизу белков и высокомолекулярных полипептидов, тем самым уменьшая количество нейротрофических факторов белковой и полипептидной природы [Хабриева. У., 2005]. Пептидный препарат, полученный таким способом, содержит денатурированные продукты кислотного гидролиза белков и полипептидов с нарушенной четвертичной и третичной структурой, что снижает его специфичность и биологическую активность, повышает его иммуногенность, вызывая аллергические реакции при применении.
Для решения данной проблемы нами предложено получать белково-пептидную композицию с выраженными ноотропными свойствами из нейрональных и глиальных клеток, полученных путем направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) человека. Видовая специфичность используемых клеточных культур позволит избежать иммунологических конфликтов, развитие которых возможно при использовании пептидных композиций ксеногенного происхождения, полученных из тканей мозга свиней, овец и других животных. Кроме того, использование клеточных культур человека позволит получить белково-пептидную композицию содержащую белки и пептиды с молекулярной массой до 100 кДа, в которую будут включены не только небольшие пептиды, но и полноразмерные белковые нейрональные ростовые и дифференцировочные факторы. Эффективность действия таких факторов заведомо выше, чем у коротких пептидов, а иммуногенность отсутствует. Использование ИПСК в качестве источника получения белково-пептидной композиции позволяет решить проблему дефицита донорского материала и этические вопросы, возникающие при применении для аналогичных целей эмбрионального материала и культур эмбриональных стволовых клеток человека.
Таким образом, нами к рассмотрению предложен способ получения белково-пептидной композиции с ноотропными свойствами, включающий: забор биоптата кожи, получение культуры фибробластов, криоконсервацию культуры фибробластов, размораживание культуры фибробластов, адаптирование культуры фибробластов к xeno free условиям, репрограммирование фибробластов для получения индуцированных плюрипатентных стволовых клеток (ИПСК), культивирование ИПСК, криоконсервацию ИПСК, размораживание ИПСК, нейрональную дифференцировку ИПСК, получение белково-пептидного комплекса, где для проведения нейрональной дифференцировки ИПСК культивируют на чашках Петри в среде Е8 до 80-90% монослоя, при этом на первом этапе дифференцировки используют нейрональную среду №1 (Н-1) состоящую из DMEM/F12, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, 1% добавки N2, Noggin 20-80 нг/мл, SB431542 5-12 мкМ, дорсоморфин 2-6 мкМ (или LDN193189 0,1-3 мкМ), на втором этапе дифференцировки используют нейрональную среду №2 (Н-2) состоящую из Neurobasal, 2% В27, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, FGF2 5-20 нг/мл, Purmorphamine 1-10 мкМ, на третьем этапе дифференцировки используют нейрональную среду №3 (Н-3) состоящую из Neurobasal, 2% В27, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, смеси незаменимых аминокислот 1%, аскорбиновой кислоты 200 мкМ, BDNF 10-20 нг/мл, а для получения белково-пептидного комплекса культуру нейронов и глиальных клеток, полученных методом нейрональной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, поэтапно гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,3 и не выше 8,3 с последующим центрифугированием; полученный супернатант фильтруют; фильтрат подвергают ионообменной хроматографии с сепарацией связавшихся белков, сбор целевых фракций подвижной фазой начинают при значении ионной силы 0,175 ммоль/л, увеличивая ее постепенно или ступенчато с шагом 0,035 ммоль/л до значения ионной силы 0,22 ммоль/л, полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
Получение ИПСК является простой и отработанной задачей, несмотря на то, что экспериментальные исследования проводятся только последние 10 лет. Характеристика и стандартизация культур ИПСК стала возможной благодаря открытию ряда транскрипционных факторов, которые являются уникальными для плюрипотентного состояния. К ним относятся, как минимум, 4 гена - Oct-4, Sox2, с-Мус и Klf4, которые способны трансформировать фибробласты в плюрипотентное состояние.
Помимо этого, известен следующий набор транскрипционных факторов: Oct4, Sox2, Nanog и Lin28 [Yu J. et al., 2007]. Исследования данных факторов дали возможность получения ИПСК, как от различных млекопитающих [Li W. et al., 2009, Liu H. et al., 2008, Kwon D.-J. et al., 2013]; так и из различных типов клеток [Aasen Т. et al., 2008, Aoi 2008, Lagarkova M.A. et al., 2010], и что самое важное для настоящей задачи - нейрональных клеток [Eminli S. et al. 2008], что говорит об универсальных механизмах репрограммирования соматических клеток до плюрипотентного состояния.
Для характеристики нейрональной дифференцировки известны такие маркеры, как nestin совместно с Sox2, ядерный белок нервных клеток NeuN, β-тубулин III, ассоциированный с микротрубочками белок МАР2, белки нейрофиламентов, нейрон- специфическая енолаза, синаптофизин и связанная с полисиаловой кислотой молекула адгезии нервных клеток (PSA-NCAM), кислый глиальный фибриллярный белок GFAP, белок S-100 и др.
Способ осуществляется следующим образом.
Пример 1.
Забор биоптата кожи (размером от 0,5 до 1 см2) производят из любого доступного участка (наиболее удобно из-за ушной раковиной или с внутренней стороны предплечья). После асептической обработки и анестезии 0,5% раствором новокаина участок кожи отсекают с помощью микрохирургического лезвия. Биоптат помещают в стерильный флакон, содержащий транспортную среду (F12 с амикацином, 0,5 г/л). Флакон с содержимым запечатывают и маркируют следующими данными: ФИО донора, дата и время забора. Транспортировку производят при температуре 2-6°С.
Полученный материал стерильно переносят в культуральную посуду и тщательно промывают раствором Хенкса с цефазолином (1 г/л). Материал трижды промывают раствором Версена и дезагрегируют путем инкубации в растворе Версена с добавлением 0,25% трипсина. В течение 1-1,5 часов при 37°С. После инкубации тканевую взвесь интенсивно перемешивают и центрифугируют в течение 10 минут при 1100 об/мин. Осадок разводят культуральной средой (DMEM/F12 1:1 с добавлением аутогенной сыворотки до 10%, амикацина до 500 мг/л), перемешивают и переносят в культуральную посуду. Культуральные флаконы помещают в CO2-инкубатор (37°С, 5% CO2).
Через 2-3 дня удаляют среду с неприкрепившимися клетками. Замену культуральной среды на свежую осуществляют каждые 3-4 дня. После образования субконфлуентного монослоя клетки дезагрегируют раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина и переносят в новую культуральную посуду. Коэффициент рассева составляет от 3 до 10 выбирают в зависимости от индивидуальных пролиферативных характеристик фибробластов. Культивируют не более пяти пассажей. На пятом пассаже проводят контроль стабильности кариотипа и способность фибробластов синтезировать коллаген I типа (с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания).
В результате были получены фибробласты в количестве 150 млн. клеток. Клеточная культура характеризовалась интенсивной пролиферацией, экспрессией тканеспецифических белков внеклеточного матрикса (гликозаминогликанов, хондроэтинсульфатов, фибронектина, коллагенов I, III типа). С помощью иммуноцитохимии охарактеризован фенотип полученных культур, относительное количество названных клеток в культуре составляет не менее 95%.
При необходимости длительного хранения полученные фибробласты подвергают криоконсервации. Перед замораживанием клетки рассевают из расчета получения субконфлуентного монослоя через 1-2 дня.
В боксе на ледяной бане (при 4°С) готовят криозащитный раствор, состоящий из 10% ДМСО (высокоочищенного диметилсульфоксида) и 90% аутогенной сыворотки.
Клеточную культуру дезагрегируют раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина, подсчитывают количество клеток с помощью счетчика и осаждают клетки центрифугированием (1100 об/мин, 10 мин). К осадку добавляют свежеприготовленный криозащитный раствор из расчета 1 мл на 5 млн клеток, перемешивают и помещают полученную суспензию в криопробирки. Маркируют, указывая ФИО донора, номер пассажа, количество клеток, дату криозамораживания, данные ответственного исполнителя.
Образцы замораживают до - 80°C с помощью программного замораживателя, а затем помещают в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранят при - 196°С.
Криопробирки с клеточным материалом извлекают из сосуда Дьюара и быстро размораживают при температуре 37°С на водяной бане.
Клеточную суспензию из криопробирки по каплям переносят в центрифужную пробирку, доливают полной культуральной средой до десятикратного объема и центрифугируют при 1100 об/мин в течение 10 мин.
Отмытые от криоконсерванта клетки переносят в культуральную посуду с полной ростовой средой.
Перед процедурой репрограммирования культуру фибробластов переводят на среду, не содержащую компонентов животного происхождения. Для этого клетки 2-3 пассажа промывают PBS, затем открепляют раствором трипсина-версена в течение 3-5 минут. Открепленные клетки переносят в 15 мл пробирки, добавляют среду DMEM с содержанием 10% эмбриональной телячьей сыворотки для инактивации работы фермента и центрифугируют 5 минут при 1100 об/мин. Далее супернатант отбирают и сажают клетки на культуральный пластик в количестве 1500-2000 клеток/см2 в среду DMEM, содержащую эмбриональную телячью сыворотку 10%, L-глутамин 2 тМ, пенициллин-стрептомицин 100 мг/л. Через 24 часа клетки промывают PBS и заливают среду без добавления компонентов животного происхождения (на 1 литр готовой среды: DMEM/F12, HEPES 872 мл; натрия бикарбонат 7.5% 6,4 мл, заменитель эмбриональной телячьей сыворотки 100 мл, основной фактор роста фибробластов человека bFGF (10 μg/mL) 1,2 мл, эпидермальный фактор роста человека EGF (1 mg/mL) 1 мл, гидрокортизон (50 μМ) 20 мл). Клетки культивируют в данной среде один-два пассажа.
Для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) проводят репрограммирование фибробластов путем трансдукции с помощью вектора Sendai (CytoTune®-iPS Reprogramming Kits (Cat. № A13780-01, A13780-02)).
Фибробласты культивируют на 6 луночном планшете в течение 2 суток так, чтобы получить плотность клеток 200-300 тыс. клеток на лунку. Перед проведением трансдукции снимают клетки с одной лунки и подсчитывают их число. Производят расчет объема вирусной суспензии по формуле:
Трансдукцию производят со значениями MOI 5,5 и 3 (так как KOS MOI=5, he-Мус MOI=5, hKlf4 MOI=3). Титр вектора зависит от номера партии реактива и должен быть определен на сайте производителя.
Для размораживания вирусной суспензии CytoTune®2.0 Sendai, которая хранится при -80°С, каждую пробирку, погружают на 5-10 сек в воду при 37°С, а затем инкубируют при комнатной температуре до полного оттаивания. Суспензию центрифугируют, пробирку помещают в лед и добавляют необходимое количество CytoTune®2.0 Sendai в 1 мл среды для фибробластов, предварительно прогретой до 37°С. Аккуратно размешивают суспензию. Через 5 мин удаляют среду из лунок, в которых находятся фибробласты, и добавляют приготовленную вирусную суспензию. Инкубируют клетки ночь при стандартных культуральных условиях. Через 24 часа после трансдукции, производят замену среды на свежую. После трансдукции контролируют цитотоксичность вируса в течение 48 часов. Допускается гибель клеток не более 50%.
Клетки культивируют в течение 6 суток, меняя среду каждый день. На 7 сутки трансдуцированные клетки пересаживают на чашки Петри, предварительно покрытые витронектином.
Перед культивированием клеток на дне культуральной посуды формируют подложку из витронектина. Витронектин размораживают при комнатной температуре и разводят из расчета 40 мкл витронектина на 1 мл DPBS. Наносят 1 мл приготовленного раствора на чашку Петри диаметром 35 мм и инкубируют 1 час при комнатной температуре. Перед нанесением клеточной суспензии витронектин удаляют.
Для пересева на новые чашки Петри клетки промывают DPBS и дезагрегируют раствором Версена с добавлением 0,25% трипсина при комнатной температуре. Добавляют 2 мл культуральной среды в каждую лунку, перемешивают, переносят клеточную суспензию в пробирку и центрифугируют в режиме 200×g в течение 4 минут. Осадок ресуспензируют в культуральной среде, подсчитывают число клеток и рассаживают клетки на чашки Петри диаметорм 10 см из расчета от 100 до 500 тыс. клеток на чашку. Культивируют при стандартных культуральных условиях. Через сутки заменяют среду на Essential 8™ (Е8), которую далее меняют на свежую ежедневно. При визуальном осмотре под микроскопом выявляют репрограммированные клетки.
Через 3-4 недели после трансдукции клетки формируют крупные колонии. Выявление колоний репрограммированных клеток путем прижизненной окраски Tral-60 или Tral-81. Колонии iPS-клеток вручную отбирают и переносят на чашки Петри, покрытые витронектином для дальнейших исследований.
При культивировании ИПСК ведется визуальный контроль за морфологическими характеристиками культур. ИПСК растут плотными колониями с ровными краями. Клетки мелкие, с крупными ядрышками. Культивирование осуществляют в чашках Петри диаметром 35 мм, используя культуральную среду Essential 8™ (Е8).
Клетки рассаживают по достижении плотности 50-70% монослоя. Из чашек удаляют культуральную среду и промывают 2 мл DPBS. Для дезагрегации добавляют 1 мл 0,5 мМ раствора EDTA на DPBS и инкубируют 5-8 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор EDTA, добавляют 2 мл предварительно подогретой среды, взбалтывают и переносят клеточную суспензию на чашки, предварительно покрытые витронектином, и добавляют среды до 2 мл. Замену среды на свежую проводят каждый день.
Стандартизацию ИПСК проводят по экспрессии генов, специфичных для эмбриональных стволовых клеток ОСТ4, SOX2, NANOG, FOXD3, HESX1, SALL4 методом ПЦР с обратной транскрипцией.
ИПСК подвергают криоконсервации. Готовят на льду криозащитный раствор из расчета на 1 чашку: 900 мкл среды Е8, 100 мкл DMSO и 1 мкл ингибитора Rho-киназы (сток 5 мМ). Из каждой чашки удаляют среду и промывают 2 мл DPBS. Добавляют 1 мл 0,5 мМ раствора EDTA и инкубируют 10 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор EDTA и добавляют 1 мл криозащитного раствора. Клетки снимают с поверхности чашки, перемешивают и переносят в криопробирку объемом 1,8 мл (1 мл на 1 пробирку). Образцы замораживают до - 80°C с помощью программного замораживателя, а затем помещают в сосуды Дьюара с жидким азотом и хранят при - 196°С.
Криопробирки с клеточным материалом извлекают из сосуда Дьюара и размораживают при температуре 37°С на водяной бане.
Клеточную суспензию из криопробирки (1 мл) по каплям переносят в центрифужную пробирку, доливают 9 мл теплой культуральной среды DMEM/F12 до десятикратного объема и центрифугируют при 800 об/мин в течение 5 мин.
Отмытые от криоконсерванта клетки переносят на чашки Петри, предварительно покрытые витронектином, с культуральной средой Е8, содержащей ингибитор Rho-киназы. При переносе сохряняют целостность колоний. Адаптация клеток после криоконсервации продолжается от 1 до 3 недель.
Для проведения нейрональной дифференцировки ИПСК культивируют на чашках Петри диаметром 35 мм, покрытых человеческим рекомбинантным ламинином в среде Е8 до 80-90% монослоя. Среду меняют каждый день, наливая по 2 мл на чашку.
На первом этапе дифференцировки используют нейрональную среду №1 (Н-1) состоящую из DMEM/F12, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, 1% добавки N2, Noggin 20-80 нг/мл, SB431542 5-12 мкМ, дорсоморфин 2-6 мкМ (или LDN193189 0,1-3 мкМ). В первый день производят смену среды на смесь среды Е8 и Н-1 в соотношении 1:4, через день производят полную смену среда на Н-1. Клетки культивируют в течение 14-20 суток до формирования характерных скоплений звездчатой формы, что соответствует стадии формирования нервной трубки в эмбриогенезе. Скопления выявляют визуально при помощи микроскопа. Клетки дезагрегируют, добавляя 1 мл раствора Версена и инкубируют 3-5 мин при комнатной температуре. Затем удаляют раствор Версена, клетки снимают с подложки суспендированием и переносят в пробирку. Клетки центрифугируют 10 минут при 800-1100 об/мин., затем осадок переносят на новые чашки Петри в соотношении 1:3, предварительно покрытые человеческим рекомбинантным ламинином, и культивируют в среде для нейрональных предшественников (Н-2), состоящую из Neurobasal, 2% В27, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, FGF2 5-20 нг/мл, Purmorphamine 1-10 мкМ. Среду меняют через сутки до достижения плотного монослоя, после чего снова производят пересев в соотношении 1:3.
До полной зрелости нейрональные предшественники необходимо культивировать в среде для созревания №3 (Н-3), состоящую из Neurobasal, 2% В27, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, смеси незаменимых аминокислот 1%, аскорбиновой кислоты 200 мкМ, BDNF 10-20 нг/мл. На этом этапе происходит созревание нейрональных предшественников и глии. Морфологически большинство клеток имеют отростчатую форму.
Стандартизацию нейральных клеток проводили по экспрессии генов DARPP-32, РАХ6, FOXP2, NCAM1, EN02, Nestin, TUBB3, НТТ, GFAP, S-100 и синаптического транспортера ГАМК GAT1.
Активную композицию белков и пептидов получают путем ионообменной хроматографии фильтрата надосадочной фракции отцентрифугированного гомогената кульутры нейронов и глиальных клеток, в присутствии буферного раствора, детергентов и солюбилизантов. Условия ионообменной хромотаграфии подобраны таким образом, что катионные (внутриядерные белки) не сорбируются на сорбенте.
Культуру нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека поэтапно:
- гомогенизируют в буферном растворе, с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,3 и не выше 8,3 с последующим центрифугированием при значении g в интервале 10000-28000 в течение 90-30 мин;
- полученный супернатант фильтруют;
- фильтрат подвергают ионообменной хроматографии с сепарацией связавшихся белков с использованием элюента с ионной силой в интервале от 0,14 до 0,21 ммоль/л при рН в интервале от 5,3 до 8,3. Сбор целевых фракций подвижной фазой начинают при значении ионной силы 0,175 ммоль/л, увеличивая ее постепенно или ступенчато с шагом 0,035 ммоль/л до значения ионной силы 0,22 ммоль/л, полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
Полученная композиция включает в себя белки и пептиды молекулярной массой в пределах от 0,5 до 200 кДа, средняя молекулярная фракция находится в пределах от 20 до 180 кДа не менее 70%.
Пример 2. Характеристика ИПСК.
В процессе репрограммирования до плюрипотентного состояния происходят значительные изменения в паттерне экспрессии генов. Анализ экспрессии некоторых маркерных генов в клонах ИПСК проводят двумя различными методами: окрашивание антителами и ПЦР с обратной транскрипцией. Показано, что полученные клоны ИПСК специфично окрашиваются на маркеры ПСК ОСТ4 и SSEA-4. ОСТ4 и SSEA-4 является общепринятыми маркерами ПСК (Рисунок 1А, 1Б). Методом ПЦР с обратной транскрипцией была показана экспрессия генов, специфичных для ПСК ОСТ4, SOX2, NANOG, FOXD3, HESX1, SALL4, на таком же уровне, что и в ЭСК человека. Для нормировки количества кДНК использовали уровень экспрессии гена домашнего хозяйства GAPDH, в качестве положительного и отрицательного контролей использовали кДНК из ЭСК и фибробластов кожи человека.
Тест на формирование жизнеспособных химер используют для выявления способности к дифференцировке во все типы клеток организма, доказательства плюрипотентности ИПСК мыши. В случае клеток человека доступны менее строгие тесты, такие как in vitro дифференцировка в клетки трех зародышевых листков, способность к образованию эмбриоидных телец, а в случае in vivo формирование тератома-подобных новообразований при введении ПСК иммунодефицитным мышам. Эмбриоидное тельце представляет начальный этап спонтанной дифференцировки и позволяет определить в своем составе клетки, принадлежащие разным зародышевым листкам. В результате такой спонтанной дифференцировки образовались клетки различной принадлежности. Через две недели после начала культивирования в адгезионной форме клетки фиксируют и проводят окрашивание клеточных культур с использованием антител к белкам-маркерам трех зародышевых листков. В культуре спонтанно дифференцировавшихся клеток находят клетки, положительно окрашивающиеся на маркер эктодермы пан-цитокератин (Cytokeratin), мезодермы CD105 и энтодермы α-фетопротеин (AFP) (рис. 2А). Также для части клонов был выполнен тест на формирование тератом. ИПСК инъецировали подкожно в заднюю лапу иммунодифицитных мышей, после чего, через 10-12 недель формировались тератомы, в которых находили ткани, принадлежащие к трем зародышевым листкам (рис. 2Б). Таким образом, полученные ИПСК способны дифференцироваться в клетки всех трех зародышевых листков и являются плюрипотентными.
Анализ экспрессии маркерных генов в нейронально преддифиренцированных плюрипотентных стволовых клеток
Проведен анализ и выявлены нейроны, экспрессирующие белок DARPP-32, известный специфический маркер серединных шипиковых нейронов стриатума. На этапе наращивания, клетки латерального ганглионарного бугорка, демонстрировали экспрессию маркерных генов SOX2, РАХ6, FOXP2, NCAM1, ENO2, Nestin (рис. 3Б). Анализ показал, что до 95% полученных клеток экспрессировали нейрональный маркер TUBB3, до 80% клеток, экспрессирующих TUBB3, также экспрессировали DARPP-32 (рис. 3В). Дифференцированные нейроны также продемонстрировали экспрессию НТТ и синаптического транспортера ГАМК GAT1 (рис. 3В).
Пример 3.
Дополнительно композицию характеризовали по количеству в 1 мл общего белка и таких факторов, как мозговой нейротрофический фактор (Brain-Derived Neurotrophic Factor, BDNF) и глиальный нейротрофический фактор (GDNF). Для этого использовали твердофазный иммуноферментный анализ. 1 мл суспензии центрифугировали, полученные в результате центрифугирования супернатанты апплицировали в лунки планшета с предварительно адсорбированными первичными антителами к BDNF и GDNF, далее анализ проводили согласно инструкции производителя. Содержание факторов выражали в пг/мл композиции. Всего было исследовано 10 образцов композиции, получены результаты по содержанию BDNF не менее 50 пг/мл и GDNF не менее 40 пг/мл.
Общий белок в 1 мл суспензии определяли методом Бредфорда. Суммарная масса белка в составе композиции составляет не менее 20 мг/мл препарата.
Пример 4.
Оценка эффективности использования композиции на модели перманентной окклюзии правой средней мозговой артерии у крыс
На экспериментальной модели перманентной окклюзии правой средней мозговой артерии у крыс была продемонстирована эффективность системного введения Препарата в отношении объема развивающегося инфаркта в бассейне средней мозговой артерии. В эксперименте были сформированы две группы: введение препарата (n=12) и введение физиологического раствора (n=12) в объеме 1 мл.
Введение Препарата осуществляли внутрибрюшинно однократно через 60 минут после наступления окклюзии. Факт окклюзии кровеносных сосудов подтверждали с помощью лазерной допплероской флоуметрии.
Проводили сравнение выживаемости (кривые Каплан-Мейера) через 14 суток между группой крыс с моделью инсульта и группой крыс с моделью инсульта и введением Препарата, при этом выживаемость составила 50 и 91, 6% соответственно.
Все крысы тестировались по шкале mNSS на 1, 8 и 15 сутки после инсульта. Нормирование баллов каждого животного производилась к 1 суткам (до введения Препарата и физиологического раствора). Отмечается достоверная разница нормированных баллов по шкале mNSS между группами на 8 (р=0,005) и 16 (р=0,005) сутки (U-критерий Манна - Уитни). Медиана нормированных баллов по шкале mNSS составила 95 и 49% на 8 день для группы с введением физиологического раствора и Препарата соответственно и 78 и 23% на 15 день.
Через 15 суток после наступления окклюзии животных выводили из эксперимента и исследовали серийные срезы всего головного мозга толщиной 2 мм, окрашенные 2,3,5-трифенилтетразолий хлоридом (ТТХ). Данный краситель окрашивает неишемизированые участки в розовый цвет, а ишемизированные, где наблюдается гибель клеток, остаются неокрашенными. Окрашенные срезы сканируют с двух сторон и высчитывают объем инфаркта ишемизированного полушария. Объемная доля инфаркта при введении физиологического раствора составила 25,4±5,6%, а после введения Препарата 19,8±3,9%.
Таким образом, введение композиции экспериментальным животным с острой перманентной окклюзией средней мозговой артерии приводит к достоверному увеличению выживаемости и уменьшению неврологических дефицитов у экспериментальных животных.
Claims (1)
- Способ получения ноотропной белково-пептидной композиции, включающий: забор биоптата кожи, получение культуры фибробластов, криоконсервацию культуры фибробластов, размораживание культуры фибробластов, адаптирование культуры фибробластов к xeno free условиям культивирования, репрограммирование фибробластов для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), культивирование ИПСК, криоконсервацию ИПСК, размораживание ИПСК, нейрональную дифференцировку ИПСК, получение белково-пептидного комплекса, где для проведения нейрональной дифференцировки ИПСК культивируют на чашках Петри, покрытых витронектином в среде Е8 до 70% монослоя, при этом на первом этапе дифференцировки используют нейрональную среду №1 (Н-1), состоящую из DMEM/F12, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, 1% добавки N2, Noggin 20-80 нг/мл, SB431542 5-12 мкМ, дорсоморфина 2-6 мкМ (или LDN193189 0,1-3 мкМ), на втором этапе дифференцировки используют нейрональную среду №2 (Н-2), состоящую из Neurobasal, 2% В27, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, FGF2 5-20 нг/мл, Purmorphamine 1-10 мкМ, на третьем этапе дифференцировки используют нейрональную среду №3 (Н-3), состоящую из Neurobasal, 2% В27, пенициллин-стрептомицина 50 ед/мл, L-глутамина 1 мМ, смеси незаменимых аминокислот 1%, аскорбиновой кислоты 200 мкМ, BDNF 10-20 нг/мл, а для получения белково-пептидного комплекса культуру нейронов и глиальных клеток, полученных методом нейрональной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека, поэтапно гомогенизируют в буферном растворе с одновременной экстракцией в присутствии обратимых ингибиторов протеолиза и неионных детергентов при рН не менее 5,3 и не выше 8,3 с последующим центрифугированием; полученный супернатант фильтруют; фильтрат подвергают ионообменной хроматографии с сепарацией связавшихся белков, сбор целевых фракций подвижной фазой начинают при значении ионной силы 0,175 ммоль/л, увеличивая ее постепенно или ступенчато с шагом 0,035 ммоль/л до значения ионной силы 0,22 ммоль/л, полученные фракции объединяют и подвергают стерилизующей фильтрации.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118201A RU2690498C1 (ru) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2018118201A RU2690498C1 (ru) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2690498C1 true RU2690498C1 (ru) | 2019-06-04 |
Family
ID=67037769
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2018118201A RU2690498C1 (ru) | 2018-05-17 | 2018-05-17 | Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2690498C1 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732600C1 (ru) * | 2019-12-26 | 2020-09-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, и способ ее получения |
| RU2752906C2 (ru) * | 2019-12-26 | 2021-08-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ ее получения |
| RU2803498C1 (ru) * | 2022-04-12 | 2023-09-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук | Способ получения средства, обладающего ноотропной активностью |
| CN117126801A (zh) * | 2023-08-30 | 2023-11-28 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法、产品及应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2001088104A2 (en) * | 2000-05-17 | 2001-11-22 | Geron Corporation | Neural progenitor cell populations |
| US6455277B1 (en) * | 1996-04-22 | 2002-09-24 | Amgen Inc. | Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides |
| RU2345133C2 (ru) * | 2003-03-12 | 2009-01-27 | Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт. Лтд. | Получение терминально дифференцированных дофаминергических нейронов из эмбриональных стволовых клеток человека |
| RU2380410C2 (ru) * | 2003-09-03 | 2010-01-27 | Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт. Лтд. | ПОЛУЧЕНИЕ ГАМКергических НЕЙРОНОВ in vitro ИЗ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ |
| RU2445106C1 (ru) * | 2010-07-01 | 2012-03-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза |
-
2018
- 2018-05-17 RU RU2018118201A patent/RU2690498C1/ru active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6455277B1 (en) * | 1996-04-22 | 2002-09-24 | Amgen Inc. | Polynucleotides encoding human glial cell line-derived neurotrophic factor receptor polypeptides |
| WO2001088104A2 (en) * | 2000-05-17 | 2001-11-22 | Geron Corporation | Neural progenitor cell populations |
| RU2345133C2 (ru) * | 2003-03-12 | 2009-01-27 | Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт. Лтд. | Получение терминально дифференцированных дофаминергических нейронов из эмбриональных стволовых клеток человека |
| RU2380410C2 (ru) * | 2003-09-03 | 2010-01-27 | Релайанс Лайф Сайенсиз Пвт. Лтд. | ПОЛУЧЕНИЕ ГАМКергических НЕЙРОНОВ in vitro ИЗ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ ПРИ ЛЕЧЕНИИ НЕВРОЛОГИЧЕСКИХ РАССТРОЙСТВ |
| RU2445106C1 (ru) * | 2010-07-01 | 2012-03-20 | Закрытое Акционерное Общество "Фарм-Синтез" | Фармацевтическая композиция, предназначенная для лечения заболеваний центральной и периферической нервной системы сосудистого, травматического, токсического, гипоксического и аутоиммунного генеза |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2732600C1 (ru) * | 2019-12-26 | 2020-09-21 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, и способ ее получения |
| RU2752906C2 (ru) * | 2019-12-26 | 2021-08-11 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова" | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ ее получения |
| RU2803498C1 (ru) * | 2022-04-12 | 2023-09-14 | Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук | Способ получения средства, обладающего ноотропной активностью |
| CN117126801A (zh) * | 2023-08-30 | 2023-11-28 | 呈诺再生医学科技(北京)有限公司 | 一种高再生传代的纤维软骨细胞制备方法、产品及应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2021225187B2 (en) | Methods for differentiating pluripotent cells | |
| US20210102177A1 (en) | Derivation of human skin organoids from pluripotent stem cells | |
| US9249390B2 (en) | Method for producing polarized retinal progenitor cells from pluripotent stem cells and their differentiation into retinal pigment epithelium cells | |
| KR102210180B1 (ko) | 모양체 주연부형 구조체의 제조 방법 | |
| RU2690498C1 (ru) | Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека | |
| JP2010537626A (ja) | フィーダ細胞を含まない培地および培養系 | |
| RU2690846C1 (ru) | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека | |
| JP7260475B2 (ja) | 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るフィーダーフリーの方法 | |
| CN111386338B (zh) | 包含神经系统细胞或神经组织和非神经上皮组织的细胞团块的制备方法及该细胞团块 | |
| JP2024059771A (ja) | 細胞のリプログラミング方法 | |
| US20210315938A1 (en) | Methods and Compositions for Retinal Neuron Generation in Carrier-Free 3D Sphere Suspension Culture | |
| US20070020608A1 (en) | Method for the generation of neural progenitor cells | |
| Kandasamy et al. | Glycoconjugates reveal diversity of human neural stem cells (hNSCs) derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) | |
| RU2732600C1 (ru) | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, и способ ее получения | |
| RU2646446C1 (ru) | Способ оценки нейропротекторных свойств веществ in vitro и тест-система для его осуществления | |
| Kamiya et al. | Induction of Functional Mesenchymal Stem/Stromal Cells from Human iPCs Via a Neural Crest Cell Lineage Under Xeno-Free Conditions | |
| RU2732599C1 (ru) | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из глиальных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ её получения | |
| RU2752906C2 (ru) | Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ ее получения | |
| Kishigami et al. | Histological analysis of epithelial stem cells during induced pluripotent stem cell-derived teratoma development | |
| KR20240144127A (ko) | 다능성 줄기세포로부터 표피각질형성세포로의 분화 유도 방법 | |
| Santos | Culture Platform for Induction of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Cortical Neural Stem and Progenitor Cells under Chemically Defined Conditions | |
| Baltazar | Monolayer differentiation of human induced Pluripotent Stem Cells (hiPSC) into cardiomyocytes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC41 | Official registration of the transfer of exclusive right |
Effective date: 20201209 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner |