JP7260475B2 - 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るフィーダーフリーの方法 - Google Patents
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Description
(i)ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、上記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
(ii)色素細胞及び/又は神経上皮様構造が出現するまで、この培養物を、上記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
を含む、方法である。
(i)ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、上記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
(ii)色素細胞が出現するまで、この培養物を、上記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
(iiiRPE)工程(ii)で得られた培養物から、少なくとも1つの色素細胞を収集する工程と、
(ivRPE)工程(iiiRPE)で得られた該色素細胞を培養する工程と、
を含む、方法に関する。
(i)ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、上記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
(ii)神経上皮様構造が出現するまで、この培養物を、上記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
(iiiNR)工程(ii)で得られた培養物から、少なくとも1つの神経上皮様構造由来の細胞を収集する工程と、
(ivNR)工程(iiiNR)で得られた該細胞を培養する工程と、
を含む、方法である。
移植/細胞療法:非限定的な例として、すでに失われた視力を回復するのを助長する失われた細胞の置換療法における、RPE細胞及び/又は網膜前駆体細胞又はそれらから分化した細胞の使用が挙げられる。
RGC、桿体、錐体及びRPE細胞を含む全ての細胞の機能を保護又は増強することが可能な作用物質を同定するための薬物スクリーニング。「作用物質」とは、本明細書中では、任意の種類の分子又は組成物を意味するが、任意の電磁放射線又は粒子線(UV、可視光、電離放射線等)等の非化学的物質も意味する。
幹細胞又はそれらの誘導体を使用して、病態生理学を研究するのに、また薬物スクリーニング又は特注療法にも使用することができる多能性細胞、特にhiPS細胞からヒト網膜疾患モデルを産生すること。
網膜発達、組織形成、及びシナプス形成を含むが限定されない様々なプロセスを研究するのに有用な資源であるヒト神経発達の特有のモデル。
1.1 実験手順
ヒト線維芽細胞及びiPS細胞培養
マイトマイシン不活性化マウス胚線維芽細胞に関して予め培養した樹立hiPSC-2クローン[19]を、フィーダーフリーの条件に適応させた。hiPSC-2クローン細胞由来のiPSコロニーを、酵素非含有のGentle細胞解離試薬(STEMCELL Technologies)2ml中で、室温にて7分~10分インキュベートした。解離溶液を吸引した後、フィーダー細胞を剥離させずに、iPSコロニーの中心を上下にピペッティングすることによって、予め加温した既知組成Essential 8(商標)培地(Thermo Fischer Scientific)2ml中に、剥離した細胞凝集体を再懸濁した。ヒトiPSCを、Essential 8(商標)培地の入った切断型組換えヒトビトロネクチン(rhVTN-N)でコーティングした皿上に移した。標準的な5%CO2/95%エアーインキュベーター中で、毎日培地を交換しながら、細胞を37℃にて日常的に培養した。iPS細胞を、週に1回、酵素非含有のGentle細胞解離試薬を用いて(2ml、室温にて7分間)継代培養した。剥離した細胞凝集体をEssential 8(商標)培地中に収集して、慎重に上下にピペッティングして、コンフルエンスに応じて、1/10~1/60の比で再度蒔く細胞凝集体の一様な懸濁液を得た。フィーダーフリーの適応させたhiPSCを、継代数3~5後に網膜分化させた。hiPSC-2クローンを、継代数16(p16)で適応させて、p20~p40で特性化及び分化に使用した。
網膜細胞分化は、幾つかの変更を伴って、これまでに確立されたプロトコル[28]に基づいた。ヒトiPSCを、rhVTN-N(Thermo Fischer Scientific)でコーティングした直径6cmの皿において、Essential 8(商標)培地中で70%~80%コンフルエンスに増殖させた。0日目(D0)として定義されるこの時点で、hiPSCを、既知組成Essential 6(商標)培地(Thermo Fischer Scientific)中で培養した。2日後、培地を、Essential 6(商標)培地、1%CTS(商標)(Cell Therapy Systems)N2サプリメント(Thermo Fischer Scientific)、10ユニット/mlのペニシリン及び10mg/mlのストレプトマイシン(Thermo Fischer Scientific)で構成されるE6N2培地に切り替えた。培地を2日~3日毎に交換した。D28で、同定された自己形成網膜オルガノイドを、針を使用して、周囲細胞とともに単離して、10ng/mlの動物由来成分非含有の(animal-free)組換えヒトFGF2(Peprotech)を補充したProB27培地中で、浮遊構造として6ウェルプレート(ウェル1つ当たり8個~12個のオルガノイド)において培養して、培地の半分を2日~3日毎に交換した。ProB27培地は、既知組成DMEM:Nutrient Mixture F-12(DMEM/F12、1:1、L-グルタミン)、1%MEM非必須アミノ酸、2%CTS(商標)B27サプリメント(Thermo Fischer Scientific)、10ユニット/mlのペニシリン及び10mg/mlのストレプトマイシンで構成される。D35で、FGF2を除去して、「ProB27培地」の半分を、次の数週間、2日~3日毎に交換した。
D84の3個~5個の網膜オルガノイドを、冷Cryostem冷凍培地(Clinisciences)250μl中に懸濁して、イソプロパノールベースのMr Frosty冷凍容器(Thermo Fischer Scientific)に入れた1.5ml容の低温チューブ(Nunc)中で、-80℃にて最低4時間冷凍した。冷凍したチューブを、-150℃の冷凍庫中で長期間保管した。冷凍容器を用いた場合と同じ方法を使用して、hiRPE細胞を、継代数1で、Cryostem冷凍培地中で(1.5×106個の細胞/250μl)冷凍して、-150℃で長期保管した。冷凍した網膜構造又はhiRPEp1細胞を、水浴中で、37℃にて迅速に解凍して、下流の研究用に予め加温した専用培地中に再懸濁させた。
網膜オルガノイドをまず、回転振盪機上で、0.2%ゼラチン、0.5%Triton X-100及び0.01%チメロサール(Sigma-Aldrich)を含有するPBS 1Xの溶液(PBSGT)中でRTにて3時間インキュベートした。次に試料を、選択した一次抗体(データは示していない)を含有するPBSGTに移し、100rpmで回転しながら、37℃にて3日間置いた。この後、RTにてPBSGT中で30分間、6回洗浄した。次に、試料を、PBSGT中に1:600で希釈したCy3又はAlexa Fluor 594(Interchim)のいずれかとコンジュゲートさせた適切な二次抗体をともに一晩インキュベートした。PBSGT中でRTにて6回の30分洗浄後、溶媒で透明化した器官の3Dイメージング(3DISCO)透明化手順[29]まで、試料をPBS中4℃で保管した。
コンフルエントなhiPSCからのゼノフリー/フィーダーフリーの条件での自己形成性網膜オルガノイドの生成
エピソームアプローチ[19]によって予め生成された遺伝子挿入のないiPS細胞系統2(hiPSC-2)由来のヒトiPSCコロニーを、合成基質として切断型組換えヒトビトロネクチン(rhVTN-N)及び既知組成Essential 8(商標)培地を使用したXF/FF培養系に適応させた[21]。これらの新たな条件下で、qRT-PCRにより、hiPSC-2における多能性遺伝子の発現が、hESCで観察される発現と依然として同等であることが明らかとなった(データは示していない)。XF/FF条件で増殖させたhiPSC-2は、多能性マーカーOCT4及びSSEA4又はSOX2及びTRA1-60を発現し(データは示していない)、正常な核型を示した(データは示していない)。およそ70%コンフルエンスで、Essential 8(商標)培地中で培養したhiPSCコロニーを、Essential 6(商標)培地(FGF2及びTGFβを含まないEssential 8(商標)培地)中に2日間入れて、自己再生機構を遮断して、自発的分化を促進した。N2サプリメント単独は、フィーダー層上で培養したhiPSCを網膜の運命へと誘導するのに十分であり得ることが報告されている[19]ため、1%のCTS(商標)N2サプリメントを含有する種々の既知組成培地を試験した(図1A)。このXF/FF環境において、フィーダー層上のhiPSC[19]を用いて確証したProN2培地の使用は、残念にも細胞死を引き起こした(データは示していない)。それにも関わらず、1%のCTS(商標)N2サプリメントを含有するEssential 6(商標)培地に相当する新たな網膜分化培地(E6N2培地)を開発し、28日で接着hiPSCから神経上皮様構造の自己形成を可能にした(図1A)。このXF/FF条件において、分化中のiPSCは、14日(D14)以内に、神経分化に必須である重要なBMP及びWNTアンタゴニストである、それぞれDKK1及びノギンを内因的に発現し始めた(図1B)。分化の開始の約4週後に、自己形成性神経上皮様構造が、培養皿に出現した(図1C)。D28のこれらの単離構造のRT-qPCR分析(図1D)により、多能性マーカーPOU5F1(OCT4)の発現を損失するとともに、SIX3、MITF、VSX2、PAX6、RAX及びLHX2等の特異的なマーカーの頑強な発現を伴う眼野指定が明らかとなった(図1E)。D28の免疫染色は、これらの構造が、VSX2及びKi67を同時発現する有糸分裂網膜前駆体細胞(RPC)の集団を含むことを示した(図4A)。CRX、NRL、及びNEUROD1等の光受容体系譜に関与する転写因子の発現もまた、早ければD28で検出された(図1E)。網膜オルガノイドは、D28で周囲細胞と一緒に単離した後、浮遊構造として(図1D)、CTSTM B27サプリメントを含有する培地(ProB27培地)中でヒトFGF2とともに1週間培養して(図1A)、神経網膜の分化を支持した[30]。球状オルガノイドは、サイズが増大し、神経上皮の遠位部分は、およそD42で着色するようになった(図7B~図7D)。分化プロセスの再現性を確認するために、2つの他のhiPSC系統を、分化プロセスの再現性に付して、2つの他のhiPSC系統を、XF/FF分化プロセスに付した。本発明者らの結果により、類似した網膜オルガノイドが、エピソームアプローチによって初期化された包皮線維芽細胞に由来するhiPSC(図7E~図7F)又はセンダイウイルスを用いたXF/FF条件で初期化された成体皮膚線維芽細胞に由来するhiPSC(図7G~図7H)から差がなく得ることができることが実証された。D28でこれらの3つのhiPSC系統に関して1cm2当たりの発達した構造の数の評価により、効率の観点で幾つかの予測される細胞系統間の可変性が明らかとなった(図7I)。網膜指定及び分化に関与する転写因子は、D35後にRAX、SIX3及びVSX2発現の顕著な増加を伴って、ProB27培地における浮遊培養中に、網膜オルガノイドにおいて依然として発現されたのに対して、非網膜前脳マーカーFOXG1の発現は減少した(図1F)。D35で、網膜オルガノイドを形成する細胞は、RAX及びPAX6を同時発現し(図1H及び図1I)、それらの眼野のアイデンティティを確認した[31]。この時点では、VSX2+細胞は、発達中の神経上皮の外側部分に主に位置し(図1J~図1L)、同様にPAX6も発現した(図1J及び図1K)。MITF+細胞は、RPE細胞に相当するオルガノイドの遠位部分に主に見られた(図1L及び図1M)。D35で、PAX6+/VSX2-細胞集団は、第1の有糸分裂後の分化中の網膜ニューロンに相当する神経上皮の内側部分で濃縮され(図1J及び図1K)、Ki67増殖マーカーを発現しなかった(図1N及び図1O)。同じ位置の幾つかの細胞は、RGC、BRN3Aの特異的マーカーにとって免疫反応性であることがわかった(図4B)。それにも関わらず、D35で、網膜オルガノイドの外側部分は、VSX2及びKi67の同時発現によって同定される増殖性RPCを依然として含有していた(図1O)。興味深いことに、RT-qPCR分析により、光受容体前駆体の出現は、VSX2及びRAX発現の減少を伴って(図1F)、NRL、CRX及びNEUROD1発現のアップレギュレーションによってD42後に検出することができることが示された(図1G)。
オルガノイドRNA抽出物に関するRT-qPCR分析により、RPCは、浮遊培養全体にわたってCRX(図1G)、リカバリン(RCVRN)及び錐体アレスチン(CAR)発現(図2A)の増加を伴って、光受容体系譜に関係し得ることが示された。ロドプシン(RHO)、青又は赤/緑(R/G)オプシン(OPS)等の成熟光受容体に特異的な遺伝子の発現は、100日後のみに出現する(図2B)。CRX、OTX2、及びRCVRNにとって免疫反応性である未熟光受容体をD49で同定することができ(図2C及び図2D)、これらのマーカーのより強力な発現が、D84で観察された(図2E)。桿体及び錐体は、D281(およそ9ヵ月)まで長期間維持された培養におけるRHO又はR/G OPS、青OPS及びCAR免疫染色のいずれかによって明らかに同定することができる(図2G~図2N)。興味深いことに、40日~50日後に、外側核層に似ている外部細胞層が、幾つかのiPSC由来の網膜オルガノイドにおいて観察することができる(図2H、図2I)にもかかわらず、分化中の光受容体は、多くの場合、ロゼットの内側に見られた(図2C~図2G)。細胞表面マーカーCD73は、分化の種々の時点で分化中のRCVRN+光受容体において特異的に発現される(図2D、図2F)。光受容体によるCD73の発現は、RCVRN、CAR、青OPS及びR/G OPSとの同時発現によって、D140後に確認された(図2J)。逆に、CD73は、ロゼット周辺に位置するPAX6+細胞(RGC及び水平/アマクリン細胞に相当する)によっては発現されなかった。効率的な光受容体分化はまた、D77~D175に、RCVRN、CAR、CRX、RHO、青OPS及びR/G OPSを発現する細胞を示す2つの他のhiPSC系統に由来する網膜オルガノイドでも観察された。175日齢の網膜オルガノイドでは、結合繊毛マーカーであるアセチル化チューブリンにより、RCVRN+細胞に並置された非常に薄い構造の存在が明らかとなり(図2I)、繊毛及び光受容体外側セグメント(POS)の形成を示唆した。桿体及び錐体を含有するロゼットの空間分布を分析するために、本発明者らは、D195の網膜オルガノイドに対して、光受容体特異的なマーカー及び3DISCO透明化手順を用いた全載免疫染色を実施した。この技術は、免疫組織化学と組み合わせると、区分する必要なく、透明な試料全体をイメージングすることを可能にする[29]。RCVRN/RHO及びCAR/RHOの発現を特徴とする光受容体の空間配置が、3D再構築画像で観察された(図3A、図3B)。RHO+桿体又はCAR+錐体を含有するロゼットの正確な3Dパターンは、網膜オルガノイドの外側部分で可視化された(図3C)。透明化したD195のオルガノイドのRHO染色の高解像度共焦点イメージングにより、ロゼットの中心において出現するPOSを暗示する強烈な紡錘染色が明らかとなった(図3D)。同様の染色が、種々の網膜オルガノイドにおいて錐体を同定するCAR抗体を用いた場合に観察された。195日齢のオルガノイドに関して実施したTUNELアッセイにより、ロゼットにおけるRCVRN、RHO又は青OPS染色によって同定される光受容体が、アポトーシスを受けないようであることが実証された。透過型電子顕微鏡法分析により、D112で光受容体特異的な微小管配置を伴う基底小体及び結合繊毛等の光受容体超微細構造の存在が確認された(図3E~図3K)。幾つかの光受容体はまた、発達中のPOSに相当する膜状材料を提示して、D196で明らかに同定された(図3L)。hiPSC由来の光受容体が、機能成熟を達成することが可能であるかどうかを試験するために、本発明者らは、内向きの暗電流(IDC)を示すそれらの能力を試験した。環状ヌクレオチド感受性(CNG)チャネルの活性化によるNa+及びCa2+の流入に相当するIDCは、光受容体のcGMP濃度の増加の結果である。この「暗状態」を模倣するために、本発明者らは、これまでに記載されるように[18]、膜浸透性cGMP類似体(8-Br-cGMP)を使用して、陽イオン性CNGチャネルを開放させて、IDCを導いた。Ca2+流入は、D175の網膜オルガノイド由来の解離細胞における細胞内蛍光Ca2+指示薬Fura-2の生2光子イメージングを用いてモニタリングした。播種の48時間後に、幾つかのFura-2を負荷した網膜細胞は、細胞内蛍光の減少によって観察されるように、8-Br-cGMPに曝露されるとカルシウム流入を示した(図3M~図3N)。11個の応答性光受容体の読取り中の最大蛍光変動の平均値は、-22.52%±10.63%である(分析した細胞151個、N=4)(図3O)。細胞内蛍光の減少は、cGMP類似体に代わってAMESパフに曝露した網膜細胞では観察されなかった(分析した細胞150個、N=4)。これらの機能観察は、本明細書で報告するXF/FF培養条件が、或る特定レベルの光受容体成熟を可能にするという本発明者らの形態学的データを支持する。網膜オルガノイド内のRPCは、他の網膜細胞型を生じることが可能である。RTqPCR及びBRN3マーカーを使用した免疫染色によって、本発明者らは、分化の35日後に、RGCの早期出現を確認した(図4C及び図4K)。興味深いことに、OTX2+光受容体を含有するロゼット周辺に局在化されたBRN3A+RGCは、ProB27培地を使用した場合に、84日齢のオルガノイドにおいて依然として観察することができる(図4F)。類似した免疫蛍光分析により、2つの他のhiPSC系統に由来する網膜オルガノイドにおけるRGCの分化が確認され、分化プロセスの再現性を確認した。分化中のアマクリン細胞及び水平細胞は、RT-qPCRによって、それぞれGAD2及びLIM発現の誘導を伴って(図4L)、また免疫組織化学によって、それぞれAP2+/PAX6+及びLIM1+/PAX6+細胞の存在を伴って(図4D及び図4E)検出された。RT-qPCRにより、PKCα発現によって同定される双極細胞が後に出現することが実証され(図4M)、D281の免疫染色により、VSX2及びPKCαを同時発現する完全に分化した双極細胞の存在が確認された(図4I、図4J)。ミュラーグリア細胞の出現もまた、RT-qPCRによって、特異的なマーカーGLAST1及びRLBP1の誘導を伴って(図4M)、またグルタミンシンテターゼ(GS)及びSOX9を同時発現する細胞の同定によって(図4G)示されるように、後になって観察された。D140で、非常に稀なKi67+細胞(1セクション当たり5個未満の陽性細胞)により、網膜オルガノイドが、有糸分裂RPCの非存在によって確認される「成熟状態」に達したことが示される(図4H)。
将来の細胞移植用の光受容体前駆体の潜在的使用[32、33]及び分化の長さを考慮して、本発明者らは、細胞を分化プロセスと平行して保管することが可能な種々の凍結保存アプローチを開発しようとした。第1の戦略は、CD73が十分に発現される発達の段階で(D100に近い、免疫蛍光によって示されるように)、総網膜オルガノイドを凍結保存することであった。D84まで懸濁液中で培養した網膜オルガノイドを、冷Cryostem(商標)冷凍培地を使用して凍結保存して、光受容体の存在を、浮遊培養において、解凍の16日後にD100にオルガノイドにおいて検査した。冷凍した網膜オルガノイドは、同じ段階の冷凍していないオルガノイド(図5A、図5B)に類似して、CRX+及びRCVRN+光受容体前駆体を含有する無傷のロゼットの存在を示した(図5E、図5F)。興味深いことに、移植可能な細胞集団とみなされるCD73+細胞[34~36]は、依然として明らかに同定された。実際に、冷凍していないオルガノイド(図5C、図5D)と同様に、CD73は、RCVRN+細胞において特異的に発現され(図5G、図5H)、光受容体におけるそれらの特異的な発現が確認される。D100のCRX+細胞の定量化(図5Q)は、対照(冷凍していない)網膜オルガノイドと、冷凍した網膜オルガノイドにおいて、細胞の数間の如何なる有意な差も明らかにしなかった(p=0.1344;n=81450及び計数した細胞119339個)。第2のアプローチでは、本発明者らは、オルガノイド由来の解離網膜細胞を凍結保存することができるかどうかを検査した。この場合、D84又はD100まで培養した網膜オルガノイドを、パパインを使用して解離させて、網膜細胞を冷Cryostem(商標)冷凍培地を使用して凍結保存した。解凍後、細胞をポリ-D-リジン/ラミニン処理したカバーガラス上に蒔いて、更に5日間in vitro(DIV)で培養した。免疫染色により、冷凍したRCVRN+光受容体が、冷凍していない解離細胞と同様に、それらの強力なCD73発現を維持したことが明らかとなった(図5I~図5L)。二重CRX+及びRCVRN+細胞集団に関して、同様の観察を行った(図5M~図5P)。したがって、定量化により、冷凍した細胞と対照細胞との間で、二重CRX+及びRCVRN+細胞数の有意な差は観察されないことが示された(図5R)(p=0.5839、n=31303及び計数した細胞23958個)。
ヒトiPS由来のRPE(hiRPE)細胞を、D28までCTSTM N2サプリメントを2日後に連続添加しながら、Essential 6(商標)培地で培養したコンフルエントなhiPSCから網膜オルガノイドへと同時に生成させた(図6A)。自己形成性網膜オルガノイドを除去した後、細胞培養物をProN2培地に切り替えた。およそD42に、細胞の色素パッチを採取して、hiRPE細胞をこれらのパッチから増幅させた(図6B、図6C)。2週後、継代数1のhiRPE細胞(hiRPEp1)を、細胞バンキング用に凍結保存して、継代数3の解凍したhiRPE細胞(hiRPEp3)を完全な特性化に使用した(図6D、図6E)。生成した上皮細胞は、重要なRPE特異的な転写因子MITF及びタイトジャンクションマーカーZO-1にとって免疫反応性であった(図6F)。MITF+細胞の数を計数することにより、陽性細胞99.83%±0.31%(n=208259個の細胞)の細胞培養物の純度を確認した。ベストロフィン(BEST1)及びエズリンに関する免疫染色は、それぞれ、細胞の側底膜及び頂端側でこれらのタンパク質の発現を伴う培養物中のhiRPE細胞の正確な分極を示した(図6G、図6H)。また、RT-qPCR分析により、細胞が、凍結後に少なくとも更に継代数3で、PEDF、VEGF、MERTK及びBEST1等の成熟RPE関連マーカーの発現を保持したことが実証される(図6I)。hiRPEp3細胞の長期培養物は、特にRPE65に関して、ヒト初代培養物により近いRPE表現型を表し、成体ヒトRPE細胞において強力に発現される(図6J)。本発明者らは、バンキング後のhiRPE細胞が、典型的な自然RPE機能を依然として示すかどうかを検討した。ELISAを使用して、本発明者らは、各々の値12.4ng/ml+0.5ng/ml及び80.5ng/ml+8.8ng/ml(n=3)で、hiRPEp3細胞による血管内皮増殖因子(VEGF)及び色素上皮由来因子(PEDF)分泌を示した。本発明者らはまた、hiRPEp3細胞が、ヒト不死化RPE細胞系統ARPE-19に類似して、FITC標識POSの特異的な食作用を実行することができることを実証した(図6K~図6Q)。線維芽細胞とは逆に、hiRPE細胞及びARPE-19細胞の両方によるPOS食作用は、これまでに実証されるように[37、38]、インテグリンαvβ5に対する抗体によって阻止されて、RPE細胞によるこの受容体に関連するPOS食作用の特異性を実証した。
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Claims (10)
- ヒト網膜前駆体を得るin vitroでの方法であって、
(i)ヒト多能性幹細胞の接着培養物を、幹細胞特異的な神経促進培地に入れる工程であって、前記培養物は、フィーダー細胞を欠如している、工程と、
(ii)色素細胞及び/又は神経上皮様構造が出現するまで、この培養物を、前記幹細胞特異的な神経促進培地中で維持する工程と、
を含み、
前記幹細胞特異的な神経促進培地が、NaHCO 3 でpHを調節したDMEM/F12中においてプロゲステロン、プトレシン、亜セレン酸ナトリウム、インスリン、セレン、トランスフェリン、及びL-アスコルビン酸を含む、
方法。 - 前記幹細胞特異的な神経促進培地は、TGFβ及び/又はFGF2を更に含む、請求項1に記載の方法。
- 前記幹細胞特異的な神経促進培地の構成成分は全て、同じ生物に由来する、請求項1又は2に記載の方法。
- 工程(ii)は、前記接着培養物が、60%~80%コンフルエンスに達するまで実施される、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- 工程(ii)は、少なくとも16日間実施される、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 網膜色素上皮細胞(RPE細胞)を得るための、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法であって、
(iiiRPE)工程(ii)で得られた前記培養物から、少なくとも1つの色素細胞を収集する工程と、
(ivRPE)工程(iiiRPE)で得られた該色素細胞を培養する工程と、
を更に含む、方法。 - 工程(ivRPE)における前記培養する工程は、接着培養物系中で実行される、請求項6に記載の方法。
- 神経網膜細胞を得るための、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法であって、
(iiiNR)工程(ii)で得られた前記培養物から、少なくとも1つの神経上皮様構造由来の細胞を収集する工程と、
(ivNR)工程(iiiNR)で得られた該細胞を培養する工程と、
を更に含む、方法。 - 少なくとも1つの神経上皮様構造は、工程(iiiNR)において収集される、請求項8に記載の方法。
- 工程(ivNR)において、前記培養培地に、少なくとも5日間、FGF2が補充される、請求項8又は9に記載の方法。
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