JP2016516434A - 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るための方法 - Google Patents
網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016516434A JP2016516434A JP2016509595A JP2016509595A JP2016516434A JP 2016516434 A JP2016516434 A JP 2016516434A JP 2016509595 A JP2016509595 A JP 2016509595A JP 2016509595 A JP2016509595 A JP 2016509595A JP 2016516434 A JP2016516434 A JP 2016516434A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- culture
- retinal
- rpe
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 231
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 230000002207 retinal effect Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 title claims description 22
- 210000000844 retinal pigment epithelial cell Anatomy 0.000 title claims description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 56
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 41
- 210000001778 pluripotent stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 16
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 7
- 210000005157 neural retina Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 108091008695 photoreceptors Proteins 0.000 claims description 58
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 50
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 claims description 45
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 13
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 12
- 108010070047 Notch Receptors Proteins 0.000 claims description 12
- 210000004694 pigment cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 10
- 102100022464 5'-nucleotidase Human genes 0.000 claims description 7
- 102100030074 Dickkopf-related protein 1 Human genes 0.000 claims description 7
- 101000678236 Homo sapiens 5'-nucleotidase Proteins 0.000 claims description 7
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 claims description 7
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 6
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 5
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 4
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims description 4
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 claims description 4
- 101710099518 Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 239000002458 cell surface marker Substances 0.000 claims description 3
- 239000002356 single layer Substances 0.000 claims description 3
- 102000005650 Notch Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003583 retinal pigment epithelium Anatomy 0.000 description 56
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 33
- 102100029362 Cone-rod homeobox protein Human genes 0.000 description 25
- 101000919370 Homo sapiens Cone-rod homeobox protein Proteins 0.000 description 25
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 24
- 108010032788 PAX6 Transcription Factor Proteins 0.000 description 20
- 102100037506 Paired box protein Pax-6 Human genes 0.000 description 20
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 20
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 19
- 102000018210 Recoverin Human genes 0.000 description 18
- 108010076570 Recoverin Proteins 0.000 description 18
- DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N DAPT Chemical compound N([C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)OC(C)(C)C)C=1C=CC=CC=1)C(=O)CC1=CC(F)=CC(F)=C1 DWJXYEABWRJFSP-XOBRGWDASA-N 0.000 description 16
- 238000011977 dual antiplatelet therapy Methods 0.000 description 16
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 15
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 14
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 14
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 14
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 13
- 101000584400 Homo sapiens Homeobox protein OTX2 Proteins 0.000 description 12
- 102100030634 Homeobox protein OTX2 Human genes 0.000 description 11
- 102000014736 Notch Human genes 0.000 description 11
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 11
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 101000699762 Homo sapiens RNA 3'-terminal phosphate cyclase Proteins 0.000 description 10
- 101000854931 Homo sapiens Visual system homeobox 2 Proteins 0.000 description 10
- 101710154084 Interferon-inducible double-stranded RNA-dependent protein kinase activator A Proteins 0.000 description 10
- 102100029143 RNA 3'-terminal phosphate cyclase Human genes 0.000 description 10
- 102100029757 Retinal homeobox protein Rx Human genes 0.000 description 10
- 102100020676 Visual system homeobox 2 Human genes 0.000 description 10
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 210000002287 horizontal cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 108010028326 Calbindin 2 Proteins 0.000 description 8
- 102100021849 Calretinin Human genes 0.000 description 8
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 8
- 238000011161 development Methods 0.000 description 8
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 8
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 8
- 210000003994 retinal ganglion cell Anatomy 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 11-cis-retinal Chemical compound O=C/C=C(\C)/C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C NCYCYZXNIZJOKI-IOUUIBBYSA-N 0.000 description 7
- 101001020544 Homo sapiens LIM/homeobox protein Lhx2 Proteins 0.000 description 7
- 102100036132 LIM/homeobox protein Lhx2 Human genes 0.000 description 7
- 101710126211 POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 7
- 210000000411 amacrine cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 7
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 7
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 6
- 102000004330 Rhodopsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000820 Rhodopsin Proteins 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 210000002592 gangliocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 6
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 6
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 6
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- 102100027345 Homeobox protein SIX3 Human genes 0.000 description 5
- 101000651928 Homo sapiens Homeobox protein SIX3 Proteins 0.000 description 5
- 101001094741 Homo sapiens POU domain, class 4, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 102100035395 POU domain, class 4, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 5
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 210000001164 retinal progenitor cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 5
- 101000864646 Homo sapiens Dickkopf-related protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102000010175 Opsin Human genes 0.000 description 4
- 108050001704 Opsin Proteins 0.000 description 4
- 206010043276 Teratoma Diseases 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000004438 eyesight Effects 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 4
- 210000000608 photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 4
- 210000001116 retinal neuron Anatomy 0.000 description 4
- 108050003620 Arrestin-C Proteins 0.000 description 3
- 102100026440 Arrestin-C Human genes 0.000 description 3
- 101150059079 EBNA1 gene Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100031563 Excitatory amino acid transporter 1 Human genes 0.000 description 3
- 101001051777 Homo sapiens Protein kinase C alpha type Proteins 0.000 description 3
- 102100029181 PDZ and LIM domain protein 5 Human genes 0.000 description 3
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 3
- 102100024924 Protein kinase C alpha type Human genes 0.000 description 3
- 102000004243 Tubulin Human genes 0.000 description 3
- 108090000704 Tubulin Proteins 0.000 description 3
- 101150063416 add gene Proteins 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 3
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 3
- 208000017532 inherited retinal dystrophy Diseases 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 3
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000000394 mitotic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 3
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000004491 retinal development Effects 0.000 description 3
- 108010079094 short-wavelength opsin Proteins 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101001020548 Homo sapiens LIM/homeobox protein Lhx1 Proteins 0.000 description 2
- 101000976913 Homo sapiens Lens fiber major intrinsic protein Proteins 0.000 description 2
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 101000687905 Homo sapiens Transcription factor SOX-2 Proteins 0.000 description 2
- 101000711846 Homo sapiens Transcription factor SOX-9 Proteins 0.000 description 2
- 208000032578 Inherited retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 102100036133 LIM/homeobox protein Lhx1 Human genes 0.000 description 2
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 208000017442 Retinal disease Diseases 0.000 description 2
- 208000032430 Retinal dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 101150098192 SLC1A3 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 102100028509 Transcription factor IIIA Human genes 0.000 description 2
- 102100024270 Transcription factor SOX-2 Human genes 0.000 description 2
- 102100034204 Transcription factor SOX-9 Human genes 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 102100036857 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 102000013814 Wnt Human genes 0.000 description 2
- 108050003627 Wnt Proteins 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 201000006321 fundus dystrophy Diseases 0.000 description 2
- 210000001654 germ layer Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N isopentane Chemical compound CCC(C)C QWTDNUCVQCZILF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 2
- 210000000880 retinal rod photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- KBTLDMSFADPKFJ-UHFFFAOYSA-N 2-phenyl-1H-indole-3,4-dicarboximidamide Chemical compound N1C2=CC=CC(C(N)=N)=C2C(C(=N)N)=C1C1=CC=CC=C1 KBTLDMSFADPKFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 239000012110 Alexa Fluor 594 Substances 0.000 description 1
- 102000003916 Arrestin Human genes 0.000 description 1
- 108090000328 Arrestin Proteins 0.000 description 1
- 102100022794 Bestrophin-1 Human genes 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 101100239628 Danio rerio myca gene Proteins 0.000 description 1
- 101100351026 Drosophila melanogaster ey gene Proteins 0.000 description 1
- 108010000722 Excitatory Amino Acid Transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 1
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 238000001135 Friedman test Methods 0.000 description 1
- 229940125373 Gamma-Secretase Inhibitor Drugs 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100035857 Glutamate decarboxylase 2 Human genes 0.000 description 1
- 101000903449 Homo sapiens Bestrophin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000873786 Homo sapiens Glutamate decarboxylase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001139134 Homo sapiens Krueppel-like factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000988394 Homo sapiens PDZ and LIM domain protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 101000984042 Homo sapiens Protein lin-28 homolog A Proteins 0.000 description 1
- 101000729271 Homo sapiens Retinoid isomerohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000670189 Homo sapiens Ribulose-phosphate 3-epimerase Proteins 0.000 description 1
- 101000837829 Homo sapiens Transcription factor IIIA Proteins 0.000 description 1
- 101000652324 Homo sapiens Transcription factor SOX-17 Proteins 0.000 description 1
- 101000851376 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 8 Proteins 0.000 description 1
- 238000009015 Human TaqMan MicroRNA Assay kit Methods 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010044023 Ki-1 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100020677 Krueppel-like factor 4 Human genes 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 208000009795 Microphthalmos Diseases 0.000 description 1
- 101100011486 Mus musculus Elf4 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 210000005156 Müller Glia Anatomy 0.000 description 1
- -1 NANOG Proteins 0.000 description 1
- 101150079937 NEUROD1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700020297 NeuroD Proteins 0.000 description 1
- 102100032063 Neurogenic differentiation factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101150092239 OTX2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007354 PAX6 Transcription Factor Human genes 0.000 description 1
- 101150081664 PAX6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100035846 Pigment epithelium-derived factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039277 Pleiotrophin Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 102100025460 Protein lin-28 homolog A Human genes 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007014 Retinitis pigmentosa Diseases 0.000 description 1
- 102100031176 Retinoid isomerohydrolase Human genes 0.000 description 1
- 101001062859 Sus scrofa Fatty acid-binding protein, adipocyte Proteins 0.000 description 1
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030243 Transcription factor SOX-17 Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100022356 Tyrosine-protein kinase Mer Human genes 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 1
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102100039037 Vascular endothelial growth factor A Human genes 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N alprazolam Chemical compound C12=CC(Cl)=CC=C2N2C(C)=NN=C2CN=C1C1=CC=CC=C1 VREFGVBLTWBCJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 208000027697 autoimmune lymphoproliferative syndrome due to CTLA4 haploinsuffiency Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 1
- 108010018804 c-Mer Tyrosine Kinase Proteins 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007248 cellular mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000004081 cilia Anatomy 0.000 description 1
- 230000008045 co-localization Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N di-n-propyl-acetic acid Natural products CCCC(C(O)=O)CCC NIJJYAXOARWZEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N dimethyl butane Natural products CCCC(C)C AFABGHUZZDYHJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 210000003981 ectoderm Anatomy 0.000 description 1
- 230000005670 electromagnetic radiation Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001900 endoderm Anatomy 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002304 esc Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004373 eye development Effects 0.000 description 1
- 230000023419 eye morphogenesis Effects 0.000 description 1
- 210000000887 face Anatomy 0.000 description 1
- 239000003540 gamma secretase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 231100000024 genotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001738 genotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 230000037427 ion transport Effects 0.000 description 1
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000003716 mesoderm Anatomy 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 201000010478 microphthalmia Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001272 neurogenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000010422 painting Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 230000007310 pathophysiology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000000059 patterning Methods 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 108090000102 pigment epithelium-derived factor Proteins 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000000964 retinal cone photoreceptor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 238000009168 stem cell therapy Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L tetrazolium blue Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC=CC=2)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 MUUHXGOJWVMBDY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000009772 tissue formation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M valproate semisodium Chemical compound [Na+].CCCC(C(O)=O)CCC.CCCC(C([O-])=O)CCC MSRILKIQRXUYCT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000604 valproic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000004382 visual function Effects 0.000 description 1
- 230000004393 visual impairment Effects 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/062—Sensory transducers, e.g. photoreceptors; Sensory neurons, e.g. for hearing, taste, smell, pH, touch, temperature, pain
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0623—Stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/10—Growth factors
- C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/40—Regulators of development
- C12N2501/42—Notch; Delta; Jagged; Serrate
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
- C12N2502/13—Coculture with; Conditioned medium produced by connective tissue cells; generic mesenchyme cells, e.g. so-called "embryonic fibroblasts"
- C12N2502/1323—Adult fibroblasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2527/00—Culture process characterised by the use of mechanical forces, e.g. strain, vibration
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/50—Proteins
- C12N2533/54—Collagen; Gelatin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Neurology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Acoustics & Sound (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Description
(i)神経促進培地中にヒト多能性幹細胞の接着性培養物を配置するステップ;並びに
(ii)色素細胞(pigmented cell)及び/又は神経上皮様構造の出現まで、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ、
を含む。
(i)神経促進培地中にヒト多能性幹細胞の接着性培養物を配置するステップ;
(ii)色素細胞の出現まで、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ;
(iiiRPE)ステップ(ii)において得られた培養物から、少なくとも1つの色素細胞を収集するステップ;及び
(ivRPE)ステップ(iiiRPE)において得られた色素細胞(単数又は複数)を培養するステップ、
を含む。
(i)神経促進培地中にヒト多能性幹細胞の接着性培養物を配置するステップ;
(ii)神経上皮様構造の出現まで、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ;
(iiiNR)ステップ(ii)において得られた培養物から、少なくとも1つの神経上皮様構造由来の細胞を収集するステップ;及び
(ivNR)ステップ(iiiNR)において得られた細胞を培養するステップ、
を含む。
・移植/細胞治療:非限定的な例には、以前に失われた視力の回復を補助するための、失われた細胞の置換治療における、RPE細胞及び/又は網膜前駆体細胞若しくはそれらから分化した細胞の使用が含まれる。方法及び培養物は、全組織置換治療における使用のための組織を発生させるためにも使用され得る。
・RGC、桿体、錐体及びRPE細胞を含む全ての細胞の機能を保護又は増強することができる薬剤を同定するための薬物スクリーニング。「薬剤」は、本明細書で、任意の種類の分子又は組成物を意味するが、非化学的薬剤、例えば、任意の電磁放射線又は粒子線(UV、可視光、電離放射線など)もまた意味する。
・多能性細胞から、特にhiPS細胞から、病態生理学を研究するために、及び幹細胞又はその誘導体を使用した薬物スクリーニング又はカスタム化治療のためにも使用され得るヒト網膜疾患モデルを作ること。
・網膜発生、組織形成及びシナプス形成が含まれるがこれらに限定されない種々のプロセスを研究するための有用なリソースである、ヒト神経発生の独自のモデルとして。
[図2]組込みフリーのhiPS細胞由来の網膜前駆体の効率的な生成を示す図である。(A)分化プロトコールの異なる段階を示す模式図。(B、C)7及び14日後の、神経促進培地中で分化しているhiPS細胞の形態。(D)14日目の神経上皮様構造における、眼野転写因子(SIX3、LHX2、RAX、PAX6、MITF及びVSX2)、NRL、CRX及び多能性マーカーPOU5F1のqRT−PCR分析(n=3実験)。データは、0日目のhiPS細胞に対して標準化される。(E〜O)PAX6及びRAX(E〜G)、Ki67及びLHX2(H〜J)、又はMITF及びVSX2(K〜O)についての、14日目の神経上皮様構造の免疫蛍光染色。スケールバー=100μm(B、C、E、H及びK);50μm(F、G、I、J、L〜O)。(P)0日目、7日目及び14日目における、hiPSC−2中のノギン(noggin)及びDKK1のqRT−PCR分析。データは、hiPSC−2単一のコロニーに対して標準化される。
[図3]浮遊神経網膜(NR)様構造からの複数の網膜細胞型の分化を示す図である。(A)網膜細胞を生成するための分化プロトコールを概説する模式図
(B〜D)単離後の異なる時点における浮遊NR様構造の形態。(E、F)異なる時点における、NR様構造における眼野及び光受容体特異的転写因子のqRT−PCR分析(n=3実験)。データは、14日目のNR様構造の細胞に対して標準化される。(G〜I)MITF(G)、VSX2(G、H)、PAX6(H)、OTX2(I)及びBRN3A(I)についての、21日目のNR様構造の免疫染色。(J〜L)14日目(J)、21日目(K)及び28日目(L)における、CRXについてのNR様構造の免疫染色。(M〜N)カルレチニン(M)及びLIM1(N)についての、21日目のNR様構造の免疫染色。(O)リカバリンについての、28日目のNR様構造の免疫染色。スケールバー=100μm(B〜D、G〜L)、50μm(M〜O)。
[図4]組込みフリーのhiPS細胞からのRPE細胞の生成及び増幅を示す図である。(A)実験の模式図。(B、C)30日後の、hips細胞由来RPE細胞単層の位相差顕微鏡。(D)ZO−1及びMITFについての、30日後の、hips細胞由来RPE細胞単層の免疫染色。スケールバー=100μm。(E)継代0(P0)、P1及びP2における、hiRPE細胞における成熟RPEマーカーのqRT−PCR分析。データは、ヒト成人RPE細胞から単離された対照RNAに対して標準化される。(F)RPE細胞食作用活性の評価;FITC標識POSとの3時間のインキュベーション後の、P1におけるhiRPE細胞培養物及び対照RPE−J細胞系におけるFITC/DAPI蛍光の比率。POSの結合及び取り込みを、材料及び方法に記載したようにアッセイした(例1)。
[図5]Notch阻害による、浮遊NR様構造からの光受容体先駆体生成の加速を示す図である。(A)21日目から28日目まで又は28日目から35日目までのいずれかのDAPTの添加を用いた実験の模式図
(B)DAPTの存在下又は非存在下(対照)における、CRX及びリカバリンについての、28日目又は35日目におけるNR様構造の免疫染色。スケールバー=100μm。(C及びD)DAPTあり又はなし(対照)での、28日目及び35日目における光受容体先駆体(CRX、リカバリン)及び有糸分裂前駆体(Ki67)の定量。値は、陽性細胞の平均百分率±SEMを示す(n=4、*P<0.05)。(E)DAPTで処理した35日目のNR様構造における、成熟中の光受容体のマーカー及びGLAST(ミュラーグリア細胞についてのマーカー)のqRT−PCR分析。データは、DAPT処理なしの35日目におけるNR様構造に対して標準化される。スケールバー=100μm。
[図6]NR様構造における光受容体先駆体の初期分化を示す図である。(A)分化中のNR様構造におけるNRL及びCRX転写因子のqRT−PCR分析。データは、0日目におけるhiPSC−2と比較した、PCR発現レベルにおけるサイクル変化として表される。(B)CRXについての、14日目における凍結切片化NR様構造の免疫蛍光染色。(C〜H)CRX及びOTX2についての、21日目及び35日目における凍結切片化NR様構造の免疫蛍光染色。21日目(C〜E)及び35日目(F〜H)における、NR様構造の切片におけるOTX2及びCRXの共局在を実証する共焦点画像。(M〜N)Ki67(M)、PAX6(N)、OTX2(N)、CRX(M)についての、28日目における凍結切片化NR様構造の免疫組織化学分析。スケールバー=100μm(B);50μm(C〜H及びM〜N)。
[図7]hiPSC−2由来NR様構造の厚さ分析を示す図である。(A〜C)17日目から24日目までの、1つの代表的NR様構造の厚さの発達(黒色線)。(D)13個の独立したNR様構造の厚さの発達のグラフ表現。各線は、1つのNR様構造に対応する。(E)17日目から24日目の間での80.6±10.2%の増加を示す、13個の別々のNR様構造の厚さ(平均±SEM;**P<0.01;****P<0.0001)を示すヒストグラム。スケールバー=100μm。
[図8]異なるhiPSCクローンを用いた網膜分化プロトコールの再現性を示す図である。(A〜C)17日目、21日目及び24日目における、hiPSC−1から誘導された浮遊NR様構造の形態。(D〜F)17日目、21日目及び24日目おける、hiPSC−2から誘導された浮遊NR様構造の形態。(G及びH)hiPSC−1又はhiPSC−2から誘導されたNR様構造における、17日目及び35日目における眼野転写因子のqRT−PCR分析。(I及びJ)hiPSC−1又はhiPSC−2から誘導されたNR様構造における、17日目及び35日目における光受容体特異的転写因子のqRT−PCR分析。データは、各遺伝子について、14日目に対して相対的である。スケールバー=100μm。
[図9]浮遊NR様構造からの全ての網膜細胞型の分化。(A〜E)異なる時点における、NR様構造における選択された神経網膜細胞型のqRT−PCR分析。データは、R/G及びブルーオプシンの両方について、14日目及び35日目のNR様構造に対して標準化される。(F〜Q)RGC(BRN3A、PAX6、カルレチニン)、アマクリン細胞(PAX6、AP2、カルレチニン)、水平細胞(LIM、PAX6、カルレチニン)、光受容体(OTX2、リカバリン、CRX、CD73、錐体アレスチン、ロドプシン、ブルー及びR/Gオプシン)、双極細胞(PKCα)、ミュラーグリア細胞(GS、SOX9)並びに有糸分裂前駆体についてのマーカー(Ki67)を使用した、分化の異なる段階における凍結切片化NR様構造の免疫組織化学的分析。スケールバー=50μm(F〜N)、25μm(O〜Q)。
[図10]長期培養後の、NR様構造における成熟光受容体の存在を示す図である。リカバリン(A〜D)、ロドプシン(A〜B)及びアセチルチューブリン(C〜D)についての112日目における凍結切片化NR様構造の免疫蛍光染色。免疫組織化学的分析により、内部ロゼットにおける光受容体の優勢な存在が確認され、ロゼットの管腔帯におけるアセチル化チューブリン陽性構造の出現が確認された(D中の矢印)。スケールバー=25μm(A〜C)及び10μm(D)。
網膜ニューロン及び網膜色素上皮細胞へのヒト組込みフリーの誘導多能性幹細胞の、信頼性のある効率的な分化
1.1 実験手順
ヒト線維芽細胞及びiPS細胞の培養
8歳の男児由来の成人ヒト皮膚線維芽細胞(AHDF)(Rustin博士からの贈与、INSERM U676、Paris、France)を、標準的な5%CO2/95%空気インキュベータ中で、37℃で、10% FBS(Life Technologies)、1mMピルビン酸ナトリウム(Life Technologies)、1×MEM非必須アミノ酸(Life Technologies)を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)高グルコース、Glutamax II(Life Technologies)中で培養した。この培地を「線維芽細胞培地」と呼んだ。樹立されたヒトiPS細胞を、10ng/mlのヒト組換え線維芽細胞増殖因子2(FGF2)(Preprotech)を含むReproStem培地(ReproCell)中で、マイトマイシン−C不活化マウス胚性線維芽細胞(MEF)フィーダー層(Zenith)上で維持した。細胞を、標準的な5%CO2/95%空気インキュベータ中で、37℃で慣用的にインキュベートした。この培地を「iPS培地」と呼んだ。細胞を、実体顕微鏡(Vision Engineering Ltd)下で1週間に1回手動で継代した。
再プログラミングを、記載されたようにエピソームアプローチを用いて実施した(Yuら、2009)。簡潔に述べると、oriP/EBNA1ベースのエピソームベクターpEP4EO2SEN2K(プラスミド20925、Addgene)、pEP4EO2SET2K(プラスミド20927、Addgene)及びpCEP4−M2L(プラスミド20926、Addgene)を、ヌクレオフェクション(nucleofection)(Nucleofector 4D、V4XP、DT−130プログラムを用いる、Lonza)を介して、AHDF中に共トランスフェクトした。トランスフェクトした線維芽細胞(ヌクレオフェクション1回当たり106細胞)を、「線維芽細胞培地」中に、3×10cm MEF播種皿(5.106細胞/cm2)に直接プレートした。トランスフェクションの4日後に、「線維芽細胞培地」を、再プログラミング効率を増加させることが記載された以下の分子(Zhangら 2013)を補充した「iPS培地」で置換した:500μMのバルプロ酸(Sigma、France)、0.5μMのPD−0325901(Selleck、Euromedex、France)及び2μMのSB431542(Selleck)。14日後に、細胞を、「iPS培地」単独中で培養した。30〜40日の間に、コンパクトな細胞クラスターを切り取り、60mm Organ Style細胞培養皿(Dutscher、France)中に移した。出現したhiPSコロニーを、そのヒトES細胞様のコロニー形態に従って実体顕微鏡下で選別した。これらを、引き続く特徴付けのために、上記のようにマイトマイシン−C不活化MEFフィーダー層上で拡大増殖させた。エピソームベクターの完全な喪失及び再プログラミング性遺伝子の非組込みを、以下に記載するようにPCRによって達成した。
hiPS細胞からのエピソームDNAの精製を、製造者のプロトコールに従って、Nucleospin Plasmid Quick Pureキット(Macherey−Nagel、France)を用いて実施した。ゲノムDNAを、フェノール/クロロホルム抽出法を使用して単離した。精製方法の性質に起因して、Yuら(2009)によって明確に報告されたように、ゲノム精製DNAには、同じ細胞由来の残存量のエピソームDNAが混入する可能性が高く、同様に、精製されたエピソームDNAには、少量のゲノムDNAが混入した。PCR反応を、Go Taq flexiポリメラーゼ(Promega、France)を用いて実施した。各PCR反応について、100ngを含むことと同等の104細胞から抽出した10μlのゲノムDNA又はエピソームDNAを、鋳型として添加した。PCRミックスは1×Go Taq Flexi緩衝液、2mM MgCl2、0.2mM dNTPs、0.5μMの各プライマー及び1.25Uのポリメラーゼを含み:94℃で1分間の最初の変性;94℃で45秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間の35サイクル、及びその後72℃で5分間のプログラムを用いた。ネイティブ線維芽細胞由来のエピソーム及びゲノムDNAを、陰性対照として使用し、oriP/EBNA1ベースのエピソームベクター(上記、Yuら 2009を参照のこと)を、陽性対照として使用した。
活発に増殖しているhiPS細胞コロニー(80%コンフルエンシー)を、37℃で90分間、コルヒチン(20mg/ml、Eurobio、France)で処理した。細胞を、0.05%トリプシン−EDTAで解離させ、次いで、37℃で10〜14分間にわたって75mM KCl(Sigma Aldrich)中でインキュベートし、その後、3:1メチルアルコール/氷酢酸で固定した。mFISH核型分析のために、固定した細胞を、変性した「カクテルペインティング(cocktail painting)mFISH」プローブ(MetaSystems、Altussheim、Germany)と、37℃で一晩ハイブリダイズさせた。スライドを、1×SSC及び0.4×SSCの連続浴中で洗浄し、核を、250ng/mlのジアミジノ−フェニル−インドール(DAPI)で染色した。ビオチン化プローブを、Cy5 MetaSystems B−tect検出キット(MetaSystems)を使用して明らかにした。10〜20個の分裂中期を、AxioCamカメラ(Carl Zeiss、France)に連結されたUV HBO 100−Wランプを備えたZeiss Z1蛍光顕微鏡を使用して捕捉した。分析した全ての分裂中期を、MetaSystems Isisソフトウェア(MetaSystems)を使用して核型分析した。
MEF上の培養物中のヒトiPS細胞を、室温で10分間95%エタノールで固定した。次いで、細胞を、PBSでリンスし、5mM MgCl2及び0.05% Tween−20を含むTris緩衝液pH9.5中の5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスファート(BCIP)及びニトロブルーテトラゾリウム(NBT)(Roche、France)の混合物と共に室温で5〜10分間インキュベートした。染色後、細胞をPBSでリンスし、その後明視野顕微鏡下で可視化した。
ヒトiPS細胞コロニーを、実体顕微鏡(Vision Engineering Ltd.)下でMEF層から機械的に剥離し、次いで、ReproStem培地中で超低付着培養皿(Nunc、Dutscher、France)中に、懸濁物中で培養した。培地を2日毎に交換し、EBを2週間培養し、その後、RNA抽出又は免疫組織化学分析を行った。
ヒトiPS細胞を、iPS培地中で、マイトマイシン−C不活化マウスMEFフィーダー層上に、コンフルエンスになるまで拡大増殖させた。0日目として規定されるこの時点で、コンフルエントなhiPS細胞を、FGF2なしのiPS培地中で培養した。2日後、この培地を、ダルベッコ改変イーグル培地:Nutrient Mixture F−12(DMEM/F12、1:1、L−グルタミン)、1% MEM非必須アミノ酸及び1% N2サプリメント(Life technologies)によって構成される「神経促進培地」に切り替えた。この培地を、2〜3日毎に交換した。14日目に、色素細胞によって取り囲まれた同定された神経上皮様構造を単離し、最初の2日間の間、3D Nutator振盪機(VWR、France)上に乗せた24ウェルプレート中で、10ng/mlのFGF2を補充した「神経促進培地」を用いて、浮遊構造(3D)として個々に培養し、培地を、2〜3日毎に交換した。単離された構造は、振盪機プラットフォーム上で培養した場合、培地中で懸濁されたままであり、通常は、培養プレートの底に付着できなかった。19日目、20日目又は21日目に、FGF2を除去し、「神経促進培地」の半分を、次の数週間にわたって2〜3日毎に交換した。
総RNAを、製造者のプロトコールに従ってNucleospin RNA IIキット(Macherey−nagel、France)を使用して抽出し、RNAの収量及び品質を、NanoDrop分光光度計(Thermo Scientific、France)を用いてチェックした。cDNAを、製造者の推奨に従ってQuantiTect逆転写キット(Qiagen)を使用して、500ngの総RNAから合成した。次いで、合成したcDNAを、DNaseを含まない水中で1/20で希釈し、その後定量的PCRを実施した。qPCR分析を、製造者の指示に従って、カスタムTaqMan(登録商標)Array 96−Well Fastプレート及びTaqMan(登録商標)遺伝子発現マスターミックス(Applied Biosystems)を用いてApplied Biosystems real−timePCRシステムズ(7500 Fast System)で実施した。増幅のための、全てのプライマー及びFAMで標識したMGBプローブを、Applied Biosystems(Life Technologies、France)から購入した。結果を、18Sに対して標準化し、遺伝子発現の定量は、3回の独立した実験におけるΔCt法に基づいた。ヒト成人RPE細胞由来の対照RNAは、中心窩レベルにおいて切り出された眼杯から単離されたRPE細胞に対応する。
凍結切片のために、網膜様構造を、4%パラホルムアルデヒド(PFA)中で4℃で15分間固定し、PBS中で洗浄した。構造を、最低2時間の間、PBS/30%スクロース(Sigma)溶液中で4℃でインキュベートした。構造を、PBS、7.5%ゼラチン(Sigma)、10%スクロース溶液中に包埋し、−50℃でイソペンタン中で凍結させ、10μm厚の凍結切片を収集した。
奇形腫形成アッセイを、僅かな改変を伴って、以前に記載されたように(Griscelliら、2012)実施した。簡潔に述べると、1×106〜2×106細胞を、6週齢NOD Scidガンマ(NSG)マウス(Charles River)の後肢筋肉中に注射した。9〜10週間後、奇形腫を切り出し、4%パラホルムアルデヒド中で固定した。次いで、サンプルを、パラフィン中に包埋し、切片を、ヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
光受容体外節(POS)を、ブタの眼から精製し、確立された手順(2)に従って、0.1mg/ml FITC(異性体−1)とのインキュベーションによって、蛍光色素で共有結合的に標識した。継代3におけるRPE−J(不死化ラットRPE細胞系)及び継代1におけるhiRPE細胞を、96ウェル組織培養プレートの個々のウェル中に配置した。各ウェルを、1×106のPOS粒子を含む100μLのDMEMで層状化し、32℃(RPE−J)又は37℃(hiRPE)で3時間インキュベートし、その後、1mM MgCl2及び0.2mM CaCl2を含むPBS(PBS−CM)でフィルターウェルを3回リンスした。内在化された粒子の排他的な検出のために、表面結合FITC−POSの蛍光を、PBS−CM中0.2% トリパンブルー中での10分間のインキュベーションによって選択的にクエンチし、その後細胞を固定した。細胞を、氷冷メタノール中で5分間のインキュベーションによって固定し、その後、再水和し、室温で10分間DAPIとインキュベーションした。蛍光シグナルを、Infinite M1000 Pro(Tecan)プレートリーダーを用いて定量した。RPE−J細胞系を、食作用活性についての陽性対照として使用し、POSの非存在下のhiRPE細胞を、陰性対照として使用した。
分散の分析を、全てのペアワイズ分析のために、ノンパラメトリックFriedman検定とその後のDunnの多重比較検定、又はMann−Whitney検定(Prism 6、GraphPadソフトウェア)のいずれかを用いて実現した。P<0.05の値を、統計的に有意とみなした。
ヒト組込みフリーのiPS細胞の生成及び特徴付け
成人ヒト皮膚線維芽細胞(AHDF)を、Yuら(2009)によって以前に記載されたプラスミドベクターに対応する、OCT4、NANOG、SOX2、LIN28、KLF4及びcMYCをコードする3つのプラスミドと共に共トランスフェクトした。トランスフェクトした線維芽細胞を、再プログラミングプロセスを加速し、エピソームベクターの喪失を低減させると以前に記載された小分子(Zhangら 2012)(図1A)の存在下で「iPS培地」中で培養した。ES様コロニーが、最初に、密集したドーム様構造を伴って、トランスフェクションのおよそ30から40日後の間に、可視的になった(図1B)。選別及び拡大増殖した時点で、これらのhiPS細胞コロニーは、典型的なヒトES細胞の形態を示した。これらのhiPS細胞の分析は、クローンが、多能性マーカーNanog、TRA−1−81、OCT4及びSSEA4の発現と共に、アルカリホスファターゼ(AP)活性を発達させたことを実証した(図1C〜E)。qRT−PCRに基づくTaqManプローブにより、多能性遺伝子の発現が、それぞれの線維芽細胞集団を超えて顕著に増加し、ヒトES細胞において見られたものと匹敵したことが明らかになった(図1I)。iPSコロニーは、培養物中で2週間後の胚様体に対する、qRT−PCRに基づくTaqManプローブ(図1J)及び免疫組織化学(図1F〜H)によって観察されるように、3つ全ての胚葉の誘導体へとin vitroで分化できた。さらに、ヒトiPS細胞系は、正常な核型を示した(図1K)。hiPS細胞は、導入遺伝子のゲノム組込みを示さず、エピソーム中のOriP部位に対するRT−PCR分析によって実証されるように、15継代後にエピソームベクターを完全に喪失した(図1L)。ヒトiPSC系の多能性は、奇形腫形成アッセイによって検証した。
iPS細胞分化のための必要条件は、自己再生機構のシャットダウンであるので、FGF2を培地から除去して、コンフルエントなiPS細胞の自発的分化を促進した。培養培地からのFGF2の中止(withdrawal)は、ヒトES細胞においてGreberら(2011)によって申し分なく実証されたように、神経外胚葉誘導もまた促進し得る。神経外胚葉系列へのhiPS細胞のこの分化に都合がいいように、コロニーを、1% MEM非必須アミノ酸及び1% N2サプリメントを含むDMEM/F12培地を含む神経促進培地中で培養した(図2A)。これは、4日以内の色素性コロニーの出現をもたらした。7日後、フェーズ−ブライト構造は、色素細胞のパッチの半分よりも多くに近接するようになり始めた(図2B)。2週間以内に、全てのこれらの構造は、1cm2当たり1〜2個の構造に対応する、色素細胞のパッチで部分的に取り囲まれた神経上皮様構造へと組織化された(図2C)。他の色素性コロニーは、神経上皮様構造を発生させず、これらの構造の形成は、非色素性領域ではめったに観察されなかった。14日目に、qRT−PCRに基づくTaqManプローブにより、全ての形成された神経上皮様構造が、多能性関連遺伝子OCT4(POU5F1)の発現を喪失し、眼野特定化と関連する転写因子、例えばLHX2、RAX、PAX6、SIX3の発現を獲得したことが明らかになった(図2D)。神経上皮(neurepithelial)様構造の免疫染色により、全ての細胞が、眼野細胞に特徴的なPAX6及びRAX(Mathers及びJamrich 2000)を同時発現したことが実証された(図2E〜G)。ほぼ全ての細胞がLHX2陽性であり(図2H、2J)、それらの前駆体状態が、細胞増殖マーカーKi67を使用して確認された(図2H〜J)。qRT−PCRにより、眼胞/眼杯形成の間の網膜特定化に関与する2つの転写因子MITF及びVSX2(Horsfordら 2005)の発現が、14日目においてそれぞれ10及び100倍増加されることがさらに実証された(図2D)。免疫組織化学(Immunhistochemistry)により、VSX2及びMITF発現の正反対の勾配が明らかになり、VSX2について最も強力な染色が、神経上皮様構造において明らかになり、一方で、最も強いMITF発現が、構造の周辺の色素性部分に見出された(図1K〜O)。合わせると、これらの知見により、神経上皮様構造が神経網膜前駆体に典型的なマーカー発現プロフィールを有し、神経網膜(NR)様構造と改名され得ることが実証される。興味深いことに、qRT−PCRにより、光受容体先駆体の転写因子、例えばNRL及びCRXの発現が、培養物中での早くも14日後に、NR様構造において5倍増加することが明らかになり(図2D)、これは、一部の網膜前駆体が、光受容体系列において既に関与していた可能性があることを示唆する。
細胞の周囲の色素性パッチを伴うNR様構造に対応する構造全体(図2C)を、14日目に機械的に単離し、3D撹拌下で浮遊構造としてさらに培養した(図3A)。浮遊構造を、RPE系列への分化ではなく神経網膜分化に都合がよいように、FGF2の存在下で培養した(Fuhrmann 2010;Martinez−Moralesら 2004)。単離の1日後(15日目)に、このNR様構造は、培養の間にサイズが増加し続けた中空球を形成した(図3B〜D)。定量的分析により、17日目から24日目の間に、139±19μmから251±41μmまでの、神経上皮の厚さにおける増加が示された(図7)。本発明者らは、成長中の球からRNAを単離することによるqRT−PCR及び免疫組織化学の両方を使用して、特異的網膜表現型の時間過程及び獲得を分析した。14日目から42日目までの分化プロセスを通じて、網膜の特定化及び分化に関与する転写因子、例えばLHX2、RAX、SIX3、PAX6、VSX2及びMITFが、なおも発現された(図3E)。21日目に、VSX2を発現している細胞は、NR様構造の発生中の神経上皮(neuroeptithelium)中に位置し、MITF陽性細胞は、構造の周辺におけるRPE細胞中で排他的に見出された(図3G)。RPE細胞におけるMITF発現の制限が、NR様構造におけるそのmRNA発現の減少によって確認された(図1E)。VSX2陽性細胞は、神経上皮の外側部分に沿って優勢に位置し、PAX6もまた発現する(図3H)。PAX6陽性/VSX2陰性細胞は、神経上皮の内側部分において集合し、これは、最初の分化している網膜ニューロンに対応し得、増殖マーカーKi67を有さなかった。実際、早くも21日目に、神経節細胞及びアマクリン細胞が、BRN3A(図3I)又はカルレチニン(図3M)に対する抗体を用いた、同じ内部位置における免疫組織化学によって同定された。分化している水平細胞に対応するLIM1陽性細胞もまた、発生中の神経上皮において見出された(図3N)。光受容体などの網膜細胞の分化に関与する転写因子をコードする2つの遺伝子OTX2及びNEUROD1(Basset及びWallace 2012)の発現は、浮遊培養の間に大きく増加した(図3E)。免疫組織化学的分析により、構造の周辺におけるRPE細胞中のOTX2の発現、及び光受容体の傾倒した先駆体(Nishidaら、2003)に対応する神経上皮中へのOTX2陽性細胞の出現が示された(図3I)。光受容体系列への分化は、14日目から42日目までの、qRT−PCRによるNRL及びCRX発現の大きな増加によって確認される(図3F及び図6A)。CRX陽性細胞は、21日目及び28日目における数の進行性の増加(図3K、L)を伴って、早くも14日目に、神経上皮において同定可能であった(図3J)。この段階で、光受容体先駆体が、リカバリン免疫染色を用いて同定された(図3O)。
神経促進培地中で培養したコンフルエントなhiPS細胞由来の細胞の色素性パッチの迅速な出現を考慮して、本発明者らは、これらを単離し、RPE細胞に分化させようとした。7日目から14日目の間に、細胞の色素性パッチを、機械的に選択し、拡大増殖のためにゼラチン被覆プレート上に再プレートした(図4A)。3週間〜1ヵ月後に、これらは、RPE細胞の古典的な敷石状形態を示すコンフルエントな細胞単層を形成した(図4B〜C)。ほとんどの細胞は、重要なRPE特異的転写因子MITFについて免疫反応性であり、細胞−細胞界面は、網膜色素上皮のタイトジャンクションマーカーZO−1によってラインがひかれていた(図4D)。成人ヒトRPE細胞に対して標準化したqRT−PCR分析により、hiRPE細胞が、数継代の後、成熟RPE関連マーカー、例えばMERTK、RPE65、BEST1及びPEDFの発現を保持したことが実証された(図4E)。hiRPE細胞が機能的かどうか決定するために、FITC標識光受容体外節(POS)の食作用を実施するそれらの能力を試験した。3時間以内に、30%内在化POSの平均で、対照RPE−J細胞系に対してと同程度に効率的な、顕著な食作用活性が検出された(図4F)。
後期に生じる網膜細胞型への網膜前駆体細胞の分化
浮遊培養における単離されたNR様構造の長期維持により、qRT−PCRによって実証されるように、後期に生じる網膜細胞型へのRPCのさらなる分化が可能になった(図9A〜E)。実際、成熟中のRGC(BRN3A及びB)、アマクリン(カルレチニン及びGAD2)、及び水平細胞(LIM)の、初期に生じる網膜マーカーの最初の発現(図9A及びB)の後、錐体(R/Gオプシン、ブルーオプシン及び錐体アレスチン)及び桿体光受容体(ロドプシン及びリカバリン)(図9C及びD)、双極(PKCα)及びミュラーグリア細胞(GLAST1)(図9E)に対応する、後期に生じる網膜細胞型のマーカーの出現が観察された。21日目(図9F)から42日目(図9G)の間に、NR様構造のほとんどが、その層状の外観を喪失し、RGC(BRN3A及びカルレチニン)、アマクリン(カルレチニン及びAP2)及び水平細胞(LIM)(図9G〜J)の異なるマーカーを発現した細胞によって取り囲まれた、分化している光受容体に対応する、OTX2+、CRX+及びリカバリン+細胞を含んだ内部ロゼットを発達させた(図9G、J〜L及び図6F〜H)。興味深いことに、42日目に、リカバリン+細胞は、移植のための光受容体先駆体の細胞ソーティングに使用されるマーカー(Eberleら、2011)、細胞表面マーカーCD73(図9L)を発現した。77日目に、PAX6は、RGC、アマクリン及び水平細胞におけるその発現(図9M)と一致して、有糸分裂後細胞(KI67−)において、ロゼットの外側にのみ存在した。112日目までに、ロドプシン及びR/Gオプシンが、NR様構造中に出現し、これは、桿体及び錐体の両方の成熟化を反映している(図9N、O)。リカバリン+及びロドプシン+細胞は、共通して、112日目において、残留ロゼットの最も内側部分において局在化した(図10A及びB)。興味深いことに、連結性の繊毛マーカーアセチル化チューブリンを使用する免疫組織化学により、リカバリン+細胞に隣接するロゼットの管腔帯における非常に薄い構造の存在が明らかになり、これは、潜在的な繊毛及び光受容体外節の形成を示唆している(図10C及びD)。2つの他の後期に生じる網膜細胞型、双極及びミュラーグリア細胞の分化は、PKCα染色(図9P)によって、並びにグルタミンシンテターゼ(GS)及びSOX9の同時発現(図9Q)によってそれぞれ検出されるまで、培養により長い時間(112日目)もまた必要とした。それによって、これらの細胞培養条件は、連続的な様式での、NR様構造中に存在するRPCからの全ての網膜細胞型の生成を可能にした。
Notch阻害による光受容体先駆体生成の加速
CRX及びリカバリンに対する抗体を用いた免疫組織化学的分析により、光受容体先駆体の数が、14日目(図3J)から28日目(図3L、図5B)の間に徐々に増加したことが実証された。21日目から35日目の間に、これらのNR様構造は、その層状構造を喪失し、CRX及びリカバリン(RECOVRIN)陽性細胞を含む内部ロゼットを発達させた(図5B)。興味深いことに、7日間にわたる21日目におけるNotchインヒビターDAPTの添加は、CRX及びリカバリン陽性細胞の両方の数を劇的に増加させるのに十分である(図5B)。28日目から35日目までのDAPTによる後の処理もまた、CRX及びリカバリンを発現する細胞の数における大きな増加をもたらした(図5B)。21日目から28日目の間のDAPTによる1週間の処理は、光受容体先駆体の増強された生成を可能にしたが、これは、28日目に、CRX+及びリカバリン+細胞の数が、対照と比較して、それぞれ2.2倍及び2.6倍増加したからである(図5C)。付随して、Ki67染色によって28日目に評価した有糸分裂前駆体の集団は、28日目の処理の後に、大きく減少した(3分の1)(図5C)。Notch阻害の効果はまた、28日目から35日目の間に評価されたが、これは、DAPTへの長期曝露ではなく、いくつかのRPCが、DAPT処理後の28日目に残存したからである。これらの条件下で、Notch阻害は、NR様構造内の光受容体先駆体の数における増加、即ち、それぞれ、CRX+及びリカバリン+細胞の数における35日目における1.7倍及び4.1倍の増加もまたもたらした(図5D)。興味深いことに、35日目には通常は検出されない錐体−アレスチン+細胞が、DAPT処理後の時点で明確に同定できた(示さず)。さらに、qRT−PCR分析により、DAPT処理後の35日目における錐体−アレスチン発現の増加が確認されたが、ロドプシン、ブルーオプシン及びG/Rオプシンの遺伝子発現における顕著な変化は観察されなかった(図5E)。GLAST1発現は、DAPT処理後に減少した(図5E)。
考察
この研究は、無血清神経促進培地中でのコンフルエントなhiPSCの単純な培養が、2週間でNR様構造及びRPE細胞を生成するのに十分であるという新規知見を示している。本明細書に記載されるプロセスは、EBの形成及び選択、DKK1、ノギン(NOGGIN)及びWNT並びに/又はMatrigelなどの誘導分子の添加、並びに接着性基材上のEB被覆のステップを回避する。初期に生成される構造は、PAX6及びRAXの同時発現によって明らかなOV表現型、並びに神経上皮とRPEとの間でのVSX2及びMITFの正反対の勾配を示す。この効率は、コンフルエントなhiPSCによる、hESCS又はhiPSCの網膜分化のために一般的に添加される神経及び網膜特定化の2つの誘導因子DKK1及びノギン(NOGGIN)の漸増する内因性の生成に一部起因する可能性が高い(Meyerら、2011;Boucherieら、2013)。それにもかかわらず、以前の研究は、培養培地に添加された又はMatrigel中に存在するIGF−Iが、網膜前駆体識別性にhESCを指向させ得ることを報告しており(Lambaら、2006;Zhuら、2013)、これは、N2サプリメント中に既に存在しているインスリンが、上記条件における類似の役割を果たすのに十分であることを示唆している。
Barber, A.C., Hippert, C., Duran, Y., West, E.L., Bainbridge, J.W., Warre−Cornish, K., Luhmann, U.F., Lakowski, J., Sowden, J.C., Ali, R.R., and Pearson, R.A. (2013) Repair of the degenerate retina by photoreceptor transplantation. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 110, 354−359.
Basett, E.A., and Wallace, V.A. (2012) Cell fate determination in the vertebrate retina. Trends Neurosci. 9, 565−573.
Boucherie, C., Mukherjee, S., Henckaerts, E., Thrasher, A.J., Sowden, J.C., and Ali, R.R. (2013) Self−organizing neuroepithelium from human pluripotent stem cells facilitates derivation of photoreceptors. Stem Cells. 31, 408−414.
Boucherie, C., Sowden, J.C., and Ali, R.R. (2011) Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors. Regen. Med. 4, 469−479.
Buchholz, D.E., Hikita, S.T., Rowland, T.J., Friedrich, A.M., Hinman, C.R., Johnson, L.V., and Clegg, D.O. (2009) Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells 27, 2427−2434.
Chen, M., Chen, Q., Sun, X., Shen, W., Liu, B., Zhong, X., Leng, Y., Li, C., Zhang, W., Chai, F., Huang, B., Gao, Q., Xiang, A.P., Zhuo, Y., and Ge, J.(2010) Generation of retinal ganglion−like cells from reprogrammed mouse fibroblasts. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 11, 5970−5978.
Comyn, O., Lee, E., and MacLaren, R.E. (2010) Induced pluripotent stem cell therapies for retinal disease. Curr. Opin. Neurol. 1, 4−9.
Dahlmann−Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., and Khaw, P.T. (2010) Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Can. J. Ophthalmol. 4, 333−341.
Eberle D, et al. (2011) Increased integration of transplanted CD73−positive photoreceptor precursors into adult mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci 52: 6462−71.
Fuhrmann, S. (2010) Eye morphogenesis and patterning of the optic vesicle. Curr. Top. Dev. Biol. 93, 61−84.
Greber, B., Coulon, P., Zhang, M., Moritz, S., Frank, S., Muller−Molina, A.J., Arauzo−Bravo, M.J., Han, D.W., Pape, H.C., and Scholer, H.R. (2011) FGF signalling inhibits neural induction in human embryonic stem cells. EMBO J. 30, 4874−4784.
Griscelli F, et al. (2012) Malignant germ cell−like tumors, expressing Ki−1 antigen (CD30), are revealed during in vivo differentiation of partially reprogrammed human−induced pluripotent stem cells. Am J Pathol 180: 2084−96.
Horsford, D.J., Nguyen, M.T., Sellar, G.C., Kothary, R., Arnheiter, H., and McInnes, R.R. (2005) Chx10 repression of Mitf is required for the maintenance of mammalian neuroretinal identity. Development 1, 177−187.
Idelson, M., Alper, R., Obolensky, A., Ben−Shushan, E., Hemo, I., Yachimovich−Cohen, N., Khaner, H., Smith, Y., Wiser, O., Gropp, M., Cohen, M.A., Even−Ram, S., Berman−Zaken, Y., Matzrafi, L., Rechavi, G., Banin, E., and Reubinoff, B. (2009) Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells. Cell Stem Cell 5, 396−408.
Kokkinaki, M., Sahibzada, N., and Golestaneh, N. (2011) Human induced pluripotent stem−derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells 5, 825−835.
Jagatha, B., Divya, M.S., Sanalkumar, R., Indulekha, C.L., Vidyanand, S., Divya, T.S., Das, A.V., and James, J. (2009) In vitro differentiation of retinal ganglion−like cells from embryonic stem cell derived neural progenitors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 380, 230−235.
Jin, Z.B., Okamoto, S., Xiang, P., and Takahashi, M. (2012) Integration−free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl. Med. 6, 503−509.
Lamba, D.A., Karl, M.O., Ware, C.B., and Reh, T.A. (2006) Efficient generation of retinal progenitor cells from human embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 12769−12774.
Lamba, D.A., Gust, J. and Reh, T.A. (2009) Transplantation of human embryonic stem cell−derived photoreceptors restores some visual function in Crx−deficient mice. Cell Stem Cell 1, 73−79.
Lu, B., Malcuit, C., Wang, S., Girman, S., Francis, P., Lemieux, L., Lanza, R., and Lund, R. (2009) Long−term safety and function of RPE from human embryonic stem cells in preclinical models of macular degeneration. Stem Cells. 9, 2126−2135.
Martinez−Morales, J.R., Rodrigo, I., and Bovolenta, P. (2004) Eye development: a view from the retina pigmented epithelium. Bioessays. 7, 766−777.
Mathers, P.H., and Jamrich M. (2000) Regulation of eye formation by the Rx and pax6 homeobox genes. Cell. Mol. Life Sci. 2, 186−194.
Mellough, C.B., Sernagor, E., Moreno−Gimeno, .I, Steel, D.H., and Lako, M. (2012) Efficient stage−specific differentiation of human pluripotent stem cells toward retinal photoreceptor cells. Stem Cells 30, 673−686.
Meyer, J.S., Shearer, R.L., Capowski, E.E., Wright, L.S., Wallace, K.A., McMillan, E.L., Zhang, S.C., and Gamm, D.M. (2009) Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 16698−16703.
Meyer, J.S., Howden, S.E., Wallace, K.A., Verhoeven, A.D., Wright, L.S., Capowski, E.E., Pinilla, I., Martin, J.M., Tian, S., Stewart, R., Pattnaik, B., Thomson, J.A., and Gamm, D.M. (2011) Optic vesicle−like structures derived from human pluripotent stem cells facilitate a customized approach to retinal disease treatment. Stem Cells 29, 1206−1218.
Nakano, T., Ando, S., Takata, N., Kawada, M., Muguruma, K., Sekiguchi, K., Saito, K., Yonemura, S., Eiraku, M., and Sasai, Y. (2012) Self−formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell 10, 771−785.
Nishida, A., Furukawa, A., Koike, C., Tano, Y., Aizawa, S., Matsuo, I., and Furukawa, T. (2003) Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nat. Neurosci. 12, 1255−1263.
Osakada, F., Ikeda, H., Mandai, M., Wataya, T., Watanabe, K., Yoshimura, N., Akaike, A., Sasai, Y., and Takahashi, M. (2008) Toward the generation of rod and cone photoreceptors from mouse, monkey and human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 26, 215−224.
Osakada, F., Jin, Z.B., Hirami, Y., Ikeda, H., Danjyo, T., Watanabe, K., Sasai, Y., and Takahashi, M. (2009) In vitro differentiation of retinal cells from human pluripotent stem cells by small−molecule induction. J. Cell. Sci. 122, 3169−3179.
Parameswaran, S., Balasubramanian, S., Babai, N., Qiu, F., Eudy, J.D., Thoreson, W.B., and Ahmad, I. (2010) Induced pluripotent stem cells generate both retinal ganglion cells and photoreceptors: therapeutic implications in degenerative changes in glaucoma and age−related macular degeneration. Stem Cells 4, 695−703.
Pearson, R.A., Barber, A.C., Rizzi, M., Hippert, C., Xue, T., West, E.L., Duran, Y., Smith, A.J., Chuang, J.Z., Azam, S.A., Luhmann, U.F., Benucci, A., Sung, C.H., Bainbridge, J.W., Carandini, M., Yau, K.W., Sowden, J.C., and Ali, R.R. (2012) Restoration of vision after transplantation of photoreceptors. Nature 485, 99−103.
Roger, J., Brajeul, V., Thomasseau, S., Hienola, A., Sahel, J−A., Guillonneau, X., and Goureau, O. (2006) Involvement of Pleiotrophin in CNTF−mediated differentiation of the late retinal progenitor cells. Dev.Biol. 298, 527−539.
Tucker, B.A., Anfinson, K.R., Mullins, R.F., Stone, E.M., and Young, M.J. (2013) Use of a synthetic xeno−free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation. Stem Cells Transl. Med. 1, 16−24.
Zahabi, A., Shahbazi, E., Ahmadieh, H., Hassani, S.N., Totonchi, M., Taei, A., Masoudi, N., Ebrahimi, M., Aghdami, N., Seifinejad, A., Mehrnejad, F., Daftarian, N., Salekdeh, G.H., and Baharvand, H. (2012) A new efficient protocol for directed differentiation of retinal pigmented epithelial cells from normal and retinal disease induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 21, 2262−2272.
Vaajasaari, H., Ilmarinen, T., Juuti−Uusitalo, K., Rajala, K., Onnela, N., Narkilahti, S., Suuronen, R., Hyttinen, J., Uusitalo, H., and Skottman, H. (2011) Toward the defined and xeno−free differentiation of functional human pluripotent stem cell−derived retinal pigment epithelial cells. Mol. Vis. 17, 558−575
Yu, J., Hu, K., Smuga−Otto, K., Tian, S., Stewart, R., Slukvin, I.I., and Thomson, J.A. (2009) Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science 324, 797−801.
Zhang, Y., Li, W., Laurent, T., and Ding, S. (2012) Small molecules, big roles − the chemical manipulation of stem cell fate and somatic cell reprogramming. J. Cell. Sci. 125, 5609−5620.
Zhu, Y., Carido, M., Meinhardt, A., Kurth, T., Karl, M.O., Ader, M., and Tanaka, E.M. (2013) Three−dimensional neuroepithelial culture from human embryonic stem cells and its use for quantitative conversion to retinal pigment epithelium. PLoS One. 2013;8(1):e54552.
Claims (16)
- ヒト網膜前駆体をin vitroで得るための方法であって、
(i)神経促進培地中にヒト多能性幹細胞の接着性培養物を配置するステップ;並びに
(ii)色素細胞及び/又は神経上皮様構造の出現まで、前記神経促進培地中でこの培養物を維持するステップ、
を含む、上記方法。 - 前記神経促進培地が、分化因子ノギン(noggin)、Dkk−1及びIGF−1、のうちの少なくとも1つを欠く、請求項1に記載の方法。
- 前記神経促進培地が、ノギン(noggin)、Dkk−1及びIGF−1を欠く、請求項2に記載の方法。
- ステップ(i)において、多能性幹細胞が、少なくとも80%コンフルエンスに達するコロニー型単層を形成する、請求項1から3までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(ii)が、少なくとも7日間の間実施される、請求項1から4までのいずれか一項に記載の方法。
- 網膜色素上皮細胞(RPE細胞)を得るための、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法であって、
(iiiRPE)ステップ(ii)において得られた培養物から、少なくとも1つの色素細胞を収集するステップ;及び
(ivRPE)ステップ(iiiRPE)において得られた色素細胞(単数又は複数)を培養するステップ、
をさらに含む、上記方法。 - ステップ(ivRPE)における培養が、接着性培養系において実施される、請求項6に記載の方法。
- 神経網膜細胞を得るための、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法であって、
(iiiNR)ステップ(ii)において得られた培養物から、少なくとも1つの神経上皮様構造由来の細胞を収集するステップ;及び
(ivNR)ステップ(iiiNR)において得られた細胞を培養するステップ、
をさらに含む、上記方法。 - 少なくとも1つの神経上皮様構造が、ステップ(iiiNR)において収集される、請求項8に記載の方法。
- ステップ(ivNR)における培養が、非接着性培養系において実施される、請求項8又は請求項9に記載の方法。
- ステップ(ivNR)において、培養培地に、少なくとも5日間の間、FGF2が補充される、請求項8から10までのいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(ivNR)における培養が、振盪条件下で実施される、請求項8から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 光受容体先駆体を得るための、請求項8から12までのいずれか一項に記載の方法であって、ステップ(ivNR)が、少なくとも21日間の間実施される、上記方法。
- ステップ(ivNR)において、Notchインヒビターが、少なくとも1〜5日間の間、培養培地に添加される、請求項13に記載の方法。
- 細胞表面マーカーCD73の結合を介して、光受容体先駆体を細胞ソーティングするステップをさらに含む、請求項13又は請求項14に記載の方法。
- RPE細胞、及び神経網膜の先駆体の両方を得るための、請求項1から15までのいずれか一項に記載の方法であって、請求項6又は請求項7において規定されるステップ(iiiRPE)及び(ivRPE)が、請求項8から14までのいずれか一項において規定されるステップ(iiiNR)及び(ivNR)と並行して実施される、上記方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP20130165654 EP2796545A1 (en) | 2013-04-26 | 2013-04-26 | Methods for obtaining retinal progenitors, retinal pigmented epithelial cells and neural retinal cells |
EP13165654.8 | 2013-04-26 | ||
PCT/IB2014/061010 WO2014174492A1 (en) | 2013-04-26 | 2014-04-25 | Methods for obtaining retinal progenitors, retinal pigmented epithelial cells and neural retinal cells |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016516434A true JP2016516434A (ja) | 2016-06-09 |
JP6482005B2 JP6482005B2 (ja) | 2019-03-13 |
Family
ID=48190294
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016509595A Active JP6482005B2 (ja) | 2013-04-26 | 2014-04-25 | 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るための方法 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9994815B2 (ja) |
EP (2) | EP2796545A1 (ja) |
JP (1) | JP6482005B2 (ja) |
KR (1) | KR102146007B1 (ja) |
CN (1) | CN105492596B (ja) |
AU (1) | AU2014258981B2 (ja) |
CA (1) | CA2909851C (ja) |
DK (1) | DK2989200T3 (ja) |
ES (1) | ES2868360T3 (ja) |
IL (1) | IL242224B (ja) |
PT (1) | PT2989200T (ja) |
WO (1) | WO2014174492A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020508653A (ja) * | 2017-02-17 | 2020-03-26 | ソルボンヌ・ユニヴェルシテ | 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るフィーダーフリーの方法 |
Families Citing this family (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR102073730B1 (ko) | 2009-11-17 | 2020-02-05 | 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 | 인간 rpe 세포의 생산 방법 및 인간 rpe 세포의 제약 제제 |
US11241460B2 (en) | 2013-03-15 | 2022-02-08 | Astellas Institute For Regenerative Medicine | Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells |
EP3178925B1 (en) * | 2014-08-08 | 2021-10-06 | National Center For Child Health And Development | Method for producing retinal ganglion cells |
CN106318909B (zh) * | 2015-06-23 | 2019-04-05 | 何伟 | 一种具有治疗视网膜退行性病变功能的视网膜祖细胞及其制剂 |
WO2017219062A1 (en) * | 2016-06-23 | 2017-12-28 | The University Of Sydney | Methods for differentiating cells into cells with a muller cell phenotype, cells produced by the methods, and methods for using the cells |
CN109423480B (zh) * | 2017-12-21 | 2022-04-12 | 中山大学中山眼科中心 | 一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法 |
CN109988750A (zh) * | 2017-12-29 | 2019-07-09 | 江苏艾尔康生物医药科技有限公司 | 一种视网膜色素上皮细胞的培养方法 |
WO2019170766A1 (en) | 2018-03-07 | 2019-09-12 | Sorbonne Universite | Compositions and methods for efficent amplification of retinal progenitors cells |
CN108795864B (zh) * | 2018-05-24 | 2021-08-24 | 中山大学中山眼科中心 | 一种利用人诱导多能干细胞获得富含视锥及视杆细胞的类视网膜组织的方法 |
SG11202109855PA (en) * | 2019-03-13 | 2021-10-28 | Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd | Method for evaluating quality of transplant neural retina, and transplant neural retina sheet |
EP4110899A4 (en) * | 2020-02-28 | 2024-03-20 | Riken | METHOD FOR PRODUCING A RETINAL PIGMENT EPITHELIAL CELL |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2383333A1 (en) * | 2010-04-28 | 2011-11-02 | Technische Universität Dresden | Method for producing polarized retinal progenitor cells from pluripotent stem cells and their differentiation into retinal pigment epithelium cells |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL162648A0 (en) * | 2001-12-21 | 2005-11-20 | Mount Sinai Hospital Corp | Cellular compositions and methods of making and using them |
JP4389087B2 (ja) * | 2003-06-11 | 2009-12-24 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 虹彩組織由来の神経幹細胞から網膜神経細胞を生産する方法 |
EP4248752A3 (en) * | 2004-01-23 | 2024-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Improved modalities for the treatment of degenerative diseases of the retina |
WO2009132156A1 (en) * | 2008-04-22 | 2009-10-29 | Regenerative Research Foundation | Retinal pigment epithelial stem cells |
EP2470645B1 (en) * | 2009-08-24 | 2019-06-26 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Substantially pure human retinal progenitor, forebrain progenitor, and retinal pigment epithelium cell cultures and methods of making the same |
KR102073730B1 (ko) * | 2009-11-17 | 2020-02-05 | 아스텔라스 인스티튜트 포 리제너러티브 메디슨 | 인간 rpe 세포의 생산 방법 및 인간 rpe 세포의 제약 제제 |
FI20106354A0 (fi) * | 2010-12-20 | 2010-12-20 | Suomen Punainen Risti Veripalvelu | Menetelmä ihmisen retinan pigmentti-epiteelisolujen valmistamiseksi |
-
2013
- 2013-04-26 EP EP20130165654 patent/EP2796545A1/en not_active Withdrawn
-
2014
- 2014-04-25 PT PT147264196T patent/PT2989200T/pt unknown
- 2014-04-25 US US14/786,427 patent/US9994815B2/en active Active
- 2014-04-25 JP JP2016509595A patent/JP6482005B2/ja active Active
- 2014-04-25 CA CA2909851A patent/CA2909851C/en active Active
- 2014-04-25 ES ES14726419T patent/ES2868360T3/es active Active
- 2014-04-25 EP EP14726419.6A patent/EP2989200B1/en active Active
- 2014-04-25 WO PCT/IB2014/061010 patent/WO2014174492A1/en active Application Filing
- 2014-04-25 KR KR1020157033001A patent/KR102146007B1/ko active IP Right Grant
- 2014-04-25 CN CN201480029524.1A patent/CN105492596B/zh active Active
- 2014-04-25 AU AU2014258981A patent/AU2014258981B2/en active Active
- 2014-04-25 DK DK14726419.6T patent/DK2989200T3/da active
-
2015
- 2015-10-22 IL IL242224A patent/IL242224B/en active IP Right Grant
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2383333A1 (en) * | 2010-04-28 | 2011-11-02 | Technische Universität Dresden | Method for producing polarized retinal progenitor cells from pluripotent stem cells and their differentiation into retinal pigment epithelium cells |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
CELL STEM CELL, 2012, VOL.10, P.771-785, JPN6018010317 * |
EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, 2006, VOL.82, P.265-274, JPN6018010319 * |
EXPERIMENTAL EYE RESEARCH, 2008, VOL.86, P.957-965, JPN6018010315 * |
JOURNAL OF CELL SCIENCE, 2009, VOL.122, P.3169-3179, JPN6018010321 * |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020508653A (ja) * | 2017-02-17 | 2020-03-26 | ソルボンヌ・ユニヴェルシテ | 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るフィーダーフリーの方法 |
JP7260475B2 (ja) | 2017-02-17 | 2023-04-18 | ソルボンヌ・ユニヴェルシテ | 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るフィーダーフリーの方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR102146007B1 (ko) | 2020-08-19 |
EP2989200B1 (en) | 2021-01-20 |
CA2909851C (en) | 2021-11-09 |
CA2909851A1 (en) | 2014-10-30 |
DK2989200T3 (da) | 2021-04-26 |
EP2989200A1 (en) | 2016-03-02 |
EP2796545A1 (en) | 2014-10-29 |
JP6482005B2 (ja) | 2019-03-13 |
AU2014258981B2 (en) | 2019-12-05 |
WO2014174492A1 (en) | 2014-10-30 |
KR20160002969A (ko) | 2016-01-08 |
US9994815B2 (en) | 2018-06-12 |
AU2014258981A1 (en) | 2015-12-03 |
IL242224B (en) | 2020-03-31 |
US20160060596A1 (en) | 2016-03-03 |
PT2989200T (pt) | 2021-04-26 |
CN105492596A (zh) | 2016-04-13 |
CN105492596B (zh) | 2020-03-17 |
ES2868360T3 (es) | 2021-10-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6482005B2 (ja) | 網膜前駆体、網膜色素上皮細胞及び神経網膜細胞を得るための方法 | |
US20200333326A1 (en) | Human trophoblast stem cells and uses thereof | |
Tucker et al. | Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation | |
Liu et al. | Neural crest stem cells and their potential therapeutic applications | |
JP7055638B2 (ja) | 幹細胞からの筋肉系列細胞の生成 | |
Zahabi et al. | A new efficient protocol for directed differentiation of retinal pigmented epithelial cells from normal and retinal disease induced pluripotent stem cells | |
CA2811732C (en) | Cell culture substrate, and cell culturing method using the substrate and method for inducing differentiation of pluripotent stem cells using the substrate | |
JP7219618B2 (ja) | 物理的刺激による環境流入を用いた細胞のリプログラミング方法 | |
JP2005502356A (ja) | 治療のための腸内幹細胞の分離、培養および分化方法 | |
Limnios et al. | Efficient differentiation of human embryonic stem cells to retinal pigment epithelium under defined conditions | |
WO2018149985A1 (en) | Feeder-free methods for obtaining retinal progenitors, retinal pigmented epithelial cells and neural retinal cells | |
Bosch et al. | Discovering the potential of dental pulp stem cells for corneal endothelial cell production: a proof of concept | |
JP2023054306A (ja) | 無担体3d球体浮遊培養における網膜ニューロン生成のための方法および組成物 | |
Soleimanifar et al. | Coculture of conjunctiva derived mesenchymal stem cells (CJMSCs) and corneal epithelial cells to reconstruct the corneal epithelium | |
US20100233136A1 (en) | Isolated populations of cells and methods of generating and using same | |
WO2022239868A1 (ja) | 網膜組織の製造方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170331 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180322 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180621 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180822 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20180921 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181004 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20180921 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190104 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190116 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190205 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6482005 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313115 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |