KR102146007B1 - 망막 전구 세포, 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막 세포를 얻기 위한 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 만능 줄기 세포를 신경 형성 촉진성 배지 내에서 부착배양 하는 단계 (ⅰ); 및 상기 신경 형성 촉진성 배지 내 상기 배양물을 색소 침착 세포 및/또는 신경 상피-유사 구조체가 나타날 때까지 유지시키는 단계 (ⅱ)를 포함하는 인 비트로에서 인간 망막 전구체를 얻는 방법에 관한 것이다. 유리하게는 RPE 세포 및/또는 신경 망막의 전구체를 얻기 위한 추가적인 단계가 수행될 수 있다.

Description

망막 전구 세포, 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막 세포를 얻기 위한 방법{Method for obtaining retinal progenitors, retinal pigmented epithelial cells and neural retinal cells}
망막 전구 세포, 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막 세포를 얻기 위한 방법에 관한 것이다.
광수용체 세포 또는 망막 색소 침착 상피(retinal pigmented epithelium: RPE)를 지지하는 기능의 장애 또는 완전한 손실은 유전된 망막 변성 및 노화-관련 황반 변성(age-related macular degeneration: AMD) 등의 망막 질병에서 비가역적인 실명의 주요한 원인이다. 녹내장에서 망막 신경절 세포(Retinal ganglion cell: RGC)의 사멸은 결국 시야의 비가역적인 손실로 이어진다. 변성된 망막을 구출하는 것은 주요한 과제이며 세포의 교체가 가장 유망한 접근법 중 하나이다(Pearson et al., 2012; Barber et al., 2013). 인간 만능(pluripotent) 줄기 세포, 배아 줄기(ES) 세포, 유도 만능 줄기(iPS) 세포의 이용은 인간 망막 변성 질병에 대한 새로운 길을 열어준다. 배양시에 이들의 만능 상태를 유지하면서 무한정으로 확장될 수 있는 능력을 갖는 인간 ES(hES) 및 iPS(hiPS) 세포는 조직 이식을 위한 무제한적인 망막 세포(광수용체, RPE 및 RGC)의 원천으로서 사용될 수 있다(reviews in: Comyn et al., 2010; Dahlmann-Noor et al., 2010, Boucherie et al., 2011). 그러나, 이러한 신기술은 여전히 많은 문제에 직면한다. 특히, 현재의 분화 과정은 효율과 안정성을 보장할 만큼 정교하지 않다. 몇몇 공개 문헌들은 hES 및 hiPS 세포가 세포 배양물에서 콜로니의 자발적인 분화(Buchholz et al., 2009; Vaajasaari et al., 2011; Zahabi et al., 2012) 또는 다른 부유 집합 방법(floating aggregate methods)(Idelson et al., 2009; Lu et al., 2009; Kokkinaki et al., 2011)에 의해 상대적으로 쉽게 RPE 세포로 분화될 수 있음을 나타낸다. 증가하는 양의 수렴적 데이터는 hES 또는 hiPS가 배아체 형성 이후 신경 망막 계통에 얽히고(committed) 광수용체 마커를 발현하는 세포로 더욱 분화하는 능력을 증명하였다(Lamba et al., 2006, 2009; Osakada et al., 2008, 2009; Meyer et al., 2009, Mellough et al., 2012). 이전에 개발된 여러 방법들은 여전히, 비록 실제로 진보한 것이지만, 일반적으로 만능 줄기 세포가 고도로 전문화된 세포 유형으로 분화하는 것과 관련 있는 단점을 겪고 있다. hES 또는 hiPS 세포의 광수용체-지향 분화에 대한 이러한 프로토콜은 여러 단계 및 여러 분자의 첨가를 필요로 하고, 보다 비효율적이다. 최근 다른 그룹들이 hES 또는 hiPS 세포의 배아체로부터의 시신경 소포-유사 구조의 3D 구조를 얻기 위한 추가적인 시도를 하였다(Meyer et al., 2011; Nakano et al., 2012). 분화 방법은 배아체 주변의 복합체 세포외기질(extracellular matrix: ECM)을 되살리고, 신경 상피(neuroepithelium)의 자가 형성 및 광수용체 세포 계통으로의 다소 빠른 분화를 허용케 하기 위해 마트리겔을 사용하였다(Meyer et al., 2011; Nakano et al., 2012; Boucherie et al., 2013; Zhu et al., 2013).
따라서, 본 기술 분야에서는 인 비트로(in vitro) 분화 및 발달에서 정확한 모델인 망막 전구체(progenitor), RPE 세포 및 신경 망막 세포를 포함하는 실질적으로 순수한 특정 인간 신경 상피 계통 세포의 배양물을 얻기 위한 단순하고, 효율적이고 및 신뢰할 수 있는 방법이 요구된다.
하기의 실험 부분에서 개시되는 바와 같이, 본 발명자는 iPS 세포에 2D 및 3D 배양 시스템을 결합한 새로운 망막 분화 프로토콜을 적용하였다. 이러한 프로토콜은 배아체 또는 세포 덩어리의 형성을 피하고, 마트리겔 또는 혈청 없이도 수행될 수 있다. 본 발명자는 신경 형성 촉진성(pro-neural) 배지 내에서 배양된 융합성(confluent) hiPS 세포가 2주 내에 안구 분야(field) 정체성을 갖는 신경 상피-유사 구조체를 발생시키고, 이는 3D 배양으로 전환하는 경우 주요 망막 세포 유형으로 분화할 수 있음을 증명하였다. 이러한 조건 하에서, hiPS 세포는 발달적으로 적절한 시간 창(time window) 내 망막 마커의 급격한 발현과 함께 신경 망막-유사 조직으로 자가-조직화(self-assembled)된다; 이들은 RGC 및 광수용체 등의 여러 망막 세포 유형이 생기게 한다.
따라서 본 발명의 제1 목표는 하기의 단계를 포함하는 인 비트로에서 인간 망막 전구 세포를 얻기 위한 방법이다:
(ⅰ) 인간 만능 줄기 세포의 부착성(adherent) 배양물을 신경 형성 촉진성 배지에 위치시키는 단계; 및
(ⅱ) 상기 신경 형성 촉진성 배지 내 상기 배양물을 색소 침착 세포(pigmented cell) 및/또는 신경 상피-유사 구조체가 나타날 때까지 유지시키는 단계.
본 문헌에서, "망막 전구체(retinal progenitor)" 또는 "망막 전구 세포(retinal progenitor cell)"는 RPE로 분화할 수 있을 뿐만 아니라, 광수용체의 전구체를 포함하는 신경 망막의 모든 세포 유형을 발생시키는 능력이 있는 세포를 포함한다.
"인간 만능 줄기 세포(Human pluripotent stem cell)"는 인간 배아 줄기(hES) 세포 및 인간 유도 만능 줄기(hiPS) 세포를 포함한다. 상기 방법은 인간 유도 만능 줄기 세포로 유리하게 수행될 수 있다.
본 명세서의 "신경 형성 촉진 배지(pro-neural medium)"는 신경 세포의 유지 및/또는 성장을 우선적으로 하게 하는 임의의 배양 배지를 가리킨다. 이러한 배지의 비제한적인 예시는 Dulbeco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) 또는 Neurobasal® Medium (Gibco®) 등의 영양 배지로 구성된 임의의 배지이고, 상기 영양 배지는 하기 요소의 적어도 일부를 포함하는 배지 보충물로 보충된다: 탄소원, 비타민, 무기염, 아미노산 및 단백질 소화제. 신경 형성 촉진 배지를 얻기 위한 적절한 보충물의 비제한적인 예시는 N2, B27, G5 및 BIT9500 보충물, 또한 이것들로부터 유래된 임의의 보충물들이다. 이러한 보충물에 존재하는 성분들은 하기 표 1에 요약되어 있다.
Figure 112015112643513-pct00001
표 1: 신경 형성 촉진 배지를 위한 4개의 배지 보충물의 조성. a Brewer et al., 1993 참조; b 제조사로부터 제공됨(Gibco BRL, Germany); c 제조사로부터 제공됨(StemCell Technologies Inc., Canada); d 제조사로부터 제공됨(Life Technologies, USA).
하기 실험 부분에서 "신경 망막-유사 구조(neural retina-like structure)"라고도 불리는 앞서 기재된 "신경 상피-유사 구조체(neuroepithelial-like structure)"는 신경 형성 촉진 배지 내에서 배양 수일 후에 나타나기 시작하는 위상-선명(phase-bright) 구조체를 가리킨다. 이러한 구조는 기본적으로 OCT4 등의 만능-관련 유전자들을 현저하게 발현하지 않고, LHX2, RAX, PAX6 및 SIX3 등의 안구 분야 특정화(specification)와 관련 있는 전사 요소를 발현하는 세포로 만들어진다. 실험 부분에서 개시되는 바와 같이, 상기 방법을 수행할 때 색소 침착 세포가 최초로 나타나며, 신경 상피-유사 구조체가 색소 침착 세포의 패치(patch)의 부근에서 가장 자주 나타난다.
물론, 본 발명에 따르는 방법을 수행하는 경우, 당업자는 다양한 마커의 발현을 검출할 수 있다(이들의 발현 또는 이들이 더 이상 발현되지 않는다는 사실을 확인 및/또는 이들의 발현 수준을 정량적으로 측정하기 위함). 당업계에 알려진 임의의 기술들이 본 목적을 위해 사용될 수 있고, 예를 들면 정량적 RT-PCR 및 면역분석법 등이 있다. 만능성에 대한 마커의 예시는 OCT4, SOX2 및 NANOG이다; 안구 분야에 대한 마커의 예시는 RAX, PAX6, OTX2, LHX2 및 SIX3이다. 처음 두 개의 것이 바람직하다.
유리하게, 상기 방법들은 복잡하고 비싼 배지들 없이 수행될 수 있다. 실제로, 매우 간단한 배지가 만능 줄기 세포의 부착 배양으로부터 인간 망막 전구체를 얻기 위해 사용될 수 있다. 특히, 분화 인자가 요구되지 않는다. 상기 방법의 바람직한 구체예에 따르면, 배양 단계에서 사용되는 신경 형성 촉진 배지는 하기의 분화 인자 중 적어도 하나가 결여된 것이다: noggin, Dkk-1 및 IGF-1. 특히, 상기 신경 형성 촉진 배지는 상기 3개의 인자가 결여될 수 있다.
단계 (ⅰ)에서 사용되는 인간 만능 줄기 세포는 모든 종류의 부착성 배양 시스템에서 배양될 수 있다. 이러한 배양에서 사용될 수 있는 표면의 비제한적인 예시는 다음과 같다: 유리, 플라스틱(처리 가능), 콜라겐, 라피닌, 피브로넥틴, 마트리겔TM, 폴리-L-리신, 영양 세포, 또는 Corning SynthemaxTM 등의 상업적으로 이용가능한 임의의 합성 표면. 바람직한 구체예에서, 상기 방법의 단계 (ⅰ)에서 사용되는 부착 배양은 적어도 80%의 융합성에 도달하는 콜로니-유형 단층(monolayer)의 형태이다. 당업자는 부착성 세포에 대한 융합성의 개념에 익숙할 것이고, 국소적으로, 즉 오직 용기(recipeint)의 일 영역에서만 인식할 수 있는, 특히 상기 융합성이 전체 배양 표면 상에서 균일하지 않은 경우는 더욱 그러한, 이러한 융합성을 평가할 수 있을 것이다. 콜로니-유형 단층의 경우, "80% 융합성(80% confluence)"은, 필요하다면, 일부 콜로니들이 다른 콜로니들과 정시적으로(punctually) 접촉할 때, 일부 여유 공간(표면의 10 내지 30%로 나타나는)이 이러한 콜로니들 사이에 남아 있는 상황으로 정의될 수 있다.
실험 부분에 기재된 바와 같이, 그리고 이는 비록 강제적인 것은 아니지만, 본 발명에 따르는 방법은 만능 줄기 세포의 유지를 위한 배양 배지 내의 상기 만능 줄기 세포의 부착성 배양의 단계가 단계 (ⅰ)보다 선행되도록 수행할 수 있고, 1일 내지 4일, 바람직하게는 2일간 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF/FGF2)가 결여되도록 수정할 수 있다. 본 추가적인 단계를 위한 적절한 배지의 비제한적인 예시는 Primate ES Cell Medium 및 ReproCELL의 ReproStem 배지이다.
상기 방법의 특정 구체예에서, 단계(ⅱ)는 신경 상피-유사 구조체의 충분한 양이 나타나도록 적어도 7일, 바람직하게는 10 내지 14일간 수행된다. 물론, 상기 배양 방법은 단계 (ⅱ)가 짧아질 수 있도록 개량될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 신경 상피-유사 구조체는 기본적으로 OCT4 등의 만능-관련 유전자들을 현저하게 발현하지 않고, 안구 분야 특정화와 관련 있는 전사 요소를 발현하는 세포로 만들어진다. 그러므로, 배양 시스템에 의존적으로, 당업자는 단계 (ⅱ)의 끝을 적어도 일부 세포들이 OCT4의 발현을 정지 및/또는 RAX 및 PAX6의 발현을 시작하는 때로 정하는 것을 선택할 수 있다. 이미 언급한 바와 같이, 이러한 특성화(characterization)는 qRT-PCR 또는 면역염색 등의 임의의 알려진 기술로 수행할 수 있다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 RPE 세포를 얻기 위한 방법에 관한 것이고, 상기 방법은 하기의 단계들을 포함한다:
(ⅰ) 인간 만능 줄기 세포를 신경 형성 촉진성 배지에서 부착배양 하는 단계;
(ⅱ) 상기 신경 형성 촉진성 배지 내 상기 배양물을 색소 침착 세포가 나타날 때까지 유지시키는 단계;
(ⅲRPE) 단계 (ⅱ)에서 얻은 배양물로부터, 하나 이상의 색소 침착 세포를 수득하는 단계; 및
(ⅳRPE) 상기 단계 (ⅲRPE)에서 얻은 색소 침착 세포(들)를 배양하는 단계.
본 방법을 수행할 때, 당업자는 단계 (ⅲRPE)에서 수득한 세포들이 소안구증-연관 전사 인자(microphthalmia-associated transcription factor: MITF)를 발현하는지를 확인할 수 있다. 이미 언급한 바와 같이, 당업계에 알려진 임의의 기술(qRT-PCR 및 면역 염색 등)이 본 목적에 사용될 수 있다.
RPE 세포를 얻기 위한 상기 방법의 바람직한 구체예에 따르면, 단계 (ⅳRPE)의 배양은 부착성 배양 시스템 내에서 수행된다. 상기 언급한 바와 같이 임의의 부착성 배양 시스템이 사용될 수 있다.
RPE 세포를 얻기 위한 본 발명의 방법을 수행할 때, 상기 세포들은 적어도 5일간 단계 (ⅳRPE)에서 증폭된다. 유리하게는, 단계 (ⅳRPE)의 배양은 몇 주 동안 유지 및 증폭될 수 있고, 거대한 양의 RPE 세포를 얻을 수 있다: 예를 들면, 색소 침착 세포의 약 10 패치를 단계 (ⅲRPE)에서 수득하고 3 cm2의 새로운 디시에 함께 위치시키고, 실질적으로 순수한(99%) RPE 세포의 융합성 부착성 배양물을 3 내지 4주 후, 또는 FGF2가 배양 배지에 첨가(2 내지 3일마다 10 ng/ml씩)된다면 10 내지 14일 후에 얻는다.
본 발명의 또 다른 측면은 신경 망막 세포를 얻는 방법으로, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
(ⅰ) 인간 만능 줄기 세포를 신경 형성 촉진성 배지에서 부착배양 하는 단계;
(ⅱ) 상기 신경 형성 촉진성 배지 내 상기 배양물을 신경 상피-유사 구조체가 나타날 때까지 유지시키는 단계;
(ⅲNR) 단계 (ⅱ)에서 얻은 배양물로부터, 하나 이상의 신경 상피-유사 구조체로부터의 세포를 수득하는 단계; 및
(ⅳNR) 상기 단계 (ⅲNR)에서 얻은 세포를 배양하는 단계.
본 명세서의 "신경 망막 세포(neural retinal cell)"는 RGC, 양극성 세포(bipolar cell), 수평 세포(horizontal cell), 무축삭 세포(amacrine cell), 광수용체 세포(막대 및 원추), 뮐러 글리아 세포(Muller glial cell), 및 이들 모든 세포 유형의 전구체까지도 포함한다.
중요한 것은, 다양한 신경 망막 세포는 배양된 세포가 분화하는 단계 (ⅳNR) 중의 동일한 시간에 나타나지는 않는다는 것이다. 그러므로, 단계 (ⅳNR)의 지속에 의존적으로 여러 세포 유형이 형성된다. 나타나는 순서는 하기와 같다: 신경절 세포(ganglion cell)가 최초로 나타나고, 이후 무축삭 세포 및 수평 세포, 및 광수용체가 나중에 나타난다. 요구되는 세포-유형에 의존적으로, 당업자는 그에 따라서 배양 단계 (ⅳNR)를 21 내지 42일간 수행할 것이다.
하기 실험 부분에서 예시된 바와 같이, 본 발명의 본 측면에 따르는 방법은 단계 (ⅲNR)에서 적어도 하나의 신경 상피-유사 구조체를 수득하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 이는 기계적으로 상기 구조체를 부착성 세포 층으로부터 분리하여 수행될 수 있다. 상기 구조체는 이후 멀티웰 플레이트, 페트리 디시, 플라스크 등과 같은 다른 배양 용기에 단독 또는 다른 신경 상피-유사 구조체와 함께 위치시킬 수 있다.
본 방법을 수행할 때, 당업자는 유리하게는 단계 (ⅲNR)에서 수득한 세포가 안구 분야 세포의 특징으로 PAX6 및 RAX를 동시-발현하는지를 확인할 수 있다. 대안적 또는 추가적으로, 단계 (ⅲNR)에서 수득한 세포에 의한 세포 증식 마커 Ki67의 발현이 측정될 수 있다.
특정 유리한 측면에 따르면, 본 발명은 상기 단계 (ⅰ) 내지 (ⅳNR)를 포함하는 광수용체 전구체를 얻는 방법과 관련이 있고, 상기 단계 (ⅳNR)는 적어도 21일간 수행되고, 바람직하게는 적어도 28일간 수행된다. 물론, 배양 조건의 향후 개발에 의존적으로, 본 단계는 더욱 짧아질 수 있다.
단계 (ⅳNR) 동안 임의의 시간에서, 당업자는, 배양되는 세포 내 NRL 및/또는 CRX의 발현을, 예를 들면 qRT-PCR로 측정하여, 광수용체 계통으로의 분화를 확인할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 광수용체 전구체는 하기 실험 부분에 개시된 바와 같이 리커버린(RECOVERIN) 면역 염색으로 확인할 수 있다. 본 발명자는 또한 광수용체 전구체의 세포 분류를 위한 세포 표면 마커로서 사용될 수 있는 CD73이 리커버린과 동시 발현되는 것을 증명하였다. 이러한 점은 단계 (ⅳNR) 후 광수용체 전구체의 세포 분류 단계를 추가적으로 더하여, 예를 들면 항-CD73 항체를 이용하여, 유리하게 이용될 수 있다. 그 결과물인 광수용체 전구체가 풍부한 세포군은, 예를 들면 세포 이식 또는 스크리닝 방식에 이용될 수 있다.
선택적으로, DAPT 등의 Notch 저해제가 단계 (ⅳNR)에서 적어도 1일간, 바람직하게는 5일간 또는 그 이상의 기간 동안 배양 배지에 첨가될 수 있다. DAPT는 γ-세크레타제(secretase) 저해제 및 간접적인 Notch의 저해제이고, 본 발명자들은 단계 (ⅳNR)에서 며칠간 이를 첨가하는 것이 광수용체 전구체의 발생에 유리한 것을 발견하였다(하기 실시예 2 및 도 5 참조).
상기 개시된 신경 망막 세포를 얻는 방법의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 단계 (ⅳNR)의 배양은 비-부착성 배양 시스템에서 수행된다. 예를 들면, 단계 (ⅲNR)에서 수득한 신경 상피-유사 구조체는 부유 구조(floating structure)로서 배양된다. 특정 구체예에 따르면, 각각의 단계 (ⅲNR)에서 수득한 신경 상피-유사 구조체는 개별적인 용기/웰에서 부유 구조로서 배양된다.
비-부착성 시스템의 비제한적인 예시는, 세포가 배지 내에서 동적으로 현탁되는 것이 유지되는, 자기적으로 회전하는 스피너(spinner) 플라스크 또는 진탕(shaken) 플라스크 또는 디시뿐만 아니라, 비록 세포의 교반이 유지되지는 않지만, 기판(substrate)에 견고하게 부착될 수는 없는 정치 배양 베슬(stationary culture vessel) 또는 T-플라스크 및 병을 포함한다.
실험 부분에 기재된 바와 같이, 세포 또는 신경 상피-유사 구조체는 유리하게는 교반 조건하에서 단계 (ⅳNR)를 수행하는 것으로 배지 내에서 동적으로 현탁되는 것이 유지될 수 있다. 임의의 진탕기(shaker), 예를 들면, 3차원적으로 배양물을 교반하는 회전기 등이 본 목적에 이용될 수 있다.
신경 망막 세포를 얻기 위한 본 발명의 방법의 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 단계 (ⅳNR)에서 사용되는 배양 배지는 적어도 5일간 FGF2로 보충된다. 이러한 배양 배지는 바람직하게는 상기 정의된 바와 같은 신경 형성 촉진 배지이다.
본 발명의 일 장점은 제1 부착성 배양으로부터, 두 개의 다른 배양이 병렬적으로 수행될 수 있고, RPE 세포(제1 배양, 바람직하게는 부착성) 및 신경 망막의 전구체(제2 배양, 바람직하게는 비-부착성) 모두를 얻을 수 있다는 점이다. 따라서, 본 발명은 상기 정의된 단계 (ⅰ) 및 (ⅱ)를 포함하고, 이후 상기 정의된 단계 (ⅲRPE) 및 (ⅳRPE)가 뒤따르고, 상기 정의된 단계(ⅲNR) 및 (ⅳNR) 또한 병렬적으로 함께 수행되는 것인, RPE 세포 및 신경 망막의 전구체 모두를 얻는 방법과 관련 있는 것이다.
가장 중요하게, 본 발명은 쉽고 빠르게, 많은 양의 주요 유형(RPE, RGC, 무축삭 세포, 수평 세포, 뮐러 글리아 세포 및 광수용체) 중 임의의 망막 세포를 높은 순도로 얻는 신뢰할 수 있는 방법을 제공한다. 예를 들면, 75% 초과의 광수용체 전구체를 포함하는 배양물을 1개월 내에 얻을 수 있다.
이러한 방법들, 및 이들을 통해 얻은 실질적으로 순수한 세포 배양물은 하기의 영역에서 유용할 것으로 보인다:
ㆍ이식/세포 치료: 비제한적인 예시는 RPE 세포 및/또는 망막 전구체 세포 또는 이들로부터 분화한 세포의 이미 잃은 시야의 회복을 돕기 위한 손실 세포 교체 치료(lost cells replacement therapy)에서의 이용을 포함한다. 상기 방법 및 배양물은 또한 전체 조직 교체 치료에 사용하기 위한 조직을 발달시키기 위해 사용할 수 있다.
ㆍRGC, 막대, 원추 및 RPE 세포를 포함하는 모든 세포의 기능을 보호 또는 향상 시킬 수 있는 제제를 선별하기 위한 약물 스크리닝. 본 명세서에서 "제제(agent)"는 모든 종류의 분자 또는 조성물뿐만 아니라, 또한 모든 전자기 또는 미립자 방사선(corpuscular radiation)(UV, 가시 광선, 전리 방사선(ionizing radiation) 등)과 같은 비-화학적 제제를 의미한다.
ㆍ병리생리학 연구와 줄기 세포 또는 이의 유도체를 이용한 약물 스크리닝 또는 맞춤형 치료에도 사용될 수 있는, 만능 세포, 특히 hiPS 세포로부터 인간 망막 질병 모델 생성.
ㆍ망막 발달, 조직 형성, 및 시냅스 형성을 제한 없이 포함하는 다양한 과정을 연구하기 위한 유용한 자원이 될 수 있는 인간 신경 발달의 고유 모델.
본 발명은 하기의 도면 및 실시예에 따라 더욱 설명된다.
도 1 : 비삽입성 (integration-free) hiPS 세포의 유도 및 특성화. (A) AHDF의 리프로그래밍(reprogrammation)에 포함되는 단계들을 묘사하는 모식도. (B) 섬유아세포 상의 불균일한 hiPS 콜로니의 출현. (C) hiPS 세포로 확립된 웰의 양성 알카라인 포스파타제 염색. (D, E) hiPS 세포(서브 클론(subclone) 2)의 면역조직화학(immunohistochemistry)에 의한 만능 마커의 발현. (F) hiPS 세포, AHDF 및 hES 세포 내 만능성 및 자기-재생 마커의 qRT-PCR 분석(n=3 실험). 데이터는 hES 세포에 대해 정규화(normalized) 됨. (G) 2주 후 hiPS 세포로부터 유래된 배아체 내 여러 세균 층 마커의 qRT-PCR 분석(n=3 실험). 데이터는 미분화 hiPS 세포에 대해 정규화 됨. (H-J) 내배엽(endoderm)(SOX17), 중배엽(mesoderm)(SMA), 외배엽(ectoderm)(PAX6, TUJI-1)의 마커에 대한 2주 후 hiPS 세포(서브 클론 2)로부터 유래된 배아체의 면역 염색. (K) hiPS 서브 클론 2의 핵형(karyotype) 분석. (L) 2 또는 15 계대(passage) 후 hiPS 서브 클론 2(AHDFc2p5 또는 AHDFc2p15) 및 대조군으로서 AHDF로부터의 게놈 DNA(gDNA) 단편 및 에피솜 단편(epi 추출물) 내 oriP/EBNA1 벡터의 검출을 위한 oriP를 표적으로 하는 프라이머를 이용하는 PCR 스크리닝. 스케일바=100 μm.
도 2 : 비삽입성 hiPS 세포로부터의 망막 전구체 발생 효율. (A) 분화 프로토콜의 여러 단계를 나타내는 모식도. (B, C) 신경 형성 촉진 배지 내에서 7 및 14일 후 분화하는 hiPS 세포의 형태(morphology). (D) D14에서 신경 상피-유사 구조체체 내의 안구-분야 전사 인자(SIX3 , LHX2 , RAX , PAX6 , MITF 및 VSX2), NRL, CRX 및 만능성 마커 POU5F1 의 qRT-PCR 분석(n= 3 실험). 데이터는 hiPS 세포에 대해 D0에서 정규화된다. (E-O) PAX6 및 RAX (E-G), Ki67 및 LHX2 (H-J), 또는 MITF 및 VSX2 (K-O)에 대한 D14 신경 상피-유사 구조체의 면역 형광 염색. 스케일바= 100 μm(B, C, E, H 및 K); 50 μm(F, G, I, J, L-O). (P) D0, D7 및 D14에서 hiPSC-2 내의 NOGGIN 및 DKK1의 qRT-PCR 분석. 데이터는 hiPSC-2 단일 콜로니에 대해 정규화된다.
도 3 : 부유 신경 망막( NR )-유사 구조로부터 복수의 망막 세포 유형의 분화. (A) 망막 세포를 발생시키기 위한 분화 프로토콜을 요약하는 모식도(
Figure 112015112643513-pct00002
= 3D 교반). (B-D) 분리 후 여러 시간에서의 부유 NR-유사 구조체의 형태. (E, F) 여러 시간에서의 NR-유사 구조체 내 안구-분야 및 광수용체 특이적 전사 인자의 qRT-PCR 분석(n=3 실험). 데이터는 D14의 NR-유사 구조체 세포에 대해 정규화된다. (G-I) MITF에 대한 NR-유사 구조체의 면역염색 (G), VSX2 (G, H), PAX6 (H), OTX2 (I) 및 BRN3A (I). (J-L) D14(J), D21(K) 및 D28(L)에서 CRX에 대한 NR-유사 구조체의 면역 염색. (M-N) 칼레티닌(CALRETININ)(M) 및 LIM1(N)에 대한 D21 NR-유사 구조체의 면역 염색. (O) 리커버린에 대한 D28 NR-유사 구조체의 면역 염색. 스케일바=100 μm(B-D, G-L), 50 μm(M-O).
도 4 : 비삽입성 hiPS 세포로부터 RPE 세포의 발생 및 증폭. (A) 실험의 모식도. (B, C) 30일 후 hiPS 세포-유래 RPE 세포 단일 층의 위상차 현미경 관찰. (D) 30일 후 hiPS 세포-유래 RPE 세포 단일 층의 ZO-1 및 MITF에 대한 면역 염색. 스케일바=100 μm. (E) 0 계대(P0), P1, P2에서 hiRPE세포 내 성숙한 RPE 마커의 qRT-PCR 분석. 데이터는 인간 성인 RPE 세포로부터 분리된 대조군 RNA로 정규화된다. (F) RPE 세포의 탐식(phagocytic) 활성 평가; FITC-라벨링(labeled) POS로 3시간 배양 후 P1의 hiRPE 세포 배양물 내 및 대조군 RPE-J 세포주 내 FITC/DAPI 형광의 비율. POS의 결합 및 흡수(uptake)는 재료 및 방법(실시예 1)에서 기술된 바와 같이 분석되었다.
도 5 : Notch 저해에 의한 부유 NR-유사 구조체로부터의 광수용체 전구체 발생의 가속. (A) D21 내지 D28 또는 D28 내지 D35의 DAPT를 첨가한 실험의 모식도(
Figure 112015112643513-pct00003
= 3D 교반). (B) D28 또는 D35에서 DAPT의 존재 또는 부존재(대조군)하의 CRX 및 리커버린에 대한 NR-유사 구조체의 면역 염색. 스케일바=100 μm. (C 및 D) D28 및 D35에서 DAPT가 있는 또는 DAPT 없는(대조군), 광수용체 전구체(CRX, 리커버린) 및 유사분열(mitotic) 전구체(Ki67)의 정량화. 수치는 양성 세포 ±SEM의 평균 백분율로 나타낸다(n=4, *P<0.05). (E) DAPT가 첨가된 D35 NR-유사 구조체 내 성숙하는 광수용체 마커 및 GLAST(뮐러 글리아 세포에 대한 마커)의 qRT-PCR 분석. 데이터는 DAPT가 첨가되지 않은 D35의 NR-유사 구조체로 정규화된다. 스케일바=100 μm.
도 6 : NR-유사 구조체 내 광수용체 전구체의 초기 분화. (A) 분화하는 NR-유사 구조체 내 NRL 및 CRX 전사 인자의 qRT-PCR 분석. 데이터는 D0의 hiPSC-2에 비교한 PCR 발현 수준의 사이클(cycle)의 변화로서 표현된다. (B) D14에서 CRX에 대한 저온 절단된(cryosectioned) NR-유사 구조체의 면역 형광 염색. (C-H) D21 및 D35에서 CRX 및 OTX2에 대한 저온 절단된 NR-유사 구조체의 면역 형광 염색. D21(C-E) 및 D35(F-H)에서 NR-유사 구조체의 절단부분 내 OTX2 및 CRX의 코로컬리제이션(colocalization)이 있음을 나타내는 공초점 이미지. (M-N) D28에서 Ki67(M), PAX6(N), OTX2(N), CRX(M)에 대한 저온 절단된 NR-유사 구조체의 면역 조직 화학 분석. 스케일바=100 μm(B); 50 μm(C-H 및 M-N).
도 7 : hiPSC -2-유래 NR-유사 구조체의 두께 분석. (A-C) D17 내지 D24의 일 대표적 NR-유사 구조체의 두께 진화(검은 선). (D) 13개 독립적인 NR-유사 구조체의 두께 진화의 그래픽 표현. 각각의 선은 하나의 NR-유사 구조체와 상응한다. (E) D17 내지 D24에서 80.6±10.2%의 증가를 나타내는, 13개의 분리된 NR-유사 구조체의 두께를 나타내는 막대 그래프(평균±SEM; **P<0.01; ****P<0.0001). 스케일바=100 μm.
도 8 : 여러 hiPSC 클론을 이용한 망막 분화 프로토콜의 재현성. (A-C) D17, D21, 및 D24에서 hiPSC-1로부터 유래한 부유 NR-유사 구조체의 형태. (D-F) D17, D21 및 D24에서 hiPSC-2로부터 유래한 부NR-유사 구조체의 형태. (G 및 H) hiPSC-1 또는 hiPSC-2로부터 유래한 NR-유사 구조체의 D17 및 D35에서의 안구 분야 전사 인자의 qRT-PCR 분석. (I 및 J) hiPSC-1 또는 hiPSC-2로부터 유래한 NR-유사 구조체의 D17 및 D35에서의 광수용체 특이적 전사 인자의 qRT-PCR 분석. 데이터는 각각의 유전자에 대해 D14를 기준으로 한다. 스케일바=100 μm.
도 9 : 부유 NR -유사 구조체로부터의 모든 망막 세포 유형의 분화. (A-E) 여러 시간에서의 NR-유사 구조체 내 선택된 신경 망막 세포 유형들의 qRT-PCR 분석. 데이터는 R/G 및 블루 옵신(BLUE OPSIN)에 대해 D14 및 D35의 NR-유사 구조체에 정규화된다. (F-Q) RGC(BRN3A, PAX6, CALRETININ), 무축삭 세포(PAX6, AP2, CALRETININ), 수평 세포(LIM, PAX6, CALRETININ), 광수용체(OTX2, RECOVERIN, CRX, CD73, CONE ARRESTIN, RHODOPSIN, BLUE 및 R/G OPSIN), 양극성 세포(PKCα), 뮐러 글리아 세포(GS, SOX9)에 대한 마커 및 유사 분열 전구체(Ki67)에 대한 마커를 이용한 분화의 여러 단계에서 저온 절단된 NR-유사 구조체의 면역 조직 화학 분석. 스케일바=50 μm(F-N), 25 μm(O-Q).
도 10 : 장기 배양 후 NR -유사 구조체 내 성숙 광수용체의 존재. D112에서 리커버린(A-D), 로돕신(A-B) 및 아세틸 투불린(TUBULIN)(C-D)에 대한 저온 절단된 NR-유사 구조체의 면역 형광 염색. 면역 조직 화학 분석으로 근엽(rosette)의 내강 영역(luminal zone) 내 아세틸화된 투불린-양성 구조체의 출현(D의 화살표)과 함께 내부 근엽(rosette) 내 광수용체의 지배적인 존재를 확인하였다. 스케일바=25 μm(A-C) 및 10 μm(D).
실시예
실시예 1: 인간 비삽입성 유도 만능 줄기 세포의 망막 신경 및 망막 침착 상피 세포로의 안정적이고 효율적인 분화
1.1 실험 절차
인간 섬유아세포 및 iPS 세포 배양
8세 소년으로부터의 성인 인간 진피 섬유아세포(Adult Human Dermal Fibroblast: AHDF)(Dr.Rustin으로부터의 선물, INSERM U676, 파리, 프랑스)를 10% FBS(Life Technologies), 1 mM 소듐 피루베이트(pyruvate)(Life Technologies), 1XMEM 비-필수적 아미노산(Life Technologies)으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) 고 글루코스, 글루타맥스 Ⅱ(Life Technologies) 내 37℃, 표준 5% CO2/95% 공기 인큐베이터 내에서 배양하였다. 본 배지는 "섬유아세포 배지"로 부른다. 확립된 인간 iPS 세포는 10 ng/ml 인간 재조합 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)(Preprotech)를 갖는 ReproStem 배지(ReproCell) 내 미토마이신-C 비활성화 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 배양 보조 세포층(feeder layer)(Zenith) 상에 유지시켰다. 세포는 일상적으로 37℃, 표준 5% CO2/95% 공기 인큐베이터 내에서 배양하였다. 본 배지는 "iPS 배지"로 부른다. 세포는 실체 현미경(Vision Engineering Ltd) 하에서 한 주에 1회 계대배양하였다.
인간 섬유아세포의 리프로그래밍
Yu et al., 2009에 기재된 바와 같이, 에피솜적 접근법으로 리프로그래밍을 하였다. 요약하면, oriP/EBNA-1-기반 에피솜 벡터 pEP4EO2SEN2K(플라스미드 20925, Addgene), pEP4EO2SET2K(플라스미드 20927, Addgene) 및 pCEP4-M2L (플라스미드 20926, Addgene)이 뉴클레오펙션(nucleofection)(Nucleofector 4D, V4XP, DT-130 프로그램 이용, Lonza)을 통해 AHDF로 함께 형질주입되었다. 형질주입된 섬유아세포(뉴클레오펙션 당 106 세포)를 "섬유아세포 배지" 내 3 x 10 cm MEF-접종 디시(5.106 세포/cm2)에 직접적으로 위치시켰다. 형질주입 4일 후 "섬유아세포 배지"는 리프로그래밍 효율을 증가시키는 것으로 설명되는 하기 분자들(Zhang et al. 2013)로 보충된 "iPS 배지"로 교체하였다: 500 μM 발프로익산(Valproic acid)(Sigma, 프랑스), 0.5 μM PD-0325901(Selleck, Euromedex, 프랑스) 및 2 μM SB431542(Selleck). 14일 후, 세포들은 "iPS 배지" 내에서 단독으로 배양되었다. 30 내지 40일에, 소형 세포 클러스터를 절단하고 60 mm Organ Style 세포 배양 디시(Dutscher, 프랑스)로 이동시켰다. 나타나는 hiPS 콜로니는 그들의 인간 ES 세포-유사 콜로니 형태에 따라 실체 현미경 하에서 골라내었다. 이들을 이후의 특성화를 위해 상기한 미토마이신-C 비활성화 MEF 배양 보조 세포층으로 확장시켰다. 에피솜 벡터 및 비삽입성 리프로그램성 유전자의 완전한 손실은 하기 기술된 PCR에 의해 달성하였다.
에피솜 벡터의 PCR 분석
hiPS 세포로부터의 에피솜 DNA의 정제는 제조사의 프로토콜에 따라 Nucleospin Plasmid Quick Pure kit(Macherey-Nagel, France)로 수행하였다. 게놈 DNA는 페놀/클로로포름 추출 방법을 이용하여 분리하였다. 정제 방법의 특성으로 인해, Yu et al. (2009).에 명확히 보고된 바와 같이, 정제된 게놈 DNA는 동일한 세포로부터의 에피솜 DNA 잔류량으로 오염될 수 있었으며, 마찬가지로, 정제된 에피좀 DNA는 소량의 게놈 DNA로 오염되었다. PCR 반응은 Go Taq flexi 폴리머라제(Promega, France)를 이용하여 수행하였다. 각각의 PCR 반응에서, 100 ng을 포함하는 것에 등가량인 104 세포로부터 추출된 10 μl의 게놈 또는 에피솜 DNA를 주형(template)으로서 첨가하였다. 그 PCR 혼합물은 1X Go Taq Flexi 버퍼, 2 mM MgCl2, 0.2 mMdNTPs, 각각의 프라이머 0.5 μM 및 폴리머라제 1.25 U를 포함하였고 하기의 프로그램을 따랐다: 94℃에서 1분간 최초 변성; 94℃에서 45초간 35 사이클, 60℃에서 30초, 72℃에서 1분 및 이후, 72℃에서 5분. 천연의 섬유아세포로부터의 에피솜 및 게놈 DNA가 음성 대조군으로서 이용되었고 oriP/EBNA-1 기반 에피솜 벡터(상기 참조, Yu et al. 2009)가 양성 대조군으로서 사용되었다.
핵형 분석
활발하게 성장하는 hiPS 콜로니(80% 융합성)에 콜키신(colchicine)(20 mg/ml, Eurobio, 프랑스)를 37℃에서 90분간 가하였다. 세포를 0.05% 트립신-EDTA로 분리한 후 75 mM KCl(Sigma Aldrich) 내 37℃에서 10-14분간 배양하였고, 그 후 3:1 메틸 알콜/빙초산으로 고정(fixation)시켰다. mFISH 핵형 분석을 위해, 고정된 세포들을 37℃에서 변성된 "cocktail painting mFISH" 프로브(MetaSystems,Altussheim, Germany)를 이용해 하룻밤 동안 혼성화시켰다. 슬라이드는 1X SSC 및 0.4X SSC의 연속적인 세척조(bath)로 세척하였고, 핵은 250 ng/ml 디아미디노-페닐-인돌(DAPI)로 염색하였다. 바이오티닐화된 프로브들이 Cy5 MetaSystems B-tect 검출 키트(MetaSystems)를 이용하여 밝혀졌다. 10 내지 20개의 중기(metaphase)들을 UV HBO 100-W 램프가 AxioCam 카메라(Carl Zeiss, 프랑스)와 연결되어 장착된 Zeiss Z1 형광현미경을 이용하여 잡아내었다. 모든 분석된 중기들은 MetaSystem Isis 소프트웨어(MetaSystens)를 이용하여 핵형 분석 하였다.
알카라인 포스파타제 (AP) 염색
배양물 내 MEF 상의 인간 iPS 세포를 95% 에탄올로 10분간 상온에서 고정시켰다. 그 후 세포들을 PBS로 세척하였고, 5 mM MgCl2 및 0.05% Tween-20을 갖는 9.5 pH Tris 버퍼 중 5-브로모-4-클로로-3-인돌일포스페이트(BCIP) 및 니트로 블루 테트라졸륨(NBT)(Roche, 프랑스)의 혼합물과 함께 5 내지 10분간 상온에서 배양하였다. 이후 염색에서, 세포들은 명시야 현미경 하에서 시각화되기 전에 PBS로 세척된다.
배아체 형성 및 분석
인간 iPS 세포 콜로니를 실체 현미경(Vision Engineering Ltd.) 하에서 MEF 층으로부터 기계적으로 떼어내고 ReproStem 배지 내 초 저 부착성 배양 디시(Nunc, Dutscher, 프랑스)에서 부유 배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였고 EB는 RNA 추출 또는 면역조직화학 분석 전 2주간 배양하였다.
망막 분화
인간 iPS 세포는 iPS 배지 내 미토마이신-C 불활성화 마우스 MEF 배양 보조 세포층 상으로 확장하여 융합(confluence)하였다. 여기서, 0일로 정의하고, 융합성 hiPS 세포를 iPS 배지 내에서 FGF2 없이 배양하였다. 2일 후, 그 배지를 Dulbecco's Modified Eagle 배지:영양 배지 F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-글루타민), 1% MEM 비-필수 아미노산 및 1% N2 보충물(Life technologies)로 구성된 "신경 형성 촉진성 배지"로 교체하였다. 그 배지는 매 2-3일마다 교체하였다. 14일차에, 색소 침착 세포로 둘러싸인 확인된 신경 상피-유사 구조체를 분리하였고 3D Nutator shaker(VWR, 프랑스)에 장착된 24 웰-플레이트 내 FGF2 10 ng/ml으로 보충된 "신경 형성 촉진성 배지"로 첫 2일간 개별적으로 부유 구조(3D)로서 배양하였고, 배지는 매 2-3일마다 교체하였다. 진탕 플랫폼 상에서 배양되었을 때 분리된 구조체는 배지 내 현탁된 상태로 남았고 일반적으로 배양 플레이트의 바닥에 부착하는데 실패하였다. 19, 20, 또는 21일차에, FGF2를 제거하였고 "신경 형성 촉진성 배지"의 절반이 매 2-3일마다 다음 수주간을 위해 교체되었다.
RPE 세포 배양물에 대해서, 확인된 색소 침착 패치(pigmented patch)를 비 색소 침착 출아 구조(non pigmented budding structure)없이 7일 내지 14일차에 잘라내었고 0.1% 겔라틴-코팅 플레이트(P0으로 기재) 상으로 이동시켰다. RPE 세포는 "신경 형성 촉진성" 배지로 확장하였고(상기 참조) 그 배지는 융합될 때까지 매 2-3일마다 교체하였고 세포들을 0.05% 트립신-EDTA로 분리하였고 새로운 겔라틴-코팅 플레이트에 분주하였다(계대 P1으로 여겨짐).
RNA 추출 및 Taqman 분석
모든 RNA는 Nucleospin RNA Ⅱ 키트(Macherey-nagel, 프랑스)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였고, RNA 수율 및 질은 NanoDrop 분광광도계( spectrophotometer)(Thermo Scientific, 프랑스)로 확인하였다. cDNA는 QuantiTect 역전사 키트(Qiagen)를 이용하여 제조사의 권고에 따라 500 ng의 총 RNA로부터 합성하였다. 합성된 cDNA는 이후 정량적 PCR을 수행하기 전에 무DN아제 수(DNase free water)로 1/20으로 희석하였다. qPCR 분석은 커스텀 TaqMan® 어레이 96-웰 Fast plates 및 TaqMan® 유전자 발현 Master Mix(Applied Biosystems)와 함께 Applied Biosystems 실시간PCR 시스템(7500 Fast System)으로 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 증폭을 위한 모든 프라이머 및 FAM으로 라벨링된 MGB 프로브는 Applied Biosystems(Life Technologies, 프랑스)에서 구입하였다. 결과는 18S에 대해 정규화 하였고 유전자 발현의 정량화는 3회의 독립적인 실험에서 Delta Ct 방법에 기반하였다. 인간 성인 RPE 세포로부터의 대조군 RNA는 중심와(fovea) 수준에서 절개한 안배(eye cup)로부터의 분리된 RPE 세포에 상응한다.
동결 절단( cryosection ), 면역 염색 및 이미지 획득
동결 절단을 위해, 망막-유사 구조체는 4℃에서 4% 파라포름알데히드(PFA) 내에서 15분간 고정시켰고 PBS로 세척하였다. 구조체는 4℃에서 PBS/30% 수크로스(Sigma) 용액 내에서 최소 2시간 동안 배양하였다. 구조체를 PBS, 7.5% 겔라틴(Sigma), 10% 수크로스 용액에 넣었고 이소펜탄 내에서 -50℃에서 동결시키고 10 μm-두께의 동결 절단체를 얻었다.
절단체의 면역 형광 염색을 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다(Roger et al. 2006). 요약하면, 슬라이드를 상온에서 블로킹 용액(PBS, 0.2% 겔라틴 및 0.25% 트리톤 X-100)과 함께 배양하고 이후 1차 항체(표 2 참조)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. Tween 0.1%(PBT)와 함께 PBS 내에서 3회 슬라이드를 세척하고 이후 1:10000 DAPI를 갖는 블로킹 버퍼 중에 1:600으로 희석된 AlexaFluor 488 또는 594(Life Technologies)와 접합된(conjugated) 적절한 2차 항체와 함께 1시간 동안 배양하였다. 형광 염색 신호는 CCD CoolSNAP-HP 카메라(Roper Scientific)이 장착된 DM6000 현미경(Leica) 또는 405, 488 및 543 nm 레이저가 장착된 Olympus FV1000 공초점 현미경을 이용하여 잡아내었다. 공초점 이미지는 1.55 또는 0.46 μm 스텝 크기를 이용하여 얻었고 각각의 획득 이미지는 2-4 스택 또는 4-8 광학 섹션을 투사(projection)한 것이다.
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표 2. 면역 조직 화학 분석을 위해 사용된 항체의 목록
테라토마 형성 분석
테라토마 형성 분석은 앞서 기술된 것에 약간의 변형을 가하여 수행하였다(Griscelli et al., 2012). 요약하면, 1x106 내지 2x106 세포를 생후 6주의 NOC Scid 감마(NSG) 마우스(Charles River)의 뒷다리 근육 내에 주입하였다. 9 내지 10주 후, 테라토마를 절단하고 4% 포름알데히드 내에서 고정시켰다. 이후 시료를 파라핀에 넣고 절단체는 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하였다.
식균작용 분석
광수용체 외부 분획(Photoreceptor outer segments: POS)을 돼지 눈으로부터 정제하고 확립된 절차(2)에 따라 0.1 mg/ml FITC(이소머-1)과 함께 배양하여 형광 염료로 공유 결합적으로 라벨링하였다. 계대 3에서의 RPE-J(불사화된 랫 RPE 세포주) 및 계대 1에서의 hiRPE 세포를 96-웰 조직 배양 플레이트의 개별적인 웰에 위치시켰다. 각각의 웰은 1x106 POS 입자를 포함하는 100 μL의 DMEM으로 계층화(layered)되었고, 32℃(RPE-J) 또는 37℃(hiRPE)에서 3시간 동안 배양되었고, 1 mM MgCl2 및 0.2 mM CaCl2를 포함하는 PBS(PBS-CM)로 상기 웰을 3회 세척하여 여과하였다. 내재된(internalized) 입자의 독점적 검출을 위해, PBS-CM 내 0.2% 트리판 블루 내에서 세포 고정 전 10분간 배양하여 표면-결합 FITC-POS의 형광을 선택적으로 퀀칭(quenching)시켰다. 세포는 얼음처럼 차가운 메탄올 내에서 5분간 고정시키고 이후 DAPI와 함께 10분간 상온에서 재수화(rehydration) 및 배양하였다. 형광 신호는 Infinite M1000 Pro(Tecal) 플레이트 판독기로 정량화하였다. RPE-J 세포주는 식균작용 확설에 대한 양성 대조군으로서 사용하였고 hiRPE 세포는 POS의 부존재 하에서 음성 대조군으로서 사용하였다.
통계적 분석
분산 분석은 비 매개 변수 Friedman 테스트 후 Dunn's 다중 비교 테스트 또는 모든 쌍 분석(all pair wise analysis)을 위한 Mann-Whitney 테스트(프리즘 6, Graphpad software)로 수행하였다.
1.2 결과
인간 비삽입성 iPS 세포의 발생 및 특성화
성인 인간 진피 섬유아세포는, 앞서 YU et al.(2009)에 기재된 플라스미드 벡터에 해당하는, OCT4 , NANOG , SOX2 , LIN28 , KLF4 및 cMYC를 코딩하는 3개의 플라스미드와 함께 형질주입 되었다. 형질주입된 섬유아세포는, 리프로그래밍 과정을 가속시키고 에피솜 벡터의 손실을 줄이는 것으로서 앞서 기술된(Zhang et al. 2012) 소분자의 존재하에, "iPS 배지"에서 배양하였다(도 1A). ES-유사 콜로니가 형질주입 후 약 30일 및 40일차에 꽉 찬 돔-유사 구조로서 최초로 관찰 가능하였다(도 1B). 골라내고 확장시켰을 때, 이러한 hiPS 세포 콜로니들은 전형적인 인간 ES 세포 형태를 나타내었다. 이러한 hiPS 세포의 분석은 만능성 마커 Nanog, TRA-1-81, OCT4 및 SSEA4의 발현과 함께 클론이 알카라인 포스파타제(AP) 활성을 개발하였음을 증명하였다(도 1C-E). qRT-PCR에 기반한 TaqMan 프로브는 만능성 유전자의 발현이 각각의 섬유아세포 개체수 이상으로 현저하게 증가하였고 인간 ES 세포에서 관찰되는 것과 비슷한 정도임을 밝혀냈다(도 1I). iPS 콜로니는, 배양 2주 후 qRT-PCR에 기반한 TaqMan 프로브(도 1J) 및 배아체에 대한 면역 조직 화학(도 1F-H)에 의해 관찰된 바와 같이, 인 비트로에서 모든 3개의 배엽층(germ layer)으로 분화할 수 있었다. 더욱이, 인간 iPS 세포주는 정상 핵형을 나타내었다(도 1K). hiPS 세포는 도입 유전자(transgene)의 유전적 삽입을 보이지 않았고 15 계대 이후 에피솜 벡터를 완전히 상실하였음이 에피솜의 OriP 부위에 대한 RT-PCR 분석에 의해 증명되었다(도 1L). 인간 iPSC 세포주의 만능성은 테라토마 형성 분석으로 검증하였다.
hiPS 세포의 안구 분야 정체성을 갖는 신경 상피-유사 구조체로의 분화
자가-재생 가동(machinery)의 종료가 iPS 세포 분화의 전제 조건이기 때문에, 융합성 iPS 세포의 자발적인 분화를 촉진하기 위해 FGF2를 배지로부터 제거하였다. 배양 배지로부터의 FGF2의 제거는 또한 인간 ES 세포 내에서 신경외배엽(neuroectoderm)의 유도를 촉진하고, 이는 Greber et al. (2011)에 잘 기술되어 있다. hiPS 세포의 신경외배엽 계통으로의 분화를 우선적으로 하기 위해, 콜로니들을 1% MEM 비 필수 아미노산 및 1% N2 보충물을 갖는 신경 형성 촉진 배지에서 배양하였다(도 2A). 이는 4일 내 색소 침착 콜로니의 출현에 이르게 하였다. 7일 후, 위상-선명 구조체들이 색소 침착 세포의 패치의 과반수 이상에 가깝게 나타나기 시작했다(도 2B). 2주 내에, 이러한 모든 구조들은 색소 침착 세포의 패치로 둘러싸인 신경 상피-유사 구조체로 조직되었고(도 2C), cm2 당 1 내지 2 구조체에 해당하였다. 다른 색소 침착 콜로니들은 신경 상피-유사 구조체으로 발달하지 않았고, 이러한 구조체의 형성은 비 색소 침착 영역에선 거의 관찰되지 않았다. 14일 차에서, qRT-PCR에 기반한 TaqMan 프로브들은 형성된 모든 신경 상피-유사 구조체들이 만능성-연관 유전자 OCT4(POU5F1)의 발현을 상실하고, LHX2 , RAX , PAX6 , SIX3 등의 안구 분야 특정화와 연관있는 전사 인자들의 발현을 획득한 것을 밝혀내었다(도 2D). 신경 상피-유사 구조체의 면역 염색으로 상기 세포들이 PAX6 및 RAX를 동시 발현한다는 것을 증명하였고(도 2E-G), 이는 안구 분야 세포의 특성이다(Mathers and Jamrich 2000). 거의 모든 세포들이 LHX2-양성(도 2H, 2J)이었고, 이들의 전구체 상태는 세포 증식 마커 Ki67(도 2H-J)를 이용하여 확인하였다. qRT-PCR로 안포/안배 형성 중 망막 특정화에 포함되는 두 개의 전사 인자인 MITF 및 VSX2의 발현을 추가적으로 증명하였고(Horsford et al. 2005), 이는 각각 14일차에 10 및 100배 증가하였다(도 2D). 면역 조직 화학으로 VSX2에 대한 염색의 가장 강한 강도는 신경 상피-유사 구조체 내였으나, 반면 가장 강한 MITF 발현은 상기 구조체의 주변 색소 침착 부분인 것을 발견하여, VSX2 및 MITF 발현의 반대되는 구배를 밝혀내었다(도 1K-O). 이들과 동시에, 이러한 발견으로 신경 상피-유사 구조체가 신경 망막 전구체에서 전형적인 마커 발현 개요를 갖고 신경 망막(Neural Retinal: NR)-유사 구조체로 이름 지어질 수 있음을 증명하였다. 흥미롭게도, qRT-PCR로 배지 내 NRL 및 CRX 등의 광수용체 전구체의 전사 인자의 발현이 이르면 14일 후에 NR-유사 구조체 내에서 5배 증가함을 밝혀내었고(도 2D), 이는 일부 망막 전구체가 이미 광수용체 계통으로 관여할 수 있음을 제시한다.
유전자 발현 분석으로 융합성 hiPSC 배양물 내의 Wnt 및 BMP의 길항제(antagonist)들인, DKK1 및 NOGGIN의 내생적 발현을 밝혀내었고 둘 모두의 유전자는 신경 상피-유사 구조체의 형성 동안 상향 조절되었다(도 2P).
hiPS 세포로부터 유래한 망막 전구체의 망막 신경으로의 효과적인 분화
세포의 색소 침착 패치로 둘러싸인 NR-유사 구조체(도 2C)에 상응하는 전체 구조를 14일차에 기계적으로 분리하였고 3D 교반 하에서 부유 구조체로서 배양하였다(도 3A). 부유 구조체는 RPE 계통으로의 분화보다 신경 망막으로의 분화를 우선적으로 하기 위해 FGF2의 존재하에서 배양하였다(Fuhrmann 2010; Martinez-Morales et al.2004). 분리 1일 후(15일차), 상기 NR-유사 구조체는 속이 빈 구체 모양을 형성하였고, 배양 동안 계속 크기가 증가하였다(도 3B-D). 정량적 분석은 신경 상피의 두께가 139±19 μm에서 251±41 μm까지 D17 내지 D24에서 증가하였음을 나타낸다(도 7). 본 발명자는 자라나는 구체로부터 분리한 RNA의 qRT-PCR 및 면역 조직 화학을 이용하여 시간 경과와 특정 망막 표현형의 획득을 분석하였다. 14일차 내지 42일차까지의 분화 과정 동안, LHX2, RAX, SIX3, PAX6, VSX2 및 MITF 등의 망막 특정화 및 분화에 포함되는 전사 인자들이 계속 발현되었다(도 3E). 21일차에서, VSX2를 발현하는 세포는 NR-유사 구조체의 발달 중인 신경 상피 내에 위치하였고, MITF-양성 세포는 구조체 주변의 RPE 세포에서만 독점적으로 발견되었다(도 3G). RPE 세포 내 MITF 발현의 제한이 NR-유사 구조체 내 이의 mRNA 발현의 감소로 확인되었다(도 1E). VSX2-양성 세포는 주로 신경 상피의 외측 부분을 따라 위치하였고, 또한 PAX6를 발현하였다(도 3H). PAX6-양성/VSX2-음성 세포들은 최초의 분화하는 망막 신경에 해당할 수 있는 신경 상피의 내부 부분에 모여 있었고, 증식 마커 Ki67을 가지고 있지 않았다. 실제로, 빠르면 21일차에, 신경절 세포 및 무축삭 세포가 동일한 내부 위치에서 BRN3A(도 3I) 또는 칼레티닌(도 3M)에 대한 항체를 이용한 면역 조직 화학에 의해 확인되었다. 분화하는 수평 세포에 해당하는 LIM1-양성 세포 또한 발달 중인 신경 상피 내에서 발견되었다(도 3N). 광수용체 등의 망막 세포의 분화에 관여하는 전사 인자들을 코딩하는 두 개의 유전자인 OTX2 및 NEUROD1(Basset and Wallace 2012)의 발현은 부유 배양 동안 크게 증가하였다(도 3E). 면역 조직 화학 분석은 구조체의 주변 내 RPE 세포에서의 OTX2의 발현 및 광수용체의 얽힌(committed) 전구체에 해당하는 OTX2-양성 세포의 신경 상피로의 출현을 보여준다(도 3I). 광수용체 계통으로의 분화는 14일차 내지 42일차에 qRT-PCR로 NRL 및 CRX 발현의 큰 증가를 확인함으로써 확인하였다(도 3F 및 6A). CRX-양성 세포들은 빠르면 14일차에 신경 상피 내에서 확인 가능하였고(도 3J), 21일차 및 28일차에서 그 수가 점진적으로 증가하였다(도 3K, L). 본 단계에서, 광수용체 전구체는 리커버린 면역 염색으로 확인하였다(도 3O).
21일차에, 신경 상피 내에서 CRX+ 세포는 OTX2를 동시 발현하였다(도 6C-H). 28일차에, CRX는 유사 분열 후 Ki67 세포 내에서 기본적으로 발현되었다(도 6M). 예측되는 바와 같이(Nishida et al., 2003), OTX2+ 얽힌 광수용체 전구체는 PAX6을 발현하지 않았다(도 6N). 이러한 모든 데이터는 상기와 같은 배양 조건이 3주 내에 hiPS 세포가 망막 세포의 주요 유형(신경절 세포, 무축삭/수평 세포 및 광수용체)들로 분화하는 것을 가능하게 함을 증명한다. 더욱이, 본 명세서에서 개발된 프로토콜은 두 별개의 비삽입성 hiPSC 세포주(hiPSC-1 및 hiPSC-2)들을 비교하였을 때 우수한 재현성을 나타냈다(도 8).
hiPS 세포로부터 RPE 세포의 발생
신경 형성 촉진성 배지에서 배양한 융합성 hiPS 세포로부터의 세포의 색소 침착 패치의 빠른 출현을 고려하여, 본 발명자는 이들을 분리하고 RPE 세포로 분화시키려 하였다. 7일 내지 14일차에서, 세포의 색소 침착 패치를 기계적으로 선별하고 확장을 위한 겔라틴-코팅 플레이트 상에 다시 올려두었다(도 4A). 3주 내지 1달 후, 이들은 RPE 세포의 전형적인 조약돌 형태를 보이는 융합성 세포 단층을 형성하였다(도 4B-C). 대부분의 세포들은 중요 RPE 특이적 전사 인자인 MITF에 대해 면역 반응성이었고, 세포간 접촉(cell-to-cell interface)이 연이어 있음을 망막 색소 침착 상피의 밀착연접(tight junction) 마커인 ZO-1로 확인하였다(도 4D). 성인 인간 RPE 세포에 정규화된, qRT-PCR 분석으로 hiRPE 세포가 여러 계대 후에도 MERTK, RPE65, BEST1 및 PEDF 등의 성숙한 RPE-연관 마커의 발현을 유지함을 증명하였다(도 4E). hiRPE 세포의 기능성 여부를 결정하기 위해, 이들의 FITC-라벨링 광수용체 외부 분획(POS)의 식균 작용을 수행하기 위한 능력을 검정하였다. 뚜렷한 식균 작용 활성이 검출되었고, RPE-J 세포주를 3시간 내 평균 30%의 내재된 POS를 갖도록 조절하기에 충분하였다(도 4F).
실시예 2: 망막 전구 세포의 후생(late-born) 망막 세포 유형으로의 분화
부유 배양 내 분리된 NR-유사 구조체의 장기간의 유지는 RPC의 후생 망막 세포 유형으로의 추가적인 분화를 가능케 하였음을 qRT-PCR로 증명하였다(도 9A-E). 실제로, 성숙한 RGC(BRN3A 및 B), 무축삭(칼레티닌 및 GAD2) 및 수평(LIM) 세포의 초생(early-born) 망막 마커들의 최초 발현 후(도 9A 및 B), 원추(R/G 옵신, 블루 옵신 및 원추 아레스틴) 및 막대 광수용체(로돕신 및 리커버린)(도 9C 및 D), 양극성(PKCα) 및 뮐러 글리아 세포(GLAST1)(도 9E)에 해당하는 후생 망막 세포 유형의 마커들이 나타나는 것이 관찰되었다. 21일(도 9F) 내지 42일차(도 9G)에, 대부분의 NR-유사 구조체는 그들의 판상(laminar) 외관을 상실하였고, RGC(BRN3A 및 칼레티닌), 무축삭(칼레티닌 및 AP2) 및 수평(LIM) 세포의 다른 마커들을 발현하는 세포에 둘러싸인, 분화 중인 광수용체에 해당하는 OTX2+, CRX+ 및 리커버린+ 세포(도 9G, J-L 및 도 6F-H)를 포함하는 내부 근엽을 발달시켰다(도 9G-J). 흥미롭게도 42일차에, 리커버린+ 세포는 이식을 위한 광수용체 전구체의 세포 분류에 이용되는 마커인 세포 표면 마커 CD73을 발현하였다(도 9L)(Eberle et al., 2011). 77일차에, PAX6은 유사 분열 후 세포(KI67-) 내에서 오로지 근엽의 외측에만 존재하였고, 이의 RGC, 무축삭 및 수평 세포 내에서의 발현과 일치하였다(도 9M). 112일차까지, 로돕신 및 R/G 옵신은 NR-유사 구조체에 나타났고, 막대 및 원추 모두의 성숙을 반영하였다(도 9N, O). 리커버린+ 및 로돕신+ 세포는 112일차에 일반적으로 잔류 근엽의 가장 안쪽 부분에 위치하였다(도 10A 및 B). 흥미롭게도, 연결 섬모(connecting cilium) 마커인 아세틸화 투불린을 이용한 면역 조직 화학에서, 리커버린+ 세포에 나란한, 근엽의 내강 영역 내 매우 얇은 구조체의 존재를 밝혀내었고, 이는 잠재적인 섬모 및 광수용체 외부 분획의 형성을 제안한다(도 10C 및 D). 두 개의 다른 후생 망막 세포 유형인 양극성 및 뮐러 글리아 세포의 분화는 또한 각각 PKCα 염색(도 9P) 및 글루타민 신테타제(GS) 및 SOX9의 공동 발현(도 9Q)에 의해 검출되기 위한 긴 배양 시간(112일)을 필요로 한다. 이로서, 상기한 세포 배양 조건은 순차적으로 NR-유사 구조체 내 존재하는 RPC로부터 모든 망막 세포 유형의 발생을 가능하게 하였다.
실시예 3: Notch 저해에 의한 광수용체 전구체 발생의 가속
CRX 및 리커버린에 대한 항체를 이용한 면역 조직 화학 분석으로 광수용체 전구체의 수가 14일(도 3J) 내지 28일차(도 3L, 도 5B)에서 점차적으로 증가함을 증명하였다. 21일 내지 35일차에, NR-유사 구조체들은 그들의 판상 구조를 상실하고 CRX 및 리커버린-양성 세포들을 포함하는 내부 근엽을 발달시켰다(도 5B). 흥미롭게도, 21일차부터 7일간의 Notch 저해제 DAPT의 첨가는 CRX 및 리커버린 양성 세포 모두를 극적으로 증가시키는데 충분하였다(도 5B). 28일 내지 35일차까지의, DAPT의 늦은 첨가는 또한 CRX 및 리커버린을 발현하는 세포의 큰 증가에 이르게 하였다(도 5B). 21일 내지 28일차의 일주일의 DAPT 첨가는 광수용체 전구체의 증가된 발생을 가능하게 하였고, 28일차 이후로 CRX+ 및 리커버린+ 세포는 대조군에 비교하여 각각 2.2 및 2.6배 증가하였다(도 5C). 이에 수반하여, 28일차에 Ki67 염색으로 평가한 유사 분열 중인 전구체(mitotic progenitor)의 수는 28일차의 첨가 이후 크게 감소(3배)하였다(도 5C). Notch 저해의 효과는 또한, DAPT에 대한 장기간의 노출보다는, 28일차의 DAPT 첨가 이후로 RPC가 거의 남아 있지 않음을 이유로, 28일 내지 35일차에 평가되었다. 이러한 조건하에서, Notch 저해는 또한 NR-유사 구조체 내의 광수용체 전구체의 수의 증가, 즉 CRX+ 및 리커버린+ 세포의 수가 35일차에 각각 1.7 및 4.1배 증가하도록 하였다(도 5D). 흥미롭게도, 일반적으로 35일차에 검출되지 않는 원추-아레스틴+ 세포가 DAPT 첨가 이후의 시간에서 명백하게 확인될 수 있었다(도면 없음). 더욱이, qRT-PCR 분석으로 DAPT 첨가 이후인 35일차에서 원추-아레스틴 발현의 증가를 확인하였고, 반면 로돕신, 블루 옵신 또는 G/R 옵신의 유전자 발현의 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 5E). GLAST1 발현은 DAPT 첨가 이후 감소하였다(도 5E).
이러한 사실은, hES 세포에 대해 최근 제안된 바와 같이(Nakano et al. 2012), Notch 신호전달이 hiPS 세포로부터 광수용체 분화의 속도를 감소시키므로, 따라서 이의 저해는 광수용체 분화를 선호케하고 다분화능성 RPC로부터 광수용체 전구체의 발생을 가속시킴을 증명하였다.
실시예 4: 논의
본 연구는 무혈청 신경 형성 촉진성 배지 내 융합성 hiPSC의 단순한 배양이 2주 내에 NR-유사 구조체 및 RPE 세포를 발생시키는데 충분함을 보여주는 새로운 발명이다. 본 명세서에 기재된 방법은 EB 형성 및 선별, DKK1, NOGGIN 및 WNT 및 또는 마트리겔과 같은 유도 분자의 첨가 단계들뿐만 아니라, 접착성 기질에 대한 EB 코팅 단계를 회피한다. 초기 발생한 구조체는 PAX6 및 RAX의 동시 발현으로 밝혀지는 OV 표현형 및, 신경 상피 및 RPE 사이에서 VSX2 및 MITF의 반대되는 구배를 나타낸다. 이러한 효율은 부분적으로 융합성 hiPSC에 의한, 신경 및 망막 특징화의 두 유도자이고 일반적으로 hESCS 또는 hiPSC의 망막 분화를 위해 첨가되는, DKK1 및 NOGGIN의 내생적 생산의 증가에 기인할 가능성이 높다(Meyer et al., 2011; Boucherie et al., 2013). 그럼에도 불구하고, 이전의 연구들은 배양 배지에 첨가되거나 마트리겔 내 존재하는 IGF-I가 hESC를 망막 전구체의 정체성으로 유도한다고 보고하였고(Lambda et al., 2006; Zhu et al., 2013), N2 보충물에 이미 존재하는 인슐린이 상기 조건에서 유사한 역할을 하기에 충분함을 제시한다.
분리된 hiPSC-유래 NR-유사 구조체의 부유 배양물은 척추 동물의 인 비보(in vivo) 망막 발생(retinogenesis)와 동일한 순차적인 방법으로 RPC의 모든 망막 세포 유형으로의 분화를 가능하게 하고, hiPSC-유래 RPC의 다분화능성을 증명한다. 흥미롭게도, 본 발명자는 또한 Notch 경로의 저해는 RPC가 광수용체 계통에 얽혀 있을 때, CRX+ 세포의 두 배 증가와 함께 명백하게 NR-유사 구조체 내의 광수용체 전구체의 비율을 증가시킴을 보고한다. Notch 저해제인, DAPT의 일주일간의 첨가는 대량의 RPC를 위한 세포 주기 종료를 유도하기에 실제로 충분하고, 35일 후, 또한 원추 전구체 마커를 발현하는 약 40%의 CRX+ 광수용체 전구체의 발생을 가능하게 한다. 이러한 전략은 치료적 적용과 함께 세포의 충분한 발생에 유리하다. NR-유사 구조체는 Nakano et al. (2012)의 hESC를 이용한 EB/마트리겔-의존적 프로토콜에서 에 의해 명쾌하게 보고된 바와 같이 이중층 배(cup)를 형성하기 위해 함입(invaginate)되지 않았다. 대신에, hiPSC-유래 구조체는 21일차까지 판상 조직을 유지하였고 이후 망막 내부 핵 층-특이적 정체성을 갖는 세포 및 RGC 둘 모두의 세포로 둘러싸인 중심 영역에서 광수용체-유사 세포들을 포함하는 근엽을 발달시켰다. 그러나 성숙하고 층화된(stratified) NR 조직을 발생시키는 것은 정제된 광수용체 전구체 또는 다른 망막-유래 세포에 기반하는 미래의 세포 치료 전략에 필요한 것은 아니다. 이러한 관점에서, 본 프로토콜은 42일 내에 이식을 위한 유망한 후보군, 즉 CD73+ 광수용체 전구체를 발생시키는 것을 가능하게 한다. 이러한 전구체는 이미 정제되어 성공적으로 마우스 망막으로 이식되었다(Eberle et al., 2011). NOTCH 저해 및 CD73 선별을 결합하는 것이 가능함은 많은 수의 이식 가능한 세포를 분리하는 것을 가능하게 하고, 망막 이영양증(retinal dystrophy)에서 퇴행한 광수용체의 교체의 가능성에 대한 매우 큰 약속을 제공한다. NR-유사 구조체로부터 RGC를 생성하는 능력은 녹내장의 치료에서 매우 중요한 의미를 가진다. 망막 신경의 발생 이외에도, 본 프로토콜은 부수적으로 인 비보 상태에 가까운 표현형을 유지하면서 쉽게 계대 배양 및 증폭될 수 있는 RPE 세포(hiRPE)의 발생을 가능하게 한다. 본 명세서에 기재된 프로토콜은 미래의 AMD 및 다른 RPE 관련 질병들의 치료를 의도하는 hiRPE 세포 뱅크를 빠르게 발생시킬 큰 가능성을 가지고 있다.
임상 등급을 유지하는 목표와 함께, 본 발명자들은 렌티 바이러스 벡터의 사용은 유전적 독성의 위험을 부담하기 때문에 에피솜 리프로그래밍으로 hiPSC를 발생시켰다. 자기 유래의(autologous) 공급원은 hiPSC의 유지에 사용될 수 있다; 이종 없는 및 공급원이 없는 시스템은 재생 치료에 바람직할 것이다. 약리학적 관점에서, hiPSC는 약 개발의 첫 번째 과정에서 새로운 화합물을 프로파일링하는 귀중한 가능성을 제공한다. hiPS-유래 RPC 및 RPE 세포의 증식 능력은 망막 이영양증의 미래의 치료를 위한 특이적 활성 화합물을 확인하는 목표와 함께 표현형 및 표적 기반 고효율 스크리닝을 위한 새로운 세포적 수단을 보장한다.
hiPSC를 특정 망막 계통으로 분화시기키 위해 일반적으로 필요한 시간 소모적 및 노동 집약적인 수동적 단계들에 대한 필요성을 제거하는 이러한 새로운 프로토콜은 RPE 세포 및 다분화능 RPC 모두의 많은 수를 발생시키기 위한 쉽게 확장 가능한 접근 방식을 제공한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법은 상대적으로 짧은 기간 안에 재생성 약제 및 약학적 검사/약물 스크리닝에 새롭게 접근하기 위한 약속을 제공하는 광수용체 전구체 또는 RGC의 원천을 만든다. hiPSC를 이용하는 본 전략은 또한 인간 망막 발달 저변에 대한 분자적 및 세포적 메커니즘을 연구하기 위한 기회를 제공하고, 인간 망막 퇴행성 질환의 인 비트로 모델의 개발을 진보시킬 것이다.
참조 문헌
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Claims (16)

  1. 하기의 단계를 포함하는 인 비트로(in vitro)에서 인간 망막 전구체를 얻는 방법:
    (ⅰ) 인간 만능 줄기 세포를 부착배양 하는 단계로서,
    - 미토마이신-C 비활성화 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 배양 보조 세포층(feeder layer)으로 구성된 영양 세포를 포함하는 부착 배양 시스템 중에,
    - 트랜스페린, 인슐린, 프로게스테론, 푸트레신(putrescine), 및 소듐 셀레니트(sodium selenite)를 포함하는 배지 보충물로 보충된 영양 배지로 구성되는 신경 형성 촉진성(pro-neural) 배지 내에서 부착배양 하는 단계; 및
    (ⅱ) 상기 신경 형성 촉진성 배지 내 상기 부착배양물을 색소 침착 세포(pigmented cell) 및/또는 신경 상피-유사 구조체가 나타날 때까지 유지시키는 단계.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 신경 형성 촉진성 배지는 하기의 분화 인자 중 하나 이상이 결여된 것인 방법: noggin, Dkk-1 및 IGF-1.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 신경 형성 촉진성 배지는 noggin, Dkk-1 및 IGF-1이 결여된 것인 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 상기 단계 (ⅰ)에서 상기 만능 줄기 세포가 80% 이상의 융합성(confluence)에 도달하는 콜로니-유형 단층을 형성하는 것인 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 단계 (ⅱ)는 7일 이상 수행되는 것인 방법.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 망막 색소 침착 상피 세포(RPE 세포)를 얻기 위해 하기의 단계를 더 포함하는 것인 방법:
    (ⅲRPE) 단계 (ⅱ)로부터 얻은 배양물로부터 하나 이상의 색소 침착 세포를 수득하는 단계; 및
    (ⅳRPE) 단계 (ⅲRPE)에서 수득한 상기 색소 침착 세포(들)를 배양하는 단계.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 단계 (ⅳRPE)의 배양은 부착성 배양 시스템에서 수행되는 것인 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 방법은 신경 망막 세포를 얻기 위해 하기의 단계를 더 포함하는 것인 방법:
    (ⅲNR) 단계 (ⅱ)로부터 얻은 배양물로부터, 하나 이상의 신경 상피-유사 구조체로부터의 세포를 수득하는 단계; 및
    (ⅳNR) 단계 (ⅲNR)에서 수득한 상기 세포를 배양하는 단계.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 하나 이상의 신경 상피-유사 구조체는 단계 (ⅲNR)에서 수득한 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 단계 (ⅳNR)의 배양은 비-부착성 배양 시스템에서 수행되는 것인 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 단계 (ⅳNR)의 배양은 FGF2가 5일 이상 보충되는 배양 배지에서 수행되는 것인 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 단계 (ⅳNR)의 배양은 진탕(shaking) 조건하에서 수행되는 것인 방법.
  13. 청구항 8에 있어서, 상기 단계 (ⅳNR)는 광수용체 전구체를 얻기 위해 21일 이상 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 단계 (ⅳNR)에서 Notch 저해제가 1일 내지 5일 이상 동안 배양 배지에 첨가되는 것인 방법.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 방법은 세포 표면 마커 CD73의 결합을 통한 광수용체 전구체의 세포 분류 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 1 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 RPE 세포 및 신경 망막의 전구체 모두를 얻기 위해, 상기 청구항 6 또는 7에서 정의된 단계 (ⅲRPE) 및 (ⅳRPE)이 상기 청구항 8 내지 14 중 어느 하나에서 정의된 단계 (ⅲNR) 및 (ⅳNR)와 병렬적으로 수행되는 것인 방법.
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