CN113272422A

CN113272422A - 用于无载体3d球体悬浮培养中视网膜神经元生成的方法和组合物

Info

Publication number: CN113272422A
Application number: CN201980073481.XA
Authority: CN
Inventors: 冯强; G·埃尔森; 卢世江
Original assignee: Hebei Cell Co ltd
Current assignee: Hebei Cell Co ltd
Priority date: 2018-09-07
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2021-08-17
Also published as: US20210315938A1; WO2020051429A1; JP7436491B2; JP2023054306A; KR20210058872A; JP2022508444A; EP3847244A4; CA3111987A1; AU2019335025A1; EP3847244A1

Abstract

在一个方面中，本文提供了包括由人多能干细胞(hPSC)体外生成的光受体前体细胞(PRPC)的视网膜神经元群，其可用作再生疗法、药物发现和疾病建模的细胞源。还提供了用于制造和使用其的方法和组合物。

Description

用于无载体3D球体悬浮培养中视网膜神经元生成的方法和组合物

相关申请的交叉引用

本申请要求2018年9月7日提交的美国临时专利申请号62/728,088的优先权和权益，其公开通过引用全文的方式纳入本文。

技术领域

本公开总体上涉及用于由例如人多能干细胞生成视网膜神经元的方法和组合物。

背景

年龄相关联的黄斑变性和遗传性视网膜变性是发达国家中导致无法治疗的失明的主要原因[1]。它们有一个共同的最终病理生理学，即光敏光受体(photoreceptor)丢失，其由视杆细胞和视锥细胞组成。对于缺少有效治疗选择的两个患者群体来说，丢失的光受体的替代可以提供一种潜在的治疗策略 [1-3]。大多数黄斑疾病都涉及光受体和视网膜色素上皮细胞(RPE)的丢失，后者支持和维持视网膜外层光受体的健康。已经公开了临床试验中移植人胚胎干细胞(hESC)衍生的RPE来治疗患有干性年龄相关联的黄斑变性(AMD) 和Stargardt病，并显示出安全性和有效性的证据，包括在4年后的评估[4-6]，但在尚未在人临床试验中对衍生自人多能干细胞(hPSC)的光受体进行此类研究[7]。

开发有效的光受体移植疗法的主要要求是建立稳健的方案，其允许由可再生来源(诸如hESC和人诱导型多能干细胞)生成大量同质的光受体前体细胞 (PRPC)，因为形成人组织的PRPC供应有限，主要存在伦理障碍[8]。在过去的数几十年中，由多种鼠和人PSC来源以不同程度的效率体外生成视网膜细胞类型的能力方面取得了显著的进展，包括PRPC和光受体，并在使用不同动物模型的临床前移植研究中建立了hPSC衍生的PRPC的潜力已得到证实[2，7，9-13]。

目前，大多数的分化方案使用传统的贴壁二维(2D)平面培养，其通常通过暴露于蛋白质因子混合物来以2D单层直接起始分化[9-11,14,15]，或者在静态培养中不受控制地形成称为胚状体(EB)的细胞聚集体，然后将其连接涂覆或未涂覆的表面以进一步分化[1，2，8]。最近，Sasai及其同事描述了称为视网膜类器官的基于EB的自组织3D分化系统，其概括了正常视网膜发育的许多方面[16]。基于该技术，数个实验室已经由人PSC层压3D视网膜类器官生成了PRPC和光受体[12，17-21]。然而，长期培养的类器官在不同的发育阶段包含大量的细胞类型，并且这些细胞类型之间形成紧密连接，这使得它们容易发生酶或物理解离，并生成不健康和异质的细胞群。此外，虽然所有这些方法都生成了可用于研究目的的光受体或其祖细胞，但是由于使用非人来源的未限定蛋白质(这带来了主要的安全问题)，它们并不适合生成用于临床应用的可移植细胞。

因此，需要一种可扩展平台，其能够在限定的条件下由hPSC(包括PRPC 和光受体)生成同质的特定细胞群。

发明内容

本公开尤其提供了用于体外产生光受体前体细胞的方法，其包括：

(a)三维(3D)球体培养多个多能干细胞以生成多个第一球体，所述第一球体包含眼早期和晚期定向(committed)视网膜神经祖细胞(CRNP)；

(b)监测球体大小，直到第一球体的直径达到约300-500μm的平均大小；

(c)将所述第一球体解离(disassociate)成第一元(plurality)基本上单一的细胞；

(d)3D球体培养所述第一多个基本单细胞以生成多个第二球体，所述多个第二球体包含光受体前体细胞(PRPC)；

(e)监测球体大小，直到第二球体的直径达到约300-500μm的平均大小；

(f)将所述第二球体解离成第二多个基本单细胞；

(g)3D球体培养所述第二多个基本单细胞以生成多个第三球体，所述多个第三球体包含有丝分裂后PRPC；和

(h)任选地，进一步将有丝分裂后PRPC分化为光受体样细胞。

在一些实施方式中，多能干细胞可以是胚胎干细胞或诱导型多能干细胞，优选来自人类。

在一些实施方式中，步骤(a)、(d)和(g)包括在旋转瓶或搅拌罐生物反应器中培养，优选在连续搅拌下。

在一些实施例中，步骤(a)还包括逐渐适应神经诱导培养基并在其中进行培养，优选NIM-3D(神经诱导培养基-3D)基础培养基，其包含DMEM/F12，具有HEPES，N2和B27无血清补充剂，青霉素/链霉素，MEM非必需氨基酸和葡萄糖，补充有一种或多种下述物质：音猬因子、肝素、IWR-1e、SB431542、 LDN193189和IGF1。

在一些实施方式中，该方法还可包括在神经诱导培养基中提供SB431542、LDN193189和IGF1第一时间段，在神经诱导培养基中提供IWR-1e第二时间段，所述第二时间段短于所述第一时间段，和在神经诱导培养基中提供音猬因子或肝素第三时间段，所述第三时间段短于所述第二时间段。在一些实施方式中，第一时间段为10-20天、优选12-18天、更优选16天。在一些实施方式中，第二时间段为5-15天、优选8-14天、更优选11天。在一些实施方式中，第三时间段为3-12天、优选5-10天、更优选7天。

在一些实施方式中，可在神经定向期间，例如IWR-1e撤出前约1-5天、 2-4天或2天，撤出音猬因子或肝素。在神经诱导培养基中，IWR-1e可在完全适应时，完全适应前约1-5天(或2-4天或1天)撤出。本文所用在某种培养基中完全适应指在100％这类培养基中培养。SB431542、LDN193189和IGF1 可在开始适应光受体分化培养基时或适应前1-5天(或2-4天或3天)撤出。

在一些实施方式中，在步骤(b)中，第一球体的直径达到约350-450μm 的平均大小。在一些实施方式中，在步骤(b)中，第一球体的直径可以达到小于约400μm的平均大小。

在一些实施方式中，步骤(c)和(f)包括将第一球体和第二球体分别与细胞解离酶接触。

在一些实施方式中，步骤(d)还包括逐渐适应光受体分化培养基并在该培养基中培养，优选PRPC-3D培养基，其包含Neurobasal^TM培养基，N2和B27 无血清补充剂，青霉素/链霉素，MEM非必需氨基酸和葡萄糖。

在一些实施方式中，步骤(g)和/或(h)还包括切换至成熟培养基并在其中培养，优选Neurobasal^TM培养基，包含L谷氨酰胺(例如，GlutaMAX^TM)、青霉素/链霉素、人脑源性神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸和DAPT(N-[N-(3,5- 二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)。在某些实施方式中，所述切换可包括逐渐适应成熟培养基。

在一些实施方式中，步骤(g)和/或(h)还包括监测球体大小直到直径为约300-500μm；将第三球体解离成第三多个基本单细胞，优选使用细胞解离酶；和使第三多个基本单细胞重新聚集。

另一方面涉及神经诱导培养基，其包含DMEM/F12，具有HEPES、N2和 B27无血清补充剂，青霉素/链霉素，MEM非必需氨基酸，葡萄糖，和音猬因子、肝素、IWR-1e、SB431542、LDN193189和/或IGF1中的一种或多种。

另一方面涉及成熟培养基，其包含Neurobasal^TM培养基，L谷氨酰胺(例如，GlutaMAX^TM)，青霉素/链霉素，人脑源性神经营养因子(BDNF)，抗坏血酸和DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)。

另一方面涉及用于光受体替代治疗的方法，其包括向有此需求的患者给予使用本文所公开的方法制备的多个有丝分裂后PRPC和/或光受体样细胞。还提供使用本文公开的方法制备的有丝分裂后PRPC和/或光受体样细胞的用途，例如用于光受体替代疗法。在一些实施方式中，光受体替代疗法用于治疗视网膜疾病，如干湿型年龄相关联的黄斑变性，视杆(rod)或视锥(cone)营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性，糖尿病视网膜病变，莱伯氏先天性黑蒙和 Stargardt病。

另一方面涉及用于体外筛选的方法，包括在使用本文所公开的方法制备的多个有丝分裂后PRPC和/或光受体样细胞中测试物质。

附图说明

图1：2D单层和3D球体hiPSC的表征。(图A)从左至右，10cm 2D细胞培养皿，hiPSC单层集落，OCT4阳性hiPSC的流式细胞术直方图(97.9％) 和2D培养的hiPSC核型分析。(图B)(上图，从左至右)旋转瓶，在30ml 旋转器(生物反应器)中培养的3D hiPSC球体，OCT4阳性hiPSC的流式细胞术直方图(98.8％)和来自3D球体的hiPSC的核型分析。(下图)4天传代间隔期间的来自一个hiPSC系的典型3D球体传代周期，培养基变化，形态学和球体大小。

图2：3D球体分化方案和时间线。(图A)示意图显示了在约100天的时间内3D球体PRPC分化。指示了分化的天数，在各时间点使用的特定培养基和小分子和生长因子。(图B)示意图显示了用于将3D-hiPSC诱导和分化为眼早期和晚期定向视网膜神经祖细胞(CRNP)和光受体前体细胞(PRPC)的逐步策略。图中指示了冷冻细胞的时间点。

图3A-3C：3D球体中由hiPSC诱导定向视网膜神经元祖细胞。图3A：相衬图像显示了30ml旋转瓶中来自D0-D19的3D神经球体的完整形态学和扩张。指示了D0(3000万)、D9(约2.5亿)和D19(约4.5亿)的细胞数量。图3B：表格总结了来自用于视网膜神经元分化的4个hiPSC系的结果。使用 PAX6抗体作为神经细胞的标志物，通过流式细胞术评估神经分化效率。图3C：由以3000万个hiPSC起始的一个旋转瓶生成的早期和晚期定向视网膜神经祖细胞(CRNP)在第19天的近似产率。

图4A-4C：诱导3D-hiPSC球体神经元分化期间多能干细胞和神经标志物的表达动力学。图4A：图表显示了通过流式细胞术分析的来自D0-D19分化期间的4个hiPSC系的OCT4、PAX6、PAX6/SOX2和SOX2阳性细胞百分比。图4B：不同神经分化天数的OCT4、PAX6、PAX6/SOX2阳性细胞的流式细胞术分析。图4C：表格总结了流式细胞术分析的结果。

图5A-5B：3D球体细胞中神经标志物的表征。图5A：相衬图像和免疫荧光染色显示了衍生自3D神经球体的细胞上的PAX6、RAX1、巢蛋白和SOX2。 D5的分化的细胞铺板并培养8天，然后用针对神经特异性标志物PAX6(绿色)、 CRNP标志物RAX1(红色)和普遍神经标志物巢蛋白(绿色)和SOX2(红色) 的抗体染色。高百分比的细胞对PAX6/RAX1和NES/SOX2呈双重阳性，这表明获得了神经和早期及晚期CRNP特性。细胞核用DAPI复染。比例尺，100μm。图5B：在诱导分化的不同天通过qRT-PCR对基因表达进行定量分析。OCT4 表达在D5完全消失；PAX6表达在D5升高并持续到D19，然后逐渐降低，直到D40；RAX1表达显示出相似的PAX6模式；CHX10表达在D13显示了峰值，然后在D40下降，这表明在该分化时间段获得早期和晚期CRNP表型并在D40 后起始PRPC特化(specification)。

图6：通过连续解离/重新聚集和球体重组方案生成的视网膜神经元球体。(图A)相衬图像显示了30ml旋转瓶中hiPSC分化不同阶段的3D视网膜神经元球的形态和扩增模式。比例尺＝100μm。(图B)示意性总结说明了来自 3000万起始3D-hiPSC的早期和晚期CRNP和有丝分裂后PRPC的产量。

图7A-7C；hiPSC生成的3D-PRPC的表征。图7A：相衬图像显示了D32 (上图)和D82(下图)分离前的3D hiPSC衍生的3D神经球形态，以及在表面上分别培养5天(D37)和18天(D100)的解离的单细胞。图7B：免疫荧光染色显示了细胞上CRX(绿色)、ThRB2(红色)和NRL(红色)、MAP2 (绿色)和GFAP(红色)的表达，所述细胞衍生自在表面培养另18天的D82 的3D-PRPC球体。Ki67染色(红色)显示了D100非常低的有丝分裂细胞百分比。DAPI用于核染色。图7C：免疫荧光染色显示了细胞上光受体特异性蛋白视紫红质(RHOD，绿色)和恢复蛋白(REC，红色)的表达，所述细胞衍生自在表面培养另18天的D82的3D-PRPC球体。DAPI用于核染色。

图8A-8B：源自hiPSC的3D-PRPC的分子表征。图8A：通过流式细胞术分析确定分化80天后的3D球体细胞的OCT4(0％)、CRX(95.2％)、NRL (96.6％)、NR2E3(91.3％)、REC(96.8)和M-视蛋白(91.2％)的胞内染色定量。仅二抗作为阴性对照。图8B：获自不同天数的视网膜神经分化的 3D球体细胞上的PRPC和光受体标志物的定量RT-PCR分析，其显示了PRPC 表型(NRL，NR2E3，ThRb2)和光受体特征(REC，RHOD，M-视蛋白)的逐渐获得。

图9：120天分化后3D球体内的细胞的表征。(图A)示意图指示D120 的3D球体是如何切片(断续线)。相衬图像显示球体的中心核心的完整形态和完整性。比例尺，100μm。(图B)切片的苏木精染色指示切片上有活细胞。 (图C)D120分化的3D-PRPC球切片上的免疫组化染色显示神经元标志物MAP2 表达。用DAPI复染细胞核。(图D)D120分化的3D球体切片的免疫组化染色显示PRPC标志物CRX(绿色)和NRL(红色)表达；而细胞增殖标志物 Ki67(红色)染色显示这些球体中增殖细胞非常低的百分比。

图10：120天分化后的3D球体表达光受体标志物。D120分化的3D球体切片上的免疫组化染色显示光受体标志物视紫红质(RHOD，绿色)和恢复蛋白(REC，红色)表达。用DAPI复染细胞核。

图11：由人诱导型多能干细胞衍生视网膜神经祖细胞的示例性神经诱导方案概述。使用小分子联合音猬因子(SHH)有效生成视网膜祖细胞。

图12：用肝素或SHH处理的分化细胞中PAX6 mRNA基因表达的比较性 RT-PCR定量。在光受体分化时间线期间由处于两种条件的细胞收集总RNA，并分析PAX6 RNA转录水平。

图13：改良型成熟培养基中源自人诱导型多能干细胞的分化第122天光受体细胞的表征。

具体实施方式

在一个方面中，本文提供了包括由人多能干细胞(hPSC)体外生成的光受体前体细胞(PRPC)的视网膜神经元群，其可用作再生疗法、药物发现和疾病建模的细胞源。还提供了制造和使用其的方法和组合物。

开发细胞疗法的一个基本要求是建立稳健的制造工艺，允许有可再生资源中衍生大量高纯度的可移植细胞，其再现了拟替代的内源性细胞类型的特征。然而，将hPSC分化为视网膜神经元和PRPC用于细胞替代疗法的许多方法在效率、纯度、同质性和可扩展性方面所产生的结果并不理想。在一个方面中，本文公开了一种稳健的、限定的和可扩展的三维(3D)球体培养系统，用于通过同步分化过程在不同发育阶段由hPSC产生高度富集的视网膜神经元，包括早期和晚期定向视网膜神经元祖细胞(CRNP)，PRPC以及光受体样细胞，可以将其容易地适应于当前通用生产实践(cGMP)方案。

在一些实施方式中，该方案或方法可以3D球体开始于hPSC，其在限定的无血清培养基中被直接诱导分化为早期CRNP、晚期CRNP、PRPC和光受体样细胞。在一些实施方式中，培养基可包括这样的小分子组合：其可在培养期间的指定时间点引入培养基中，以诱导分化，伴随在无基质和无载体条件下在旋转式生物反应器中进行的连续球体解离/重新聚集和球体重组方法。这种控制良好的3D球体系统克服了许多限制，特别是可扩展性，面向常规表面贴壁2D培养和传统拟胚体以及类器官系统。令人惊讶的是，该方法通常由3x10⁶个hiPSC 开始生成3-4.5x10⁹个PRPC，纯度约为95％。多水平的分析，包括免疫荧光染色、流式细胞术和通过RT-qPCR的定量基因表达证实了使用该系统生成的早期和晚期CRNP、PRPC和光受体样细胞的特性。因此，该3D球体平台适合于由多种可再生hPSC来源开发体外GMP合规的视网膜细胞制造方案，用于未来的临床前研究和人细胞替代疗法。

限定的最小培养条件下的3D可扩展球体培养系统可以提供多种益处，如可扩展性、再现性和同质性微环境以及成本效益。此外，开发旨在正确的阶段生成富集的视网膜神经元群(如PRPC)的方案是细胞替代疗法(如针对光受体丢失患者的细胞替代疗法)成功的关键。在一些实施方式中，本文所公开的方法模拟已知在正常发育期间引导视网膜组织发生的信号的化学和细胞因子微环境，我们开发了限定的、连续的无基质和无载体3D球体培养系统，并补充了小分子，以直接由3D球体适应的hPSC促进视网膜神经元分化。在一些实施方式中，本文公开的逐步诱导分化方案包括在每代有规律的球体解离/重新聚集，用于在约50-100天的周期内进行球体重组，其导致形成具有受控的、理想大小的均匀球体。不希望受理论束缚，据信球体的大小非常重要，其允许氧气、营养物质和其他因素充分渗透整个球体，富集神经元群体和同步神经元分化。此外，在该方案下分化的hPSC球体依次获得对神经细胞(PAX6)、早期和晚期定向视网膜神经元祖细胞(RAX1和CHX10)、PRPC(CRX、NRL、NR2E3、ThRB2)和光受体(REC、RHOD和M-视蛋白)具有特异性的标志物，纯度为约95％。

有意义的是，本文提供了在无基质和无载体条件下通过例如使用旋转瓶将未分化的hPSC扩增和流线型小分子诱导的视网膜神经元分化整合到可扩展的 3D球体培养系统中的方法，这为当前通用生产实践(cGMP)合规的方法铺平了道路，以将由hPSC产生视网膜神经元的规模扩大，用于细胞替代疗法。

定义

方便起见，将说明书、实施例和所附权利要求中使用的特定术语汇集在此。除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本文所属领域普通技术人员通常所理解的含义。

本文使用冠词“一个”和“一种”表示一个或一个以上的(即至少一个) 该冠词语法上的宾语。举例而言，“一个元件”表示一个元件或者一个以上的元件。

本文所用术语“约”表示在20％以内，更优选10％以内并且最优选5％以内。术语“基本(上)”表示超过50％，更优选超过80％并且最优选超过90％或95％。

本文所用术语“多个/多种”表示超过1个/种，例如，2、3、4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个/种，例如25、30、 40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500或更多个/种，或其间任何整数。

如本文所用，术语“包含”或“包括”是针对存在于给定实施方式中的组合物、方法及其各自的组分来使用的，为开放式，可包含未指定要素。

如本文所用，术语“基本上由……组成”是指给定实施方式所需的那些要素。该术语允许存在实质上不影响本发明的该实施方式的基本和新颖的或功能的特征的附加要素。

术语“由……组成”指本文所述的组合物、方法及其各自的组分，其排除了在该实施方式的描述中未列举的任何要素。

术语“胚胎干细胞”(ES细胞)是指已经作为细胞系连续传代的源自囊胚或桑椹的胚内部细胞团的多能干细胞。ES可以源自卵细胞与精子或DNA的受精、核移植、孤雌生殖等。术语“人胚胎干细胞”(hES细胞)指人ES细胞。ESC 的生成公开于美国专利号5843780；62000806，获自源自体细胞核移植的囊胚内细胞团的ESC述于美国专利号5945577；5,994,619；6235970，通过引用其全部纳入本文。胚胎干细胞的显著特征决定了胚胎干细胞表型。因此，如果细胞具有胚胎干细胞的一个或多个独特特征，那么该细胞将具有胚胎干细胞的表型，从而使该细胞可以与其他细胞区别开来。示例性的不同胚胎干细胞特征包括但不限于基因表达概况、增殖能力、分化能力、核型、对特定培养条件的反应性等。

本文所用术语“多能”是指在不同条件下具有分化为一种以上分化细胞类型能力的细胞，并且优选分化为具有所有三种生殖细胞层特征的细胞类型。多能干细胞的主要特征是其使用例如裸鼠畸胎瘤形成试验分化为多种细胞类型，优选分化为所有三个胚层的能力。这类细胞包括hES细胞、人胚胎源性细胞 (hEDC)和成人源性干细胞。多能干细胞可以是经遗传修饰的，也可以不经遗传修饰的。遗传修饰的细胞可以包括标志物，诸如荧光蛋白，以便于其识别。多能性还通过胚胎干细胞(ES)标志物的表达证明，但多能性的优选测试是证明分化为三个胚层中每一层的细胞的能力。应当注意的是，仅仅培养这些细胞并不能使它们自身成为多能的。相对于在培养中通常仅具有有限数量的分裂能力的原代细胞亲本而言，重编程多能干细胞(例如，本文所定义的术语iPS细胞)还具有延长的传代而不损失生长潜能的能力的特征。

如本文所用，术语“iPS细胞”和“诱导型多能干细胞”可互换地使用并且是指例如通过诱导一个或多个基因的强制表达由非多能干细胞(通常是成体体细胞)人工衍生的(例如，诱导的或通过完全逆转的)多能干细胞。

本文所用术语“重编程”是指改变或逆转体细胞分化状态的过程，从而使细胞核的发育时钟被重置；例如，重新设定成体分化细胞核的发育状态，使其可以执行早期胚胎细胞核的遗传程序，使胚胎发育所需的所有蛋白质都能合成。本文所公开的重编程涵盖体细胞向多能或全能细胞分化状态的完全逆转。重编程通常涉及在合子发育成成体的细胞分化过程中发生的至少一些核酸修饰(例如甲基化)、染色质凝聚、表观遗传变化、基因组印记等遗传模式的改变，例如逆转。

术语“更新”或“自我更新”或“增殖”在本文中互换使用，用于指干细胞通过在长时间和/或数月到数年内分裂成相同的非特化细胞类型来自我更新的能力。在一些情况下，增殖是指通过单细胞反复分裂成两个完全相同的子细胞来扩增细胞。

本文所用术语“培养”或“饲养”是指用于维持细胞活力和/或增殖的体外实验室程序。

术语“无载体三维球体”培养或饲养是指在非贴壁条件下培养细胞以使细胞可以在没有任何载体的情况下自行形成球体的技术。用于培养具有粘附性的细胞的常规方法的特征在于将细胞在诸如培养皿(二维培养)的容器的平面上培养。相反，在三维培养方法中，未向细胞提供贴附支持，并且培养在很大程度上依赖于细胞间接触。

如本文所用，“载体”或“微载体”是指由塑料、陶瓷或其他材料诸如明胶或水凝胶制成的固体球状珠，设计成为悬浮细胞培养物提供贴壁表面。其它形式或形状的载体也有报道，如纤维结构。

术语“球体”或“球状体”是指三维球形或基本球形的细胞团或聚集体。在一些实施方式中，细胞外基质可以用于帮助细胞在其球体内移动，类似于细胞在活组织中移动的方式。最常见的ECM类型是基底膜提取物或胶原蛋白。在一些实施方式中，也可使用无基质或无支架球体培养物，其中细胞悬浮在培养基中生长。这可以通过连续旋转或使用低贴附板来实现。在实施方式中，可通过单次培养或共培养技术诸如悬滴法、旋转培养法、强制漂浮法、搅拌法或凹板法来创建球体(参见例如，Breslin等,Drug Discovery Today 2013,18,240-249； Pampaloni等,Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2007,8,839–845；Hsiao等,Biotechnol.Bioeng.2012,109,1293–1304；和Castaneda等,J.Cancer Res.Clin.Oncol.2000, 126,305–310；均通过引用纳入)。在一些实施方式中，球体的大小可在3D培养期间增长。

术语“培养基”可与“培养介质”互换使用，并指任何允许细胞增殖的培养基。合适的培养基不需要促进最大增殖，只需要可测量的细胞增殖。在一些实施方式中，培养基保持细胞处于多能状态。在一些实施方式中，培养基鼓励细胞(例如，多能干细胞)分化为例如眼早期和晚期定向视网膜神经祖细胞(CRNP) 和感光前体细胞(PRPC)。本文使用的一些示例性基础培养基包括DMEM/F-12 (杜贝克氏改良的依格培养基(Dulbecco's Modified EagleMedium)/营养混合物F-12；可购自赛默飞世尔科技有限公司(Thermo FisherScientific)，无生长因子的

其不含bFGF或TGFb(无

与Pluriton^TM(“PL”) 互换使用，可购自生物工业公司(Biological Industries))和Neurobasal^TM培养基(可购自赛默飞世尔科技有限公司)。各自可以补充下述一种或多种物质：合适的缓冲液(例如，HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸))，化学限定的补充物，诸如N2(0.1-10％，例如1％)和B27(0.1-10％，例如1％)无血清补充物(可购自赛默飞世尔科技公司)，抗生素，诸如青霉素/链霉素(0.1-10％，例如1％)，MEM非必需氨基酸(伊格尔极限必需培养基(Eagle′s Minimal Essential Medium)(MEM)，其由平衡的盐溶液、氨基酸和维生素组成，他们对培养细胞的生长是必需的，并且当补充非必需氨基酸时，产生MEM非必需氨基酸溶液)，葡萄糖(0.1-10％，例如0.30％)，L-谷氨酰胺(例如， GlutaMAX^TM)，人脑源性神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸和/或DAPT (N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰基]-S-苯甘氨酸叔丁酯)。如本文所公开的用于诱导分化的因子，诸如音猬因子、肝素、IWR-1e、SB431542、LDN193189 和IGF1，也可添加到培养基中。

本文所用术语“分化细胞”是指正在分化成体细胞谱系或已终末分化的任何细胞。例如，胚胎细胞可以分化成内衬肠的上皮细胞。例如，分化细胞可以分离自胎儿或活体出生动物。

在细胞个体发育的上下文中，形容词“分化的”或“分化”是一个相对的术语，意指“分化的细胞”是相比与之进行比较的细胞而言，在发育过程中进一步发展下去的细胞。因此，干细胞可以分化为谱系限制的前体细胞(诸如中胚层干细胞)，其可以进一步分化为其他类型的前体细胞(如光受体前体细胞)，然后分化为终末期分化细胞，其将在某些组织类型中发挥特征作用，并且可能会也可能不会保留进一步扩增的能力。

术语“富集”或“富含”在本文中可交换地使用，并意指一种类型细胞的产率 (分数)比该类型细胞在起始培养物或制剂中的分数增加至少10％。

本文所用术语“试剂”或“物质”(agent)指任何化合物或物质，诸如但不限于小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。“试剂”可以是任何化学物质、实体或部分，包括但不限于合成的和天然存在的蛋白性和非蛋白性实体。在一些实施方式中，试剂是核酸、核酸类似物、蛋白质、抗体、肽、适体、核酸寡聚物、氨基酸或碳水化合物，包括但不限于蛋白质、寡核苷酸、核酶、DNA酶、糖蛋白、siRNA、脂蛋白、适体，在某些实施方式中，试剂是具有化学部分的小分子。例如，化学部分包括未取代或取代的烷基、芳香族或杂环基部分，包括大环内酯类、轻肌蛋白(leptomycin)和相关天然产物或其类似物。化合物可以已知具有所需活性和/或性质，或者可以选自多种化合物的库。

术语“小分子”指具有多个碳-碳键且分子量小于1500道尔顿的有机化合物。通常这类化合物包含一个或多个官能团，其介导与蛋白质的结构相互作用的结构，例如氢键，并且通常包括至少一个胺、羰基、羟基或羧基，并且在一些实施方式中，为至少两个化学官能团。小分子试剂可以包含环状碳或杂环结构，和/或用一个或多个化学官能团取代的芳香族或多环芳烃结构。

本文所用术语“标志物”用于描述细胞的特征和/或表型。标志物可以用于选择包含感兴趣特征的细胞。标志物会因特定细胞而异。标志物是特性，既可以是特定细胞类型的细胞形态、功能或生化(酶促)特性，也可以是由该细胞类型表达的分子。优选地，这类标志物是蛋白质，并且更优选地，具有本领域可及抗体或其他结合分子的表位。然而，标志物可由细胞中存在的任何分子组成，包括但不限于，蛋白质(肽和多肽)、脂质、多糖、核酸和类固醇。形态特征或特性的示例包括但不限于形状、大小和核质比。功能特性或特性的示例包括但不限于粘附特定基材的能力、纳入或排除特定染料的能力、特定条件下迁移的能力和沿着特定谱系分化的能力。可以通过本领域技术人员可及的任何方法来检测标志物。标志物也可以是缺乏形态特征或缺乏蛋白质、脂类等。标志物可以是有无多肽和其他形态特征的一组独特特征的组合。

本文所使用的关于分离的细胞群的术语“分离群”指已经由混合或异质细胞群中移出和分离的细胞群。在一些实施方式中，相较于从中分离或富集细胞的异质群，分离群是基本上纯的细胞群。

就特定细胞群而言，术语“基本纯(的)”指相对于构成总细胞群的细胞而言，至少约75％、优选至少约85％、更优选至少约90％且最优选至少约95％纯的细胞群。就确定的内胚层细胞群而言，重述术语“基本纯(的)”或“基本上纯 (的)”指这样的细胞群，其含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、 7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％或少于1％的不是确定的内胚层细胞或其后代的细胞，如本文术语定义。在一些实施方式中，本公开包括扩增确定的内胚层细胞群的方法，其中扩增的确定的内胚层细胞群是基本上纯的确定的内胚层细胞群。类似地，述及SCNT衍生干细胞或多能干细胞的“基本纯的”或“基本上纯的”群体，指含有少于约20％，更优选少于约15％、10％、8％、7％，最优选少于约5％、4％、3％、2％、1％的细胞群。

“视网膜”指眼神经细胞，其分层为三个核层，由光受体、水平细胞、双极细胞、无长突神经细胞、Müller胶质细胞和神经节细胞组成。

“祖细胞”是指保持有丝分裂并可以产生更多祖细胞或前体细胞获自可以分化为终末细胞系的细胞。

“前体细胞”是指能够分化为终末细胞谱系的细胞。

在本公开的实施方式中，“视网膜神经祖细胞”指分化自胚胎干细胞或诱导型多能干细胞的细胞，其表达细胞标志物PAX6和CHX10。这可以包括早期和晚期定向视网膜神经元祖细胞，其可以表达标志物PAX6、RAX1和CHX10。

在本公开的实施方式中，“光受体前体细胞”(PRPC)指分化自胚胎干细胞或诱导型多能干细胞的细胞，并且其表达标志物PAX6，但是不表达标志物 CHX10(即CHX10-)。这些细胞在视网膜神经祖细胞阶段瞬时表达CHX10，但是当细胞分化为光受体祖细胞阶段时，CHX10表达被关闭。PRPC还可以表达标志物CRX、NRL、NR2E3和ThRB2。

同样，“光受体”可指分化自胚胎干细胞或诱导型多能干细胞的有丝分裂后细胞，并且其表达细胞标志物视紫红质(RHOD)或三种锥视蛋白(cone opsin) 中的任一种(例如，M-视蛋白)，并且任选地，表达视杆或视锥cGMP磷酸二酯酶。光受体也可能表达在光受体中发现的标志物恢复蛋白(REC)。光受体可以是视杆和/或视锥光受体。

“光受体样细胞”是这样的细胞，其表达大部分或全部光受体特异性标志物，但尚未对其功能进行检测。

术语“治疗”或“处理”意指包括下述的目的施用物质：(i)预防疾病或病症，即，导致疾病或病症的临床症状不发展；(ii)抑制疾病或病症，即阻止临床症状的发展；和/或(iii)减轻疾病或病症，即导致临床症状消退。

下面进一步详细描述本公开的各个方面。在整个说明书中提供了其他定义。

多能干细胞

在各种实施方式中，PRPC和光受体细胞可以产生自人多能干细胞(hPSC)，包括但不限于人胚胎干细胞(hESC)、人类孤雌生殖干细胞(hPSC)、核移植衍生的干细胞和诱导型多能干细胞(iPSC)。获得这类hPSC的方法在本领域是众所周知的。

多能干细胞在功能上被定义为这样的干细胞：(a)当移植到免疫缺陷型 (SCID)小鼠中时能够诱导畸胎瘤；(b)能够分化成所有三个胚层的细胞类型(例如，可以分化成外胚层、中胚层和内胚层细胞类型)；和(c)表达一种或多种胚胎干细胞标志物(例如，表达Oct4，碱性磷酸酶，SSEA-3表面抗原， SSEA-4表面抗原，NANOG，TRA-1-60，TRA-1-81，SOX2，REX1等)。在某些实施方式中，多能干细胞表达选自下组的一个或多个标志物：OCT4、碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81。例如，示例性的多能干细胞可以使用本领域已知的方法生成。示例性多能干细胞包括衍生自囊胚阶段胚胎的ICM的胚胎干细胞，以及衍生自卵裂阶段或桑椹胚阶段胚胎的一个或多个卵裂球的胚胎干细胞(任选地不破坏胚胎的剩余部分)。这类胚胎干细胞可以由通过受精或无性方式产生的胚胎材料生成，包括体细胞核转移(SCNT)、孤雌生殖和雄性生殖。其它示例性多能干细胞包括通过表达因子(本文称为重编程因子)组合对体细胞进行重编程而生成的诱导型多能干细胞(iPSC)。可以使用胎儿、出生后、新生儿、青年或成人体细胞生成iPSC。

在某些实施方式中，可以用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，OCT4(有时称之为OCT3/4)，SOX2，c-Myc，和Klf4的组合。在其他实施方式中，可用于将体细胞重编程为多能干细胞的因子包括，例如，OCT4、 SOX2、NANOG和LIN28的组合。在某些实施方式中，至少两个重编程因子在体细胞中表达以成功地重编程体细胞。在其它实施方式中，至少三个重编程因子在体细胞中表达以成功地重编程体细胞。在其它实施方式中，至少四个重编程因子在体细胞中表达以成功地重编程体细胞。在其它实施方式中，鉴定其它重编程因子并单独使用或与一个或多个已知的重编程因子组合使用，以将体细胞重编程为多能干细胞。诱导型多能干细胞在功能上被定义并且包括使用多种方法(整合载体、非整合载体、化学手段等)中的任何一种进行重新编程的细胞。多能干细胞可经基因修饰或以其它方式修饰以增加寿命、效力、归巢，以防止或减少同种异体免疫反应或在分化自这类多能干细胞的细胞(例如，光受体细胞、光受体祖细胞、杆状细胞、锥状细胞等，以及例如本文实施例中描述的其他细胞)中递送所需因子。

诱导型多能干细胞(iPS细胞或iPSC)可以通过体细胞中重编程因子的蛋白质转导产生。在某些实施方式中，至少两个重编程蛋白质被转导到体细胞中以成功地重编程体细胞。在某些实施方式中，至少三个重编程蛋白质被转导到体细胞中以成功地重编程体细胞。在某些实施方式中，至少四个重编程蛋白质被转导到体细胞中以成功地重编程体细胞。

多能干细胞可以来自任何物种。胚胎干细胞已经成功地衍生于例如小鼠，非人灵长类动物的多种物种和人，并且胚胎干样细胞已经由多种其他物种中生成。因此，本领域技术人员可以由任何物种生成胚胎干细胞和胚胎衍生的干细胞，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(小鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、狗(家养和野生狗)、猫(家养和野生猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔子、仓鼠、沙鼠、松鼠、豚鼠、山羊、大象、熊猫(含大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸鱼等)等。在某些实施方式中，该物种是濒危物种。在某些实施方式中，该物种是目前已灭绝的物种。

类似地，iPS细胞可以来自任何物种。已经使用小鼠和人细胞生成这些iPS 细胞。此外，已经使用胚胎、胎儿、新生儿和成人组织成功地生成了iPS细胞。因此，可以使用来自任何物种的供体细胞容易地生成iPS细胞。因此，可以由任何物种产生iPS细胞，包括但不限于人、非人灵长类动物、啮齿动物(老鼠、大鼠)、有蹄类动物(牛、羊等)、狗(家养和野生狗)、猫(家养和野生猫，如狮子、老虎、猎豹)、兔子、仓鼠、山羊、大象、熊猫(包括大熊猫)、猪、浣熊、马、斑马、海洋哺乳动物(海豚、鲸鱼等)等。在某些实施方式中，该物种是濒危物种。在某些实施方式中，该物种是目前已灭绝的物种。

诱导型多能干细胞可以使用任何发育阶段的几乎任何体细胞作为起点来生成。例如，细胞可以来自胚胎、胎儿、新生儿、青少年或成人供体。可使用示例性体细胞包括成纤维细胞，如通过皮肤样品或活检组织获得的真皮成纤维细胞，来自滑膜组织的滑膜细胞，包皮细胞，脸颊细胞或肺成纤维细胞。虽然皮肤和脸颊提供了现成的和容易获得的适当细胞来源，几乎任何细胞都可以使用。在某些实施方式中，体细胞不是成纤维细胞。

诱导型多能干细胞可通过在体细胞中表达或诱导一种或多种重编程因子的表达来产生。体细胞可以是成纤维细胞，如真皮成纤维细胞，滑膜成纤维细胞或肺成纤维细胞，或非成纤维体细胞。体细胞可通过导致至少1、2、3、4、 5种重编程因子的表达(诸如通过病毒转导、整合或非整合载体等)和/或与之接触(例如，使用蛋白质转导结构域、电穿孔、微注射、阳离子两亲物、与含脂质双层物的融合体、洗涤剂透化等)来重编程。重编程因子可以选自：OCT3/4、 SOX2、NANOG、LIN28、C-MYC和KLF4。可以通过使体细胞与诱导重编程因子表达的至少一种试剂(例如有机小分子试剂)接触来诱导重编程因子的表达。

其它示例性多能干细胞包括通过表达或诱导因子(“重编程因子”)的组合表达来对体细胞进行重编程而产生的诱导型多能干细胞。iPS细胞可以获自细胞库。制备iPS可能是产生分化细胞的第一步。iPS细胞可以使用来自特定患者或匹配供体的材料特异性地生成，其目的是生成组织匹配的PHRPS或光受体细胞。iPSC可以产生自在预期受体中基本上不具免疫原性的细胞，例如，产生自自体同源细胞或由与预期受体组织相容的细胞。

体细胞也可以使用组合方法进行重编程，其中重编程因子被表达(例如，使用病毒载体、质粒等)并且重编程因子的表达被诱导(例如，使用有机小分子)。例如，可以通过使用病毒载体如逆转录载体或慢病毒载体进行感染来在体细胞中表达重编程因子。同样，可以使用非整合载体(如附加体质粒)在体细胞中表达重编程因子。参见例如，Yu等,Science.2009年5月8日； 324(5928):797-801，通过引用其全部内容纳入。当使用非整合型载体表达重编程因子时，可以使用体细胞的电穿孔、转染或转化(使用载体)在细胞中表达因子。例如，在小鼠细胞中，使用整合型病毒载体表达四种因子(OCT3/4、SOX2、 C-MYC和KLF4)足以重编程体细胞。在人类细胞中，使用整合型病毒载体表达四种因子(OCT3/4、SOX2、NANOG和LIN28)足以重编程体细胞。

一旦重编程因子在细胞中表达，就可以培养细胞。随着时间的推移，培养皿中出现具有ES特征的细胞。可以基于例如ES形态或基于可选择或可检测标志物的表达来选择细胞并传代培养。可以培养这些细胞以产生类似ES细胞的细胞培养物(它们是假定的iPS细胞)。

为了证实iPS细胞的多能性，可以一个或多个多能性试验中测试细胞。例如，可测试细胞是否表达ES细胞标志物；当将细胞移植到SCID小鼠体内时可以评估其产生畸胎瘤的能力；可以评估细胞分化以产生所有三个胚层的细胞类型的能力。一旦获得多能iPSC，其可用于产生本文所公开的细胞类型，例如，光受体祖细胞、光受体细胞、视杆细胞、视锥细胞等，以及本文所述的其他细胞类型。

获得hPSC的另一种方法是通过孤雌生殖。“孤雌生殖”(“孤雌生殖激活的”和“通过单性生殖激活的”在本文中可互换使用)指在没有精子穿透的情况下发生卵母细胞激活的过程，并且指早期胚胎的发育，其包括滋养外胚层和通过激活包含所有雌性源DNA的卵母细胞或胚胎细胞(例如卵裂球)获得的内细胞团。在相关方面中，“孤雌生殖体”指通过这类激活获得的细胞。在另一个相关方面，“囊胚”指受精的激活卵母细胞的卵裂阶段，包括由外部滋养层细胞和内部细胞团(ICM)构成的空心细胞球。在另一相关方面中，“囊胚形成”指这样的过程：在卵母细胞受精或激活后，卵母细胞随后在培养基中培养一段时间以使其发育成由外部滋养层细胞和ICM组成的空心细胞球(例如，5-6天)。

获得hPSC的另一种方法是通过核移植。如本文所用，“核移植”指将供体细胞或来自供体细胞的DNA融合或移植到合适的受体细胞，通常是相同或不同物种的卵母细胞，其在移植或融合之前、同时或之后经处理以去除或使内源性核DNA失活。用于核移植的供体细胞包括胚胎细胞和分化细胞，例如体细胞和生殖细胞。供体细胞可以处于增殖细胞周期(Gl、G2、S或M)或非增殖细胞周期(GO或静止)。优选地，供体细胞或来自供体细胞的DNA源自增殖哺乳动物细胞培养物，例如成纤维细胞培养物。任选地，供体细胞可以是转基因的，即，其可包含一个或多个基因添加、取代或缺失修饰。

获得hPSC的另一种方法是通过细胞重编程来获得诱导型多能干细胞。 Takahashi等(Cell 131861-872(2007))已经公开了这样的方法，所述方法用于在不使用任何胚胎或ES(胚胎干)细胞的情况下对分化细胞进行重编程，并建立具有与ES细胞相似的多能性和生长能力的可诱型多能干细胞。分化成纤维细胞的核重编程因子包括下述四个基因的产物：Oct家族基因；Sox家族基因；Klf家族基因；和Myc家族基因。

优选地，通过在适当条件下培养细胞，例如，通过在成纤维细胞饲养层或另一饲养层或培养物(其包括白血病抑制因子(LIF))上培养来维持细胞的多能性状态。这类培养细胞的多能性状态可以通过多种方法来确认，例如：(i) 确认多能细胞的特征性标志物的表达；(ii)产生含有表达多能干细胞基因型的细胞的嵌合动物；(iii)向动物(例如，SCID小鼠)注射细胞，在体内产生不同的分化细胞类型；和(iv)观察细胞体外分化(例如，在没有饲养层或LIF 的情况下培养)成为胚状体和其他分化细胞类型。

本公开中使用的细胞的多能性状态可以通过多种方法来确认。例如，可以测试细胞是否存在特征性ES细胞标志物。在人ES细胞的情况中，鉴定上述标志物(作为示例)，并且包括SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60、TRA-1-81和OCT 4，并且为本领域已知。

此外，可以通过将细胞注射到合适的动物(例如SCID小鼠)中并观察分化细胞和组织的产生来确认多能性。确认多能性的另一方法是使用对象多能细胞来生成嵌合动物并观察导入的细胞对不同细胞类型的贡献。

确认多能性的另一种方法是观察在有利于分化的条件下培养(例如，去除成纤维细胞饲养层)，ES细胞分化为胚状体和其他分化的细胞类型。该方法已经被应用，并且已经证实对象多能干细胞在组织培养中产生胚状体和不同的分化细胞类型。

通过常规传代，hPSC可以在培养中保持多能状态，直到需要衍生神经干细胞为止。

3D基质和无载体球体培养以产生光受体

为了在细胞疗法中实际应用hPSC，有必要对其进行大规模和3D培养的改善。可以使用多种3D球体培养操作，例如包括强制漂浮(forced-floating)方法，其修饰细胞培养表面并因此通过防止细胞附着于其表面来促进3D培养形成；悬滴法，其支持细胞悬浮生长；搅拌/旋转系统，其鼓励细胞相互贴附形成 3D球体。

用于生成3D球体的一种方法是通过修饰器皿表面来防止3D球体附着于该表面，从而导致细胞被迫漂浮。这促进了细胞间接触，进而促进了多细胞球体形成。示例性表面修饰包括聚-2-甲基丙烯酸羟乙基酯(聚HEMA)和琼脂糖。

3D球体产生的悬滴法使用小等分试样(通常为20ml)的单细胞悬浮液，将其滴入托盘的孔中。类似于强制漂浮，接种悬浮液的细胞密度(例如，50、 100、500个细胞/孔等)可根据所需球体大小进行相应的改变。在细胞接种后，随后将托盘倒置，并使细胞悬浮液的等分试样由于表面张力而变成保持在原位的悬滴。细胞在液滴尖端、液气界面积聚，并允许扩散。

用于产生3D球体的基于搅拌的方法可以大致分为两类：(i)旋转瓶生物反应器和(ii)旋转培养系统。这些方法背后的通用原理是将细胞悬浮液置于容器中，并使悬浮液保持运动，即轻轻搅拌或旋转容器。悬浮细胞的连续运动意味着细胞不会贴附于容器壁，而是形成细胞间相互作用。旋转瓶生物反应器 (通常称为“旋转器”)包括用来容纳细胞悬浮液的容器和用来确保细胞悬浮液连续混合的搅拌元件。旋转细胞培养生物反应器以与旋转瓶生物反应器相似的方式工作，但是其并不使用搅拌棒/杆来保持细胞悬浮液移动，而是旋转培养容器本身。

在一些实施方式中，本文提供了基于旋转瓶的3D球体培养方案。在没有饲养细胞和基质的情况下，可以在具有限定培养基的旋转瓶中连续培养多个 hPSC为基本一致的球体。培养基可以是任何限定的、无异源物质的、无血清的细胞培养基，旨在支持hPSC(如hiPSC和hES)的生长和扩增。在一个示例中，培养基是

培养基。在一些实施方式中，培养基可以是mTeSR1、mTeSR2或E8培养基或其他干细胞培养基。培养基可以补充有小分子抑制剂，所述小分子是Rho相关的，含卷曲螺旋蛋白激酶(ROCK)诸如Y27632或其他ROCK抑制剂如噻唑维文(Thiazovivin)、ROCK II抑制剂(如SR3677) 和GSK429286A。利用该悬浮培养体系，hPSC培养物可以连续传代，并持续扩增至少10代。3D-hiPSC球体的典型传代降格可以为约3-6天，此时球体可以生长至尺寸约为230-260μm直径。球体的大小可以通过取等分试样培养物并用显微镜观察来监控。然后可以使用例如用于分离原代和干细胞系以及组织的具有蛋白水解酶和胶原水解酶活性的酶将球体解离成单个(或基本上单个)细胞。在一个示例中，酶是

或TrypLE，或胰蛋白酶/EDTA。此后，在例如60-70RPM的连续搅拌下，解离的细胞可以重新聚集以在旋转瓶中重组球体。在至少3-5次重复传代后，球体逐渐增大，同时保持了一致的结构和高多能性标志物表达(OCT4)和正常的核型。如本文所用，“传代”应当理解为意指由单细胞生长成理想大小的球体的细胞球体培养物，此时球体被解离成单细胞并再次进行接种用于另一传代。对于3D-hiPSC球体，传代可能需要3-6天，或更长或更短，这取决于hPSC的类型和培养条件。一旦获得足够量的3D-hPSC球体，它们就可以进行3D球体视网膜神经元分化，如下更详细地描述。

为了由hPSC生成处于不同发育阶段的视网膜神经元祖细胞，可以采用主要是小分子的逐步方式直接诱导悬浮液中的3D-hPSC球体(图2)。在一些实施方式中，这可在3D旋转瓶或其它3D球体培养方法中完成。在各种实施方式中，连续3D球体培养可与多个解离/重新聚集步骤整合，同时可以在不同发育阶段添加小分子以诱导视网膜神经元分化。不同于之前所报道的使用蛋白质因子来诱导hPSC向视网膜谱系分化，在可能的情况下使用其质量易于控制的小分子，从而将hPSC球依次分化为不同发育阶段的视网膜细胞。

如图2所示，可以首先以单细胞(例如，1x10⁶细胞/mL)将hPSC(例如， hiPSC)接种于旋转瓶中补充有ROCK抑制剂(例如，Y27632，“Y”)的的限定培养基中。24小时后(指定为诱导的D0)，hiPSC球体可以首先用双SMAD 抑制剂SB431542(“SB”)和LDN193189(“LDN”)处理，以阻断激活素/转化生长因子b(TGF-β)和骨形态发生蛋白(BMP)的信号转导并促进神经模式形成，然后用Wnt抑制剂IWR-1e，IGF1(眼域细胞发育(eye filed cell development)的诱导剂)和肝素处理以进一步诱导视网膜神经谱系定向。

对于PRPC分化，可以通过用上述诱导因子连续稀释Pluriton^TM/无GF

和NIM-3D来实现NIM-3D培养基的逐渐适应。例如，由100％ Pluriton^TM/无GF

向100％NIM-3D的逐渐适应可以包括依次以 75％:25％、50％:50％和25％:75％，用Pluriton^TM/无GF

和NIM-3D 进行中间培养，其中细胞在各种培养基组合物中培养2-6天。也可使用其它稀释系列。NIM-3D(神经诱导培养基-3D)(与“NIM”可互换使用)基础培养基包含DMEM/F12，具有HEPES，N2(0.1-10％，例如，1％)和B27(0.1-10％，例如，1％)无血清补充剂，青霉素/链霉素(0.1-10％，例如，1％)，MEM非必需氨基酸和葡萄糖(0.1-10％，例如，0.30％)。在NIM-3D培养基中完全适应时，可在神经定向和IWR-1e期间撤出肝素。

此后，可以通过包含NIM-3D/PRPC-3D培养基的50/50适应使球体适应 PRPC-3D光受体分化培养基。PRPC-3D培养基(如图11中也称为“PRPM”) 包含Neurobasal^TM培养基，N2(0.1-10％，例如，1％)和B27(0.1-10％，例如， 1％)无血清补充剂，青霉素/链霉素(0.1-10％，例如，1％)，MEM非必需氨基酸和葡萄糖(0.1-10％，例如，0.30％)。SB431542、LDN193189和IGF1可在开始适应NIM-3D/PRPC-3D培养基开始时撤出。

另一个示例性分化方案如图11所示。与图2所示方案的关键区别在于使用音猬因子(SHH)代替肝素。令人惊讶的是，SHH在实现神经元诱导和视网膜祖细胞增殖以及维持PAX6阳性细胞的神经发生方面比肝素等其他分裂素活化的蛋白质更有效。

在分化过程中，可以使用细胞离解酶如胰蛋白酶(赛默飞世尔科技公司)、Accutase酶或胰蛋白酶/EDTA在不同的时间点将球体解离成单细胞。当球体直径通常或平均达到约300-500μm或约350-450μm时，每2-5周可以通过将球体连续解离成单细胞并重新聚集到旋转瓶中生成PRPC，以避免在球体中心产生缺氧细胞。需要注意的是，球体大小超过约450或500μm直径可能是不合需要的，因为这可能会阻止氧、营养物质和分化诱导因子/分子渗透进入球体的中心核心，从而导致坏死以及导致核细胞死亡的其他原因。因此，一旦球体的平均尺寸生长到约300-400μm或约350-450μm直径，就可以使用本领域已知用于细胞解离的各种酶将球体解离成单细胞(或基本单细胞)。

不希望受限于理论，据信如果球体变得太大(例如，直径超过500或超过400μm)那么接近球体中心的细胞可能会处于营养不良的危险。因此，在一些实施方式中，可以希望控制球体大小。在某些实施方式中，当球体的直径达到约300-500μm、约350-450μm或约230-260μm时，可以将其解离。

一旦分离，可通过过滤器过滤(例如，网目尺寸为约10-200或约20-100 或约40μm)单细胞悬浮液。然后将单细胞接种到旋转瓶中的适当培养基中。在各次重新聚集后2-3天以及之后的直到下一解离/重新聚集步骤之前的每一周都可以监测所得球体的形态(大小、外观以及纳入球体的能力)。监测通过取等分试样培养物并用显微镜观察来监控。

因此，本文公开了针对视网膜神经元不同发育阶段的逐步hPSC球分化过程，包括早期和晚期定向视网膜神经元祖细胞(CRNP)、光受体前体细胞 (PRPC)和光受体样细胞。相较于之前报道的分化方案，3D球体平台具有下述优势：

1)具有小分子但不具有未限定基质的限定培养基。在本文公开的3D球体培养系统中，从hPSC维持和扩增到3D球体视网膜分化，不向培养基中添加血清和未定义的基质或载体。此外，用小分子取代蛋白质因子，由此易于控制质量和一致性，使3D球体系统比之前报道的系统更具有一致性和可重复性；

2)用于细胞处理和制造的稳健平台。从3D-hPSC球体扩增培养直接转变到3D球体分化过程，不需要细胞操作，诸如细胞向表面附着或基质包埋，只需替换培养基，即可以使转变顺畅；另外，在过程中产生了处于不同发育阶段的视网膜神经元，并且这些细胞可以被冷冻保存，以便后续进一步分化，使质量控制过程更加容易；

3)3D球体的一致性和完整性导致视网膜神经元分化同步。通过控制搅动/搅拌速度和初始细胞密度，可以长时间(通常为3-4个月)很好地控制hPSC 扩增和诱导分化过程中3D球体的直径和完整性。这使得氧气、营养物质和分化诱导因子/分子渗透到球体的中心核心，避免坏死和导致细胞死亡的其他原因，而这在无控制的胚状体和器官系统中很常见。保持3D球体的一致性和完整性使分化过程与生成纯视网膜神经元群同步；

4)用于大规模产生所需细胞的可扩展过程。虽然实施例使用了30-50 ml的生物反应器来进行概念验证研究，但这很容易扩展到多个和大容量的生物反应器。每个30-50ml生物反应器通常生成约3×10⁸个视网膜神经元细胞，相当于20-25个T-75组织培养瓶的容量，这使该系统成为一种成本效益高且易于管理的工艺，用于细胞生产。

5)生成更加同质性的细胞群。在诱导分化过程中，解离/重新聚集步骤被整合，用于在分开这些细胞时进行球体重组，这作为去除非神经元细胞和富集神经元细胞的纯化步骤。该步骤导致在不同步骤生成不同发育阶段的视网膜细胞，包括早期和晚期的CRNP、PRPC和光受体样细胞，其具有高纯度(约 95％)，并且不污染未分化的多能干细胞；和

6)可扩展用于产生其他类型神经元的具有适应性的系统。因为该3D球体分化过程是多步骤过程，并且各步骤生成独特的神经元处理，通过改变分化诱导条件，该过程可以很容易地扩展到生成其他神经元细胞类型，包括但不限于其他视网膜神经元细胞，诸如视网膜神经节细胞和祖细胞，双极细胞、米勒细胞、水平细胞和无长突神经细胞和其它普遍神经元细胞。

在各种实施方式中，本文提供了一种新型、高些的和定义的3D球体平台，以由hPSC生成所需的细胞，具体地说，可用于盲人患者光受体替代疗法的 PRPC和光受体样细胞。该系统不仅适合于大规模生产工作，而且消除了对动物血清和基质的依赖，加上补充了小分子而非蛋白质因子，从而使其对cGMP 合规的细胞制造方案油耗并使该过程更适合于临床翻译。

光受体替代疗法

视网膜疾病常常由于有丝分裂后神经元细胞的丢失而导致失明。视网膜疾病包括视杆或视锥营养不良、视网膜变性、视网膜色素变性、糖尿病视网膜病变、黄斑变性、莱伯氏先天性黑蒙和Stargardt病。在大多数视网膜变性中，细胞丢失主要发生在外核层，包括视杆和视锥光受体。由于有丝分裂后神经元细胞群的丢失，需要一种新细胞的外源性来源来替代光受体细胞。

视网膜变性是一个不可逆的过程，最终导致失明。视网膜中的视杆和视锥光受体是主要的感光细胞，但这些细胞缺乏再生能力。目前，不存在使丢失的光受体再生的治疗，而细胞置换是治疗光受体丢失患者的唯一的治疗策略。 MacLaren等[46]是第一个证明将小鼠有丝分裂后光受体前体细胞移植到完全失明的小鼠体内恢复了一些视觉功能的研究小组。这些移植的细胞被整合到ONL 层，分化成视杆光受体，形成突触连接，并改善这些动物的视觉功能。最近，有几个研究小组报告，移植衍生自小鼠和人PSC的有丝分裂后光受体前体细胞后，具有不同范围视网膜功能障碍的动物模型的视觉功能得到改善[9、42、43]。这些结果提供了这样的概念证明动物实验，即如果将合适的细胞移植到具有合适微环境的合适位置，细胞替代疗法对光受体变性患者可能有效。使用人胚胎干细胞(hESC)和人胚胎干细胞(hiPSC)衍生的视网膜色素上皮细胞(RPE) 预防AMD和Stargardt病患者视力丧失的临床试验目前正在进行中[3-5]，但用于替代丢失的光受体的细胞移植尚未开始，因此，迫切需要来自可再生来源获得处于适当发育阶段的人光受体前体细胞，用于细胞替代疗法。显然来源于人供体的有丝分裂后人光受体前体并不代表合适的细胞替代来源，使人PSC体外分化以生成视网膜神经元，尤其是有丝分裂后光受体前体细胞将达到此目的。

因此，本文公开的PRPC或光受体细胞可以与药学上可接受的载体配制并用于光受体替代疗法。例如，PRPC或光受体细胞可单独给予或作为药物制剂的组分给予。受试化合物可以任何方便的方式配制用于给药以用于药物。适用于给药的药物制备物可以包括所述PRPC或光受体细胞，联合一种或多种药学上可接受的无菌等渗水性溶液或非水性溶液(例如，平衡盐溶液(BSS))，分散液，悬浮液或乳剂，或可在用前即刻重建为无菌注射型溶液或分散液的无菌粉末，其可含有抗氧化剂，缓冲剂，抑菌剂，溶质，悬浮剂或增稠剂。示例性的药物制备物包括所述PRPC或光受体细胞，联用

BSS

(平衡盐溶液，每mL含有氯化钠7.14mg、氯化钾0.38mg、二水氯化钙0.154mg、六水氯化镁0.2mg、磷酸二氢钠0.42mg、碳酸氢钠2.1mg、左旋糖0.92mg、谷胱甘肽二硫化物(氧化谷胱甘肽)0.184mg，盐酸和/或氢氧化钠(将pH值调节至7.4左右)水溶液)。

在给药时，用于本公开的药物制备物可以是无热原的生理上可接受的形式。

包含用于本文所述方法中的PRPC或光受体细胞的制备物可移植于悬浮液、凝胶、胶体、浆液或混合物中。此外，理想地是将制剂包封于或以粘性形式注射到玻璃体中，用于递送到视网膜或脉络膜损伤部位。此外，在注射时，冷冻保存的PRPC或光受体可使用市售可及的平衡盐溶液重悬，以获得所需的渗透压和浓度，用于便通过视网膜下注射给药。该制备物可以给予未因疾病而完全丧失的中央周围黄斑的区域，这可促进给予的细胞的附着和/或存活。

本公开的PRPC或光受体细胞可通过眼内注射以药学上可接受的眼科制剂递送。例如，当通过玻璃体腔内注射给予制剂时，可将溶液浓缩，从而可以递送最小体积。注射用浓度可为有效且无毒的任何量，取决于本文所述的因素。用于治疗患者的PRPC或光受体细胞的药物制备物可配制为至少约10⁴细胞 /mL的剂量。用于治疗环状的PRPC或光受体细胞制备物的剂量为至少约10³、 10⁴、10⁵、10⁶、107、10⁸、10⁹或10¹⁰PRPC或光受体细胞/mL。例如，PRPC 或光受体细胞可配制在药学上可接受的载体或赋形剂中。

本文所述PRPC或光受体细胞的药物制备物可包括至少约1000；2,000； 3,000；4,000；5,000；6,000；7,000；8,000；或9000个PRPC或光受体细胞。 PRPC或光受体细胞的药物制备物可以包含至少约1×10⁴、2×10⁴、3×10⁴、4×10⁴、 5×10⁴、6×10⁴、7×10⁴、8×10⁴、9×10⁴、1×10⁵、2×10⁵、3×10⁵、4×10⁵、5×10⁵、6×10⁵、 7×10⁵、8×10⁵、9×10⁵、1×10⁶、2×10⁶、3×10⁶、4×10⁶、5×10⁶、6×10⁶、7×10⁶、8×10⁶、 9×10⁶、1×10⁷、2×10⁷、3×10⁷、4×10⁷、5×10⁷、6×10⁷、7×10⁷、8×10⁷、9×10⁷、1×10⁸、 2×10⁸、3×10⁸、4×10⁸、5×108、6×10⁸、7×10⁸、8×10⁸、9×10⁸、1×10⁹、2×10⁹、 3×10⁹、4×10⁹、5×10⁹、6×10⁹、7×10⁹、8×10⁹、9×10⁹、1×10¹⁰、2×10¹⁰、3×10¹⁰、 4×10¹⁰、5×10¹⁰、6×10¹⁰、7×10¹⁰、8×10¹⁰或9×10¹⁰PRPC或光受体细胞，或更多或更少。PRPC或光受体细胞的药物制备物可以包含至少约1×10²-1×10³、 1×10²-1×10⁴、1×10⁴-1×10⁵或1×10³-1×10⁶PRPC或光受体细胞例如，PRPC或光受体细胞的药物制备物可包含至少约20,000-200,000PRPC或光受体细胞，体积为至少约50-200μL。

在上述药物制备物和组合物中，PRPC或光受体细胞的数量或PRPC或光受体细胞的浓度可通过对活细胞进行计数和排除非活细胞来确定。例如，通过无法排除活性染料(如台盼蓝)或使用功能性试验(如粘附培养基质的能力、吞噬作用等)可检测非活性PRPC或光受体细胞。此外，PRPC或光受体细胞的数量或PRPC或光受体细胞的浓度可通过对表达一个或多个PRPC或光受体细胞标志物的细胞和/或排除表达指示除PRPC或光受体细胞以外的细胞类型的一个或多个标志物的细胞来确定。

PRPC或光受体细胞可配制成在药学上可接受的眼科载剂用于递送，使得所述制备物与眼表面保持足够长时间段的接触，以允许所述细胞渗透受影响的眼区域，例如前房、后房，玻璃体、房水、玻璃体、角膜、虹膜/睫状体、晶状体、脉络膜、视网膜、巩膜、脉络膜上间隙、结膜、结膜下间隙、巩膜上间隙、角膜内间隙、角膜表间隙、扁平部、手术诱导的无血管区或黄斑。

PRPC或光受体细胞可包含在细胞片中。例如，包含PRPC或光受体细胞的细胞片可通过在可释放完整细胞片的基材上培养PRPC或光受体细胞来制备，例如，热响应性聚合物，如热响应性聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)嫁接的表面，细胞在培养温度下将粘附和增殖，然后在温度变化时，表面特征发生改变，导致培养的细胞片层释放(例如，通过冷却到低于较低临界溶液温度 (LCST)(参见da Silva等,Trends Biotechnol.2007年12月；25(12):577-83； Hsiue等,Transplantation.2006年2月15日；81(3):473-6；Ide,T.等(2006)；Biomaterials 27,607-614,Sumide,T.等(2005),FASEB J.20,392-394；Nishida, K.等(2004),Transplantation 77,379-385；和Nishida,K.等(2004),N.Engl.J. Med.351,1187-1196，其各自通过引用其全部内容纳入本文)。细胞片可附着于适于移植的基材，如当细胞片被移植到宿主生物体中时可在体内溶解的基材，例如，通过在适于移植的基材上培养所述细胞而制备，或将细胞从另一基材(如热响应性聚合物)释放到适合移植的基材上。可能适合移植的示例性基材可以包含明胶(参见Hsiue等，同上)。可能适合移植的其它基材包括基于纤维蛋白的基质和其他基质。细胞片层可用于制造用于预防或治疗视网膜变性疾病的药物。PRPC或光受体细胞片可被配制成用于将其引入有此需要的对象的眼中。例如，细胞片可以被引入由此需要的眼中，其通过伴有PRPC或光受体细胞片层移植的凹下膜切除术进行，或者其可以用于制造用于凹下膜切除术后移植的药物。

根据本文所述方法给予的制备物的体积可以取决于诸如给药模式、PRPC 或光受体细胞数量、患者年龄和体重以及所治疗疾病类型和严重程度等因素。如果通过注射给予，本公开的PRPC或光受体细胞的药物制备物的体积可为至少约1、1.5、2、2.5、3、4或5mL或更多或更少。体积可以是至少约1-2mL。

治疗视网膜变性的方法可进一步包括给予免疫抑制剂。可使用的免疫抑制剂包括但不限于：抗淋巴细胞球蛋白(ALG)多克隆抗体，抗胸腺细胞球蛋白 (ATG)多克隆抗体，硫唑嘌呤、

(抗IL-2Rα受体抗体)，环孢菌素(环孢菌素A)，

(抗IL-2Rα受体抗体)，依维莫司，麦考酚酸，

(抗CD20抗体)，西罗莫司和他克莫司。免疫抑制剂可以至少约为1、2、4、5、6、7、8、9或10mg/kg给药。当使用免疫抑制剂时，它们可全身或局部给予，并且可在给予PRPC或光受体细胞之前、同时或之后给予。免疫抑制疗法可持续数周、数月、数年，或在给予PRPC或光受体细胞后无限期地进行。例如，在给予PRPC或光受体细胞后，可以给予患者5mg/kg环孢菌素6周。

治疗视网膜变性的方法可包括给予单剂量的PRPC或光受体细胞。此外，本文所述的治疗方法可包括其中PRPC或光受体细胞在一段时间内多次给予的疗程。示例性治疗疗程可包括每周、每两周、每月、每季度、每半年或每年的治疗。或者，治疗可以分阶段进行，由此最初给予多个剂量(例如，第一周每日剂量)，随后需要较少和更少的剂量。

如果通过眼内注射给予，那么PRPC或光受体细胞可在患者的整个生命周期中周期性地递送一次或多次。例如，PRPC或光受体细胞可每年递送一次、每6-12个月递送一次、每3-6个月递送一次、每1-3个月递送一次或每1-4周递送一次。或者，对于某些情况或紊乱，可能需要更频繁的给药。如果通过植入物或装置给予，那么PRPC或光受体细胞可在患者整个生命周期内周期性地给予一次或多次，视特定患者和所治疗的病症或状况的需要而定。类似设想的是随着时间改变的治疗性方案。例如，一开始可能需要更频繁的治疗(例如，每天或每周治疗)。随着时间推移，随着患者病情好转，可能需要更低频率的治疗，甚至可以不需要进一步的治疗。

本文所描述方法可进一步包括通过测量对象中视网膜电图响应、视运动敏锐度阈值或亮度阈值来监测治疗或预防功效的步骤。该方法还可包括通过监测细胞的免疫原性或细胞在眼中的迁移来监测治疗或预防功效。

PRPC或PR可用于制造治疗视网膜变性的药物。本公开还涵盖包含PRPC 或PR的制备物在治疗失明中的用途。例如，包含人PRPC或PR的制备物可用于治疗与导致光受体损伤和失明的许多视力改变疾病相关联的视网膜变性，如糖尿病视网膜病变，黄斑变性(包括年龄相关联的黄斑变性，例如，湿性年龄相关联的黄斑变性和干性年龄相关联的黄斑变性)，视网膜色素变性和Stargardt 病(黄素斑底症(fundus flavimaculatus))，夜盲和色盲。该制备物可以包含至少约5,000-500,000PRPC或PR(例如，100,00PRPC或PR)，可以将其给予与导致光受体损伤和失明的许多视力改变疾病相关联的视网膜变性，如糖尿病视网膜病变、黄斑变性(包括年龄相关联的黄斑变性，视网膜色素变性和 Stargardt病(黄素斑底)。

本文提供的PRPC或PR可以是PRPC或PR。然而，应当注意的是，人细胞可用于人患者，以及动物模型或动物患者。例如，人细胞可在小鼠、大鼠、猫、狗或非人灵长类视网膜变性模型中进行测试。此外，人细胞可治疗性地用于治疗由此需要的动物，如在兽药中。

下述实施例阐述了本公开，并且不应解释为限制本公开的范围。

实施例

实施例1：材料和方法

人诱导型多能干细胞悬浮液培养

本研究中使用的人诱导多能干细胞(hiPSC)通过使用StemRNA^TM-NM重编程试剂盒(Stemgent公司，目录号00-0076)由人正常真皮成纤维细胞生成。 hiPSC在0.25μg/cm²iMatrix-511干细胞培养基材(重组层粘连蛋白-511) (ReproCell公司)上以集落进行常规生长并在NutriStem XF/FF^TM培养基(生物工业公司)中培养。hiPSC通过使用Accutase(创新细胞技术公司(Innovative Cell Technologies))进行解离，从传统2D单层细胞培养转换到九位搅拌板 (Dura-Mag，ChemCell公司)上的一次性旋转瓶(ReproCell公司)中进行3D球体培养。将适应球体的hPSC以0.5-1x10⁶细胞/ml的密度的单细胞形式接种到含有10μMY27632(ReproCell公司)的培养基

的30ml 旋转烧瓶(ReproCell公司)。搅拌速度调整到50-80RPM，取决于hiPSC系。除了接种后第1天仅更换一半培养基外，其余每天更换一次不含Y27632的培养基。当球体大小约为230-260μm时，用Accutase和/或TrypLE将球体解离成单细胞并每4-5天传代一次。细胞球体培养维持在5％CO₂，95％湿度，37℃下。

3D-hiPSC球体的神经定向和光受体祖细胞分化

在旋转培养瓶中3D培养扩增3-5代后，将解离的3D-hiPSC球体以1x10⁶细胞/ml接种。24小时后，将旋转瓶中未分化的hiPSC球体直接用于分化，在整个分化方案中以50-80RPM的搅拌速度进行。图2的图A列出了所有培养基组合物和因子。简言之，在D0用双SMAD抑制剂SB431542(1.5-15，Reagents Direct公司)和LDN193189(0.25-2.5μM，ReproCell公司)以及IFG1(2.5- 50μg/ml，派普泰克公司(Peprotech))对细胞球体进行第一模式形成。在D1 处，将Wnt抑制剂IWR-1e(0.25-10μM、西格玛公司(sigma))和肝素(0.25 -15μg/ml，西格玛公司)添加到分化诱导培养基。在神经定型期的D9撤出肝素，并在其D11撤出IWR-1e。所有其他因子在分化的D15撤出。对于PRPC 分化，从D2-D13，通过用上述诱导因子连续稀释Pluriton^TM/无GF

和NIM-3D来逐渐适应NIM-3D培养基。在D18-D27，通过包含NIM-3D/PRPC-3D培养基的50/50适应使球体适应PRPC-3D光受体分化培养基。从D27开始，将球体保持于PRPC-3D培养基中。培养基如下更换：D0-D1： Pluriton^TM/无GF

D2-D5：75％Pluriton^TM/无GF

NIM-3D；D6-D9：50％Pluriton^TM/无GF

NIM-3D；D10-D13： Pluriton^TM/无GF

25％-NIM-3D 75％；D13-D17：NIM-3D 100％； D18-D27：NIM-3D 50％-PRPC-3D 50％；从D27开始，PRPC-3D100％。

NIM-3D(神经诱导培养基-3D)基础培养基由如下DMEM/F12组成，具有 HEPES、1％N2和1％B27无血清补充剂(赛默飞世尔科技公司)，1％青霉素 /链霉素，MEM非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司)，0.30％葡萄糖(西格玛公司)以及图2中所述的所有因子。PRPC-3D培养基包含Neurobasal^TM培养基， 1％N2和1％B27无血清补充剂(赛默飞世尔科技公司)，1％青霉素/链霉素， MEM非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司)，0.30％葡萄糖(西格玛公司)。细胞在37℃和5％CO₂下孵育。大约85％的培养基在神经分化的D0-D19每天更换一次，并在D19后每2-4天更换一次。

在分化过程中，用TrypLE(赛默飞世尔科技公司)在不同时间点将球体解离成单细胞，并提取RNA用于qRT-PCR分析。其它细胞经处理用于流式细胞术分析和免疫荧光染色。当球体直径通常达到350-450μm时，在D19、 D30-D32、D50-D52、D80-82通过将球体连续解离成单细胞并重新聚集到30ml 旋转瓶中生成PRPC，以避免在球体中心产生缺氧细胞。简言之，解离/重新聚集过程包括将所有球体收集到50ml锥形管中，然后用PBS洗涤一次，并在37 ℃水浴中用TrypLE孵育30-60分钟。将细胞轻轻研磨成单细胞，确保形成同质的单细胞悬浮液，然后通过40μm过滤器进行过滤。将单细胞以0.5–1x10⁶ /ml的密度接种到30ml旋转瓶中具有10μM Y27632的适当培养基。在各次重新聚集后2-3天以及之后的直到下一解离/重新聚集步骤之前的每一周监测所得球体的形态(大小、外观以及纳入球体的能力)。

对于神经玫瑰花状结构(neural rosettes)选择，在神经分化的D5/D12和 D11/D18引入附加的球体附着/手动刮除步骤。简言之，将D5和D11的3ml球体悬浮培养物附着于3个Matrigel(康宁公司(Corning))涂覆的孔(6孔板中)并在用于连续分化的相同培养基中保持7天，此时附着的球体中心形成神经玫瑰花状结构。培养一周后，分别于第12天和第18天，用刮刀(康宁公司) 手动提升(lift)细胞，并以1:1的比例接种于超低附着孔上，以在静态条件下形成悬浮球体。在分化的D30-32，将静态球体解离成单细胞并重新聚集于30ml 旋转瓶中，然后使用与我们的连续解离/重新聚集过程类似的方案继续进行培养。

早期和晚期CRNP和PRPC的冷冻和解冻

由30ml旋转瓶中解离的悬浮培养获得体外分化不同阶段的hiPSC源性视网膜前体细胞(在D19收集的早期CRNP，在D30-D34收集的晚期CRNP，和在D50-D120天收集的PRPC)。将细胞分离成单细胞并使用速率控制冷冻机冷冻保存于补充有10μM Y-26632的CryostorCS10(西格玛公司)冷冻培养基中，其中在1ml等分试样中，对早期和晚期CRNP为4000-5000万细胞/瓶，而对 PRPC为500-1000万细胞/瓶。检测细胞在培养中的恢复/重新聚集的能力以及冷冻保存后的活力。将来自2种不同分化的小瓶解冻，并对总活细胞进行计数以确定回收和活力。解冻时细胞活力平均为80-90％，而回收率为60-80％。将解冻的单细胞放入旋转瓶中，保留了重新聚集的能力，其中球体大小在解冻后 2-4天内为100-150μm，这与连续离解/重新聚集相当。流式细胞术分析解冻后不同天的球体显示，表达PAX6/SOX2的细胞百分比与由最初悬浮培养解离和重新聚集后形成的球体相似。qPCR分析也证实了相似水平的标志物的表达，这进一步证明了冷冻保存和储存大量细胞以备将来应用的可行性。

免疫细胞化学

使用TrypLE将PRPC球体解离成单细胞，并以5.0×10⁴细胞/孔体外接种于Matrigel涂覆的24孔板上，在PRPC-3D培养基中持续10-20天。对于分化的D13，将整个附着的球体用于染色。除去培养基，将细胞用具有Ca/Mg的 DPBS(赛默飞世尔科技公司)洗涤3次，然后在室温下用4％PFA(多聚甲醛) (电子显微镜科学公司(Electron MicroscopySciences))固定15分钟，然后用DPBS洗涤3次。细胞在室温下用5％正常驴血清(NDS)(杰克逊免疫实验室公司)和0.1％曲通X-100(西格玛公司)的DPBS溶液渗透和封闭上至1 小时，然后与在封闭缓冲液中稀释的一抗在4℃下孵育过夜。表1总结了一抗及其稀释度和用于染色的来源。过夜孵育抗体后，将细胞用DPBS洗涤3次，然后在室温下在黑暗条件下与适当的物种特异性荧光偶联二抗一起孵育2小时，该抗体在含有2.5％NDS和0.1％曲通X-100的DPBS中稀释：驴抗小鼠

和驴抗兔

偶联的二抗[1:100](赛默飞世尔科技公司)。表2列出了用于免疫染色的二抗。用DPBS洗涤细胞3次，并在室温下用1μg/m 4’,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)(赛默飞世尔公司)对细胞核复染色3分钟，然后进行DPBS洗涤。使用计算机辅助的尼康公司(Nikon)倒置显微镜(Eclipse Ti-S)以4x、10x和20x物镜检查细胞，并使用NIS-Elements-BR软件(4.50版，尼康公司)捕获和分析图像。

免疫组织化学

在植入OCT.化合物(Scigen)后，D120球体以10-12μm在低温恒温器(徕卡CM 1950)切片。对于染色，将储存于-80℃的载玻片在室温下风干1小时，在冷4％PFA中固定15分钟，然后用DPBS洗涤3次，每次3分钟。直接在切片上进行一抗和二抗封闭和孵育。使用盖玻片用含Fluorogold-G的DAPI(南方生物技术公司(Southern Biotech))固定载玻片，在室温下干燥，并按照上述方法获取图像。

流式细胞术分析

用TrypLE(赛默飞世尔科技公司)将球体解离成单细胞，通过40μm过滤器过滤，并在冰上用固定/透化缓冲液(BD生物科学公司(BD Biosciences)) 固定12分钟。对于使用荧光偶联抗体检测细胞内抗原的流式细胞术，将固定的1.0-2.0X 10⁵细胞/管用含FBS和皂苷(BD生物科学公司)的冰冷1X BD Perm/Wash缓冲液在冰上透化30分钟，然后在黑暗条件下与适当结合的偶联抗体(汇总于表1)孵育30分钟。然后用2ml的Perm/Wash缓冲液洗涤细胞，并准备进行分析。将对照细胞与小鼠或兔IgG一起孵育。对于使用未偶联抗体检测细胞内抗原的流式细胞术，将固定细胞用在DPBS(生命技术公司(Life Technologies))(生命技术公司)中由0.05％曲通X-100(西格玛公司)和5 ％正常驴血清(NDS)(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immuno Research)) 组成的封闭缓冲液在冰上封闭30分钟，然后与在封闭缓冲液中稀释的一抗在室温下孵育1小时，然后用封闭缓冲液洗涤。然后将细胞与在封闭缓冲液[1:1000] 中稀释的适当的驴抗兔

(英杰公司(Invitrogen))或驴抗小鼠

偶联的二抗(英杰公司)在黑暗条件下孵育1小时。洗涤后，将细胞重悬于封闭缓冲液中。对照细胞仅与二抗孵育。按照标准程序在Accuri C6流式细胞仪(BD生命科学公司)上进行细胞分析。用BD Accuri C6 Plus 软件(BD)分析数据。

定量实时聚合酶链反应(qPCR)

使用RNeasy Minikit(凯杰公司)从培养的细胞中分离总RNA，并使用 NanoDropOne(赛默飞世尔公司)测量浓度。qPCR在两步反应中进行。对于逆转录(RT)，使用SuperScript OSM-IV VILO Master Mix cDNA合成试剂盒 (英杰公司)，根据制造商的说明，使用SympliAmp热循环仪(应用生物系统公司(Applied Biosystems))，将0.5μg的总RNA转录为cDNA。对于qPCR 反应，使用带有96孔板块的QuantStudio^TM6Flex实时PCR系统，在包含TaqMan 基因表达分析法和TaqMan快速高级预混液(应用生物系统公司)的20μl反应混合物中扩增15ng的cDNA。表3列出了用于实验的所有TaqMan基因表达测定法(TaqMan探针)。在所有实验中，管家基因GAPDH被用作数据标准化的内部对照。基于2^(-ΔΔCT)方法[31]，使用QuantStudio实时PCR v1.3软件分析各靶基因的相对定量数据，并将诱iPSC用作参考对照。样品设三重复并收集自3个独立的分化。

实施例2：HiPSC球体培养

为了在细胞俩佛啊中实际应用hPSC，有必要对其进行大规模和3D培养。为此，我们建立了将在

培养基中以无饲养细胞2D单层培养的hiPSC (图1，图A)转变为3D动态悬浮培养的方案，其中hiPSC作为均一球体在旋转瓶中用补充有小分子Y27632且没有饲养细胞和基质的

培养基连续培养(图1，图B)[25，32-38]。利用该悬浮培养体系，hPSC培养物可以连续传代，并持续扩增至少10代。3D hiPSC球体的典型传代间隔如图1的图 B所示，其中大小为230-260μm的球体使用Accutase解离成单细胞，并在以 60-70RPM的连续搅拌下在旋转瓶中重新聚集以重组球体。通过流式细胞术分析证明，3-5次重复传代后，球体逐渐增大，同时保持了均一结构和高多能性标志物表达(OCT4：98.8％)和正常的核型。我们的3D-hPSC传代方法是可以广泛适用的，因为它已成功地应用于我们实验室中所有常规测试的hPSC系。

实施例3：用小分子有效诱导3D-hiPSC球的视网膜神经元分化

为了由hiPSC生成处于不同发育阶段的视网膜神经元祖细胞，我们开发了一种新型方法，其中以主要是小分子的逐步方式直接诱导悬浮液中的3D-hiPSC 球体(图2)。3D旋转瓶中的这种新型方案将连续的3D球体培养与利用小分子的多种解离/重新聚集步骤整合，以诱导视网膜神经元分化。不同于之前所报道的使用蛋白质因子来诱导hPSC向视网膜谱系分化[2、8、10、11、16、21、 22]，我们鉴定并主要使用其质量易于控制的小分子，从而将hPSC球依次分化为不同发育阶段的视网膜细胞。首先将细胞以单细胞(1x10⁶细胞/ml)接种于旋转瓶中补充有Y27632的

培养基，以形成球体。24小时后(指定为诱导的D0)，hiPSC球体首先用双SMAD抑制剂SB431542和LDN193189 处理，以阻断激活素/转化生长因子b(TGF-β)和骨形态发生蛋白(BMP)的信号转导并促进神经模式形成[39]，然后添加Wnt抑制剂IWR-1e[10、11、24]， IGF1(眼域细胞发育的诱导剂)和肝素处理以进一步诱导视网膜神经谱系的定向[16]。已经证明，在神经诱导的早期阶段用小分子IWR-1e操纵Wnt信号传导已经报道将在贴壁和视网膜类器官悬浮培养中有效诱导hPSC向早期光受体祖细胞分化[23]。基于4各hiPSC系的结果，24小时内形成的球体大小为100μm -150μm，并且最佳大小为110μm-125μm(图3B)。随着分化从D0进展到 D19，hiPSC球体在生长和扩增的同时保持均匀的大小，并在未解离的情况下逐渐获神经特征。到分化的D3-D5，球体开始改变其外观，边缘更加不规则；到D19，这些不规则的边缘完全消失，球体变得半透明和光滑，这是对于神经球是典型的。在分化过程中，我们观察到细胞数量逐渐增加，当球体大小在 250-300μm直径时，D9的细胞数量为1.5-2.5X 10⁸细胞(5-8倍)，并不断增加至D19时的大约3.0–4.5X 10⁸细胞(10-15倍，图3C)其中球体的直径达到400μm(图3A)。

实施例4：3D-hPSC球体的视网膜神经元分化的动力学分析

通过流式细胞术分析监测配对盒6基因(PAX6)和性别决定区Y-盒2 (SOX2)阳性细胞和PAX6/SOX2双阳性细胞的出现来检测视网膜分化动力学和神经诱导效率。在神经诱导前D0检测到高水平(98％)的已知在hPSC中高水平表达的多能性八聚体结合转录因子4基因(OCT4)，而在分化过程中，其在D2逐渐下调至约50％，在D3逐渐下调至约5％，并在D4完全关闭至0％ (图4A-4C)。SOX2(多能和神经干细胞的标志物)在D0的hPSC中以及神经诱导后的细胞中高水平表达(直至D19)。代表早期定向视网膜祖细胞(CRNP) 的PAX6阳性细胞和PAX6/SOX2双阳性细胞在D3(约10％)出现，并在D3- D4逐渐上调(约77％)。在接下来的1-3天内，在D5-D7，PAX6阳性和 PAX6/SOX2阳性细胞急剧增加(≥90％，图4A-4C)。将有至少约90％的细胞对PAX6和PAX6/SOX2呈阳性的3D球体培养物认为是成功的诱导。

据报道，不同的hPSC系在谱系特异性分化上可能存在差异，并需要对分化条件进行优化。使用上述方案，我们用4个不同的hiPSC系测试了我们的神经分化条件。总之，使各个未分化的hPSC系适应30ml旋转瓶中的悬浮培养，并将大小约为100-150μm的球体用于视网膜神经分化，其中在图2的图A中指定的时间点的最佳浓度为10μM SB431542，1μMLDN193189，10ng/ml IGF1，IWR-1e(2μM)和肝素2μg/ml)，所有hiPSC系产生PAX6+和 PAX6+/SOX2+双阳性细胞(图4A)。我们还注意到，相较于其他3个系，hiPSC 系#2的动力学稍有不同，虽然OCT4的表达以与其他系相似的方式被完全关闭，但是通过流式细胞术分析，PAX6群在D5-D7从未达到>90％，这说明不同细胞系之间神经诱导存在变异性并且不同hiPSC系的质量需要在开始大规模细胞生产前进行检测，以便将来进行细胞替代疗法。虽然如此，但这些结果表明，我们的小分子混合物和神经诱导培养基有效地持续诱导3D-hPSC球体向神经谱系发育，并且不破坏球体。

为了进一步检测源自上述分步分化方案的细胞的特性，我们将D11球体接种在Matrigel涂覆的孔上，培养另2天，并检测PAX6、SOX2和巢蛋白(NES) 以及RAX1(在早期视网膜祖细胞中表达的视网膜特异性转录因子)的表达。这些附着的视网膜球体显示出类似于神经玫瑰花状结构的排列，并且这些细胞对PAX6-RAX1和NES-SOX2呈双重阳性(图5A)，这进一步证实了它们的视网膜谱系。早期分化期间的不同时间点进行的球体的定量实时PCR基因表达分析表明，OCT4基因在D5完全关闭(图5B)，这确证了我们的流式细胞术结果，并进一步证明了我们的3D球体培养物中不存在PSC。相反，神经标志物PAX6的表达从D5开始升高，并在D19神经分化早期中持续，然后在 D34-D40逐渐下调(图5B)，这与分化为更成熟的视网膜细胞的开始相一致。 RAX1在D5的表达表明出现早期CRNP，随后在D13高水平表达包含同源基因(CHX10)的Ceh-10同源结构域(视网膜前体细胞的标志物)，这表明在我们的3D球体培养中不同的发育视网膜细胞类型的相继出现，概括了体内观察到的视网膜发生的时间发展。我们的结果加上先前的报告[9，13，40-42]表明，早期视网膜祖细胞命运法则在大约5-13天时发生于我们的3D球体培养系统中，如图2所示。我们将D5-D13的细胞命名为早期定向视网膜神经元祖细胞(early Committed Retinal Neuron Progenitor，CRNP)，而D13-D40的细胞命名为晚期CRNP。

实施例5：由3D CRNP球体生成光受体前体细胞

虽然先前的研究已经报道了由hPSC生成光受体祖细胞在2D和3D视网膜类器官中具有不同程度的效率[9，11，15，16，18，21，43，44]，我们还研究了我们的分化方案是否能够有效地生成有丝分裂后光受体祖细胞和光受体样细胞。在约D19获得早期CRNP表型后(图5A-5B)，当连续分化的3D球体的直径达到大约400μm时候，将球体第一次解离成单个细胞，并在30ml旋转瓶中用补充有Y27632的神经分化培养基(图6)以0.5-1x10⁶细胞/ml的密度重新聚集，以重组球体。使细胞立即完全重新聚集成具有神经球形态特征的球体(相衬亮，半透明并在球体周围具有小微突)最早在重新聚集后一天，球体大小约为110μm(图6，图A)。在分化条件下，在约D14-约D30观察到球体逐渐连续生长到约400μm，此时球体被再次解离成单细胞并在旋转瓶中重新聚集。在D50-52、D80-82和D100-102重复进行类似的解离/重新聚集方法(图 6，图A)。在各解离/重新聚集周期中观察到类似的球体形成和生长模式，并且从开始的3X 10⁷hiPSC到约D100的约3.0-4.5X 10⁹视网膜神经元祖细胞，细胞数量实现了大约100倍的增加，这远比以前报告的更有效(图6，图B)

为了检测球体的细胞组成，我们在D32和D82(图7A)的解离/重新聚集时间点接种了解离的细胞，并在体外再培养约1-3周。在视网膜分化条件下培养的附着的单细胞的形态特征揭示了神经元连接类似于体外光受体祖细胞的情况(图7A)。为了进一步鉴定这些细胞的真实身份，我们通过免疫荧光细胞化学分析检测了多种感光祖细胞特异性标志物的表达。我们的结果清楚地表明，这些细胞在多轮解离/重聚集后表达高水平视锥-视杆同源盒(cone-rod homeobox，CRX)，神经视网膜亮氨酸拉链(NRL)和甲状腺激素受体-β2 (ThRB2)，关键转录因子(其对于D100发育和光受体命运法则至关重要)(图 7B)。然而，在这些球体中仅检测到少量Ki67+增殖细胞，这表明在该3D球体方案中有效生成有丝分裂后视网膜神经元。此外，在这些细胞中，微管相关蛋白(MAP2，绿色)(相对成熟的神经元细胞的一般标志物)高度表达，而胶质纤维酸性蛋白(GFAP，红色)(星形胶质细胞和/或米勒胶质细胞的标志物)很少被检测到，这表明表达光受体祖细胞特异性标志物的近乎同质的神经元群体，我们将它们称为有丝分裂后视网膜神经元光受体前体细胞(postmitotic retinal neuronsPhotoReceptor Precursor Cell，PRPC)。我们还检测了D100成熟光受体细胞标志物的表达，而我们的结果显示，大多数这些细胞表达视杆视觉色素蛋白视紫红质(rhodopsin)和神经元钙结合蛋白恢复蛋白(REC)，两者都是视杆视紫红质的标志物(图7C)。

在D80通过流式细胞术分析也证实了针对PRPC和光受体细胞样细胞的有效分化。结果表明，未检测到表达多能基因OCT4的细胞，其中90％以上的细胞表达PRPC和光受体标志物(CRX，95.2％；NRL，96.6％；NR2E3，91.3％， REC，96.8％，视锥特异性视蛋白红/绿M-视蛋白，91.2％，图8A)。为了进一步表征分化过程中这些基因的表达动力学，我们进行了RT-qPCR分析。这些分析进一步揭示了PRPC标志物基因如NRL、核受体亚家族2、E组成员3(NR2E3)和ThRβ2从分化的D40开始的逐渐增加(图8B)。类似地，光受体标志物REC、RHOD和M-视蛋白的表达动力学显示出相同的趋势，但M-视蛋白的表达仅在D70可检测到(图8B)。而PAX6、RAX1和CHX10基因(都是早期和晚期CRNP细胞的标志物)显著下调，如图5B所示。这些细胞中早期视网膜神经元基因的伴随性下调和晚期视网膜神经元标志物的上调表明这些细胞处于PRPC和光受体的发育阶段。因此，我们将分化超过80天(D80) 的细胞命名为光受体样细胞。对其他3个hiPSC系进行了相同的分析(数据未显示)，证明了该3D球体分化系统的可重复性和一致性。hiPSC衍生的PRPC 的核型分析表明通过重复解离/重聚集步骤进行长期3D球体培养后遗传稳定性良好(数据未显示)。在液氮中冷冻保存后，对球体和衍生自这些球体的单细胞的活力进行测试，并且从冷冻保存的早期和晚期CRNP和PRPC恢复了≈80％的活细胞(数据未显示)。

为了进一步表征分化的球体中的细胞，我们将D120球体包埋于OCT中并进行切片，通过特异性抗体染色检查通用神经元和视网膜神经元特异性标志物 (图9)。定性评估球体形态学和苏木精染色揭示了在球体的整个截面表面，细胞完整，无坏死核心，这进一步证明了在延长悬浮培养期间，球体被提供了适当的氧气和营养，并且代谢废物被运输到培养基中(图9)。整个切片中以紧凑的方式高水平表达MAP2(图9，图C)，以及高百分比表达PRPC特异性标志物CRX和NRL的细胞，和极低数量的Ki67+增殖细胞进一步证实了这些球体中PRPC的有效生成(图9，图D)。D120时更成熟的视杆光受体丰富，如RHOD和REC在神经上皮细胞的可识别结构内组织的球体中的广泛表达所示(图10)。总之，这些结果表明，我们的培养系统支持通过持续搅拌下小分子、解离/重新聚集和经刺激微重力增强的微环境的联合作用由hiPSC稳健生成大量高纯度且同质的PRPC。

表1：用于流式细胞术和免疫荧光的非偶联一抗的列表

表2：用于流式细胞术的偶联抗体的列表

表3：用于qPCR的TaqMan试验的列表

基因名称	TaqMan试验ID编号
		ARR3	Hs01020134_m1
ASCL1(MASH1)	Hs00269932_m1
		CRX	Hs00230899_m1
GAPDH	Hs02786624_g1
		NR2E3	Hs00183915_m1
NRL	Hs00172997_m1
		OCT4	Hs04260367_gH
OPN1MW(视蛋白-M)	Hs04194752_g1
		OPN1SW(视蛋白-S)	Hs00181790_m1
PAX6	Hs01088114_m1
		PDE6a	Hs00166495_m1
RAX	Hs00429459_m1
		RCVRN(恢复蛋白)	Hs00610056_m1
RHO(视紫红质)	Hs00892431_m1
		THRB(ThRB2)	Hs00230861_m1
VSX2(Chx10)	Hs01584046_m1

实施例6：音猬因子的使用

图11是由人诱导型多能干细胞衍生视网膜神经祖细胞的神经诱导方案概述。使用小分子联合音猬因子(SHH)有效生成视网膜祖细胞。注意，rh-SHH 指重组人SHH。

在旋转培养瓶中3D培养扩增3-5代后，将解离的3D-hiPSC球体以1x10⁶细胞/ml接种。24小时后，将旋转瓶中未分化的hiPSC球体直接用于分化，在整个分化方案中以50-80RPM的搅拌速度进行。图11列出了所有培养基组合物和因子。简言之，在D0用双SMAD抑制剂SB431542(“SB”，1.5-15，Reagents Direct公司)和LDN193189(“LDN”，0.25-2.5μM，ReproCell公司)以及IFG1 (2.5-50μg/ml，派普泰克公司)对细胞球体进行第一模式形成。在D1，向分化诱导培养基Pluriton^TM添加Wnt抑制剂IWR-1e(0.25-10μM，西格玛公司)。在D3，添加rh-SHH(0.5-20nM，西格玛公司)。将rh-SHH在神经定向的 D9撤出，而IWR-1e在D11撤出。所有其他因子在分化的D15撤出。对于PRPC 分化，从D2-D13，通过用上述诱导因子连续稀释Pluriton^TM/无GF

和NIM-3D来逐渐适应NIM-3D培养基。在D18-D27，通过包含 NIM-3D/PRPC-3D培养基的50/50适应使球体适应PRPC-3D光受体分化培养基。从D27开始，将球体保持于PRPC-3D培养基中。培养基如下更换：D0-D1： Pluriton^TM/无GF

D2-D5：75％Pluriton^TM/无GF

NIM-3D；D6-D9：50％Pluriton^TM/无GF

NIM-3D；D10-D12： Pluriton^TM/无GF

25％-NIM-3D 75％；D13-D18：NIM-3D 100％； D19-D21：NIM-3D 50％-PRPC-3D 50％；从D22开始，PRPM-3D 100％。

NIM-3D(神经诱导培养基-3D)基础培养基由如下DMEM/F12组成，具有HEPES、1％N2和1％B27无血清补充剂(赛默飞世尔科技公司)，1％青霉素/链霉素，MEM非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司)，0.30％葡萄糖(西格玛公司)以及图11中所述的所有因子。PRPM-3D培养基包含Neurobasal^TM培养基，1％N2和1％B27无血清补充剂(赛默飞世尔科技公司)，1％青霉素/ 链霉素，MEM非必需氨基酸(赛默飞世尔科技公司)，0.30％葡萄糖(西格玛公司)。细胞在37℃和5％CO₂下孵育。大约85％的培养基在神经分化的D0- D19每天更换一次，并在D19后每2-4天更换一次。

在分化的第7天，相较于肝素处理的对照，SHH处理的培养物表现出更高百分比的表达PAX6(视网膜神经发生所必需的转录因子)的细胞。在第19天，相对于对照，用SHH处理的培养物显示表达PAX6的细胞增加多于10倍。与从第7天到第21天显示出PAX6表达稳定减少的SHH条件相反，对照到第9 天表现出表达PAX6的细胞急剧减少，这可能表明细胞群已适应了主要来自内核层(INL)如双极和无长突细胞类型的替代性细胞命运。此外，肝素处理对照中神经元和视网膜特异性标志物的RT-PCR定量在多个独立的视网膜祖细胞分化中不太一致。这些结果表明，相对其它丝裂原活化蛋白，如肝素，在实现神经元诱导和增殖的视网膜祖细胞方面，SHH是更有效的替代方案。

图12显示了用肝素或SHH处理的分化细胞中PAX6 mRNA基因表达的比较性RT-PCR定量。在光受体分化时间线期间由处于两种条件的细胞收集总RNA，并分析PAX6 RNA转录水平。

肝素处理的对照在D0-D20表现出PAX6 mRNA基因表达缓慢且逐渐增加，这表明hiPSC神经诱导效率较低。相反，相对于对照，SHH处理组到第5 天表现出PAX6 RNA水平的显著且稳健升高，并在第19天之前一直保持高水平。到第5天，SHH处理的细胞的PAX6基因表达水平比对照细胞高多于4倍。这些结果表明SHH在诱导hiPSC朝向神经谱系以及在体外分化前19天维持 PAX6阳性细胞的神经发生方面比肝素更有效。

实施例7：改良型培养基促进向光受体细胞命运的成熟

为了促进前体细胞和早期光受体样细胞的存活和成熟，我们优化了我们的成熟培养基，以稳健地确定视杆和视锥光受体命运。在分化第99天，将细胞培养切换到含有1％谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素、人脑源性神经营养因子 (BDNF)(20ng/mL)、抗坏血酸(0.2mM)和DAPT(1μM)于Neurobasal^TM培养基中的培养基。如图13所示，相较于对照，上述确定的成熟培养基使视杆(RHO)和视锥(ThRβ2)标志物分别增加20％和10％。光受体前体标志物恢复蛋白比对照高约9％。在改良型成熟培养基中也观察到较少的巢蛋白阳性细胞，这表明大部分细胞经历分化并退出了神经干细胞状态。这些免疫细胞化学数据表明，相较于对照培养基，改良型培养基促进了光受体细胞的成熟。

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32.Chen,V.C.,等,人胚胎干细胞的可扩展GMP合规悬浮培养系统 (Scalable GMPcompliant suspension culture system for human ES cells).Stem Cell Res,2012.8(3):第388-402页.

33.Otsuji,T.G.,等,用于大规模人多能干细胞产生的包含功能性聚合物的3D球体培养系统(A 3D sphere culture system containing functional polymers forlarge-scale human pluripotent stem cell production).Stem Cell Reports,2014. 2(5):第734-45页.

34.Olmer,R.,等,使用确定培养基在悬浮培养中长期扩增未分化的人 iPS和ES细胞(Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells insuspension culture using a defined medium).Stem Cell Res,2010.5(1):第51-64页.

35.Lei,Y.和D.V.Schaffer,用于人多能干细胞的扩增和分化的完全确定且可扩展的3D培养系统(A fully defined and scalable 3D culture system for humanpluripotent stem cell expansion and differentiation).Proc Natl Acad Sci U SA,2013.110(52):第E5039-48页.

36.Jiang,B.,等,球状结构形成能在环境条件下长时间保存人干细胞用于储存和运输(Spheroidal formation preserves human stem cells for prolonged time underambient conditions for facile storage and transportation).Biomaterials,2017.133:第275-286页.

37.Wang,Y.,等,贴壁和悬浮培养条件下确定的无异种E8培养基中人诱导型多能干细胞的可扩展扩增(Scalable expansion of human induced pluripotent stem cellsin the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension cultureconditions).Stem Cell Res,2013.11(3):第1103-16页.

38.Ismadi,M.Z.,等,诱导型多能干细胞培养应用的旋转瓶的流动特性 (Flowcharacterization of a spinner flask for induced pluripotent stem cell cultureapplication).PLoS One,2014.9(10):第e106493页.

39.Chambers,S.M.,等,通过双重抑制SMAD信号转导高效神经转化人 ES和iPS细胞(Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dualinhibition of SMAD signaling).Nat Biotechnol,2009.27(3):第275-80页.

40.Meyer,J.S.,等,用人胚胎和诱导型多能干细胞对早期视网膜发育进行建模(Modeling early retinal development with human embryonic and inducedpluripotent stem cells).Proc Natl Acad Sci U S A,2009.106(39):第16698-703 页.

41.Zhu,J.,等,L2Rγ丢失所致免疫抑制增强小鼠视网膜中hESC衍生的光受体的长期功能整合(Immunosuppression via Loss of IL2rgamma Enhances Long-TermFunctional Integration of hESC-Derived Photoreceptors in the Mouse Retina).Cell Stem Cell,2017.20(3):第374-384e5页.

42.Zhu,J.,等,从目前良好的生产实践中制造的人诱导型多能干细胞系中生成可移植视网膜光受体(Generation of Transplantable Retinal Photoreceptors from aCurrent Good Manufacturing Practice-Manufactured Human Induced PluripotentStem Cell Line).Stem Cells Transl Med,2018.7(2): 第210-219页.

43.Reichman,S.和O.Goureau,由融合人iPS细胞产生视网膜细胞 (Productionof Retinal Cells from Confluent Human iPS Cells).Methods Mol Biol,2016.1357:第339-51页.

44.Reichman,S.,等,在无异种和无饲养细胞条件下由附着的人iPS细胞生成可储存的视网膜类器官和视网膜色素上皮细胞(Generation of Storable Retinal Organoidsand Retinal Pigmented Epithelium from Adherent Human iPS Cells in Xeno-Freeand Feeder-Free Conditions).Stem Cells,2017.35(5):第 1176-1188页.

45.Reese,B.E.,视网膜和视路的发育(Development of the retina and opticpathway).Vision Res,2011.51(7):第613-32页.

46.MacLaren,R.,等,通过移植光受体前体修复视网膜(Retinal repair bytransplantation of photoreceptor precursors).Nature,2006.444:203-207页.

对本公开所述方法和组合物的改进和变动对本领域技术人员是显而易见的，而不偏离本公开的范围和精神。虽然已结合具体的优选实施方案对本公开作了描述，但应了解，如权利要求所述，本公开不应过分地受限于这些具体实施方案。实际上，本公开所属领域的相关领域的技术人员意图和理解对所描述的用于实施本公开的方式的各种修改，这些修改落入由所附权利要求所表示的本公开的范围内。

通过引用纳入

本说明书中提到的所有专利和公开通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的专利或公开专门和单独地通过引用纳入本文那样。

Claims

1.一种用于体外产生光受体前体细胞的方法，其包括：

(a)三维(3D)球体培养多个多能干细胞以生成多个第一球体，所述多个第一球体包含眼早期和晚期定向视网膜神经祖细胞(CRNP)；

(c)将所述第一球体解离成第一多个基本单细胞；

(f)将所述第二球体解离成第二多个基本单细胞；

(h)任选地，进一步将有丝分裂后PRPC分化为光受体样细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述多能干细胞是胚胎干细胞或诱导型多能干细胞，优选来自人类。

3.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)、(d)和(g)包括在旋转瓶或搅拌罐生物反应器中培养，优选在连续搅拌下。

4.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)还包括逐渐适应神经诱导培养基并在其中进行培养，优选NIM-3D(神经诱导培养基-3D)基础培养基，其包含DMEM/F12，具有HEPES，N2和B27无血清补充剂，青霉素/链霉素，MEM非必需氨基酸和葡萄糖，补充有一种或多种下述物质：音猬因子、肝素、IWR-1e、SB431542、LDN193189和IGF1。

5.如权利要求4所述的方法，其还包括提供SB431542、LDN193189和IGF1第一时间段，提供IWR-1e第二时间段，所述第二时间段短于所述第一时间段，和提供音猬因子或肝素第三时间段，所述第三时间段短于所述第二时间段。

6.如权利要求5所述的方法，其中，所述第一时间段为10-20天，优选12-18天，更优选16天。

7.如权利要求5所述的方法，其中，所述第二时间段为5-15天，优选8-14天，更优选11天。

8.如权利要求5所述的方法，其中，所述第三时间段为3-12天，优选5-10天，更优选7天。

9.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)中，所述第一球体的直径达到约350-450μm的平均大小。

10.如权利要求1所述的方法，其中，在步骤(b)中，所述第一球体的直径达到小于约400μm的平均大小。

11.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(c)和(f)包括将所述第一球体和所述第二球体分别与细胞解离酶接触。

12.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)还包括逐渐适应光受体分化培养基并在该培养基中培养，优选PRPC-3D培养基，其包含Neurobasal^TM培养基，N2和B27无血清补充剂，青霉素/链霉素，MEM非必需氨基酸和葡萄糖。

13.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(g)和/或(h)还包括切换至成熟培养基并在其中培养，优选Neurobasal^TM培养基，包含L谷氨酰胺(例如，GlutaMAX^TM)、青霉素/链霉素、人脑源性神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸和DAPT(N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-l-丙氨酰基]-S-苯基甘氨酸叔丁酯)。

14.如权利要求1所述的方法，其中，步骤(g)和/或(h)还包括监测球体大小直到直径为约300-500μm；将第三球体解离成第三多个基本单细胞，优选使用细胞解离酶；和使第三多个基本单细胞重新聚集。

15.使用权利要求1-14中任一项所述的方法制备的有丝分裂后PRPC和/或光受体样细胞用于光受体替代疗法的用途。

16.如权利要求15所述的用途，其中，所述光受体替代疗法用于治疗视网膜疾病，如干湿型年龄相关联的黄斑变性，视杆或视锥营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性，糖尿病视网膜病变，莱伯氏先天性黑蒙和Stargardt病。

17.一种用于体外筛选的方法，包括在使用权利要求1-14中任一项所述方法制备的有丝分裂后PRPC和/或光受体样细胞中测试物质。