KR20210058872A - 담체 무함유 3d 구체 현탁 배양에서 망막 뉴런 생성을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

담체 무함유 3d 구체 현탁 배양에서 망막 뉴런 생성을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR20210058872A
KR20210058872A KR1020217010202A KR20217010202A KR20210058872A KR 20210058872 A KR20210058872 A KR 20210058872A KR 1020217010202 A KR1020217010202 A KR 1020217010202A KR 20217010202 A KR20217010202 A KR 20217010202A KR 20210058872 A KR20210058872 A KR 20210058872A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
photoreceptor
spheres
sphere
Prior art date
Application number
KR1020217010202A
Other languages
English (en)
Inventor
펭 퀴앙
지나 엘센
시-지앙 루
Original Assignee
헤베셀 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 헤베셀 코포레이션 filed Critical 헤베셀 코포레이션
Publication of KR20210058872A publication Critical patent/KR20210058872A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/062—Sensory transducers, e.g. photoreceptors; Sensory neurons, e.g. for hearing, taste, smell, pH, touch, temperature, pain
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5058—Neurological cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/16—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of eye parts, e.g. intraocular lens, cornea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/105—Insulin-like growth factors [IGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases (EC 2.)
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C12N2501/91—Heparin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Acoustics & Sound (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

한 양태에서, 본원은 재생 요법, 약물 발견 및 질환 모델링을 위한 세포 공급원으로서 사용될 수 있는 인간 만능성 줄기 세포(hPSC)로부터 시험관 내에서 생성된 광수용체 전구체 세포(PRPC)를 포함하는 망막 신경 집단을 제공한다. 이를 제조하고 사용하는 방법 및 조성물도 제공한다.

Description

담체 무함유 3D 구체 현탁 배양에서 망막 뉴런 생성을 위한 방법 및 조성물
관련 출원의 교차참조
본원은 전체 개시가 본원에 참고로 포함된, 2018년 9월 7일에 출원된 미국 가특허출원 제62/728,088호의 우선권 및 이익을 주장한다.
분야
본 개시는 일반적으로, 예를 들면, 인간 (분화)만능성 줄기 세포로부터 망막 뉴런 생성을 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
연령 관련 황반 변성 및 유전성 망막 변성은 선진국에서 치료 불가능한 실명의 주요 원인을 대표한다[1]. 이들은 간상세포와 원추세포로 구성된 감광성 광수용체의 손실이라는 공통된 최종 병태생리학을 공유한다. 손실된 광수용체의 대체는 효과적인 치료법이 없는 두 환자 집단들에 대한 잠재적 치료 전략을 제공할 수 있다[1-3]. 대다수의 황반 질환들은 광수용체 및 망막 색소 상피(RPE) 둘 다의 손실을 수반하는데, 후자는 외부 망막에서 광수용체의 건강을 뒷받침하고 유지한다. 임상시험에서 건성 연령 관련 황반 변성(AMD) 및 스타가르트병(Stargardt's disease)을 가진 환자를 치료하기 위한 인간 배아 줄기 세포(hESC) 유래 RPE의 이식은 4년 동안 평가를 포함한 안전성 및 효능의 증거를 공개하고 보여주었으나[4-6], 인간 임상시험에서 인간 만능성 줄기 세포(hPSC)로부터 유도된 광수용체에 대한 이러한 연구는 수행되지 않았다[7].
효과적인 광수용체 이식 요법을 개발하기 위한 주요 요건은 재생 가능한 공급원, 예컨대, hESC 및 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로부터 다량의 균질한 광수용체 전구체 세포(PRPC)를 생성할 수 있게 하는 강력한 프로토콜의 확립이나, PRPC가 인간 조직을 형성하기 때문에 주요 윤리적 장벽을 가지므로 공급이 제한된다[8]. 지난 수십 년 동안, 시험관 내에서 다양한 뮤린 및 인간 PSC 공급원들로부터 PRPC 및 광수용체를 비롯한 망막 세포 유형을 다양한 정도의 효율성으로 생성하는 능력 면에서 현저한 진보가 있었고, 상이한 동물 모델들을 사용한 임상전 이식 연구에서 hPSC 유래 PRPC의 잠재력이 확립되었다[2, 7, 9 내지 13].
현재, 대다수의 분화 프로토콜들은 통상적으로 단백질 인자의 칵테일에 노출시킴으로써 2차원적(2D) 단일층으로서 분화를 직접 시작하는 통상적인 부착 2D 평면 배양[9 내지 11, 14, 15], 또는 정적 배양에서 배상체(EB)로서 알려진 세포 응집체를 비제어된 방식으로 형성한 후, 추가 분화를 위해 코팅된 또는 비코팅된 표면에 부착시키는 방법을 이용하였다[1, 2, 8]. 최근에, 사사이(Sasai)와 그의 동료들은 정상 망막 발생의 많은 양태들을 재현하는 망막 오르가노이드(organoid)로서 지칭되는 EB 기반 자가-조직화 3D 분화 시스템을 기술하였다[16]. 여러 실험실들이 이 기법에 근거하여 인간 PSC-적층된 3D 망막 오르가노이드로부터 PRPC 및 광수용체를 생성하였다[12, 17 내지 21]. 그러나, 장기간 배양된 오르가노이드는 상이한 발생 단계에 있는 다수의 세포 유형들을 함유하고, 이 세포 유형들 사이의 밀착 연접부의 형성은 건강하지 않고 불균질한 세포 집단을 생성하면서 이들을 효소적 또는 물리적 해리에 취약하게 만든다. 추가로, 모든 이 방법들이 연구 목적을 위해 사용될 수 있는 광수용체 또는 이의 전구체를 생성하였을지라도, 이들은 주요 안전성 문제점을 제공하는, 비인간 유래의 규정되지 않은 단백질의 사용으로 인해 임상 적용을 위한 이식 가능한 세포를 생성하기에 적합하지 않다.
따라서, 규정된 조건 하에서 hPSC로부터 PRPC 및 광수용체를 포함하는 균질한 특정 세포 집단을 생성할 수 있는 확장 가능한 플랫폼이 필요하다.
본 개시는 특히 광수용체 전구체 세포의 시험관내 제조 방법으로서,
(a) 복수의 만능성 줄기 세포들을 3차원(3D) 구체(sphere) 배양하여, 눈 초기 및 후기 순응된(committed) 망막 신경 전구세포(CRNP)를 포함하는 복수의 제1 구체들을 생성하는 단계;
(b) 제1 구체의 직경이 약 300 내지 500 pm의 평균 크기에 도달할 때까지 구체 크기를 모니터링하는 단계;
(c) 제1 구체를 제1의 복수의 실질적으로 단일 세포들로 해리시키는 단계;
(d) 제1의 복수의 실질적으로 단일 세포들을 3D 구체 배양하여, 광수용체 전구체 세포(PRPC)를 포함하는 복수의 제2 구체들을 생성하는 단계;
(e) 제2 구체의 직경이 약 300 내지 500 pm의 평균 크기에 도달할 때까지 구체 크기를 모니터링하는 단계;
(f) 제2 구체를 제2의 복수의 실질적으로 단일 세포들로 해리시키는 단계;
(g) 제2의 복수의 실질적으로 단일 세포들을 3D 구체 배양하여, 유사분열후(postmitotic) PRPC를 포함하는 복수의 제3 구체들을 생성하는 단계; 및
(h) 임의적으로, 유사분열후 PRPC를 광수용체 유사 세포로 더 분화시키는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 만능성 줄기 세포는 바람직하게는 인간으로부터의 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 (a), (d) 및 (g)는 바람직하게는 연속적인 교반 하에서 스피너(spinner) 플라스크 또는 교반 탱크 생물반응기 내에서 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (a)는 신경 유도 배지, 바람직하게는 소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog), 헤파린(Heparin), IWR-1e, SB431542, LDN193189 및 IGF1 중 하나 이상으로 보충된, HEPES, N2 및 B27 무혈청 보충제, 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산 및 글루코스를 가진 DMEM/F12를 함유하는 NIM-3D(신경 유도 배지-3D) 기초 배지에 점진적으로 적응시키고 이 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 제1 기간 동안 SB431542, LDN193189 및 IGF1을 신경 유도 배지에 제공하는 단계, 제1 기간보다 더 짧은 제2 기간 동안 IWR-1e를 신경 유도 배지에 제공하는 단계, 및 제2 기간보다 더 짧은 제3 기간 동안 소닉 헤지호그 또는 헤파린을 신경 유도 배지에 제공하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 기간은 10일 내지 20일, 바람직하게는 12일 내지 18일, 보다 바람직하게는 16일이다. 일부 실시양태에서, 제2 기간은 5일 내지 15일, 바람직하게는 8일 내지 14일, 보다 바람직하게는 11일이다. 일부 실시양태에서, 제3 기간은 3일 내지 12일, 바람직하게는 5일 내지 10일, 보다 바람직하게는 7일이다.
일부 실시양태에서, 소닉 헤지호그 또는 헤파린은 신경 순응(neural commitment) 동안, 예를 들면, IWR-1e 사용중단 전 약 1일 내지 5일, 2일 내지 4일 또는 2일 동안 사용중단될 수 있다. IWR-1e는 신경 유도 배지에 완전히 적응시켰을 때, 또는 완전히 적응시키기 약 1일 내지 5일(또는 2일 내지 4일 또는 1일) 전에 사용중단될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 특정 배지에 완전히 적응시킨다는 것은 100% 이러한 배지에서 배양한다는 것을 의미한다. SB431542, LDN193189 및 IGF1은 광수용체 분화 배지에의 적응을 시작하였을 때, 또는 적응 약 1일 내지 5일(또는 2일 내지 4일 또는 3일) 전에 사용중단될 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 (b)에서 제1 구체의 직경은 약 350 내지 450 pm의 평균 크기에 도달할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단계 (b)에서 제1 구체의 직경은 약 400 pm 미만의 평균 크기에 도달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 (c) 및 (l)는 각각 제1 구체 및 제2 구체를 세포 해리 효소와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (d)는 광수용체 분화 배지, 바람직하게는 NeurobasalTM 배지, N2 및 B27 무혈청 보충제, 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산 및 글루코스를 함유하는 PRPC-3D 배지에 점진적으로 적응시키고 이 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)는 성숙 배지, 바람직하게는 L-글루타민(예를 들면, GlutaMAXTM), 페니실린/스트렙토마이신, 인간 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산 및 DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-1-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르)를 함유하는 NeurobasalTM 배지로 교체하고 이 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 상기 교체는 성숙 배지에 점진적으로 적응시키는 단계를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 단계 (g) 및/또는 (h)는 직경 약 300 내지 500 pm까지 구체 크기를 모니터링하는 단계; 바람직하게는 세포 해리 효소를 사용하여 제3 구체를 제3의 복수의 실질적으로 단일 세포로 해리시키는 단계; 및 제3의 복수의 실질적으로 단일 세포를 재응집시키는 단계도 포함한다.
또 다른 양태는 HEPES, N2 및 B27 무혈청 보충제, 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산, 글루코스, 및 소닉 헤지호그, 헤파린, IWR-1e, SB431542, LDN193189 및/또는 IGF1 중 하나 이상을 가진 DMEM/F12를 포함하는 신경 유도 배지에 관한 것이다.
또 다른 양태는 NeurobasalTM 배지, L-글루타민(예를 들면, GlutaMAXTM), 페니실린/스트렙토마이신, 인간 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산 및 DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-1-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르)를 포함하는 성숙 배지에 관한 것이다.
추가 양태는 본원에 개시된 방법을 이용하여 제조된 복수의 유사분열후 PRPC들 및/또는 광수용체 유사 세포들을, 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 광수용체 대체 요법을 위한 방법에 관한 것이다. 광수용체 대체 요법을 위한, 본원에 개시된 방법을 이용하여 제조된 유사분열후 PRPC 및/또는 광수용체 유사 세포의 용도도 제공된다. 일부 실시양태에서, 광수용체 대체 요법은 건성 형태 및 습성 형태의 연령 관련 황반 변성 둘 다, 간상세포 또는 원추세포 이영양증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 레버 선천성 흑암시 및 스타가르트병과 같은 망막 질환의 치료를 위한 것이다.
또 다른 양태는 본원에 개시된 방법을 이용하여 제조된 복수의 유사분열후 PRPC들 및/또는 광수용체 유사 세포들에서 작용제를 시험하는 단계를 포함하는 시험관내 스크린 방법에 관한 것이다.
도 1: 2D 단일층 및 3D 구체 hiPSC의 특징규명. (패널 A) 좌측에서 우측으로, 10 cm 2D 세포 배양 접시, hiPSC 단일층 콜로니, OCT4 양성 hiPSC(97.9%)의 유세포분석 히스토그램, 및 2D 배양으로부터의 hiPSC의 핵형 분석. (패널 B) (상부, 좌측에서 우측으로) 스피너 플라스크, 30 ㎖ 스피너(생물반응기)에서 배양된 3D hiPSC 구체, OCT4 양성 hiPSC(98.8%)의 유세포분석 히스토그램, 및 3D 구체로부터의 hiPSC의 핵형 분석. (하부) 전형적인 3D 구체 계대배양 주기, 배지 교체, 4일 계대배양 간격 동안 하나의 hiPSC 세포주로부터의 형태학 및 구체 크기.
도 2: 3D 구체 분화 프로토콜 및 타임라인. (패널 A) 도식은 약 100일의 기간에 걸쳐 3D 구체 PRPC 분화를 보여준다. 분화 일수, 구체적인 배지, 및 각각의 시점에서 사용된 소분자 및 성장 인자가 표시되어 있다. (패널 B) 도식은 3D hiPSC를 눈 초기 및 후기 순응된 망막 신경 전구세포(CRNP) 및 광수용체 전구체 세포(PRPC)로 유도하고 분화시키기 위해 사용된 단계적 전략을 보여준다. 세포를 냉동시키는 시점이 도표에 표시되어 있다.
도 3a 내지 3c: 3D 구체에서 순응된 망막 뉴런 전구세포를 hiPSC로부터 유도하는 것을 보여준다. 도 3a: 위상차 이미지는 30 ㎖ 스피너 플라스크에서 0일째 날부터 19일째 날까지 3D 신경 구체의 온전한 형태학 및 확장을 보여준다. 0일째 날의 세포 수(3천만 개), 9일째 날의 세포 수(약 2억 5천만 개) 및 19일째 날의 세포 수(약 4억 5천만 개)가 표시되어 있다. 도 3b: 표는 망막 뉴런 분화를 위해 사용된 4개의 hiPSC 세포주들로부터의 결과를 요약한다. 신경 세포의 마커로서 PAX6 항체를 사용하여 유세포분석으로 신경 분화의 효율을 평가하였다. 도 3c: 3천만 개의 hiPSC로 출발하는 1개의 스피너 플라스크로부터 생성된, 19일째 날 초기 및 후기 순응된 망막 신경 전구세포(CRNP)의 대략적인 수율.
도 4a 내지 4c: 3D hiPSC 구체의 유도된 뉴런 분화 동안 만능성 및 신경 마커의 발현 동력학. 도 4a: 그래프는 유세포분석에 의해 분석된, 0일째 날부터 19일째 날까지 분화 동안 4개의 hiPSC 세포주들의 OCT4, PAX6, PAX6/SOX2 및 SOX2 양성 세포의 퍼센트를 보여준다. 도 4b: 신경 분화의 상이한 날에 OCT4, PAX6, PAX6/SOX2 양성 세포의 유세포분석. 도 4c: 표는 유세포분석으로부터의 결과를 요약한다.
도 5a 및 5b: 3D 구체 세포에서 신경 마커의 특징규명. 도 5a: 위상차 이미지 및 면역형광 염색은 3D 신경 구체로부터 유도된 세포 상에서 PAX6, RAX1, NESTIN 및 SOX2를 보여준다. 분화된 세포를 5일째 날에 플레이팅하고 8일 동안 배양한 후, 신경 특이적 마커 PAX6(녹색), CRNP 마커 RAX1(적색) 및 일반적인 신경 마커 NESTIN(녹색) 및 SOX2(적색)에 대한 항체로 염색하였다. 높은 퍼센트의 세포들이 PAX6/RAX1 및 NES/SOX2에 대해 이중 양성이었는데, 이는 신경 및 초기 및 후기 CRNP 정체성의 획득을 시사한다. 핵을 DAPI로 반대염색하였다. 축적 막대, 100 pm. 도 5b: 유도된 분화의 상이한 날에 qRT-PCR에 의한 유전자 발현의 정량 분석. OCT4의 발현은 5일째 날까지 완전히 사라졌고; PAX6 발현은 5일째 날에 상승되었고 19일째 날까지 계속된 후, 40일째 날까지 점진적으로 감소되었고; RAX1 발현은 PAX6의 유사한 패턴을 보였고; CHX10 발현은 13일째 날에 정점을 보인 후 40일째 날에 감소되었는데, 이것은 이 분화 기간 동안 초기 및 후기 CRNP 표현형의 획득 및 40일째 날 후 PRPC 특정(specification)의 시작을 암시한다.
도 6: 연속적인 해리/재응집 및 구체 재형성 방식에 의해 생성된 망막 뉴런 구체. (패널 A) 위상차 이미지는 30 ㎖ 스피너 플라스크에서의 hiPSC 분화의 상이한 단계에서 3D 망막 뉴런 구체의 형태학 및 확장 패턴을 보여준다. 축적 막대 =100 pm. (패널 B) 도식적 요약은 3천만 개의 출발 3D hiPSC로부터의 초기 및 후기 CRNP 및 유사분열후 PRPC의 수율을 예시한다.
도 7a 내지 7c: hiPSC로부터 생성된 3D PRPC의 특징규명. 도 7a: 위상차 이미지는 32일째 날(상부) 및 82일째 날(하부) 해리 전 3D hiPSC 유래 3D 신경 구체 형태학, 및 각각 5일(37일째 날) 및 18일(100일째 날) 동안 표면 상에서 배양된 해리된 단일 세포를 보여준다. 도 7b: 면역형광 염색은 추가 18일 동안 표면 상에서 배양된 82일째 날 3D PRPC 구체로부터 유도된 세포 상에서의 CRX(녹색), ThRB2(적색) 및 NRL(적색), MAP2(녹색) 및 GFAP(적색)의 발현을 보여준다. Ki67 염색(적색)은 100일째 날에 매우 낮은 퍼센트의 유사분열 세포를 보여준다. DAPI는 핵 염색을 위해 사용된다. 도 7c: 면역형광 염색은 추가 18일 동안 표면 상에서 배양된 82일째 날 3D PRPC 구체로부터 유도된 세포 상에서의 광수용체 특이적 단백질 로돕신(RHOD, 녹색) 및 레코베린(REC, 적색)의 발현을 보여준다. DAPI는 핵 염색을 위해 사용된다.
도 8a 및 8b: hiPSC로부터 유도된 3D PRPC의 분자 특징규명. 도 8a: 80일의 분화 후 3D 구체 세포에서 유세포분석에 의해 측정된 OCT4(0%), CRX(95.2%), NRL(96.6%), NR2E3(91.3%), REC(96.8%) 및 M-Opsin(91.2%)의 세포내 염색의 정량. 이차 항체만을 음성 대조군으로서 사용하였다. 도 8b: PRPC 표현형(NRL, NR2E3, ThRb2) 및 광수용체 특성(REC, RHOD, M-Opsin)의 점진적인 획득을 보여주는, 망막 신경 분화의 상이한 날로부터 수득된 3D 구체 세포 상의 PRPC 및 광수용체 마커의 정량적 RT-PCR 분석.
도 9: 120일의 분화 후 3D 구체 내부의 세포의 특징규명. (패널 A) 도식적 예시는 120일째 날 3D 구체가 어떻게 절단되었는 지를 표시한다(단절 선). 위상차 이미지는 구체의 중심 코어에서의 온전한 형태학 및 무결성을 표시한다. 축적 막대, 100 pm. (패널 B) 단면의 헤마톡실린 염색은 단면 전체에 걸쳐 생존 세포를 표시한다. (패널 C) 분화 120일째 날 3D PRPC 구체의 단면에 대한 면역조직화학 염색은 뉴런 마커 MAP2 발현을 보여준다. DAPI를 사용하여 핵을 반대염색하였다. (패널 D). 분화 120일째 날 3D 구체의 단면에 대한 면역조직화학 염색은 PRPC 마커 CRX(녹색) 및 NRL(적색) 발현을 보여주고; 세포 증식 마커 Ki67(적색) 염색은 이 구체에서 매우 낮은 퍼센트의 증식 세포를 보여준다.
도 10: 120일 분화 후 3D 구체는 광수용체의 마커를 발현한다. 분화 120일째 날 3D 구체의 단면에 대한 면역조직화학 염색은 광수용체 마커 로돕신(RHOD, 녹색) 및 레코베린(REC, 적색)의 발현을 보여준다. DAPI를 사용하여 핵을 반대염색하였다.
도 11: 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 망막 신경 전구세포를 유도하기 위한 예시적 신경 유도 프로토콜의 개요. 소분자와 소닉 헤지호그(SHH)의 병용은 망막 전구세포를 효율적으로 생성한다.
도 12: 헤파린 또는 SHH로 처리된 분화된 세포에서의 PAX6 mRNA 유전자 발현의 비교 RT-PCR 정량. 광수용체 분화 타임라인 동안 두 조건에서 세포로부터 총 RNA를 회수하고 PAX6 RNA 전사체 수준에 대해 분석하였다.
도 13: 변형된 성숙 배지 중의 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 유도된 분화 122일째 날 광수용체 세포의 특징규명.
한 양태에서, 본원은 재생 요법, 약물 발견 및 질환 모델링을 위한 세포 공급원으로서 사용될 수 있는 인간 만능성 줄기 세포(hPSC)로부터 시험관 내에서 생성된 광수용체 전구체 세포(PRPC)를 포함하는 망막 뉴런 집단을 제공한다. 이를 제조하고 사용하는 방법 및 조성물도 제공한다.
세포 기반 요법의 개발을 위한 필수 요건은 대체하고자 하는 내생성 세포 유형의 특성을 재현하는 다량의 고도로 순수한 이식 가능한 세포를 재생 가능한 공급원으로부터 유도할 수 있게 하는 강력한 제조 과정의 확립이다. 그러나, 세포 대체 요법을 위해 hPSC를 망막 뉴런 및 PRPC로 분화시키는 다수의 방법들은 효율, 순도, 균질도 및 확장성의 관점에서 바람직하지 않은 결과를 생성하였다. 한 양태에서, 본원은 현행 일반 제조 관행(cGMP) 프로토콜에 용이하게 적응될 수 있는, 분화 과정을 동시화함으로써 초기 및 후기 순응된 망막 뉴런 전구세포(CRNP), PRPC 및 광수용체 유사 세포를 포함하는, hPSC로부터의 상이한 발생 단계에 있는 고도로 농후화된 망막 뉴런을 생성하는 강력한 규정된 확장 가능한 3차원(3D) 구체 배양 시스템을 개시한다.
일부 실시양태에서, 상기 프로토콜 또는 과정은 규정된 무혈청 배양 배지에서 초기 CRNP, 후기 CRNP, PRPC 및 광수용체 유사 세포로 분화하도록 직접 유도되는 hPSC를 3D 구체로서 사용함으로써 출발할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 배양 배지는 매트릭스 및 담체 무함유 조건 하에서 스피너 생물반응기에서 연속적인 구체 해리/재응집 및 구체 재형성 방식으로, 분화를 유도하기 위해 배양 동안 특정된 시점에서 상기 배양 배지 내로 도입될 수 있는 소분자들의 조합을 포함할 수 있다. 이 잘 제어된 3D 구체 시스템은 통상적인 표면 부착 2D 배양 및 전통적인 배상체뿐만 아니라 오르가노이드 시스템이 직면하는 많은 한계점들, 특히 확장성을 극복한다. 놀랍게도 이 방식은 통상 3x106개의 hiPSC로 시작하여 대략 95%의 순도로 3x109개 내지 4.5x109개의 PRPC를 생성함을 발견하였다. 면역형광 염색, 유세포분석 및 RT-qPCR에 의한 정량적 유전자 발현을 포함하는 다양한 수준의 분석은 이 시스템을 이용하여 생성된 초기 및 후기 CRNP, PRPC 및 광수용체 유사 세포의 정체성을 확인시켜주었다. 따라서, 이 3D 구체 플랫폼은 향후 임상전 연구 및 인간 세포 대체 요법을 위해 다수의 재생 가능한 hPSC 공급원들로부터 시험관내 GMP 준수 망막 세포 제조 프로토콜을 개발하는 데 적합하다.
규정된 최소 배양 조건에서 3D 확장 가능한 구체 배양 시스템은 다양한 이점들, 예컨대, 확장성, 재현성 및 균질한 미세환경뿐만 아니라 비용 효과도 제공할 수 있다. 추가로, 정확한 단계에서 PRPC와 같은 농후화된 망막 뉴런 집단을 생성하는 것을 목적으로 하는 프로토콜의 개발은 세포 대체 요법, 예컨대, 광수용체가 손실된 환자를 위한 세포 대체 치료의 성공의 열쇠이다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 정상적인 발생 동안 망막 조직형성을 안내하는 것으로 알려진 신호의 화학적 및 사이토카인 미세환경을 모방하기 때문에, 본 발명자들은 3D 구체에 적응된 hPSC로부터 망막 뉴런 분화를 직접 촉진하기 위해 소분자가 보충된, 규정된 연속적인 매트릭스 및 담체 무함유 3D 구체 배양 시스템을 개발하였다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 단계적 유도 분화 프로토콜은 제어된 바람직한 크기를 가진 균일한 구체의 형성을 유발하는, 약 50일 내지 100일의 기간에 걸친 구체 재형성을 위해 모든 계대배양에서 규칙적인 구체 해리/재응집을 포함한다. 이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, 구체 크기는 구체 전체에 걸쳐 산소, 영양분 및 다른 인자의 충분한 침투, 뉴런 집단의 농후화 및 신경 분화의 동시화를 허용하는 데 있어서 중요하다고 생각된다. 나아가, 이 프로토콜 하에서 분화된 hPSC 구체는 약 95%의 순도로 신경 세포(PAX6), 초기 및 후기 순응된 망막 뉴런 전구세포(RAX1 및 CHX10), PRPC(CRX, NRL, NR2E3, ThRB2) 및 광수용체(REC, RHOD 및 M-OPSIN)에 특이적인 마커를 순차적으로 획득한다.
중요하게는, 본원은 예를 들면, 스피너 플라스크를 이용함으로써 매트릭스 및 담체 무함유 조건 하에서 미분화된 hPSC 증폭 및 간소화된 소분자-유도된 망막 뉴런 분화를 확장 가능한 3D 구체 배양 시스템 내로 통합하는 방법을 제공함으로써, 세포 대체 요법을 위해 hPSC로부터의 망막 뉴런 생성을 규모확장하는 현행 일반 제조 관행(cGMP) 준수 과정을 위한 길을 개척한다.
정의
편의를 위해, 본 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 일부 용어들이 여기에 기재되어 있다. 달리 정의되어 있지 않은 한, 본원에서 사용된 모든 기술 용어들 및 과학 용어들은 본 개시가 속하는 분야에서 통상의 기술을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다.
단수형 관사는 관사의 하나 또는 하나 초과(즉, 적어도 하나)의 문법적 객체를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들면, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 20% 이내, 보다 바람직하게는 10% 이내, 가장 바람직하게는 5% 이내를 의미한다. 용어 "실질적으로"는 50% 초과, 바람직하게는 80% 초과, 가장 바람직하게는 90% 또는 95% 초과를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "복수의"는 1개 초과, 예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개 이상, 예를 들면, 25개, 30개, 40개, 50개, 60개, 70개, 80개, 90개, 100개, 200개, 300개, 400개, 500개 이상, 또는 이들 사이의 임의의 정수를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 또는 "포함한다"는 소정의 실시양태에 존재하되, 특정되지 않은 요소의 포함도 배제하지 않는 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분(들)을 지칭하는 데 사용된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "로 본질적으로 구성된"은 소정의 실시양태를 위해 요구된 요소들을 지칭한다. 상기 용어는 본 발명의 그 실시양태의 기본 특성(들) 및 신규 또는 기능적 특성(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가 요소의 존재를 허용한다.
용어 "로 구성된"은 실시양태의 그 설명에서 언급되지 않은 임의의 요소를 배제하는, 본원에 기재된 조성물, 방법 및 이의 각각의 성분을 지칭한다.
용어 "배아 줄기 세포"(ES 세포)는 세포주로서 연속적으로 계대배양된 배반포 또는 상실배의 내부 세포 덩어리로부터 유도된 만능성 세포를 지칭한다. ES 세포는 난세포와 정자 또는 DNA의 수정, 핵 전달, 단성생식 등으로부터 유도될 수 있다. 용어 "인간 배아 줄기 세포"(hES 세포)는 인간 ES 세포를 지칭한다. ESC의 생성은 미국 특허 제5,843,780호 및 제6,200,806호에 개시되어 있고, 체세포 핵 전달로부터 유도된 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 수득된 ESC는 미국 특허 제5,945,577호, 제5,994,619호 및 제6,235,970호에 기재되어 있고, 이 특허들은 전체적으로 본원에 참고로 포함된다. 배아 줄기 세포의 식별 특성은 배아 줄기 세포 표현형을 규정한다. 따라서, 세포는 그 세포가 다른 세포와 식별될 수 있도록 배아 줄기 세포의 특유의 특성들 중 하나 이상의 특성을 가진 경우 배아 줄기 세포의 표현형을 가진다. 예시적 식별 배아 줄기 세포 특성은 유전자 발현 프로파일, 증식 능력, 분화 능력, 핵형, 특정 배양 조건에 대한 반응성 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "만능(성)(pluripotent)"은 상이한 조건 하에서 하나 초과의 분화된 세포 유형으로 분화하는, 바람직하게는 모든 3개의 배세포 층들의 특징적인 세포 유형으로 분화하는 능력을 가진 세포를 지칭한다. 만능성 세포는 예를 들면, 누드 마우스 기형종 형성 어세이를 이용함으로써, 주로 하나 초과의 세포 유형, 바람직하게는 모든 3개의 배엽들로 분화하는 그의 능력을 특징으로 한다. 이러한 세포는 hES 세포, 인간 배아 유래 세포(hEDC) 및 성체 유래 줄기 세포를 포함한다. 만능성 줄기 세포는 유전적으로 변형될 수 있거나 유전적으로 변형되지 않을 수 있다. 유전적으로 변형된 세포는 그의 확인을 용이하게 하기 위해 형광 단백질과 같은 마커를 포함할 수 있다. 만능성에 대한 바람직한 시험이 3개의 배엽들 각각의 세포로 분화하는 능력의 입증이지만, 만능성은 배아 줄기(ES) 세포 마커의 발현에 의해서도 입증된다. 이러한 세포를 단순히 배양하는 것은 그 자체로 이 세포를 만능성 세포로 만들지 않음을 인지해야 한다. 재프로그래밍된 만능성 세포(예를 들면, iPS 세포는 본원에서 그 용어로서 정의됨)도 일반적으로 배양물에서 단지 제한된 수의 분열을 하는 능력을 가진 일차 세포 모체에 비해 성장력의 손실 없이 연장된 계대배양 능력이라는 특성을 가진다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "iPS 세포" 및 "유도 만능 줄기 세포"는 교환 가능하게 사용되고, 예를 들면, 하나 이상의 유전자의 강제된 발현을 유도함으로써 비-만능성 세포, 전형적으로 성체 체세포로부터 (예를 들면, 유도된 또는 완전한 복귀에 의해) 인위적으로 유도된 만능성 줄기 세포를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재프로그래밍"은 핵의 발생 시계가 재설정되도록 체세포의 분화 상태를 변경시키거나 복귀시키는 과정; 예를 들면, 초기 배아 세포 핵의 유전 프로그램을 수행하여, 배아 발생을 위해 요구된 모든 단백질들을 만들 수 있도록 성체 분화된 세포 핵의 발생 상태를 재설정하는 것을 의미한다. 본원에 개시된 재프로그래밍은 체세포의 분화 상태를 만능성 또는 전능성 세포로 완전히 복귀시키는 것을 포괄한다. 재프로그래밍은 일반적으로 자이고트(zygote)가 성체로 발생할 때 세포 분화 동안 일어나는 핵산 변형(예를 들면, 메틸화), 염색질 축합, 후성적 변화, 게놈 임프린팅(imprinting) 등의 유전성 패턴들 중 적어도 일부의 변경, 예를 들면, 복귀를 수반한다.
용어 "재생" 또는 "자가-재생" 또는 "증식"은 본원에서 교환 가능하게 사용되고, 장기간 및/또는 수개월 내지 수년에 걸쳐 동일한 비-전문화된 세포 유형으로 분열함으로써 스스로 재생하는 줄기 세포의 능력을 지칭하기 위해 사용된다. 일부 경우, 증식은 2개의 동일한 딸 세포들로의 단일 세포의 반복된 분열에 의한 세포의 증폭을 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "배양물" 또는 "배양"은 세포 생존율 및/또는 증식을 유지하기 위한 시험관내 실험실 절차를 지칭한다.
용어 "담체 무함유 3차원 구체" 배양물 또는 배양은 세포가 임의의 담체 없이 스스로 구체를 형성할 수 있도록 비부착 조건에서 세포를 배양하는 기법을 의미한다. 부착성을 가진 세포를 배양하는 통상적인 방법은 세포를 페트리 접시와 같은 용기의 평면 상에서 배양함(2차원적 배양)을 특징으로 한다. 대조적으로, 3차원적 배양 방법에서 부착 신호가 세포에게 제공되지 않고 배양은 주로 세포-세포 접촉에 의존한다.
본원에서 사용된 바와 같이, "담체" 또는 "마이크로담체"는 현탁 세포 배양을 위한 부착 표면을 제공하도록 디자인된, 플라스틱, 세라믹 또는 다른 재료, 예컨대, 젤라틴 또는 하이드로겔로 만들어진 고체 구형 비드를 지칭한다. 다른 형태 또는 모양, 예컨대, 섬유성 구조를 가진 담체도 보고되어 있다.
용어 "구체" 또는 "회전타원체"는 3차원적 구형 또는 실질적으로 구형 세포 덩어리 또는 응집체를 의미한다. 일부 실시양태에서, 세포외 매트릭스는 세포가 살아있는 조직에서 움직이는 방식과 유사하게 세포가 그의 회전타원체 내부에서 움직일 수 있게 하는 데 사용될 수 있다. 사용되는 가장 흔한 유형의 ECM은 기저막 추출물 또는 콜라겐이다. 일부 실시양태에서, 매트릭스 또는 스카폴드 무함유 회전타원체 배양도 이용될 수 있고, 이때 세포는 배지에서 현탁된 상태로 성장한다. 이것은 연속적인 회전에 의해 달성될 수 있었거나 저부착 플레이트를 이용함으로써 달성될 수 있었다. 일부 실시양태에서, 구체는 단일 배양 또는 공배양 기법, 예컨대, 현적(hanging drop), 회전 배양, 강제 부유(forced-floating), 교반 또는 오목판 방법으로부터 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌[Breslin et al., Drug Discovery Today 2013, 18, 240-249]; 문헌[Pampaloni et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 839-845]; 문헌[Hsiao et al., Biotechnol. Bioeng. 2012, 109, 1293-1304]; 및 문헌[Castaneda et al., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 2000, 126, 305-310] 참조; 모두 참고로 포함됨). 일부 실시양태에서, 구체의 크기는 3D 배양 동안 성장할 수 있다.
용어 "배양 배지"는 "배지"와 교환 가능하게 사용되고 세포 증식을 허용하는 임의의 배지를 지칭한다. 적합한 배지는 유일하게 측정 가능한 세포 증식인 최대 증식을 촉진할 필요가 없다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 세포를 만능성 상태로 유지한다. 일부 실시양태에서, 배양 배지는 세포(예를 들면, 만능성 세포)가 예를 들면, 눈 초기 및 후기 순응된 망막 신경 전구세포(CRNP) 및 광수용체 전구체 세포(PRPC)로 분화하도록 촉진한다. 본원에서 사용된 몇몇 예시적 기초 배지는 DMEM/F-12(둘베코의 변형된 이글 배지/영양분 혼합물 F-12; 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific)으로부터 입수될 수 있음), bFGF 또는 TGFb를 함유하지 않은 성장 인자 무함유 NutriStem® 배지(PluritonTM ("PF")과 교환 가능하게 사용되는 GF 무함유 NutriStem®, 바이올로지칼 인더스트리스(Biological Industries)로부터 입수될 수 있음) 및 NeurobasalTM 배지(써모 피셔 사이언티픽으로부터 입수될 수 있음)를 포함한다. 이들 각각은 하기 물질들 중 하나 이상으로 보충될 수 있다: 적합한 완충제(예를 들면, HEPES(4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산)), 화학적으로 규정된 보충제, 예컨대, N2(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%) 및 B27(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%) 무혈청 보충제(써모 피셔 사이언티픽으로부터 입수될 수 있음), 항생제, 예컨대, 페니실린/스트렙토마이신(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%), MEM 비필수 아미노산(비필수 아미노산으로 보충될 때 MEM 비필수 아미노산 용액을 만드는, 배양된 세포의 성장에 필수적인 균형잡힌 염 용액, 아미노산 및 비타민으로 구성된 이글(Eagle)의 최소 필수 배지(MEM)), 글루코스(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 0.30%), L-글루타민(예를 들면, GlutaMAXTM), 인간 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산, 및/또는 DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-1-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르). 분화를 유도하는 인자, 예컨대, 본원에 개시된 소닉 헤지호그, 헤파린, IWR-1e, SB431542, LDN193189 및 IGF1도 배지에 첨가될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "분화된 세포"는 체세포 계통으로 분화하는 과정에 있거나 말기 분화된 임의의 세포를 지칭한다. 예를 들면, 배아 세포는 소장의 내층을 형성하는 상피 세포로 분화할 수 있다. 분화된 세포는 예를 들면, 태아 또는 살아있는 상태로 태어난 동물로부터 단리될 수 있다.
세포 개체발생의 문맥에서, 형용사 "분화된" 또는 "분화하는"은 "분화된 세포"가 그와 비교되는 세포보다 발생 경로에서 더 아래까지 진행한 세포임을 의미하는 상대적 용어이다. 따라서, 줄기 세포는 계통-제한된 전구체 세포(예컨대, 중배엽 줄기 세포)로 분화할 수 있고, 이 전구체 세포는 상기 경로에서 더 아래에 있는 다른 유형의 전구체 세포(예컨대, 광수용체 전구체)로 분화할 수 있고, 그 후 특정 조직 유형에서 특징적인 역할을 하고 더 증식하는 능력을 보유할 수 있거나 보유하지 않을 수 있는 말기 분화된 세포로 분화할 수 있다.
용어 "농후화" 또는 "농후화된"은 본원에서 교환 가능하게 사용되고, 한 유형의 세포의 수율(분율)이 출발 배양물 또는 제제 중의 그 유형의 세포의 분율에 비해 적어도 10% 증가됨을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "작용제"는 임의의 화합물 또는 물질, 예컨대, 소분자, 핵산, 폴리펩타이드, 펩타이드, 약물, 이온 등을 의미하나, 이들로 제한되지 않는다. "작용제"는 합성 단백질성 물질 및 비단백질성 물질, 및 천연 생성 단백질성 물질 및 비단백질성 물질을 포함하나 이들로 제한되지 않는 임의의 화학물질, 물질 또는 모이어티일 수 있다. 일부 실시양태에서, 작용제는 단백질, 올리고뉴클레오타이드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지단백질, 앱타머, 및 이들의 변형물 및 조합 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩타이드, 앱타머, 핵산의 올리고머, 아미노산 또는 탄수화물이다. 특정 실시양태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 가진 소분자이다. 예를 들면, 화학적 모이어티는 마크롤라이드, 렙토마이신 및 이의 관련 천연 생성물 또는 유사체를 포함하는 비치환된 또는 치환된 알킬, 방향족 또는 헤테로사이클릴 모이어티를 포함한다. 화합물은 원하는 활성 및/또는 성질을 가진 것으로 알려져 있을 수 있거나, 다양한 화합물들의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
용어 "소분자"는 다수의 탄소-탄소 결합들 및 1500 달톤 미만의 분자량을 가진 유기 화합물을 지칭한다. 전형적으로, 이러한 화합물은 단백질과의 구조적 상호작용, 예를 들면, 수소 결합을 매개하는 하나 이상의 작용기를 포함하고, 전형적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 하이드록실 또는 카르복실 기를 포함하고 일부 실시양태에서 적어도 2개의 화학적 작용기들을 포함한다. 소분자 작용제는 하나 이상의 화학적 작용기 및/또는 헤테로원자로 치환된 환형 탄소 또는 헤테로환형 구조 및/또는 방향족 또는 폴리방향족 구조를 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "마커"는 세포의 특성 및/또는 표현형을 기술하기 위해 사용된다. 마커는 관심 있는 특성을 포함하는 세포의 선택을 위해 사용될 수 있다. 마커는 구체적인 세포에 따라 달라질 것이다. 마커는 특정 세포 유형의 세포의 형태학적 특성이든, 아니면 기능적 특성이든, 아니면 생화학적(효소적) 특성이든 관계없이 특성, 또는 세포 유형에 의해 발현된 분자이다. 바람직하게는, 이러한 마커는 단백질이고, 보다 바람직하게는 당분야에서 사용될 수 있는 항체 또는 다른 결합 분자에 대한 에피토프를 가진다. 그러나, 마커는 단백질(펩타이드 및 폴리펩타이드), 지질, 폴리사카라이드, 핵산 및 스테로이드를 포함하나, 이들로 제한되지 않는, 세포에서 발견된 임의의 분자로 구성될 수 있다. 형태학적 특성 또는 형질의 예는 모양, 크기 및 핵 대 세포질 비를 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 기능적 특성 또는 형질의 예는 특정 기판에 부착하는 능력, 특정 염료를 혼입하거나 배제하는 능력, 특정 조건 하에서 이동하는 능력, 및 특정 계통을 따라 분화하는 능력을 포함하나, 이들로 제한되지 않는다. 마커는 당분야에서 숙련된 자에 의해 이용될 수 있는 임의의 방법에 의해 검출될 수 있다. 마커는 형태학적 특성의 부재 또는 단백질, 지질 등의 부재일 수도 있다. 마커는 특유의 특성의 패널인 폴리펩타이드의 존재 및 부재와 다른 형태학적 특성의 조합일 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 세포의 단리된 집단에 대하여 용어 "단리된 집단"은 혼합된 또는 불균질한 세포 집단으로부터 제거되고 분리된 세포 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 집단은 세포의 단리 또는 농후화에 사용된 불균질한 집단에 비해 실질적으로 순수한 세포 집단이다.
특정 세포 집단에 대하여 용어 "실질적으로 순수한"은 총 세포 집단을 구성하는 세포에 대하여 적어도 약 75%, 바람직하게는 적어도 약 85%, 보다 바람직하게는 적어도 약 90%, 가장 바람직하게는 적어도 약 95% 순수한 세포 집단을 지칭한다. 다시 말해, 최종 내배엽 세포의 집단에 대하여 용어 "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된"은 본원에서 상기 용어들에 의해 정의된 바와 같이 최종 내배엽 세포 또는 이의 자손이 아닌 세포를 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만, 또는 1% 미만으로 함유하는 세포 집단을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본 개시는 최종 내배엽 세포 집단을 증폭시키는 방법을 포괄하고, 이때 증폭된 최종 내배엽 세포 집단은 실질적으로 순수한 최종 내배엽 세포 집단이다. 유사하게, "실질적으로 순수한" 또는 "본질적으로 정제된" SCNT 유래 줄기 세포 또는 만능성 줄기 세포 집단은 약 20% 미만, 보다 바람직하게는 약 15%, 10%, 8%, 7% 미만, 가장 바람직하게는 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 미만을 함유하는 세포 집단을 지칭한다.
"망막"은 광수용체, 수평 세포, 양극성 세포, 아마크린(amacrine) 세포, 뮬러(Muller) 신경교세포 및 신경절 세포로 구성된 3개의 핵 층으로 적층된, 눈의 신경 세포를 지칭한다.
"전구세포"는 유사분열 상태로 남아있고 전구세포 또는 전구체 세포를 생성할 수 있거나 최종 운명 세포 계통으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다.
"전구체 세포"는 최종 운명 세포 계통으로 분화할 수 있는 세포를 지칭한다.
본 개시의 실시양태에서, "망막 신경 전구세포"는 세포 마커 PAX6 및 CHX10을 발현하는, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 세포를 지칭한다. 이것은 마커 PAX6, RAX1 및 CHX10을 발현할 수 있는 초기 및 후기 순응된 망막 뉴런 전구세포를 포함할 수 있다.
본 개시의 실시양태에서, "광수용체 전구체 세포"(PRPC)는 마커 CHX10을 발현하지 않으면서(즉, CHX10-) 마커 PAX6을 발현하는, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 세포를 지칭한다. 이 세포는 망막 신경 전구세포 단계에서 CHX10을 일시적으로 발현하나, CHX10 발현은 세포가 광수용체 전구세포 단계로 분화할 때 꺼진다. PRPC는 마커 CRX, NRL, NR2E3 및 ThRB2도 발현할 수 있다.
또한, "광수용체"는 세포 마커 로돕신(RHOD) 또는 3개의 원추세포 옵신들 중 임의의 원추세포 옵신(예를 들면, M-OPSIN)을 발현하고 임의적으로 간상세포 또는 원추세포 cGMP 포스포디에스터라제를 발현하는, 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포로부터 분화된 유사분열후 세포를 지칭할 수 있다. 광수용체는 광수용체에서 발견되는 마커 레코베린(REC)도 발현할 수 있다. 광수용체는 간상세포 및/또는 원추세포 광수용체일 수 있다.
"광수용체 유사 세포"는 대다수의 또는 모든 광수용체 특이적 마커들을 발현하는 세포이나, 그의 기능에 대해 시험되지 않았다.
용어 "치료" 또는 "치료하는"은 (i) 질환 또는 질병(병태)의 예방, 즉 질환 또는 질병의 임상 증상이 발생하지 않게 하는 것; (ii) 질환 또는 질병의 억제, 즉 임상 증상의 발생의 정지; 및/또는 (iii) 질환 또는 질병의 경감, 즉 임상 증상의 퇴행의 야기를 포함하는 목적으로 물질을 투여하는 것을 의미한다.
본 개시의 다양한 양태는 이하에 더 상세히 기재되어 있다. 추가 정의는 본 명세서 전체에 걸쳐 기재되어 있다.
만능성 줄기 세포
다양한 실시양태에서, PRPC 및 광수용체 세포는 인간 배아 줄기 세포(hESC), 인간 단성생식 줄기 세포(hpSC), 핵 전달 유래 줄기 세포 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 인간 만능성 줄기 세포(hPSC)로부터 생성될 수 있다. 이러한 hPSC를 수득하는 방법은 당분야에서 잘 알려져 있다.
만능성 줄기 세포는 (a) 면역결핍(SCID) 마우스에 이식될 때 기형종을 유도할 수 있고; (b) 모든 3개의 배엽들의 세포 유형으로 분화할 수 있고(예를 들면, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포 유형으로 분화할 수 있고); (c) 배아 줄기 세포의 하나 이상의 마커를 발현하는(예를 들면, OCT4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, NANOG, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, REX1 등을 발현하는) 줄기 세포로서 기능적으로 정의된다. 특정 실시양태에서, 만능성 줄기 세포는 OCT4, 알칼리성 포스파타제, SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60 및 TRA-1-81로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커를 발현한다. 예시적 만능성 줄기 세포는 예를 들면, 당분야에서 알려진 방법을 이용함으로써 생성될 수 있다. 예시적 만능성 줄기 세포는 배반포 단계 배아의 ICM으로부터 유도된 배아 줄기 세포뿐만 아니라, (임의적으로 배아의 나머지를 파괴하지 않으면서) 난할 단계 또는 상실배 단계 배아의 하나 이상의 난할구로부터 유도된 배아 줄기 세포도 포함한다. 이러한 배아 줄기 세포는 수정에 의해, 또는 체세포 핵 전달(SCNT), 단성생식 및 동정생식을 포함하는 무성 수단에 의해 생성된 배아 물질로부터 생성될 수 있다. 추가 예시적 만능성 줄기 세포는 인자들(본원에서 재프로그래밍 인자들로서 지칭됨)의 조합을 발현하여 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성된 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함한다. iPSC는 태아, 출생후, 신생아, 소아 또는 성체 체세포를 사용함으로써 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 체세포를 만능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는 데 사용될 수 있는 인자는 예를 들면, OCT4(종종 OCT3/4로서 지칭됨), SOX2, c-Myc 및 Klf4의 조합을 포함한다. 다른 실시양태에서, 체세포를 만능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는 데 사용될 수 있는 인자는 예를 들면, OCT4, SOX2, NANOG 및 LIN28의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 재프로그래밍 인자들이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 재프로그래밍 인자들이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 적어도 4개의 재프로그래밍 인자들이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포에서 발현된다. 다른 실시양태에서, 추가 재프로그래밍 인자들이 확인되고 체세포를 만능성 줄기 세포로 재프로그래밍하기 위해 단독으로 사용되거나 하나 이상의 알려진 재프로그래밍 인자와 병용된다. 유도 만능 줄기 세포는 기능적으로 정의되고 다양한 방법들(통합 벡터, 비-통합 벡터, 화학적 수단 등) 중 임의의 방법을 이용함으로써 재프로그래밍된 세포를 포함한다. 만능성 줄기 세포는 수명, 효능, 귀소를 증가시키기 위해, 동종면역 반응을 예방하거나 감소시키기 위해, 또는 원하는 인자를 이러한 만능성 세포로부터 분화된 세포(예를 들면, 광수용체, 광수용체 전구세포, 간상세포, 원추세포 등, 및 본원, 예를 들면, 실시예에 기재된 다른 세포 유형) 내로 전달하기 위해 유전적으로 변형될 수 있거나 다른 방식으로 변형될 수 있다.
유도 만능 줄기 세포(iPS 세포 또는 iPSC)는 체세포 내로의 재프로그래밍 인자의 단백질 형질도입에 의해 생성될 수 있다. 특정 실시양태에서, 적어도 2개의 재프로그래밍 단백질들이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포 내로 형질도입된다. 다른 실시양태에서, 적어도 3개의 재프로그래밍 단백질들이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포 내로 형질도입된다. 다른 실시양태에서, 적어도 4개의 재프로그래밍 단백질들이 체세포를 성공적으로 재프로그래밍하기 위해 체세포 내로 형질도입된다.
만능성 줄기 세포는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다. 배아 줄기 세포는 예를 들면, 마우스, 비인간 영장류의 다수의 종들 및 인간에서 성공적으로 유도되었고, 배아 줄기 유사 세포는 다수의 추가 종들로부터 생성되었다. 따라서, 당분야에서 숙련된 자는 인간, 비인간 영장류, 설치류(마우스, 래트), 유제류(소, 양 등), 개(사육 개 및 야생 개), 고양이과(사육 고양이과 및 야생 고양이과, 예컨대, 사자, 호랑이, 치타), 토끼, 햄스터, 게르빌루스쥐, 다람쥐, 기니 피그, 염소, 코끼리, 판다(자이언트 판다를 포함함), 돼지, 라쿤, 말, 얼룩말, 해양 포유류(돌고래, 고래 등) 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 배아 줄기 세포 및 배아 유래 줄기 세포를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종은 멸종위기 종이다. 특정 실시양태에서, 종은 현재 멸종된 종이다.
유사하게, iPS 세포는 임의의 종으로부터 유래할 수 있다. 이 iPS 세포는 마우스 및 인간 세포를 사용함으로써 성공적으로 생성되었다. 나아가, iPS 세포는 배아, 태아, 신생아 및 성체 조직을 사용함으로써 성공적으로 생성되었다. 따라서, 임의의 종으로부터의 기증자 세포를 사용하여 iPS 세포를 용이하게 생성할 수 있다. 따라서, 인간, 비인간 영장류, 설치류(마우스, 래트), 유제류(소, 양 등), 개(사육 개 및 야생 개), 고양이과(사육 고양이과 및 야생 고양이과, 예컨대, 사자, 호랑이, 치타), 토끼, 햄스터, 염소, 코끼리, 판다(자이언트 판다를 포함함), 돼지, 라쿤, 말, 얼룩말, 해양 포유류(돌고래, 고래 등) 등을 포함하나, 이들로 제한되지 않는 임의의 종으로부터 iPS 세포를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 종은 멸종위기 종이다. 특정 실시양태에서, 종은 현재 멸종된 종이다.
유도 만능 줄기 세포는 사실상 임의의 발생 단계의 임의의 체세포를 출발점으로서 사용함으로써 생성될 수 있다. 예를 들면, 세포는 배아, 태아, 신생아, 소아 또는 성체 기증자로부터 유래할 수 있다. 사용될 수 있는 예시적 체세포는 섬유모세포, 예컨대, 피부 샘플 또는 생검에 의해 수득된 피부 섬유모세포, 활막 조직으로부터의 활막세포, 포피 세포, 뺨 세포 또는 폐 섬유모세포를 포함한다. 피부 및 뺨이 용이하게 입수할 수 있고 용이하게 획득할 수 있는 적절한 세포 공급원을 제공하지만, 사실상 임의의 세포를 사용할 수 있다. 특정 실시양태에서, 체세포는 섬유모세포가 아니다.
유도 만능 줄기 세포는 체세포에서 하나 이상의 재프로그래밍 인자를 발현시키거나 이 인자의 발현을 유도함으로써 생성될 수 있다. 체세포는 섬유모세포, 예컨대, 피부 섬유모세포, 활막 섬유모세포 또는 폐 섬유모세포, 또는 비-섬유모세포성 체세포일 수 있다. 체세포는 (예컨대, 바이러스 형질도입, 통합 또는 비-통합 벡터 등을 통해) 적어도 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 재프로그래밍 인자의 발현을 야기함으로써, 그리고/또는 (예를 들면, 단백질 형질도입 도메인, 전기천공, 마이크로주사, 양이온성 양친매성 물질, 함유하는 지질 이중층과의 융합, 세제 투과가능화 등을 이용하여) 상기 재프로그래밍 인자와 접촉시킴으로써 재프로그래밍될 수 있다. 재프로그래밍 인자는 OCT3/4, SOX2, NANOG, LIN28, C-MYC 및 KLF4로부터 선택될 수 있다. 재프로그래밍 인자의 발현은 체세포를, 재프로그래밍 인자의 발현을 유도하는 적어도 하나의 작용제, 예컨대, 유기 소분자 작용제와 접촉시킴으로써 유도될 수 있다.
추가 예시적 만능성 줄기 세포는 인자들("재프로그래밍 인자들")의 조합을 발현시키거나 이 발현을 유도하여 체세포를 재프로그래밍함으로써 생성된 유도 만능 줄기 세포를 포함한다. iPS 세포는 세포 은행으로부터 수득될 수 있다. iPS 세포의 제조는 분화된 세포의 생성에 있어서 초기 단계일 수 있다. iPS 세포는 구체적으로 조직-일치된 PHRPS 또는 광수용체 세포를 생성할 목적으로 특정 환자 또는 일치된 기증자로부터의 물질을 사용함으로써 생성될 수 있다. iPSC는 대상으로 삼은 수용자에서 실질적으로 면역원성을 갖지 않는 세포로부터 생성될 수 있고, 예를 들면, 자가 세포 또는 대상으로 삼은 수용체에 대한 조직적합성을 가진 세포로부터 생성될 수 있다.
체세포는 조합 방식을 이용함으로써 재프로그래밍될 수도 있고, 이때 재프로그래밍 인자는 (예를 들면, 바이러스 벡터, 플라스미드 등을 사용함으로써) 발현되고, 재프로그래밍 인자의 발현은 (예를 들면, 유기 소분자를 사용함으로써) 유도된다. 예를 들면, 재프로그래밍 인자는 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 체세포에서 발현될 수 있다. 또한, 재프로그래밍 인자는 비-통합 벡터, 예컨대, 에피좀 플라스미드를 사용함으로써 체세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 전체적으로 본원에 참고로 포함된 문헌[Yu et al., Science. 2009 May 8; 324(5928):797-801]을 참조한다. 재프로그래밍 인자가 비-통합 벡터를 사용함으로써 발현될 때, 상기 인자는 상기 벡터를 사용한 체세포의 전기천공, 형질감염 또는 형질전환을 이용함으로써 상기 세포에서 발현될 수 있다. 예를 들면, 마우스 세포에서 통합 바이러스 벡터를 사용한 4개의 인자들(OCT3/4, SOX2, C-MYC 및 KLF4)의 발현은 체세포를 재프로그래밍하기에 충분하다. 인간 세포에서, 통합 바이러스 벡터를 사용한 4개의 인자들(OCT3/4, SOX2, NANOG 및 LIN28)의 발현은 체세포를 재프로그래밍하기에 충분하다.
일단 재프로그래밍 인자가 세포에서 발현되면, 상기 세포는 배양될 수 있다. ES 특성을 가진 세포가 시간에 따라 배양 접시에서 나타난다. 상기 세포는 예를 들면, ES 형태학에 근거하여, 또는 선택 또는 검출 마커의 발현에 근거하여 선택되고 서브배양될 수 있다. 상기 세포는 ES 세포와 유사한 세포(이들은 잠정적 iPS 세포임)의 배양물을 생성하도록 배양될 수 있다.
iPS 세포의 만능성을 확인하기 위해, 세포를 하나 이상의 만능성 어세이에서 시험할 수 있다. 예를 들면, 세포를 ES 세포 마커의 발현에 대해 시험할 수 있고; SCID 마우스에 이식될 때 기형종을 형성하는 능력에 대해 세포를 평가할 수 있고; 모든 3개의 배엽들의 세포 유형을 생성하도록 분화하는 능력에 대해 세포를 평가할 수 있다. 일단 만능성 iPSC가 수득되면, 이를 사용하여 본원에 개시된 세포 유형, 예를 들면, 광수용체 전구세포, 광수용체 세포, 간상세포, 원추세포 등 및 본원에 기재된 다른 세포 유형을 생성할 수 있다.
hPSC를 수득하는 또 다른 방법은 단성생식이다. "단성생식"("처녀생식적으로 활성화된" 및 "단성생식적으로 활성화된"은 본원에서 교환 가능하게 사용됨)은 난모세포의 활성화가 정자 침투의 부재 하에서 일어나는 과정을 지칭하고, 모든 암컷 유래의 DNA를 포함하는 난모세포 또는 배아 세포, 예를 들면, 난할구의 활성화에 의해 수득된, 영양외배엽 및 내부 세포 덩어리를 포함하는 초기 단계 배아의 발생을 지칭한다. 관련 양태에서, "반수성개체"는 이러한 활성화에 의해 수득된 세포를 지칭한다. 또 다른 관련 양태에서, "배반포"는 외부 세포영양막 세포 및 내부 세포 덩어리(ICM)로 만들어진 세포의 중공형 공을 포함하는 활성화된 난모세포의 수정란의 난할 단계를 의미한다. 추가 관련 양태에서, "배반포 형성"은 난모세포 수정 또는 활성화 후 난모세포가 외부 세포영양막 세포 및 ICM으로 만들어진 세포의 중공형 공으로 발생할 수 있게 하는 시간(예를 들면, 5일 내지 6일) 동안 난모세포를 배지에서 후속 배양하는 과정을 지칭한다.
hPSC를 수득하는 또 다른 방법은 핵 전달이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "핵 전달"은 기증자 세포 또는 기증자 세포로부터의 DNA를, 적합한 수용자 세포, 전형적으로 이식 또는 융합 전에, 이식 또는 융합과 동시에, 또는 이식 또는 융합 후에 그의 내생성 핵 DNA를 제거하거나 불활성화시키도록 처리된 동일한 또는 상이한 종의 난모세포에 융합시키거나 이식하는 것을 의미한다. 핵 전달에 사용된 기증자 세포는 배아 세포 및 분화된 세포, 예를 들면, 체세포 또는 배세포를 포함한다. 기증자 세포는 증식 세포 주기(Gl, G2, S 또는 M) 또는 비-증식 주기(GO 또는 휴면기)에 있을 수 있다. 바람직하게는, 기증자 세포 또는 기증자 세포로부터의 DNA는 증식 포유류 세포 배양물, 예를 들면, 섬유모세포 세포 배양물로부터 유래한다. 기증자 세포는 임의적으로 형질전환 세포일 수 있다. 즉 기증자 세포는 하나 이상의 유전적 추가, 치환 또는 결실 변형을 포함할 수 있다.
hPSC를 수득하는 추가 방법은 유도 만능 줄기 세포를 수득하기 위한 세포의 재프로그래밍이다. 문헌[Takahashi et al. (Cell 131, 861-872 (2007))]은 임의의 배아 또는 ES(배아 줄기) 세포를 사용하지 않고 분화된 세포를 재프로그래밍하는 방법, 및 ES 세포의 만능성 및 성장 능력과 유사한 만능성 및 성장 능력을 가진 유도성 만능 줄기 세포를 확립하는 방법을 개시한다. 분화된 섬유모세포를 위한 핵 재프로그래밍 인자는 하기 4개의 유전자들의 생성물을 포함한다: Oct 패밀리 유전자; Sox 패밀리 유전자; Klf 패밀리 유전자; 및 Myc 패밀리 유전자.
세포의 만능성 상태는 바람직하게는 적절한 조건 하에서 세포를 배양함으로써, 예를 들면, 섬유모세포 피더(feeder) 층 또는 또 다른 피더 층, 또는 백혈병 억제 인자(LIF)를 포함하는 배양물에서 배양함으로써 유지된다. 이러한 배양된 세포의 만능성 상태는 다양한 방법들, 예를 들면, (i) 만능성 세포의 특징적인 마커의 발현의 확인; (ii) 만능성 세포의 유전형을 발현하는 세포를 함유하는 키메라 동물의 생성; (iii) 생체 내에서 상이한 분화된 세포 유형을 생성하는 동물, 예를 들면, SCID 마우스 내로의 세포의 주사; 및 (iv) (예를 들면, 피더 층 또는 LIF의 부재 하에서 배양될 때) 시험관 내에서 배상체 및 다른 분화된 세포 유형으로의 세포의 분화의 관찰에 의해 확인될 수 있다.
본 개시에서 사용된 세포의 만능성 상태는 다양한 방법들에 의해 확인될 수 있다. 예를 들면, 세포를 특징적인 ES 세포 마커의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있다. 인간 ES 세포의 경우, 이러한 마커의 예는 앞서 확인되어 있고, SSEA-4, SSEA-3, TRA-1-60, TRA-1-81 및 OCT4를 포함하고, 당분야에서 알려져 있다.
또한, 만능성은 세포를 적합한 동물, 예를 들면, SCID 마우스 내로 주사하고 분화된 세포 및 조직의 생성을 관찰함으로써 확인될 수 있다. 만능성을 확인하는 또 다른 방법은 키메라 동물을 생성하기 위해 본 만능성 세포를 사용하는 것 및 상이한 세포 유형에의 도입된 세포의 기여를 관찰하는 것이다.
만능성을 확인하는 또 다른 방법은 분화에 유리한 조건(예를 들면, 섬유모세포 피더 층의 제거) 하에서 배양될 때 배상체 및 다른 분화된 세포 유형으로의 ES 세포 분화를 관찰하는 것이다. 이 방법은 이용되고 있고 본 만능성 세포는 조직 배양물에서 배상체 및 상이한 분화된 세포 유형들을 생성한다는 것이 확인되었다.
hPSC는 신경 줄기 세포가 유도되기를 원할 때까지 관용적인 계대배양에 의해 만능성 상태로 배양물에서 유지될 수 있다.
광수용체를 생성하기 위한 3D 매트릭스 및 담체 무함유 구체 배양
hPSC를 세포 요법에 실제로 적용하기 위해, 대규모 3D 배양 시스템에 대한 추가 개량이 필요하다. 다양한 3D 구체 배양 절차들이 이용될 수 있고, 예컨대, 세포 배양 표면을 변형시킴으로써 세포가 그의 표면에 부착되지 못하게 하여 3D 배양물 형성을 촉진하는 강제 부유 방법; 현탁액에서의 세포 성장을 뒷받침하는 현적 방법; 및 세포가 서로 부착하여 3D 회전타원체를 형성하도록 촉진하는 교반/회전 시스템을 포함할 수 있다.
3D 회전타원체를 생성하는 한 방법은 표면을 변형시켜 용기 표면에 부착하지 못하게 함으로써, 세포의 강제 부유를 야기하는 것이다. 이것은 다세포 구체 형성을 촉진하는 세포-세포 접촉을 촉진한다. 예시적 표면 변형은 폴리-2-하이드록시에틸 메타크릴레이트(폴리-HEMA) 및 아가로스를 포함한다.
3D 회전타원체 생성의 현적 방법은 트레이의 웰 내로 피펫팅되는 단일 세포 현탁액의 작은 분취액(전형적으로 20 ㎖)을 사용한다. 강제 부유와 유사하게, 시딩 현탁액의 세포 밀도(예를 들면, 특히 50개, 100개 또는 500개 세포/웰)는 회전타원체의 요구된 크기에 따라 적절히 변경될 수 있다. 세포 시딩 후, 트레이를 후속적으로 뒤집고, 세포 현탁액의 분취액은 표면 장력으로 인해 제자리에 유지되는 현적으로 바뀐다. 세포는 액체-공기 계면에서 현적의 끝(tip)에 축적되고, 증식될 수 있게 된다.
3D 회전타원체를 생성하는 교반 기반 방법은 (i) 스피너 플라스크 생물반응기 및 (ii) 회전 배양 시스템으로서 대략 두 범주로 분류될 수 있다. 이 방법들을 뒷받침하는 일반적인 원리는 세포 현탁액을 용기에 넣고 현택액을 움직이는 상태로 유지하는 것, 즉 상기 현탁액을 약하게 교반하거나 용기를 회전시키는 것이다. 현탁된 세포의 연속적인 움직임은 세포가 용기 벽에 부착되지 않는 대신에 세포-세포 상호작용을 형성함을 의미한다. 스피너 플라스크 생물반응기(전형적으로 "스피너"로서 알려짐)는 세포 현탁액을 보유하기 위한 용기 및 세포 현탁액이 연속적으로 혼합되도록 보장하기 위한 교반 요소를 포함한다. 회전 세포 배양 생물반응기는 스피너 플라스크 생물반응기와 유사한 수단에 의해 작동하나, 세포 현탁액 움직임을 유지하기 위해 교반 바/막대를 이용하는 대신에 배양 용기 그 자체가 회전된다.
일부 실시양태에서, 본원은 스피너 플라스크 기반 3D 구체 배양 프로토콜을 제공한다. 복수의 hPSC들은 피더 세포 및 매트릭스의 부재 하에서 규정된 배양 배지를 가진 스피너 플라스크 내에서 실질적으로 균일한 구체로서 연속적으로 배양될 수 있다. 배양 배지는 hPSC, 예컨대, hiPSC 및 hES의 성장 및 증폭을 뒷받침하도록 디자인된 임의의 규정된 제노(xeno) 무함유 및 혈청 무함유 세포 배양 배지일 수 있다. 일례에서, 배지는 NutriStem® 배지이다. 일부 실시양태에서, 배지는 mTeSR1, mTeSR2 또는 E8 배지, 또는 다른 줄기 세포 배지일 수 있다. 배지는 Rho 관련 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 소분자 억제제, 예컨대, Y27632 또는 다른 ROCK 억제제, 예컨대, 티아조비빈(Thiazovivin), ROCK II 억제제(예를 들면, SR3677) 및 GSK429286A로 보충될 수 있다. 이 현탁 배양 시스템을 이용하여 hPSC 배양물을 연속적으로 계대배양할 수 있고 적어도 10회 계대배양 동안 일관되게 증폭시킬 수 있다. 3D hiPSC 구체를 위한 전형적인 계대배양 간격은 약 3일 내지 6일일 수 있고, 이때 구체는 직경 약 230 내지 260 pm의 크기로 성장할 수 있다. 구체 크기는 배양물의 분취액을 채취하고, 예를 들면, 현미경관찰을 이용하여 관찰함으로써 모니터링될 수 있다. 그 다음, 예를 들면, 일차 및 줄기 세포주 및 조직을 탈착시키기 위해 단백질용해 및 콜라겐용해 활성을 가진 효소를 사용하여 구체를 단일(또는 실질적으로 단일) 세포로 해리시킬 수 있다. 일례에서, 상기 효소는 아큐타제(Accutase)®, 또는 TrypLE, 또는 트립신/EDTA이다. 그 후, 해리된 세포는 예를 들면, 60 내지 70 RPM에서 연속적인 교반 하에서 스피너 플라스크 내에서 재응집되어 구체를 재형성할 수 있다. 구체는 적어도 3회 내지 5회 반복된 계대배양 후 높은 만능성 마커 발현(OCT4) 및 정상적인 핵형과 함께 균일한 구조를 유지하면서 크기가 점진적으로 증가된다. 본원에서 사용된 바와 같이, "계대배양"은 단일 세포로부터 원하는 크기의 구체까지 성장된 세포 구체 배양물을 의미하는 것으로 이해되고, 이때 상기 구체는 단일 세포로 해리되고 다음 계대배양을 위해 다시 시딩된다. 계대배양은 3D hiPSC 구체의 경우 약 3일 내지 6일, 또는 hPSC의 유형 및 배양 조건에 따라 더 길거나 더 짧은 기간이 소요될 수 있다. 일단 충분한 양의 3D hPSC 구체가 수득되면, 이하에 더 상세히 기재된 바와 같이, 상기 구체를 3D 구체 망막 뉴런으로 분화시킬 수 있다.
hPSC로부터 상이한 발생 단계에 있는 망막 뉴런 전구세포를 생성하기 위해, 주로 소분자를 사용하여 현탁액 중의 3D hPSC 구체를 단계적 방식으로 직접 유도할 수 있다(도 2). 일부 실시양태에서, 이것은 3D 스피너 플라스크 또는 다른 3D 구체 배양 방법에서 수행될 수 있다. 다양한 실시양태에서, 연속적인 3D 구체 배양은 여러 해리/재응집 단계들과 통합될 수 있는 반면, 소분자는 망막 뉴런 분화를 유도하기 위해 상이한 발생 단계들에서 첨가될 수 있다. 종래 보고된 바와 같이 망막 계통을 향한 hPSC 분화의 유도를 위해 단백질 인자를 사용하는 대신에, 가능한 경우 소분자를 사용하고, 이의 질을 용이하게 제어하여, hPSC 구체를 망막 세포의 상이한 발생 단계들로 순차적으로 분화시킬 수 있다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 먼저 스피너 플라스크에서 ROCK 억제제(예를 들면, Y27632, "Y")로 보충된 규정된 배지(예를 들면, NutriStem®("NS") 배지) 중의 단일 세포(예를 들면, 1x106개 세포/웰)로서 hPSC(예를 들면, hiPSC)를 시딩하여 구체를 형성할 수 있다. 유도 0일째 날로서 표기된 24시간 후, hiPSC 구체를 먼저 이중 SMAD 억제제 SB431542("SB") 및 LDN193189("LDN")로 처리하여, 액티빈(activin)/형질전이 성장 인자 β(TGF-β) 및 골 형태형성 단백질(BMP)의 신호 전달도입을 차단하고 신경 패턴화를 용이하게 할 수 있고, 이어서 Wnt 억제제 IWR-1e, IGF1(시야 세포 발생의 유도제) 및 헤파린을 첨가하여 망막 신경 계통 순응을 더 유도할 수 있다.
PRPC 분화를 위해, 상기 언급된 유도 인자를 가진 PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® 및 NIM-3D의 연속 희석을 통해 NIM-3D 배지에의 점진적인 적응을 달성할 수 있다. 예를 들면, 100% PluritonTM/GF 무함유 NutriStem®부터 100% NIM-3D까지 점진적인 적응은 세포가 각각의 배지 조성물에서 2일 내지 6일 동안 머무르게 하면서, 75%:25%, 50%:50% 및 25%:75%에서 PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® 및 NIM-3D로 순차적으로 중간 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 다른 연속 희석도 이용될 수 있다. NIM-3D(신경 유도 배지-3D)("NIM"과 교환 가능하게 사용됨) 기초 배지는 HEPES, N2(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%) 및 B27(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%) 무혈청 보충제, 페니실린/스트렙토마이신(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%), MEM 비필수 아미노산 및 글루코스(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 0.30%)를 가진 DMEM/F12를 함유한다. 헤파린은 신경 순응 동안 사용중단될 수 있고 IWR-1e는 NIM-3D 배지에 완전히 적응시켰을 때 사용중단될 수 있다.
그 후, 구체는 NIM-3D/PRPC-3D 배지를 함유하는 50/50 적응을 통해 PRPC-3D 광수용체 분화 배지에 적응될 수 있다. PRPC-3D 배지(예를 들면, 도 11에서 "PRPM"으로서도 지칭됨)는 NeurobasalTM 배지, N2(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%) 및 B27(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%) 무혈청 보충제, 페니실린/스트렙토마이신(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 1%), MEM 비필수 아미노산 및 글루코스(0.1% 내지 10%, 예를 들면, 0.30%)를 함유한다. SB431542, LDN193189 및 IGF1은 NIM-3D/PRPC-3D 배지에 적응시키기 시작할 때 사용중단될 수 있다.
또 다른 예시적 분화 프로토콜은 도 11에 예시되어 있다. 도 2에 나타낸 프로토콜과의 핵심 차이는 헤파린 대신에 소닉 헤지호그(SHH)를 사용한다는 것이다. 놀랍게도, SHH는 뉴런 유도 및 망막 전구세포 증식을 달성하는 데 있어서뿐만 아니라 PAX6 양성 세포의 신경발생을 유지하는 데 있어서도 다른 미토겐-활성화된 단백질, 예컨대, 헤파린의 보다 효과적인 대체물이다.
분화 동안, 상이한 시점에서 세포 해리 효소, 예컨대, TrypLE(써모 피셔 사이언티픽), 아큐타제 또는 트립신/EDTA를 사용하여 구체를 단일 세포로 해리시킬 수 있다. 구체의 중심에서 저산소성 세포를 생성하는 것을 피하기 위해 구체 직경이 전형적으로 또는 평균 약 300 내지 500 pm 또는 약 350 내지 450 pm에 도달할 때, 2주 내지 5주마다 구체를 단일 세포로 연속적으로 해리시키고 스피너 플라스크 내로 재응집시킴으로써 PRPC를 생성할 수 있다. 직경이 약 450 또는 500 pm를 초과하는 구체 크기는 바람직하지 않을 수 있는데, 이것은 산소, 영양분 및 분화 유도 인자/분자가 구체의 중심 코어 내로 침투하지 못하게 함으로써, 상기 코어에서 세포 사멸을 유발하는 괴사 및 다른 유해한 원인을 초래할 수 있기 때문임을 인지해야 한다. 따라서, 일단 구체가 약 300 내지 400 pm 또는 약 350 내지 450 pm의 평균 직경 크기까지 성장하면, 당분야에서 알려진 세포 해리를 위한 다양한 효소들을 사용하여 구체를 단일(또는 실질적으로 단일) 세포로 해리시킬 수 있다.
이론에 의해 구속받고자 하지는 않지만, 구체가 너무 크게(예를 들면, 500 pm 초과 또는 400 pm 초과의 직경) 성장하면, 구체의 중심에 가까운 세포는 영양실조에 걸릴 수 있다고 생각된다. 따라서, 일부 실시양태에서 구체 크기를 제어하는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 구체의 직경이 약 300 내지 500 pm, 약 350 내지 450 pm, 또는 약 230 내지 260 pm에 도달할 때 구체를 해리시킬 수 있다.
일단 해리되면, 필터(예를 들면, 약 10 내지 200 pm, 또는 약 20 내지 100 pm, 또는 약 40 pm의 메쉬 크기)를 통해 단일 세포 현탁액을 여과할 수 있다. 이어서, 단일 세포를 적절한 배양 배지에서 스피너 플라스크 내로 시딩할 수 있다. 생성된 구체의 형태학(크기, 외관, 및 구체 내로 혼입하는 능력)을 각각의 재응집 후 2일 내지 3일 동안, 및 그 후 다음 해리/재응집 단계까지 매주 모니터링할 수 있다. 모니터링은 배양물의 분취액을 채취하고, 예를 들면, 현미경관찰을 이용하여 관찰함으로써 수행될 수 있다.
따라서, 본원은 초기 및 후기 순응된 망막 뉴런 전구세포(CRNP), 광수용체 전구체 세포(PRPC) 및 광수용체 유사 세포를 포함하는, 망막 뉴런의 상이한 발생 단계들을 향한 단계적 hPSC 구체 분화 과정을 개시한다. 3D 구체 플랫폼은 종래 보고된 분화 프로토콜에 비해 하기 장점을 가진다:
1) 소분자를 사용하되, 비규정된 매트릭스를 사용하지 않은 규정된 배양 배지. 본원에 개시된 3D 구체 배양 시스템에서, hPSC 유지 및 증폭부터 3D 구체 망막 분화까지 혈청 및 비규정된 매트릭스 또는 담체를 배양 배지에 첨가하지 않는다. 더욱이, 단백질 인자를 대체하기 위해 소분자를 사용하기 때문에, 질 및 일관성이 용이하게 제어될 수 있음으로써, 3D 구체 시스템을 종래 보고된 시스템보다 더 일관성있게 반복될 수 있도록 만들 수 있다.
2) 세포 과정 및 제조를 위한 강력한 플랫폼. 3D hPSC 구체 증폭 배양으로부터 3D 구체 분화 과정으로의 전환은 간단하고, 표면에의 세포 부착 또는 매트릭스 매립과 같은 세포 조작은 필요하지 않고, 전환을 원활하게 만드는 배양 배지 교체만이 요구되고; 추가로, 상기 과정 동안 상이한 발생 단계의 망막 뉴런들이 생성되었고, 이 세포들은 나중에 추가 분화를 위해 냉동보존될 수 있으므로, 질 제어 과정이 더 용이해질 수 있다.
3) 동시화된 망막 뉴런 분화를 유발하는 3D 구체의 균일성 및 무결성. 교반/교란 속도 및 초기 세포 밀도를 제어함으로써, hPSC 증폭 및 유도된 분화 과정에서 3D 구체의 직경 및 무결성을 긴 시간, 전형적으로 3개월 내지 4개월 동안 잘 제어할 수 있다. 이것은 산소, 영양분 및 분화 유도 인자/분자가 구체의 중심 코어 내로 침투하게 하여, 제어되지 않은 배상체 및 오르가노이드 시스템에서 흔한, 세포 사멸을 유발하는 괴사 및 다른 유해한 원인을 피할 수 있게 한다. 3D 구체의 균일성 및 무결성의 유지는 순수 망막 뉴런 집단의 생성과 함께 동시화된 분화 과정을 야기한다.
4) 원하는 세포의 다량 생성을 위한 확장 가능한 과정. 실시예는 개념 증명 연구를 위해 30 내지 50 ㎖ 생물반응기를 이용하였지만, 이것은 다수의 생물반응기들 및 큰 부피의 생물반응기까지 용이하게 확장될 수 있다. 각각 30 내지 50 ㎖의 생물반응기는 통상적으로 20개 내지 25개의 T-75 조직 배양 플라스크의 용량에 해당하는 약 3x108개의 망막 뉴런 세포를 생성하는데, 이것은 세포 생성에 있어서 이 시스템을 비용 효과적이고 용이하게 관리될 수 있는 과정으로 만든다.
5) 보다 균질한 세포 집단의 생성. 유도된 분화 과정 동안, 이 세포들을 분할할 때 구체 재형성을 위해 해리/재응집 단계가 통합되는데, 이것은 비-뉴런 세포를 제거하고 뉴런 세포를 농후화하기 위한 정제 단계로서 기여한다. 이 단계들은 초기 및 후기 CRNP, PRPC 및 광수용체 유사 세포를 포함하는, 상이한 단계들에 있는 상이한 발생 단계 망막 세포들을 미분화된 만능성 줄기 세포의 오염 없이 고순도(약 95%)로 생성한다.
6) 다른 뉴런 유형의 생성을 위해 확장될 수 있는 적응 가능한 시스템. 이 3D 구체 분화 과정이 다단계 절차이고 각각의 단계가 분화 유도 조건을 변형시킴으로써 특유의 뉴런 프로세서를 생성하기 때문에, 이 과정은 다른 망막 뉴런 세포, 예컨대, 망막 신경절 세포 및 전구세포, 양극성 세포, 뮬러 세포, 수평 세포 및 아마크린 세포, 및 다른 일반적인 뉴런 세포를 포함하나, 이들로 제한되지 않는 다른 뉴런 세포 유형을 생성하도록 용이하게 확장될 수 있다.
다양한 실시양태에서, 본원은 실명 환자에서 광수용체 대체 요법을 위해 사용될 수 있는 hPSC, 구체적으로 PRPC 및 광수용체 유사 세포로부터 원하는 세포를 생성하는 신규 효율적인 규정된 3D 구체 플랫폼을 제공한다. 이 시스템은 대규모 생산 노력에 적합할 뿐만 아니라, 동물 혈청 및 매트릭스에 대한 의존성도 제거하고, 단백질 인자 대신에 소분자를 보충함으로써, 이를 cGMP 준수 세포 제조 프로토콜에 친화적이게 만들고 과정을 임상 해석에 더 적합하게 만든다.
광수용체 대체 요법
망막 질환은 종종 유사분열후 뉴런 세포의 손실로 인해 실명을 초래한다. 망막 질환들 중에는 간상세포 또는 원추세포 이영양증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성, 레버 선천성 흑암시 및 스타가르트병이 있다. 대다수의 망막 변성들에서, 세포 손실은 주로 간상세포 및 원추세포 광수용체를 포함하는 외부 핵 층에서 일어난다. 유사분열후 뉴런 세포 집단이 손실되면서, 광수용체 세포에 대한 대체물로서 신규 세포의 외생성 공급원이 필요하다.
망막 변성은 궁극적으로 실명을 유발하는 비가역적 과정이다. 망막 내의 간상세포 및 원추세포 광수용체는 주요 감광 세포이나, 이 세포들은 재생 능력을 결여한다. 현재, 손실된 광수용체를 재생시키는 치료는 없고, 세포 대체는 광수용체 손실을 가진 환자를 치료하기 위한 유일한 치료 전략이다. 맥라렌과 그의 동료들(MacLaren et al.)[46]은 완전히 실명한 마우스 내로의 마우스 유사분열후 광수용체 전구체 세포의 이식이 일부 시각 기능을 회복시켰음을 입증한 첫 번째 연구진이었다. 이 이식된 세포는 이 동물에서 ONL 층 내로 통합되었고 간상세포 광수용체로 분화하였고 시냅스 연결을 형성하였고 시각 기능을 개선하였다. 최근에, 마우스 PSC 및 인간 PSC 둘 다로부터 유도된 유사분열후 광수용체 전구체 세포의 이식 후 변경된 범위의 망막 기능상실을 가진 동물 모델에서 시각 기능의 개선을 보고한 여러 연구진들이 있다[9, 42, 43]. 이 결과들은 적절한 세포가 적합한 미세환경을 가진 올바른 위치 내로 이식될 때 광수용체 변성 환자를 위한 세포 대체 요법이 작동할 수 있다는 개념 증명 동물 연구를 제공한다. AMD 및 스타가르트병을 가진 환자를 위해 시력 손실을 예방하기 위해 hESC 및 hiPSC 유래 망막 색소 상피(RPE)를 사용하는 여러 임상시험들이 현재 진행되고 있으나[3 내지 5], 손실된 광수용체의 대체를 위한 세포 이식은 아직 시작되지 않았으므로, 세포 대체 요법을 위해 재생 가능한 공급원으로부터의 적절한 발생 단계의 인간 광수용체 전구체 세포는 절실히 필요하다. 분명하게는, 인간 기증자로부터의 유사분열후 인간 광수용체 전구체는 세포 대체를 위한 적합한 공급원을 대표하지 않고, 망막 신경, 특히 유사분열후 광수용체 전구세포를 생성하기 위한 인간 PSC의 분화가 상기 목적에 적합할 것이다.
따라서, 본원에 개시된 PRPC 또는 광수용체 세포는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 제제화될 수 있고 광수용체 대체 요법에 사용될 수 있다. 예를 들면, PRPC 또는 광수용체 세포는 단독으로, 또는 약학 제제의 한 성분으로서 투여될 수 있다. 본 화합물은 의약에 사용하기 위해 임의의 편리한 방식으로 투여되도록 제제화될 수 있다. 투여에 적합한 약학 제제는 항산화제, 완충제, 정균제, 용질, 현탁제 또는 증점제를 함유할 수 있는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액(예를 들면, 균형잡힌 염 용액(BSS)), 분산액, 현탁액 또는 유화액, 또는 사용 직전에 멸균 주사 가능한 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 함께 PRPC 또는 광수용체 세포를 포함할 수 있다. 예시적 약학 제제는 ALCON® BSS PLUS®(물 중에 ㎖당 염화나트륨 7.14 mg, 염화칼륨 0.38 mg, 염화칼슘 이수화물 0.154 mg, 염화마그네슘 육수화물 0.2 mg, 이염기성 인산나트륨 0.42 mg, 중탄산나트륨 2.1 mg, 덱스트로스 0.92 mg, 글루타티온 디설파이드(산화된 글루타티온) 0.184 mg, 염산 및/또는 수산화나트륨(pH를 대략 7.4까지 조절하기 위함)을 함유하는 균형잡힌 염 용액)와 함께 PRPC 또는 광수용체 세포를 포함한다.
투여될 때, 본 개시에서 사용되는 약학 제제는 발열원 무함유 생리학적으로 허용 가능한 형태로 존재할 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 사용된 PRPC 또는 광수용체 세포를 포함하는 제제는 현탁액, 겔, 콜로이드, 슬러리 또는 혼합물로 이식될 수 있다. 또한, 상기 제제는 바람직하게는 캡슐화될 수 있거나, 망막 또는 맥락막 손상 부위로 전달되도록 유리체액 내로 점성 형태로 주사될 수 있다. 또한, 주사 시, 망막하 주사에 의한 투여를 위해 요구된 오스몰농도 및 농도를 달성하기 위해 시판되는 균형잡힌 염 용액으로 냉동보존된 PRPC 또는 광수용체 세포를 재현탁할 수 있다. 상기 제제를 질환에 의해 완전히 손실되지 않은 중심주위 황반의 영역에 투여하여, 투여된 세포의 부착 및/또는 생존을 촉진할 수 있다.
본 개시의 PRPC 또는 광수용체 세포는 안내 주사에 의해 약학적으로 허용 가능한 안과 제제로 전달될 수 있다. 유리체내 주사로 제제를 투여할 때, 예를 들면, 최소화된 부피가 전달될 수 있도록 용액을 농축할 수 있다. 주사를 위한 농도는 본원에 기재된 인자에 따라, 효과적이고 독성을 나타내지 않는 임의의 양일 수 있다. 환자의 치료를 위한 PRPC 또는 광수용체 세포의 약학 제제는 적어도 약 104개 세포/㎖의 용량으로 제제화될 수 있다. 환자의 치료를 위한 PRPC 또는 광수용체 세포 제제는 적어도 약 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개 또는 1010개의 PRPC 또는 광수용체 세포/㎖의 용량으로 제제화된다. 예를 들면, PRPC 또는 광수용체 세포는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제로 제제화될 수 있다.
본원에 기재된 PRPC 또는 광수용체 세포의 약학 제제는 적어도 약 1,000개, 2,000개, 3,000개, 4,000개, 5,000개, 6,000개, 7,000개, 8,000개 또는 9,000개의 PRPC 또는 광수용체 세포를 포함할 수 있다. PRPC 또는 광수용체 세포의 약학 제제는 적어도 약 1x104개, 2x104개, 3x104개, 4x104개, 5x104개, 6x104개, 7x104개, 8x104개, 9x104개, 1x105개, 2x105개, 3x105개, 4x105개, 5x105개, 6x105개, 7x105개, 8x105개, 9x105개, 1x106개, 2x106개, 3x106개, 4x106개, 5x106개, 6x106개, 7x106개, 8x106개, 9x106개, 1x107개, 2x107개, 3x107개, 4x107개, 5x107개, 6x107개, 7x107개, 8x107개, 9x107개, 1x108개, 2x108개, 3x108개, 4x108개, 5x108개, 6x108개, 7x108개, 8x108개, 9x108개, 1x109개, 2x109개, 3x109개, 4x109개, 5x109개, 6x109개, 7x109개, 8x109개, 9x109개, 1x1010개, 2x1010개, 3x1010개, 4x1010개, 5x1010개, 6x1010개, 7x1010개, 8x1010개 또는 9x1010개의 PRPC 또는 광수용체 세포, 또는 더 많거나 더 적은 PRPC 또는 광수용체 세포를 포함할 수 있다. PRPC 또는 광수용체 세포의 약학 제제는 적어도 약 1x102개 내지 1x103개, 1x102개 내지 1x104개, 1x104개 내지 1x105개, 또는 1x103개 내지 1x106개의 PRPC 또는 광수용체 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, PRPC 또는 광수용체 세포의 약학 제제는 적어도 약 50 내지 200 ㎕의 부피에 적어도 약 20,000개 내지 200,000개의 PRPC 또는 광수용체 세포를 포함할 수 있다.
상기 약학 제제 및 조성물에서, PRPC 또는 광수용체 세포의 수, 또는 PRPC 또는 광수용체 세포의 농도는 살아있는 세포를 카운팅하고 살아있지 않은 세포를 배제함으로써 측정될 수 있다. 예를 들면, 살아있지 않은 PRPC 또는 광수용체는 바이탈 염료(vital dye)(예컨대, 트립판 블루)의 배제 실패에 의해 검출될 수 있거나, 기능 어세이(예컨대, 배양 기판에 부착하는 능력, 식세포작용 등)를 이용함으로써 검출될 수 있다. 추가로, PRPC 또는 광수용체 세포의 수, 또는 PRPC 또는 광수용체 세포의 농도는 하나 이상의 PRPC 또는 광수용체 세포 마커를 발현하는 세포를 카운팅하고/하거나 PRPC 또는 광수용체 이외의 세포 유형을 표시하는 하나 이상의 마커를 발현하는 세포를 배제함으로써 측정될 수 있다.
PRPC 또는 광수용체 세포는 제제가 세포로 하여금 눈의 영향받은 영역, 예를 들면, 전방, 후방, 유리체, 안방수, 유리체액, 각막, 홍체/모양체, 수정체, 맥락막, 망막, 공막, 맥락막위 공간, 결막, 결막하 공간, 공막외 공간, 각막내 공간, 각막외 공간, 평면부(pars plana), 수술적으로 유도된 무혈관 영역, 또는 황반을 침투할 수 있게 하기에 충분한 시간 동안 안구 표면과 접촉한 상태로 유지되도록 약학적으로 허용 가능한 안과 비히클로 전달될 수 있게끔 제제화될 수 있다.
PRPC 또는 광수용체 세포는 세포의 시트 내에 함유될 수 있다. 예를 들면, PRPC 또는 광수용체 세포를 포함하는 세포의 시트는 세포의 온전한 시트가 방출될 수 있는 기판, 예를 들면, 열반응성 중합체, 예컨대, 열반응성 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(PNIPAAm)-이식된 표면 상에서 PRPC 또는 광수용체 세포를 배양함으로써 제조될 수 있고, 이때 세포는 배양 온도에서 부착하고 증식한 후, (예를 들면, 하한 임계 용해 온도(LCST) 아래까지 냉각시킴으로써) 온도 변동이 있을 때 표면 특성이 변경되어, 세포의 배양된 시트의 방출을 야기한다(전체적으로 본원에 각각 참고로 포함된 문헌[Silva et al., Trends Biotechnol. 2007 December; 25(12):577-83]; 문헌[Hsiue et al., Transplantation. 2006 Feb. 15; 81(3):473-6]; 문헌[Ide, T. et al. (2006); Biomaterials 27, 607-614]; 문헌[Sumide, T. et al. (2005), FASEB J. 20, 392-394]; 문헌[Nishida, K. et al. (2004), Transplantation 77, 379-385]; 및 문헌[Nishida, K. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196] 참조). 예를 들면, 세포를 이식에 적합한 기판 상에서 배양하거나, 세포를 또 다른 기판(예컨대, 열반응성 중합체)으로부터 이식에 적합한 기판 상으로 방출시킴으로써 제조된 세포의 시트는 이식에 적합한 기판, 예컨대, 상기 시트가 숙주 유기체 내로 이식될 때 생체 내에서 용해될 수 있는 기판에 부착된 상태일 수 있다. 이식에 잠재적으로 적합한 예시적 기판은 젤라틴을 포함할 수 있다(상기 문헌[Hsiue et al.] 참조). 이식에 적합할 수 있는 대안적 기판은 피브린 기제 매트릭스 등을 포함한다. 세포의 시트는 망막 변성 질환의 예방 또는 치료를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. PRPC 또는 광수용체 세포의 시트는 이를 필요로 하는 대상체의 눈 내로 도입되도록 제제화될 수 있다. 예를 들면, 세포의 시트는 PRPC 또는 광수용체 세포의 시트의 이식과 함께 중심와하 막절제술에 의해 이를 필요로 하는 눈 내로 도입될 수 있거나, 중심와하 막절제술 후 이식을 위한 의약의 제조를 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 방법에 따라 투여되는 제제의 부피는 투여 방식, PRPC 또는 광수용체 세포의 수, 환자의 연령 및 체중, 및 치료되는 질환의 유형 및 중증도와 같은 요인에 의해 좌우될 수 있다. 주사에 의해 투여되는 경우, 본 개시의 PRPC 또는 광수용체 세포의 약학 제제의 부피는 적어도 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4 또는 5 ㎖일 수 있거나, 이보다 더 많거나 적을 수 있다. 상기 부피는 적어도 약 1 내지 2 ㎖일 수 있다.
망막 변성을 치료하는 방법은 면역억제제의 투여를 추가로 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 면역억제제는 항-림프구 글로불린(ALG) 다중클론 항체, 항-흉선세포 글로불린(ATG) 다중클론 항체, 아자티오프린, BASILIXIMAB®(항-IL-2Ra 수용체 항체), 사이클로스포린(사이클로스포린 A), DACLIZUMAB®(항-IL-2Ra 수용체 항체), 에버롤리무스, 마이코페놀산, RITUXIMAB®(항-CD20 항체), 시롤리무스 및 타크롤리무스를 포함할 수 있으나, 이들로 제한되지 않는다. 면역억제제는 적어도 약 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 mg/kg으로 투약될 수 있다. 면역억제제는 사용될 때 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있고, PRPC 또는 광수용체 세포의 투여 전에, 투여와 동시에, 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 면역억제 요법은 PRPC 또는 광수용체 세포의 투여 후 수주, 수개월, 수년 또는 무기한 동안 계속될 수 있다. 예를 들면, 환자는 PRPC 또는 광수용체 세포의 투여 후 6주 동안 5 mg/kg 사이클로스포린을 투여받을 수 있다.
망막 변성의 치료 방법은 단회 용량의 PRPC 또는 광수용체 세포의 투여를 포함할 수 있다. 또한, 본원에 기재된 치료 방법은 PRPC 또는 광수용체 세포가 일부 기간에 걸쳐 다회 투여되는 요법의 과정을 포함할 수 있다. 치료의 예시적 과정은 매주, 2주마다, 매월, 분기마다, 연 2회 또는 매년 치료를 포함할 수 있다. 대안적으로, 치료는 단계적으로 진행될 수 있고, 이에 따라 다회 용량이 초기에 투여되고(예를 들면, 첫 번째 주 동안 매일 용량), 그 후 더 적고 덜 빈번한 용량이 요구된다.
안내 주사에 의해 투여되는 경우, PRPC 또는 광수용체 세포는 환자의 일생 전체에 걸쳐 1회 이상 주기적으로 전달될 수 있다. 예를 들면, PRPC 또는 광수용체 세포는 해마다 1회, 6개월 내지 12개월마다 1회, 3개월 내지 6개월마다 1회, 1개월 내지 3개월마다 1회 또는 1주 내지 4주마다 1회 전달될 수 있다. 대안적으로, 특정 질병 또는 장애의 경우 더 빈번한 투여가 바람직할 수 있다. 이식물 또는 디바이스에 의해 투여되는 경우, PRPC 또는 광수용체 세포는 치료되는 구체적인 환자 및 장애 또는 질병을 위해 필요한 경우 1회, 또는 환자의 일생 전체에 걸쳐 1회 이상 주기적으로 투여될 수 있다. 유사하게, 시간에 따라 변하는 치료법이 고려된다. 예를 들면, 더 빈번한 치료가 처음에 필요할 수 있다(예를 들면, 매일 또는 매주 치료). 시간에 따라 환자의 상태는 개선되기 때문에, 덜 빈번한 치료가 필요할 수 있거나 심지어 추가 치료가 필요하지 않을 수 있다.
본원에 기재된 방법은 대상체에서 망막전도 반응, 시운동력 역치(optomotor acuity threshold) 또는 휘도 역치를 측정함으로써 치료 또는 예방 효능을 모니터링하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 방법은 눈에서 세포의 면역원성 또는 세포의 이동을 모니터링함으로써 치료 또는 예방의 효능을 모니터링하는 단계도 포함할 수 있다.
PRPC 또는 PR은 망막 변성을 치료하기 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다. 본 개시는 실명의 치료에 있어서 PRPC 또는 PR을 포함하는 제제의 용도도 포괄한다. 예를 들면, 인간 PRPC 또는 PR을 포함하는 제제는 광수용체 손상 및 실명, 예컨대, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성(연령 관련 황반 변성, 예를 들면, 습성 연령 관련 황반 변성 및 건성 연령 관련 황반 변성을 포함함), 색소성 망막염 및 스타가르트병(황반 안저), 야맹증 및 색맹을 초래하는 다수의 시력 변경 질병들과 관련된 망막 변성을 치료하는 데 사용될 수 있다. 상기 제제는 광수용체 손상 및 실명, 예컨대, 당뇨병성 망막병증, 황반 변성(연령 관련 황반 변성을 포함함), 색소성 망막염 및 스타가르트병(황반 안저)을 초래하는 다수의 시력 변경 질병들과 관련된 망막 변성을 치료하기 위해 망막에 투여될 수 있는 적어도 약 5,000개 내지 500,000개의 PRPC 또는 PR(예를 들면, 10,000개의 PRPC 또는 PR)을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 PRPC 또는 PR은 PRPC 또는 PR일 수 있다. 그러나, 인간 세포가 인간 환자뿐만 아니라, 동물 모델 또는 동물 환자에서도 사용될 수 있음을 인지해야 한다. 예를 들면, 인간 세포는 망막 변성의 마우스, 래트, 고양이, 개 또는 비-인간 영장류 모델에서 시험될 수 있다. 추가로, 인간 세포는 이를 필요로 하는 동물을 치료하기 위해 치료적으로, 예컨대, 수의학에서 사용될 수 있다.
하기 실시예는 본 개시를 예시하기 위한 예이고 본 개시의 범위를 제한하는 것으로서 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
인간 유도 만능 줄기 세포 현탁 배양
StemRNATM-NM 재프로그래밍 키트(스템전트(Stemgent), 카탈로그 # 00-0076)를 사용하여 인간 정상 피부 섬유모세포로부터 이 연구에서 사용된 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)를 생성하였다. hiPSC를 0.25 pg/cm2 iMatrix-511 줄기 세포 배양 기판(재조합 라미닌-511)(리프로셀(ReproCell)) 상에서 콜로니로서 시험관 내에서 통상적으로 성장시키고 NutriStem XF/FFTM 배양물(바이올로지칼 인더스트리스(Biological Industries))에서 배양하였다. 아큐타제(이노베이티브 셀 테크놀로지스(Innovative Cell Technologies))로 해리시킴으로써 9 위치 교반 플레이트(Dura-Mag, 켐셀(ChemCell)) 상에서 일회용 스피너 플라스크(리프로셀) 내에서 hiPSC를 통상적인 2D 단일층으로부터 3D 구체 배양물로 전환시켰다. 구체 적응된 hPSC를 10 μM Y27632(리프로셀)와 함께 배양 배지(NutriStem®)를 함유하는 30 ㎖ 스피너 플라스크(리프로셀) 내에서 0.5x106개 내지 1x106개 세포/㎖의 밀도로 단일 세포로서 시딩하였다. 교반 속도를 hiPSC 세포주에 따라 50 내지 80 RPM까지 조절하였다. 배지가 절반만 교체되었을 때 시딩 후 1일째 날을 제외하고, 배지를 Y27632가 없는 새로운 배양 배지로 매일 교체하였다. 아큐타제 및/또는 TrypLE를 사용하여 구체를 단일 세포로 해리시켰고, 구체 크기가 대략 230 내지 260 pm에 도달할 때 4일 내지 5일마다 계대배양하였다. 세포 구체 배양물을 37℃에서 95% 습도와 함께 5% CO2에서 유지하였다.
3D hiPSC 구체의 신경 순응 및 광수용체 전구세포 분화
스피너 플라스크 내의 3D 배양물에서 3회 내지 5회 계대배양 동안 증폭시킨 후, 해리된 3D hiPSC 구체를 1x106개 세포/㎖로 시딩하였다. 24시간 후, 분화 프로토콜 전체에 걸쳐 50 내지 80 RPM의 교반 속도로 스피너 플라스크 내에서 분화시키기 위해 미분화된 hiPSC 구체를 직접 사용하였다. 모든 배지 조성 및 인자들은 도 2의 패널 A에 나열되어 있다. 요약하건대, 이중 SMAD 억제제 SB431542(1.5 내지 15 μM, 리전츠 다이렉트(Reagents Direct)) 및 LDN193189(0.25 내지 2.5 μM, 리프로셀), 및 IFG1(2.5 내지 50 pg/㎖, 펩프로텍(Peprotech))을 사용하여 0일째 날에 세포 구체를 먼저 패턴화하였다. 1일째 날에 Wnt 억제제 IWR-1e(0.25 내지 10 μM, 시그마) 및 헤파린(0.25 내지 15 pg/㎖, 시그마)을 분화 유도 배지에 첨가하였다. 헤파린을 신경 순응 9일째 날에 사용중단하였고 IWR-1e를 11일째 날에 사용중단하였다. 모든 다른 인자들을 분화 15일째 날에 사용중단하였다. PRPC 분화를 위해, PluritonTM/GF 무함유 Nutristem 및 상기 언급된 유도 인자를 가진 NIM-3D의 연속 희석을 통해 2일째 날부터 13일째 날까지 NIM-3D 배지에 점진적으로 적응시켰다. 18일째 날부터 27일째 날까지, NIM-3D/PRPC-3D 배지를 함유하는 50/50 적응을 통해 구체를 PRPC-3D 광수용체 분화 배지에 적응시켰다. 27일째 날부터, 구체를 PRPC-3D 배지에서 유지하였다. 배지를 다음과 같이 교체하였다: 0일째 날부터 1일째 날까지: PluritonTM/GF 무함유 NutriStem®; 2일째 날부터 5일째 날까지: 75% PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® - 25% NIM-3D; 6일째 날부터 9일째 날까지: 50% PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® - 50% NIM-3D; 10일째 날부터 13일째 날까지: PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® 25% - NIM-3D 75%; 13일째 날부터 17일째 날까지: NIM-3D 100%; 18일째 날부터 27일째 날까지: NIM-3D 50% - PRPC-3D 50%; 27일째 날부터 PRPC-3D 100%.
NIM-3D(신경 유도 배지-3D) 기초 배지는 HEPES, 1% N2 및 1% B27 무혈청 보충제(써모 피셔 사이언티픽), 1% 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산(써모 피셔 사이언티픽), 0.30% 글루코스(시그마) 및 도 2에 기재된 모든 인자들을 가진 DMEM/F12로 구성되었다. PRPC-3D 배지는 NeurobasalTM 배지, 1% N2 및 1% B27 무혈청 보충제(써모 피셔 사이언티픽), 1% 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산(써모 피셔 사이언티픽), 0.30% 글루코스(시그마)로 구성되었다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지의 대략 85%를 신경 분화 0일째 날부터 19일째 날까지 매일 교체하였고 19일째 날 후 2일 내지 4일마다 교체하였다.
분화 동안, 상이한 시점에서 TrypLE(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 구체를 단일 세포로 해리시켰고, qRT-PCR 분석을 위해 RNA를 추출하였다. 유세포분석 및 면역형광 염색을 위해 추가 세포를 프로세싱하였다. 구체의 중심에서 저산소성 세포의 생성을 피하기 위해 구체 직경이 전형적으로 350 내지 450 pm에 도달하였을 때, 19일째 날, 30일째 날 내지 32일째 날, 50일째 날 내지 52일째 날, 80일째 날 내지 82일째 날에 구체를 단일 세포로 연속적으로 해리시키고 30 ㎖ 스피너 플라스크 내로 재응집시킴으로써 PRPC를 생성하였다. 요약하건대, 해리/재응집 절차는 모든 구체들을 50 ㎖ 원추형 튜브 내로 모은 후, PBS로 1회 세척하고 37℃ 수조에서 30분 내지 60분 동안 TrypLE와 함께 인큐베이션하는 단계로 구성되었다. 세포를 단일 세포로 약하게 분쇄하여, 확실히 균질한 단일 세포 현탁액이 생성되게 한 후, 40 pm 필터를 통해 여과하였다. 단일 세포를, 10 μM Y27632를 가진 적절한 배양 배지 중의 0.5x106개 내지 1x106개/㎖의 밀도로 30 ㎖ 스피너 플라스크 내로 시딩하였다. 생성된 구체의 형태학(크기, 외관 및 구체 내로 혼입하는 능력)을 각각의 재응집 후 2일 내지 3일 동안 모니터링하였고 그 후 다음 해리/재응집 단계까지 매주 모니터링하였다.
신경 로제트(rosette) 선택을 위해, 구체의 추가 부착/수동 스크래핑 단계를 신경 분화의 5일째 날/12일째 날 및 11일째 날/18일째 날에 도입하였다. 요약하건대, 5일째 날 및 11일째 날에 3 ㎖의 구체 현탁액 배양물을 (6웰 플레이트의) 3개의 매트리겔(Matrigel)(코닝(Corning)) 코팅된 웰에 부착시켰고 부착된 구체의 중심에서 신경 로제트가 형성되었을 때 추가 7일 동안 연속적인 분화를 위해 사용된 동일한 배지에서 유지하였다. 배양물에서 1주 후, 각각 12일째 날 및 18일째 날에 세포를 스크래퍼(코닝)로 수동으로 떼어내고 1:1 비로 초저(ultra-low) 부착 웰 상에 플레이팅하여 정적 조건 하에서 현탁액 중의 구체를 형성하였다. 분화 30일째 날 내지 32일째 날, 정적 구체를 단일 세포로 해리시키고 30 ㎖ 스피너 플라스크 내로 재응집시켰고, 본 발명자들의 연속적인 해리/재응집 절차와 유사한 프로토콜을 이용하여 계속 배양하였다.
초기 및 후기 CRNP 및 PRPC의 냉동보존 및 해동
시험관내 분화의 다양한 단계들에 있는 hiPSC 유래 망막 전구세포(19일째 날에 수집된 초기 CRNP, 30일째 날 내지 34일째 날에 수집된 후기 CRNP, 및 50일째 날 내지 120일째 날에 수집된 PRPC)를 30 ㎖ 스피너 플라스크의 해리된 현탁 배양물로부터 회수하였다. 세포를 단일 세포로 해리시켰고, 속도 제어된 냉동기를 이용하여 10 μM Y-26632로 보충된 Cryostor CS10(시그마) 냉동 배지에서 초기 및 후기 CRNP의 경우 1 ㎖ 분취액 중의 4천만 개 내지 5천만 개 세포/바이알 및 PRPC의 경우 1 ㎖ 분취액 중의 5백만 개 내지 1천만 개 세포/바이알의 양으로 냉동보존하였다. 회수율/배양물에서 재응집하는 능력 및 냉동보존 후 생존율에 대해 세포를 시험하였다. 2개의 상이한 분화로부터의 바이알을 해동시켰고, 총 생존 세포를 카운팅하여 회수율 및 생존율을 측정하였다. 해동 시 평균 세포 생존율은 약 80% 내지 90%이었고 회수율은 약 60% 내지 80%이었다. 스피너 플라스크 내로 해동된 단일 세포는 재응집 능력을 보유하였고, 이때 구체 크기는 해동 후 2일 내지 4일 이내에 100 내지 150 pm에 도달하였는데, 이 크기는 연속적인 해리/재응집의 구체 크기에 필적할만하다. 해동 후 상이한 날에 구체의 유세포분석은 초기 현탁 배양으로부터의 해리 및 재응집 후 형성된 구체에 비해 유사한 퍼센트의 PAX6/SOX2 발현 세포를 보여준다. qPCR 분석도 마커가 유사한 수준으로 발현됨을 확인시켜주었는데, 이는 향후 적용을 위한 다량의 세포의 냉동보존 및 보관의 실행 가능성을 더 입증한다.
면역조직화학
TrypLE를 사용하여 PRPC 구체를 단일 세포로 해리시키고 PRPC-3D 배지에서 10일 내지 20일 동안 5.0x104개 세포/웰로 시험관 내에서 매트리겔 코팅된 24웰 플레이트 상에 시딩하였다. 분화 13일째 날, 전체 부착된 구체를 염색에 사용하였다. 배지를 제거하였고, 세포를 Ca/Mg을 가진 PBS(써모 피셔 사이언티픽)로 3회 세척한 후, 실온에서 15분 동안 4% PFA(파라포름알데하이드)(일렉트론 마이크로스코피 사이언시스(Electron Microscopy Sciences))로 고정시킨 후, DPBS로 3회 세척하였다. 세포를 투과가능하게 만들었고 최대 1시간 동안 실온에서 DPBS 중의 5% 정상 당나귀 혈청(NDS)(잭슨 이뮤노랩(Jackson Immunolab)) 및 0.1% 트리톤 X-100(시그마)으로 차단한 후, 4℃에서 하룻밤 동안 차단 완충제에 희석된 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 염색을 위해 사용된 일차 항체 및 이의 희석 및 공급원은 표 1에 요약되어 있다. 하룻밤 항체 인큐베이션 후, 세포를 DPBS로 3회 세척한 후, 2.5% NDS 및 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 DPBS에 희석된 적절한 종 특이적 형광 접합된 이차 항체와 함께 어두운 조건 하에서 실온에서 2시간 동안 후속 인큐베이션하였다: 당나귀 항-마우스 Alexa Fluor® 488-접합된 이차 항체[1:1000] 및 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor® 594-접합된 이차 항체[1:1000](써모 피셔 사이언티픽). 면역염색을 위해 사용된 이차 항체는 표 2에 나열되어 있다. 세포를 DPBS로 3회 세척하였고, 세포 핵을 실온에서 3분 동안 1 pg/㎖ 4',6-디아미디노-2-페닐인돌, 이염화물(DAPI)(써모 사이언티픽)로 반대염색한 후, DPBS로 세척하였다. 4배, 10배 및 20배 대물렌즈를 가진 컴퓨터-보조된 니콘(Nikon) 도립 현미경(Eclipse Ti-S)을 이용하여 세포를 조사하였고, 이미지를 포착하였고 NIS-요소-BR 소프트웨어(버전 4.50, 니콘)를 이용하여 분석하였다.
면역조직화학
120일째 날 구체를 OCT 화합물(사이겐(Scigen))에 매립한 후 크리오스타트(cryostat)(Leica CM 1950) 상에서 10 내지 12 pm로 절단하였다. 염색을 위해, -80℃에서 저장된 슬라이드를 1시간 동안 실온에서 공기 건조하고 15분 동안 냉온 4% PFA로 고정시킨 후 각각 3분 동안 DPBS로 3회 세척하였다. 일차 항체 및 이차 항체를 사용한 차단 및 인큐베이션을 박편에 대해 직접적으로 전술된 바와 같이 수행하였다. 커버슬립을 사용하여 Fluorogold-G 함유 DAPI(서던 바이오텍(Southern Biotech))로 슬라이드를 마운팅하고 실온에서 건조하였고, 이미지를 전술된 바와 같이 획득하였다.
유세포분석
TrypLE(써모 피셔 사이언티픽)를 사용하여 구체를 단일 세포로 해리시켰고 40 pm 여과기를 통해 여과하였고 얼음 상에서 12분 동안 고정/투과 가능화 완충제(비디 바이오사이언시스(BD Biosciences))로 고정시켰다. 세포내 항원을 검출하기 위해 형광 접합된 항체를 사용하는 유세포분석을 위해, 고정된 1.0x105개 내지 2.0x105개 세포/튜브를 얼음 상에서 30분 동안 FBS 및 사포닌(비디 바이오사이언시스) 함유 빙냉 IX BD 투과가능화/세척 완충제로 투과가능하게 만든 후, 어두운 조건 하에서 30분 동안 적절하게 접합된 항체(표 1에 요약됨)와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 2 ㎖의 투과 가능화/세척 완충제로 세척하고 분석을 위해 준비하였다. 대조군 세포를 마우스 또는 토끼 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 세포내 항원을 검출하기 위해 비접합된 항체를 사용하는 유세포분석을 위해, 고정된 세포를 얼음 상에서 30분 동안 DPBS(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 중의 0.05% 트리톤 X-100(시그마) 및 5% 정상 당나귀 혈청(NDS)(잭슨 이뮤노 리서치(Jackson Immuno Research))으로 구성된 차단 완충제로 차단한 후, 실온에서 1시간 동안 차단 완충제에 희석된 일차 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 차단 완충제로 세척하였다. 이어서, 세포를 어두운 조건 하에서 1시간 동안 차단 완충제에 희석된[1:1000] 적절한 당나귀 항-토끼 Alexa Fluor® 488-접합된 이차 항체(인비트로겐) 또는 당나귀 항-마우스 Alexa Fluor® 647-접합된 이차 항체(인비트로겐)와 함께 인큐베이션하였다. 세척 후, 세포를 차단 완충제에 재현탁하였다. 대조군 세포를 이차 항체와만 인큐베이션하였다. 세포를 표준 절차에 따라 Accuri C6 유세포분석기(비디 바이오사이언시스) 상에서 분석하였다. 데이터를 BD Accuri C6 Plus 소프트웨어(BD)로 분석하였다.
정량적 실시간 중합효소 연쇄 반응(qPCR)
RNeasy 미니키트(퀴아젠(Qiagen))를 사용하여 배양된 세포로부터 총 RNA를 단리하였고, NanoDrop One(써모 사이언티픽)을 이용하여 농도를 측정하였다. qPCR을 2-단계 반응으로 수행하였다. 역전사(RT)를 위해, SympliAmp 열 순환기(어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems))를 이용하여, 제조사의 설명서에 따라 SuperScript OSM-IV VILO 마스터 혼합물 cDNA 합성 키트(인비트로겐)를 사용하여 0.5 ㎍의 총 RNA를 cDNA로 전사하였다. qPCR 반응을 위해, 96웰 플레이트 블록을 가진 QuantStudio™ 6 Flex 실시간 PCR 시스템을 이용하여, TaqMan 유전자 발현 어세이 및 TaqMan 신속 진행된 마스터 혼합물(어플라이드 바이오시스템스)을 함유하는 20 ㎕ 반응 혼합물에서 15 ng의 cDNA를 증폭시켰다. 실험을 위해 사용된 모든 TaqMan 유전자 발현 어세이(TaqMan 프로브)는 표 3에 나열되어 있다. 모든 실험에서, 데이터 표준화를 위한 내부 대조군으로서 하우스 킵핑 유전자 GAPDH를 사용하였다. 기준 대조군으로서 사용된 iPSC와 함께 2(-ΔΔCT) 방법[31]에 기반한 QuantStudio 실시간 PCR v1.3 소프트웨어를 이용하여 각각의 표적 유전자에 대한 상대적 정량 데이터를 분석하였다. 샘플을 삼중으로 수행하였고 3회의 독립적인 분화로부터 채취하였다.
실시예 2: HiPSC 구체 배양
세포 요법에 hPSC를 실제로 적용하기 위해, 대규모 3D 배양 시스템의 추가 개량이 필요하다. 이를 위해, 본 발명자들은 NutriStem® 배지 중의 피더 무함유 2D 단일층에서 배양된 hiPSC(도 1, 패널 A)를 3D 동적 현탁 배양으로 전환시키는 프로토콜을 확립하였는데, 이때 hiPSC는 피더 세포 및 매트릭스의 부재 하에서 소분자 Y27632로 보충된 NutriStem® 배지를 가진 스피너 플라스크 내에서 균일한 구체로서 연속적으로 배양되었다(도 1, 패널 B)[25, 32 내지 38]. 이 현탁 배양 시스템을 이용하여 hPSC 배양물을 연속적으로 계대배양할 수 있고 적어도 10회 계대배양 동안 일관되게 증폭시킬 수 있다. 3D hiPSC 구체를 위한 전형적인 계대배양 간격은 도 1의 패널 B에 표시되어 있고, 이때 아큐타제를 사용하여 230 내지 260 pm의 크기를 가진 구체를 단일 세포로 해리시켰고 60 내지 70 RPM에서 연속적인 교반 하에서 스피너 플라스크 내에서 재응집시켜 구체를 재형성하였다. 3회 내지 5회 반복된 계대배양 후 유세포분석 및 정상 핵형에 의해 입증된 바와 같이, 구체는 높은 만능성 마커 발현(OCT4: 98.8%)과 함께 균일한 구조를 유지하면서 그의 크기가 점진적으로 증가되었다. 본 발명자들의 3D hPSC 계대배양 방법은 본 발명자들의 실험실에서 생성된 모든 통상적으로 시험된 hPSC 세포주들에 대해 성공적으로 활용되었기 때문에 널리 적용될 수 있다.
실시예 3: 소분자를 사용한 3D hiPSC 구체의 망막 뉴런 분화의 효율적인 유도
hiPSC로부터 상이한 발생 단계의 망막 뉴런 전구세포들을 생성하기 위해, 본 발명자들은 주로 소분자를 사용하여 단계적 방식으로 현탁액 중의 3D hiPSC 구체를 직접 유도하는 신규 방법을 개발하였다(도 2). 3D 스피너 플라스크에서의 이 신규 프로토콜은 연속적인 3D 구체 배양을, 망막 뉴런 분화를 유도하기 위해 소분자를 사용하는 여러 해리/재응집 단계들과 통합시킨다. 종래 보고된 바와 같이[2,8,10,11,16,21,22] 망막 계통을 향한 hPSC 분화의 유도를 위해 단백질 인자를 사용하는 대신에, 본 발명자들은 hPSC 구체를 망막 세포의 상이한 발생 단계들로 순차적으로 분화시키기 위해 질을 용이하게 제어할 수 있는 소분자를 확인하였고 이 소분자를 주로 사용하였다. 먼저 세포를, 스피너 플라스크 내에서 Y27632로 보충된 NutriStem® 배지에서 단일 세포((1x106개 세포/㎖)로서 시딩하여 구체를 형성하였다. 유도 0일째 날로서 표기된 24시간 후, 먼저 hiPSC 구체를 이중 SMAD 억제제 SB431542 및 LDN193189로 처리하여, 액티빈/형질전이 성장 인자 β(TGF-β) 및 골 형태형성 단백질(BMP)의 신호 전달도입을 차단하였고 신경 패턴화를 용이하게 한 후[39], Wnt 억제제 IWR-1e[10, 11, 24], IGF1(시야 세포 발생의 유도제)[18] 및 헤파린을 첨가하여 망막 신경 계통 순응을 더 유도하였다[16]. 신경 유도의 초기 단계에서 소분자 IWR-1e를 사용한 Wnt 신호전달의 조작은 부착 및 망막 오르가노이드 현탁 배양 둘 다에서 hPSC를 초기 광수용체 전구세포로 효율적으로 유도하는 것으로 보고되었음을 확인하였다[23]. 24시간 이내에 형성된 구체의 크기는 100 pm 내지 150 pm이었고, 이때 최적 크기는 4개의 hiPSC 세포주들로부터의 결과에 근거할 때 110 pm 내지 125 pm이었다(도 3b). 분화가 0일째 날부터 19일째 날까지 진행되었을 때, hiPSC 구체는 성장하고 확장되고 해리 없이 신경 정체성을 점진적으로 획득하는 동안 크기가 균질한 상태로 유지되었다. 분화 3일째 날 내지 5일째 날까지, 구체는 더 불규칙적인 가장자리를 가진 그의 외관을 변화시키기 시작하였고; 19일째 날까지 이 불규칙적인 가장자리는 완전히 사라졌고, 구체는 반투명하고 매끄러워졌는데, 이것은 신경 구체에 있어서 전형적인 특징이다. 분화 동안, 본 발명자들은 구체의 직경 크기가 250 내지 300 pm에 도달할 때인 9일째 날에 1.5x108개 내지 2.5x108개 세포(5배 내지 8배)부터, 구체의 직경이 약 400 pm에 도달할 때인 19일째 날에 대략 3.2x108개 내지 4.5x108개 세포(10배 내지 15배, 도 3c)까지 계속 증가하는 세포 수의 점진적인 증가를 관찰하였다(도 3a).
실시예 4: 3D hPSC 구체로부터의 망막 뉴런 분화의 동력학적 분석
유세포분석으로 페어링된 박스(Paired box) 6 유전자(PAX6) 및 성별 결정 영역 Y-박스 2(SOX2) 양성 세포 및 PAX6/SOX2 이중 양성 세포의 외관을 모니터링함으로써 망막 분화의 동력학 및 신경 유도의 효율을 조사하였다. hPSC에서 고수준으로 발현되는 것으로 알려진 만능성 8량체 결합 전사 인자 4 유전자(OCT4)는 신경 유도 전 0일째 날에 고수준으로 검출되었지만(98%), 분화 동안 2일째 날에 약 50%까지 그리고 3일째 날에 약 5%까지 점진적으로 하향조절되었고 4일째 날에 0%까지 완전히 차단되었다(도 4a 내지 4c). 만능성 줄기 세포 및 신경 줄기 세포 둘 다에 대한 마커인 SOX2는 0일째 날에 hPSC에서 고수준으로 발현되었고 19일째 날까지 신경 유도 후 세포에서 고수준으로 발현되었다. 초기 순응된 망막 전구세포(CRNP)를 대표하는 PAX6 양성 세포 및 Pax6/SOX2 이중 양성 세포는 3일째 날에 나타났고(약 10%) 3일째 날 내지 4일째 날에 점진적으로 상향조절되었다(약 77%). 다음 1일 내지 3일인 5일째 날 내지 7일째 날 이내에 PAX6 양성 세포 및 PAX6/SOX2 양성 세포는 현저히 증가되었다(>90%, 도 4a 내지 4c). PAX6 및 PAX6/SOX2에 대한 양성을 나타내는 세포의 적어도 약 90%를 가진 3D 구체 배양물은 성공적인 유도로서 간주되었다.
상이한 hPSC 세포주들은 계통 특이적 분화에서 달라질 수 있고 조건에 대한 최적화를 필요로 할 수 있다고 보고되어 있다. 본 발명자들은 상기 프로토콜을 이용하여 4개의 상이한 hiPSC 세포주들로 본 발명자들의 신경 분화 조건을 시험하였다. 요약하건대, 각각의 미분화된 hPSC 세포주를 30 ㎖ 스피너 플라스크에서 현탁 배양에 적응시켰고, 도 2의 패널 A에 표시된 시점에서 최적화된 농도의 10 pM SB431542, 1 pM LDN193189, 10 ng/㎖ IGF1, IWR-1e(2 pM) 및 헤파린(2 pg/㎖)을 사용한 망막 신경 분화를 위해 약 100 내지 150 pm의 크기 범위를 가진 구체를 사용하였고, 모든 hiPSC 세포주들은 PAX6+ 양성 세포 및 PAX6+/SOX2+ 이중 양성 세포를 생성하였다(도 4a). 본 발명자들은 hiPSC 세포주 #2가 다른 3개의 세포주들에 비해 약간 상이한 동력학을 가졌지만, OCT4 발현이 다른 세포주들과 유사한 방식으로 완전히 차단되었고 PAX6 집단이 유세포분석에 의해 확인될 때 5일째 날 내지 7일째 날에 >90%에 도달하지 못하였다는 것도 인지하였는데, 이는 상이한 세포주들 중에서 신경 유도의 가변성이 존재하고 상이한 hiPSC 세포주들의 질이 향후 세포 대체 요법을 위한 대규모 세포 생산을 시작하기 전에 시험될 필요가 있음을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 이 결과들은 본 발명자들의 소분자 칵테일 및 신경 유도 배지가 구체의 파괴 없이 3D hPSC 구체를 신경 계통 발생 쪽으로 계속 효율적으로 유도하였음을 입증하였다.
상기 단계적 분화 프로토콜로부터 유도된 세포의 정체성을 더 조사하기 위해, 본 발명자들은 11일째 날 구체를 매트리겔 코팅된 웰 상에 시딩하고 추가 2일 동안 배양하였고 PAX6, SOX2 및 NESTIN(NES)의 발현뿐만 아니라, 초기 망막 전구세포에서 발현된 망막 특이적 전사 인자인 RAX1의 발현도 조사하였다. 이 부착된 망막 구체는 신경 로제트와 유사한 배열을 나타내고 이 세포들은 PAX6-RAX1 및 NES-SOX2에 대한 이중 양성을 나타냄으로써(도 5a), 그들의 망막 계통을 더 확인시켜주었다. 분화의 초기 단계 동안 상이한 시점들에서 구체의 정량적 실시간 PCR 유전자 발현 분석은 OCT4 유전자가 5일째 날에 완전히 차단되었음을 보여줌으로써, 본 발명자들의 유세포분석 결과를 확인시켜주었고 본 발명자들의 3D 구체 배양에서의 PSC의 부재를 더 입증하였다. 대조적으로, 신경 마커 PAX6의 발현은 5일째 날부터 상승되었고 19일째 날에 신경 분화의 초기 단계에서 계속된 후, 34일째 날 내지 40일째 날에 점진적으로 하향조절되었는데(도 5b), 이 결과는 더 성숙한 망막 세포로의 분화의 시작과 일치한다. 5일째 날 RAX1의 발현은 초기 CRNP의 출현을 표시하였고, 이어서 13일째 날에 망막 전구체 세포의 마커인 Ceh-10 호메오도메인(homeodomain) 함유 상동체(CHX10) 유전자가 고수준으로 발현되었는데, 이것은 생체내 망막형성에서 관찰된 시간적 발생을 재현하는, 본 발명자들의 3D 구체 배양에서 상이한 발생 망막 세포 유형들의 순차적인 출현을 입증한다. 본 발명자들의 결과와 종래 보고[9, 13, 40 내지 42]는 도 2에 예시된 바와 같이 본 발명자들의 3D 구체 배양 시스템에서 초기 망막 전구세포 운명 특정이 대략 5일째 날 내지 13일째 날에 일어났음을 보여주었다. 본 발명자들은 5일째 날 내지 13일째 날의 세포를 초기 순응된 망막 뉴런 전구세포(CRNP; C ommitted R etinal N euron P rogenitor)로서 명명하였고 13일째 날 내지 40일째 날의 세포를 후기 CRNP로서 명명하였다.
실시예 5: 3D CRNP 구체로부터의 광수용체 전구체 세포의 생성
종래 연구가 2D 및 3D 망막 오르가노이드 둘 다에서 다양한 정도의 효율성으로 hPSC로부터 광수용체 전구세포를 생성하는 것을 보고하였지만[9, 11, 15, 16, 18, 21, 43, 44], 본 발명자들은 본 발명자들의 분화 프로토콜이 유사분열후 광수용체 전구세포 및 광수용체 유사 세포를 효율적으로 생성할 수 있는지도 조사하였다. 약 19일째 날에 초기 CRNP 표현형을 획득한 후(도 5a 및 5b), 계속 분화된 3D 구체의 직경이 약 400 pm에 도달하였을 때, Y27632로 보충된 신경 분화 배지를 가진 30 ㎖ 스피너 플라스크에서 구체를 먼저 단일 세포로 해리시키고 0.5x106개 내지 1x106개 세포/㎖의 세포 밀도로 재응집시켜 구체를 재형성하였다(도 6). 신경구체의 형태학적 특성(위상차 명시야, 반투명하고 구체의 주변에 작은 마이크로스파이크를 가짐)을 가진 구체로의 세포의 즉시 완전한 재응집은 약 110 pm의 구체 크기로 재응집한 후 하루만큼 빠른 시간 이내에 달성되었다(도 6, 패널 A). 분화 조건 하에서, 약 400 pm까지 점진적 및 연속적인 구체 크기의 성장은 약 14일째 날부터지 약 30일째 날까지 관찰되었고, 이때 구체는 단일 세포로 다시 해리되었고 스피너 플라스크 내에서 재응집되었다. 유사한 해리/재응집 방법을 50일째 날 내지 52일째 날, 80일째 날 내지 82일째 날, 및 100일째 날 내지 102일째 날에 반복적으로 수행하였다(도 6, 패널 A). 구체 형성 및 성장의 필적할만한 패턴은 각각의 해리/재응집 주기 동안 관찰되었고, 3x107개의 hiPSC로 출발하여 약 100일째 날에 약 3.0x109개 내지 4.5x109개의 망막 뉴런 전구세포까지 세포 수의 대략 100배 증가가 달성되었는데, 이것은 종래 보고보다 훨씬 더 효율적이다(도 6, 패널 B).
구체의 세포 조성을 조사하기 위해, 본 발명자들은 32일째 날 및 82일째 날의 해리/재응집 시점에서 해리된 세포들을 시딩하고(도 7a) 추가 약 1주 내지 3주 동안 시험관 내에서 배양하였다. 망막 분화 조건 하에서 배양된 부착된 단일 세포들의 형태학적 특징규명은 시험관 내에서 광수용체 전구세포의 것과 유사한 뉴런 연결을 보여주었다(도 7a). 이 세포들의 실제 정체성을 더 확인하기 위해, 면역형광 세포화학 분석으로 광수용체 전구세포에 특이적인 여러 마커들의 발현을 조사하였다. 본 발명자들의 결과는 이 세포들이 여러 라운드의 해리/재응집 후 분화 100일째 날에 광수용체 운명 특정 및 발생에 결정적인 핵심 전사 인자인 원추세포-간상세포 호메오박스(CRX), 신경 망막 류신 지퍼(NRL) 및 갑상선 호르몬 수용체-β2(ThRB2)를 고수준으로 발현하였음을 명확히 입증하였다(도 7b). 반면, 소수의 Ki67+ 증식 세포만이 이 구체에서 검출되었는데, 이것은 유사분열후 망막 뉴런이 이 3D 구체 프로토콜에서 효율적으로 생성되었음을 시사한다. 추가로, 상대적인 성숙 뉴런 세포에 대한 일반 마커인 마이크로튜브 관련 단백질(MAP2, 녹색)은 고수준으로 발현된 반면, 성상세포 및/또는 뮬러 신경교세포에 대한 마커인 신경교세포 섬유질 산성 단백질(GFAP, 적색)은 이 세포들에서 거의 검출되지 않았는데, 이것은 광수용체 전구세포 특이적 마커를 발현하는 거의 균질한 뉴런 집단을 시사하고, 본 발명자들은 이를 유사분열후 망막 뉴런 광수용체 전구체 세포(PRPC; P hoto R eceptor P recursor C ell)로서 명명하였다. 본 발명자들은 100일째 날에 성숙 광수용체 세포 마커의 발현도 조사하였고, 본 발명자들의 결과는 이 세포들 대다수가 둘 다 간상세포 광수용체에 대한 마커인 간상세포 시각적 색소 단백질 로돕신(RHOD) 및 신경 칼슘 결합 단백질 레코베린(REC)을 발현하였음을 보여주었다(도 7c).
PRPC 및 광수용체 유사 세포를 향한 효율적인 분화는 80일째 날에 유세포분석에 의해서도 확인되었다. 결과는 만능성 유전자 OCT4를 발현하는 검출 가능한 세포가 없는 반면, 90% 초과의 세포들이 PRPC 및 광수용체 마커(CRX, 95.2%; NRL, 96.6%; NR2E3, 91.3%, REC, 96.8% 및 원추세포 특이적 옵신 적색/녹색 M-OPSIN, 91.2%, 도 8a)를 발현하였음을 보여주었다. 분화 과정 동안 이 유전자들의 발현 동력학을 더 특징규명하기 위해, 본 발명자들은 RT-qPCR 분석을 수행하였다. 이 분석은 분화 40일째 날에 시작하는 PRPC 마커 유전자, 예컨대, NRL, 핵 수용체 서브패밀리 2, 군 E, 구성원 3((NR2E3), 및 ThR(12의 점진적인 증가도 보여주었다(도 8b). 유사하게, 광수용체 마커 REC, RHOD 및 M-OPSIN의 발현 동력학은 동일한 경향을 보여주었으나, M-OPSIN의 발현만이 70일째 날에 검출될 수 있었다(도 8b). 반면, 모두 초기 및 후기 CRNP 세포에 대한 마커인 PAX6, RAX1 및 CHX10 유전자는 도 5b에 나타낸 바와 같이 현저히 하향조절되었다. 이 세포들에서 수반되는 초기 망막 뉴런 유전자의 하향조절과 후기 망막 뉴런 마커의 상향조절은 이 세포들이 PRPC 및 광수용체의 발생 단계에 있음을 시사한다. 따라서, 본 발명자들은 80일째 날(D80) 이후에 분화된 세포를 광수용체 유사 세포로서 명명한다. 다른 3개의 hiPSC 세포주들을 사용하여 동일한 분석을 수행함으로써(데이터는 제시되지 않음), 이 3D 구체 분화 시스템의 반복성 및 일관성을 입증하였다. hiPSC 유래 PRPC의 핵형 분석은 반복된 해리/재응집 단계에 의한 장기간 3D 구체 배양 후 유전적 안정성을 보여주었다(데이터는 제시되지 않음). 구체 및 이 구체로부터 유도된 단일 세포 둘 다를 액체 질소에서 냉동보존한 후 생존율에 대해 시험하였고, 냉동보존된 초기 및 후기 CRNP 및 PRPC로부터 약 80% 생존 세포를 회수하였다(데이터는 제시되지 않음).
분화된 구체에서 세포를 더 특징규명하기 위해, 본 발명자들은 120일째 날 구체를 OCT에 매립하고 절단하였고, 일반 뉴런 및 망막 뉴런 특이적 마커를 특이적 항체 염색으로 조사하였다(도 9). 구체 형태학 및 헤마톡실린 염색의 정성적 평가는 괴사성 코어를 갖지 않은 구체의 전체 단면 전체에 걸쳐 분명한 세포 무결성을 보여줌으로써, 연장된 현탁 배양 동안 대사 폐기물이 배양 배지 내로 수송되면서 적절한 산소 및 영양분이 구체에 공급됨을 더 입증하였다(도 9). PRPC 특이적 마커인 CRX 및 NRL을 발현하는 높은 퍼센트의 세포 및 매우 낮은 수의 Ki67+ 증식 세포와 함께, 조밀한 방식으로 단면 전체에 걸친 MAP2의 고수준 발현(도 9, 패널 C)은 이 구체에서의 PRPC의 효율적인 생성을 더 확인시켜준다(도 9, 패널 D). 신경상피의 인식 가능한 구조 내에서 조직화된 구체에서 RHOD 및 REC의 널리 퍼진 발현(도 10)에 의해 확인된 바와 같이, 보다 성숙한 간상세포 광수용체는 120일째 날까지 풍부하였다. 아울러, 이 결과는 본 발명자들의 배양 시스템이 연속적인 교반 하에서 소분자들, 해리/재응집 및 자극된 미세중력-향상된 미세환경의 조합된 효과에 의해 hiPSC로부터 다수의 고도로 순수하고 균질한 PRPC가 강력히 생성되도록 뒷받침한다는 것을 입증한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
실시예 6: 소닉 헤지호그의 사용
도 11은 인간 유도 만능 줄기 세포로부터 망막 신경 전구세포를 유도하기 위한 신경 유도 프로토콜의 개요이다. 소분자와 소닉 헤지호그(SHH)의 병용은 망막 전구세포를 효율적으로 생성한다. rh-SHH는 재조합 인간 SHH를 지칭함을 인지한다.
스피너 플라스크 내의 3D 배양에서 3회 내지 5회 계대배양 동안 증폭시킨 후, 해리된 3D hiPSC 구체를 1x106개 세포/㎖로 시딩하였다. 24시간 후, 미분화된 hiPSC 구체를 분화 프로토콜 전체에 걸쳐 50 내지 80 RPM의 교반 속도로 스피너 플라스크 내에서 분화시키기 위해 직접 사용하였다. 모든 배지 조성 및 인자는 도 11에 나열되어 있다. 요약하건대, 먼저 0일째 날에 세포 구체를 이중 SMAD 억제제 SB431542("SB", 1.5 내지 15 μM, 리전츠 다이렉트) 및 LDN193189("LDN", 0.25 내지 2.5 μM, 리프로셀) 및 IFG1(2.5 내지 50 pg/㎖, 펩프로텍)로 패턴화하였다. 1일째 날, Wnt 억제제 IWR-1e(0.25 내지 10 μM, 시그마)를 분화 유도 배지 PluritonTM에 첨가하였다. 3일째 날, rh-SHH(0.5 내지 20 nM, 시그마)를 첨가하였다. rh-SHH를 신경 순응 9일째 날에 사용중단하였고 IWR-1e를 11일째 날에 사용중단하였다. 모든 다른 인자들을 분화 15일째 날에 사용중단하였다. PRPC 분화를 위해, PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® 및 상기 언급된 유도 인자를 가진 NIM-3D의 연속 희석을 통해 2일째 날부터 13일째 날까지 NIM-3D 배지에 점진적으로 적응시켰다. 18일째 날부터 27일째 날까지, NIM-3D/PRPC-3D 배지를 함유하는 50/50 적응을 통해 구체를 PRPC-3D 광수용체 분화 배지에 적응시켰다. 27일째 날부터, 구체를 PRPC-3D 배지에서 유지하였다. 배지를 다음과 같이 교체하였다: 0일째 날부터 1일째 날까지: PluritonTM/GF 무함유 NutriStem®; 2일째 날부터 5일째 날까지: 75% PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® - 25% NIM-3D; 6일째 날부터 9일째 날까지: 50% PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® - 50% NIM-3D; 10일째 날부터 12일째 날까지: PluritonTM/GF 무함유 NutriStem® 25% - NIM-3D 75%; 13일째 날부터 18일째 날까지: NIM-3D 100%; 19일째 날부터 21일째 날까지: NIM-3D 50% - PRPM-3D 50%; 22일째 날부터: PRPM-3D 100%.
NIM-3D(신경 유도 배지-3D) 기초 배지는 HEPES, 1% N2 및 1% B27 무혈청 보충제(써모 피셔 사이언티픽), 1% 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산(써모 피셔 사이언티픽), 0.30% 글루코스(시그마) 및 도 11에 기재된 모든 인자들을 가진 DMEM/F12로 구성되었다. PRPM-3D 배지는 NeurobasalTM 배지, 1% N2 및 1% B27 무혈청 보충제(써모 피셔 사이언티픽), 1% 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산(써모 피셔 사이언티픽), 0.30% 글루코스(시그마)로 구성되었다. 세포를 5% CO2와 함께 37℃에서 인큐베이션하였다. 배지의 대략 85%를 신경 분화 0일째 날부터 19일째 날까지 매일 교체하였고 19일째 날 후 2일 내지 4일마다 교체하였다.
SHH 처리된 배양물은 분화 7일째 날까지 헤파린 처리된 대조군에 비해 망막 신경형성에 필수적인 전사 인자인 PAX6을 발현하는 보다 높은 퍼센트의 세포를 나타내었다. 19일째 날, SHH로 처리된 배양물은 대조군에 비해 PAX6을 발현하는 세포의 10배 이상의 증가를 나타내었다. 7일째 날부터 21일째 날까지 PAX6 발현의 꾸준한 감소를 보인 SHH 조건과 대조적으로, 대조군은 9일째 날까지 PAX6 발현 세포의 급격한 감소를 나타내었는데, 이것은 세포 집단이 주로 내부 핵 층(INL), 예컨대, 양극성 세포 유형 및 아마크린 세포 유형으로부터 대안적 세포 운명을 채택하였음을 표시할 수 있다. 추가로, 헤파린 처리된 대조군에서 신경 특이적 마커 및 망막 특이적 마커의 RT-PCR 정량은 여러 독립적인 라운드의 망막 전구세포 분화 전체에 걸쳐 덜 일관되었다. 이 결과는 SHH가 신경 유도 및 망막 전구세포의 증식을 달성하는 데 있어서 다른 미토겐 활성화된 단백질, 예컨대, 헤파린의 보다 효과적인 대체물임을 시사한다.
도 12는 헤파린 또는 SHH로 처리된 분화된 세포에서 PAX6 mRNA 유전자 발현의 비교 RT-PCR 정량을 보여준다. 광수용체 분화 타임라인 동안 두 조건들에서 세포로부터 총 RNA를 회수하고 PAX6 RNA 전사체 수준에 대해 분석하였다.
헤파린 처리된 대조군은 0일째 날 내지 20일째 날에 PAX6 mRNA 유전자 발현의 느린 점진적인 증가를 나타내었는데, 이것은 덜 효율적인 hiPSC 신경 유도를 표시한다. 대조적으로, SHH 처리된 군은 대조군에 비해 5일째 날까지 PAX6 RNA 수준의 유의미한 강력한 상승을 나타내었고 19일째 날까지 높은 수준으로 유지하였다. SHH 처리된 세포에 대한 PAX6 유전자 발현 수준은 5일째 날까지 대조군의 세포보다 4배 이상 더 높았다. 이 결과는 SHH가 hiPSC를 신경 계통으로 유도하는 데 있어서 헤파린보다 훨씬 더 효율적일뿐만 아니라 시험관 내에서 처음 19일의 분화 동안 PAX6 양성 세포의 신경형성을 유지하는 데 있어서도 훨씬 더 효율적임을 암시한다.
실시예 7: 변형된 배지는 광수용체 세포 운명으로의 성숙을 향상시킨다.
전구체 및 초기 광수용체 유사 세포의 생존 및 성숙을 촉진하기 위해, 본 발명자들은 간상세포 및 원추세포 광수용체 운명을 강력히 특정하도록 본 발명자들의 성숙 배지를 최적화하였다. 분화 99일째 날, 세포 배양물을 NeurobasalTM 배지 중에 1% 글루타맥스(Glutamax), 1% 페니실린/스트렙토마이신, 인간 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF)(20 ng/㎖), 아스코르브산(0.2 mM) 및 DAPT(1 μM)를 함유하는 배지로 전환시켰다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해, 상기 특정된 성숙 배지는 간상세포 마커(RHO) 및 원추세포 마커(ThR(12)를 각각 20% 및 10%까지 증가시켰다. 광수용체 전구체 마커 레코베린은 대조군보다 대략 9% 더 높았다. 변형된 성숙 배지에서 더 적은 네스틴(Nestin) 양성 세포도 관찰되었는데, 이것은 더 많은 대다수의 세포들이 분화하였고 신경 줄기 세포 상태를 빠져나갔음 시사한다. 이 면역조직화학적 데이터는 변형된 배지가 대조군 배지에 비해 광수용체 세포 운명으로의 성숙을 향상시킴을 암시한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
본 개시의 기재된 방법 및 조성물의 변형 및 변경은 본 개시의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당분야에서 숙련된 자에게 자명할 것이다. 본 개시가 특정 실시양태와 관련하여 기재되어 있지만, 청구된 본 개시가 이러한 특정 실시양태로 과도하게 제한되어서는 안 된다는 것을 이해해야 한다. 실제로, 본 개시를 실시하기 위한 기재된 방식의 다양한 변형이 관련 분야에서 숙련된 자에 의해 의도되고 이해되고, 이때 이 개시는 하기 청구범위에 의해 표시된 본 개시의 범위 내에 있다.
참고에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 특허들 및 간행물들은 각각의 독립적인 특허 및 간행물이 참고로 포함되는 것으로 구체적 및 개별적으로 표시된 것처럼 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

Claims (17)

  1. 광수용체 전구체 세포의 시험관내 제조 방법으로서,
    (a) 복수의 만능성(pluripotent) 줄기 세포들을 3차원(3D) 구체(sphere) 배양하여, 눈 초기 및 후기 순응된(committed) 망막 신경 전구세포(CRNP)를 포함하는 복수의 제1 구체들을 생성하는 단계;
    (b) 제1 구체의 직경이 약 300 내지 500 pm의 평균 크기에 도달할 때까지 구체 크기를 모니터링하는 단계;
    (c) 제1 구체를 제1의 복수의 실질적으로 단일 세포들로 해리시키는 단계;
    (d) 제1의 복수의 실질적으로 단일 세포들을 3D 구체 배양하여, 광수용체 전구체 세포(PRPC)를 포함하는 복수의 제2 구체들을 생성하는 단계;
    (e) 제2 구체의 직경이 약 300 내지 500 pm의 평균 크기에 도달할 때까지 구체 크기를 모니터링하는 단계;
    (f) 제2 구체를 제2의 복수의 실질적으로 단일 세포들로 해리시키는 단계;
    (g) 제2의 복수의 실질적으로 단일 세포들을 3D 구체 배양하여, 유사분열후 PRPC를 포함하는 복수의 제3 구체들을 생성하는 단계; 및
    (h) 임의적으로, 유사분열후 PRPC를 광수용체 유사 세포로 더 분화시키는 단계
    를 포함하는, 광수용체 전구체 세포의 시험관내 제조 방법.
  2. 제1항에 있어서, 만능성 줄기 세포가 바람직하게는 인간으로부터의 배아 줄기 세포 또는 유도 만능 줄기 세포인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 (a), (d) 및 (g)가 바람직하게는 연속적인 교반 하에서 스피너 플라스크 또는 교반 탱크 생물반응기 내에서 배양하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 단계 (a)가 신경 유도 배지, 바람직하게는 소닉 헤지호그(Sonic Hedgehog), 헤파린(Heparin), IWR-1e, SB431542, LDN193189 및 IGF1 중 하나 이상으로 보충된, HEPES, N2 및 B27 무혈청 보충제, 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산 및 글루코스를 가진 DMEM/F12를 함유하는 NIM-3D(신경 유도 배지-3D) 기초 배지에 점진적으로 적응시키고 이 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 제1 기간 동안 SB431542, LDN193189 및 IGF1을 제공하는 단계, 제1 기간보다 더 짧은 제2 기간 동안 IWR-1e를 제공하는 단계, 및 제2 기간보다 더 짧은 제3 기간 동안 소닉 헤지호그 또는 헤파린을 제공하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 제1 기간이 10일 내지 20일, 바람직하게는 12일 내지 18일, 보다 바람직하게는 16일인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 제2 기간이 5일 내지 15일, 바람직하게는 8일 내지 14일, 보다 바람직하게는 11일인 방법.
  8. 제5항에 있어서, 제3 기간이 3일 내지 12일, 바람직하게는 5일 내지 10일, 보다 바람직하게는 7일인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 제1 구체의 직경이 약 350 내지 450 pm의 평균 크기에 도달하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 단계 (b)에서 제1 구체의 직경이 약 400 pm 미만의 평균 크기에 도달하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 단계 (c) 및 (f)가 각각 제1 구체 및 제2 구체를 세포 해리 효소와 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 단계 (d)가 광수용체 분화 배지, 바람직하게는 NeurobasalTM 배지, N2 및 B27 무혈청 보충제, 페니실린/스트렙토마이신, MEM 비필수 아미노산 및 글루코스를 함유하는 PRPC-3D 배지에 점진적으로 적응시키고 이 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 단계 (g) 및/또는 (h)가 성숙 배지, 바람직하게는 L-글루타민(예를 들면, GlutaMAXTM), 페니실린/스트렙토마이신, 인간 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF), 아스코르브산 및 DAPT(N-[N-(3,5-디플루오로펜아세틸)-1-알라닐]-S-페닐글리신 t-부틸 에스테르)를 함유하는 NeurobasalTM 배지로 교체하고 이 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 단계 (g) 및/또는 (h)가 직경 약 300 내지 500 pm까지 구체 크기를 모니터링하는 단계; 바람직하게는 세포 해리 효소를 사용하여 제3 구체를 제3의 복수의 실질적으로 단일 세포로 해리시키는 단계; 및 제3의 복수의 실질적으로 단일 세포를 재응집시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  15. 광수용체 대체 요법을 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 제조된 유사분열후 PRPC 및/또는 광수용체 유사 세포의 용도.
  16. 제15항에 있어서, 광수용체 대체 요법이 건성 형태 및 습성 형태의 연령 관련 황반 변성 둘 다, 간상세포 또는 원추세포 이영양증, 망막 변성, 색소성 망막염, 당뇨병성 망막병증, 레버 선천성 흑암시 및 스타가르트병과 같은 망막 질환의 치료를 위한 것인 용도.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 방법을 이용하여 제조된 유사분열후 PRPC 및/또는 광수용체 유사 세포에서 작용제를 시험하는 단계를 포함하는 시험관내 스크리닝 방법.
KR1020217010202A 2018-09-07 2019-09-06 담체 무함유 3d 구체 현탁 배양에서 망막 뉴런 생성을 위한 방법 및 조성물 KR20210058872A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862728088P 2018-09-07 2018-09-07
US62/728,088 2018-09-07
PCT/US2019/049916 WO2020051429A1 (en) 2018-09-07 2019-09-06 Methods and compositions for retinal neuron generation in carrier-free 3d sphere suspension culture

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210058872A true KR20210058872A (ko) 2021-05-24

Family

ID=69723278

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217010202A KR20210058872A (ko) 2018-09-07 2019-09-06 담체 무함유 3d 구체 현탁 배양에서 망막 뉴런 생성을 위한 방법 및 조성물

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20210315938A1 (ko)
EP (1) EP3847244A4 (ko)
JP (2) JP7436491B2 (ko)
KR (1) KR20210058872A (ko)
CN (1) CN113272422A (ko)
AU (1) AU2019335025A1 (ko)
CA (1) CA3111987A1 (ko)
WO (1) WO2020051429A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113943707B (zh) * 2021-09-24 2023-11-21 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院 一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102712900B (zh) * 2009-10-06 2015-07-01 首尔大学校产学协力团 干细胞分化成为视网膜细胞的方法
EP4292600A3 (en) * 2013-03-15 2024-04-10 Astellas Institute for Regenerative Medicine Photoreceptors and photoreceptor progenitors produced from pluripotent stem cells
JP6651440B2 (ja) * 2013-10-09 2020-02-19 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 哺乳動物の網膜幹細胞の生産方法及び適用
GB201402692D0 (en) 2014-02-16 2014-04-02 Univ Newcastle Synthetic retina

Also Published As

Publication number Publication date
CN113272422A (zh) 2021-08-17
EP3847244A1 (en) 2021-07-14
JP2022508444A (ja) 2022-01-19
JP2023054306A (ja) 2023-04-13
US20210315938A1 (en) 2021-10-14
WO2020051429A1 (en) 2020-03-12
EP3847244A4 (en) 2022-10-12
JP7436491B2 (ja) 2024-02-21
AU2019335025A1 (en) 2021-04-08
CA3111987A1 (en) 2020-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7245752B2 (ja) 多能性幹細胞から生成された光受容体および光受容体前駆体
US10828335B2 (en) Production of midbrain dopaminergic neurons and methods for the use thereof
KR102487142B1 (ko) 만능 세포를 분화시키는 방법
US9487752B2 (en) Priming of pluripotent stem cells for neural differentiation
JP7029144B2 (ja) 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法
TW201629213A (zh) 網膜組織的製造方法
JP2008099662A (ja) 幹細胞の培養方法
KR102297580B1 (ko) 전안부 조직의 제조 방법
JP2018531048A (ja) 網膜色素上皮細胞の調製法
JP2018531048A6 (ja) 網膜色素上皮細胞の調製法
JP2023054306A (ja) 無担体３ｄ球体浮遊培養における網膜ニューロン生成のための方法および組成物

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination