CN113943707B - 一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法，属于生物技术领域。本发明的筛选方法通过改良TrypLE消化液以及直接贴壁培养后再分选，提高了细胞活性，降低细胞死亡率，分选活性率由40‑60％提高到95％以上。分选出的细胞在改良N2B27神经干细胞培养基中细胞扩增更加稳定，提高了扩增代次，由原来P5能稳定提高到P10左右，并保持着视网膜干细胞活性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法。
背景技术
视网膜变性疾病(RD)是以视网膜色素上皮细胞和视网膜神经元丢失为特点的一类严重致盲性眼病。针对视网膜变性导致的神经元死亡目前尚无有效的治疗手段，干细胞移植是治疗视网膜变性具有前景的治疗策略。
视网膜前体细胞(RPC)是一类有治疗潜力的干细胞。以往富集人视网膜前体细胞多从流产胚胎视网膜，来源受限，并涉及伦理学问题，因此迫切需要开发新的治疗细胞来源。人视网膜类器官是经人多能干细胞诱导形成的三维视网膜组织，与在体视网膜发育高度相似，并且其突破伦理学限制，在体外较易获得，有望成为干细胞治疗视网膜变性新的种子细胞来源。积极开发从人视网膜类器官上稳定高效富集治疗细胞的策略将为治疗视网膜变性疾病提供丰富的治疗来源，是干细胞治疗视网膜变性疾病临床转化的必经之路。
前期已经证实通过表面抗原分选C-kit+SSEA4-细胞是一群具有治疗效果的视网膜前体细胞。目前从类器官中富集这群视网膜前体细胞采取机械分离加消化酶分离单细胞---表面抗体染色---过细胞筛网---上机分选---阳性细胞接种(整个过程需要3-4小时左右)，主要存在以下问题：1、视网膜类器官神经组织消化较困难，分离的细胞活力低；2、消化后即时分选的单细胞总量少，富集到的阳性细胞数量少；3、从消化经过染色再分选耗时较长，最终分选得到的阳性细胞状态差，进而导致扩增困难。因此，有必要优化实验方案来获得更多数量和更高质量的C-kit+SSEA4-视网膜前体细胞来满足临床移植治疗。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法。为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法，所述方法为：
(1)取视网膜类器官并分离视网膜神经层，将视网膜神经层放入改良消化液中37℃消化30分钟，在消化15分钟后将未消化散的神经层更换另一管新鲜改良消化液，摇晃、轻轻吹打，贴壁培养2天；
(2)取出步骤(1)中贴壁培养细胞，只加入TrypLE消化酶3-5分钟，收集细胞；
(3)将步骤(2)中收集的细胞用改良N2B27神经干细胞培养基培养。
作为优选的技术方案之一，所述改良消化液为TrypLE消化酶中含有0.125％胰蛋白酶。
作为优选的技术方案之一，所述改良N2B27神经干细胞培养基包括D/F12D/F12基础培养基、Neurobasal培养基、B27添加剂、N2添加剂、BFGF和血清替代物。
作为优选的技术方案之一，所述D/F12D/F12基础培养基和Neurobasal培养基的体积比为1：1。
作为优选的技术方案之一，所述B27添加剂的质量分数为2％、N2添加剂的质量分数为1％。
作为优选的技术方案之一，所述改良N2B27神经干细胞培养基中BFGF的终浓度为20ng/mL。
作为优选的技术方案之一，血清替代物的质量分数为3％。
本发明的有益效果在于：
本发明通过表面抗原分选策略(ckit+ssea4-)从小鼠、人胚胎视网膜和人视网膜类器官上富集视网膜前体细胞，并初步证实其细胞移植治疗的安全性和有效性。针对上述原分选流程现有技术的不足，本发明着力于多维度调整实验方案：1)分选前两天机械分离视网膜神经层加改良消化液(改良为TrypLE消化液+0.125％胰酶)分离细胞(之前只是TrypLE消化液)，但不需要过度吹打或消化为单细胞，贴壁培养两天，小组织块可以单细胞爬出，并得到一定的扩增；2)分选时再次消化，很容易为单细胞，400目细胞筛过滤细胞浪费大大减少，并且活性率大大提高；3)包被剂采用imatrix，非动物源性，为临床级产品，适用于人胚胎干细胞以及各类神经干细胞；4)原有培养基为Lonza无血清培养基，扩增效率较差，改良的N2B27神经干细胞培养基中N2添加剂和B27添加剂在视网膜前体细胞培养中对增殖状态起着关键的作用，对于细胞扩增更加稳定，并提高扩增代次。
本发明方法能明显提高细胞分选活性及数量和扩增效率及代次，从而大大提高收获的种子细胞数量。通过本发明多维度的调整实验方案，所具有的优点和有益效果如下：
1)分选活性率由60-70％提高到95％以上；
2)分选阳性细胞数量提高20倍以上；
3)细胞扩增由原来P5能稳定提高到P10左右。
附图说明
图1将诱导30d的人视网膜类器官神经层均使用改良消化液消化后分为直接贴壁和400目细胞筛网过滤后贴壁两种处理方式后的细胞培养，A、B为消化后贴壁培养的细胞状态；C、D为消化后过细胞筛网再培养的细胞情况。
图2为均使用改良消化液消化再不同处理后的分选比较，A、C为消化后过细胞筛网直接染色分选的方法的流式分选效率及细胞贴壁情况；B、D为消化后贴壁培养2天再染色分选的方法的流式分选效率及细胞贴壁情况。
图3为分选后采用两种培养基进行培养后的各代次细胞状态的比较，A为原Lonza无血清培养基培养的状态；B为改良N2B27神经干细胞培养基培养的状态。
图4为分选后采用两种培养基进行培养后细胞特性的比较，A为原Lonza无血清培养基培养后的细胞视网膜干细胞RAX的标记；B为N2B27神经干细胞培养基培养后的细胞视网膜干细胞RAX的标记。
具体实施方式
以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。通过实施例，科研人员可以对本发明有更清楚的了解，可以在此基础上对本发明做出一定的变更和修改，以获得不同的研究效果下述实施例中的实验方法，如无特殊说明均为常规方法。实验过程中涉及到的试剂均为常规试剂，使用均参照产品使用说明书使用。
实施例1
视网膜前体细胞的筛选和培养
(1)取hESC来源的视网膜类器官，在显微镜下用1ml空针针头机械分离视网膜神经层，将视网膜神经层放入改良消化液中37℃消化30分钟，在消化15分钟后将未消化散的神经层更换另一管新鲜改良消化液，且每3分钟摇晃几次，轻轻吹打，再贴壁培养2天；所述改良消化液为TrypLE消化酶中含有0.125％胰蛋白酶。
(2)取出步骤(1)中贴壁培养细胞，只加入TrypLE消化酶3-5分钟，经流式分选ckit+ssea4-收集细胞；
(3)将步骤(2)收集的细胞用改良N2B27神经干细胞培养基培养；所述改良N2B27神经干细胞培养基成分包括DMEM/F12和Neurobasal培养基1:1混合，再添加2％ B27添加剂、1％N2添加剂、20ng/mL BFGF和3％KOSR血清替代物。用单一的TrypLE消化酶作为步骤(1)中的对照消化酶。用Lonza无血清培养基添加20ng/mL BFGF和3％KOSR血清替代物作为步骤(3)中的对照培养基。
诱导30d的人视网膜类器官神经层通过改良的TrypLE+0.125％胰蛋白酶消化液消化视网膜前体细胞消化结果如图1中A、B所示，A、B均为改良消化液消化后直接贴壁的细胞，可见贴壁后第一天局部组织块大量细胞爬出，细胞密度高状态好。由于单一的TrypLE消化能力较弱，适合单细胞消化，常规浓度0.25％胰蛋白酶消化较强，而视网膜类器官神经层类似于多层组织，说明改良后的消化液将两者结合并降低胰蛋白酶浓度，这样可以提高组织消化能力又对细胞损伤较小；图1中C、D均为改良消化液消化后，直接过400目细胞筛网再接种(现有技术方案是直接消化过细胞筛网，保证为单细胞才能进行细胞分选)，可见呈单细胞生长，但细胞密度较稀，说明通过消化后直接过滤获得的单细胞量大大减少，而AB改进后的方案给予未完全消化的神经层一定的缓解期，贴壁后单细胞可以充分爬出并迅速增殖；如果直接采取以往的消化手段：提高胰蛋白酶浓度或延长消化时间或增加吹打次数都将导致细胞活性的大大下降。
图2为诱导30d的人视网膜类器官神经层通过不同消化再不同处理后的分选结果，A为改进前的方法：单独用TrypLE消化30分钟后，4度染色ckit和ssea4抗体再离心洗涤后直接过400目细胞筛网再分选(从分离神经层到分选接种需要3小时左右)，可见其细胞活性率为40％左右，说明单独用TrypLE消化神经层消化不充分，通过400目细胞筛网为单细胞损伤一半以上的细胞量，并且消化不充分也会造成吹打次数的增加，进而导致细胞活性也大大降低；C为改进前直接分选后的细胞贴壁第二天的状态，可见获得的细胞密度小；B为改进后的方法：改良的TrypLE+0.125％胰蛋白酶消化液消化30分钟后，因不要求为单细胞，从而轻轻吹打并减少吹打次数，将细胞悬液直接贴壁2-3天，可见细胞团块单细胞能充分爬出，并且未贴壁的死细胞少，说明改良的消化液搭配后消化让细胞紧密排列的神经层组织达到松散状态，细胞容易爬出，减少死细胞发生；再收集细胞染色过400目细胞筛网后分选，可见其单细胞总量大且活性率近90％，分选收获细胞量得到大大提升；D为改进后的分选细胞，贴壁第二天的状态，可见获得的细胞密度明显增多，并且细胞以簇状生长，说明其增殖能力好。
图3为按改良消化液并且采取贴壁后再分选后的ckit+ssea4-视网膜前体细胞，分别用原培养基和改良N2B27神经干细胞培养基进行培养后各代次细胞状态的比较，A为原Lonza无血清培养基培养的状态，P1细胞就以网状为主，细胞密度增殖能力较小，培养基中悬浮死细胞较多，一般1：2传代，P3状态稍好，P5细胞状态本身还好，但可见其增殖能力明显降低；B为N2B27神经干细胞培养基培养的状态，从P1到P5都可见细胞密度较高，增殖能力好，行1：3传代，能连续传代到P10以上，本实验主要集中在P3-P5，说明改进后的培养基能将细胞维持到很好的状态，能充分满足后续实验要求。
图4为按改良消化液并且采取贴壁后再分选后的ckit+ssea4-视网膜前体细胞，分别用原培养基和改进后的培养基(N2B27神经干细胞培养基)进行培养后细胞特性的比较。通过视网膜干细胞标记物Rax的鉴定可见在培养基改进前后细胞特性并没有改变，P3细胞均保持着视网膜干细胞特性，A、B图Rax细胞在传代后第三代相似，其阳性率均接近100％，说明改进后的N2B27神经干细胞培养基能大大提高ckit+ssea4-细胞增殖能力的情况下并保持视网膜干细胞特性，其优势明显优于Lonza无血清培养基。
最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (1)
1.一种视网膜前体细胞的筛选和培养方法，其特征在于，所述方法为：
(1)取视网膜类器官并分离视网膜神经层，将视网膜神经层放入改良消化液中37℃消化30分钟，在消化15分钟后将未消化散的神经层更换另一管新鲜改良消化液，摇晃、轻轻吹打，贴壁培养2天；所述改良消化液由TrypLE消化液和0.125％胰蛋白酶组成；
(2)取出步骤(1)中贴壁培养细胞，只加入TrypLE消化液3-5分钟，收集细胞；
(3)将步骤(2)中收集的细胞用改良N2B27神经干细胞培养基培养；所述改良N2B27神经干细胞培养基包括DMEM/F12基础培养基、Neurobasal培养基、B27添加剂、N2添加剂、BFGF和KOSR血清替代物，所述DMEM/F12基础培养基和Neurobasal培养基的体积比为1：1，所述改良N2B27神经干细胞培养基中B27添加剂的质量分数为2％、N2添加剂的质量分数为1％、BFGF的终浓度为20ng/mL、KOSR血清替代物的质量分数为3％。
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