JP2018526025A - 嗅神経鞘細胞の調製方法 - Google Patents
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Abstract
Description
1.倫理的要因:中絶胎児に由来する嗅球組織の使用は倫理によって制約される場合がある;
2.細胞の純度がより低いこと:(1)広域スペクトルの細胞増殖抑制剤であるシタラビンおよび化学試薬は、線維芽細胞の成長を阻害するのと同時に嗅神経鞘細胞を阻害し、そのため、その量を決定することが困難である;(2)物理的方法は、線維芽細胞を除くときに、多数の嗅神経鞘細胞を失うことをもたらす;(3)血清含有培養培地が使用されるときには、線維芽細胞の方が、速く、かつ容易に成長する;
3.連続した継代培養ができないこと:(1)広域スペクトルの細胞増殖抑制剤としてのシタラビンおよび化学試薬は嗅神経鞘細胞の継代数に影響を及ぼす;(2)血清が基本培地として使用されるときには、嗅神経鞘細胞は無指向的に分化しやすく、また、線維芽細胞が急速に成長し、そのため、生物学的特徴を多数回の継代の後において維持することが困難である;
4.潜在的危険性の存在:同種の血清および組織試料はウイルス感染および細菌感染を受けやすく、また、拒絶反応、アレルギーまたはその他の未知の危険をもたらす傾向がある。
下記の工程を含む、嗅神経鞘細胞の調製方法:
(1)上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜に由来する単一の嗅神経鞘細胞を37℃および5%CO2の条件のもとで嗅神経鞘細胞用の培養培地において培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程;
(2)工程(1)で得られる培養上清をろ過することによって得られる前記細胞を再び嗅神経鞘細胞用の培養培地と混合し、前記細胞を37℃および5%CO2の条件のもとで培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程。
上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックを酵素により消化して、単一の細胞を得る工程
を含む。
工程1.神経栄養因子を用いて、嗅神経鞘細胞用の培養培地を調合する工程。
工程2.組織の採取:上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜組織の適量を局所麻酔下で把持する工程。
工程3.組織ブロックの前処理:把持した組織ブロックの表面の残留血液を洗い流し、前記組織ブロックを1mm3の大きさでのブロックに加工する工程。
工程4.2つの酵素の組合せによる消化:はさみで切り刻んだ前記組織ブロックを集め、2体積のコラゲナーゼIおよび中性プロテアーゼを加え、振動下、37℃での水浴において消化する工程。
工程5.初代培養:前記消化によって得られる単一の細胞を集め、前記単一の細胞を遠心分離チューブに入れ、嗅神経鞘細胞用の培養培地と十分に混合し、その後、細胞培養フラスコに接種し、37℃および5%CO2でインキュベーターにおいて培養する工程。
工程6.継代培養:前記細胞がおよそ90%にまで接着して成長したとき、継代培養される前記細胞の培養上清を集め、ろ過し、前記培養上清を嗅神経鞘細胞用の培養培地と1:3の比率で混合して、前記継代のための培養培地を調合する工程。
工程7.超低温での凍結保存:前記細胞がおよそ90%にまで接着して成長したとき、凍結保存される前記細胞の上清を集め、ろ過して、(自己血清、前記細胞培養上清、DMEM/F12およびDMSOからなる)嗅神経鞘細胞に特有の凍結保存培地を調合し、凍結保存を常法手順に従って行う工程。
工程8.分化培養:グリア細胞を分化させるための調合された培養培地(嗅神経鞘細胞用の培養培地:前記自己血清=87:13)を加え、分化培養を常法手順に従って行う工程。
嗅神経鞘細胞用の培養培地を、DMEM/DF12(Gibco)を基礎培養培地として用いて調合し、これに、20ng/ml〜60ng/mlのEGF、20ng/ml〜80ng/mlのFGF、1ml〜2mlのN2(100×)、2ml〜3mlのB27(50×)および0.1μg/mlのT3(Sigma)を最終濃度で含む培養因子を補充し、その後、培地をクリーンベンチにおいてろ過し、滅菌し、その後の使用のために4℃で保存した。
組織ブロック取得の2日前に、鼻腔を清浄化し、感染がないことを確認した;取得前に、2回の局所麻酔手術を、1.2%〜1.5%のテトラカインを含有する生理食塩水が浸された綿糸シートを、ガン型鉗子を用いて鼻腔内に挿入することによって行った(それぞれを5分間〜10分間行った);上鼻甲介および中鼻甲介の上部かつ外側1/3に近い嗅粘膜組織を、篩骨洞用の鉗子を用いて採取し、得られた組織をガラス皿に入れ、その後、ガラス皿を氷箱に入れ、氷箱を直ちに培養室に戻した。
実験室に戻した後、組織ブロックを、100U/mlのペニシリンを含有する生理食塩水により洗浄して、粘膜組織ブロックの表面の残留血液を除き、滅菌された眼科用ハサミにより、ガラス皿において大きさが1mm3のブロックに切断した。
ハサミで切り刻んだ組織ブロックを集め、これに2体積のコラゲナーゼIおよび中性プロテアーゼを加え、組織ブロックを、振動下、37℃での水浴において15分間消化し、その後、肉厚エルボ部を有するピペットを用いて繰り返しピペッッティングし、1分間にわたって自然沈降させた。上清を遠心分離チューブに移し、消化を終了させた。上記操作を3回繰り返し、その結果、組織を単一細胞懸濁物に消化することができた。消化終結後のすべての細胞懸濁物を一緒に集め、1200r/4分で遠心分離し、DMEM/F12により洗浄し、合計で3分間、1200r/4分で遠心分離した。
嗅神経鞘細胞用の培養培地を加えて、単一細胞懸濁物を調製し、これを、ポリ−L−リシンによって処理された傾斜開口部を有するプラスチック製培養フラスコに1×104細胞/mlの密度で接種し、その後、37℃および5%CO2で恒温恒湿インキュベーターにおいて培養した。
培養上清を、細胞がおよそ90%のコンフルエンスにまで成長したときに集め、0.22μmのフィルターによりろ過し、嗅神経鞘細胞用の培養培地と1:3の比率で混合して、この継代のための培養培地を調合した;細胞を集め、これに適量の継代用培地を加えて、細胞懸濁物を調製し、トリパンブルーによる染色の後、生細胞を顕微鏡で計数し、その後、再び継代した(継代細胞の密度が1×104細胞/cm3であった)。
培養上清を、細胞がおよそ90%のコンフルエンスにまで成長したときに集め、0.22μmのフィルターによりろ過して、嗅神経鞘細胞に特有の凍結保存培地を調合した(自己血清:細胞培養上清:DMEM/F12:DMSOの体積比率=5:2:2:1);凍結保存のための細胞を常法により集め、これに凍結保護剤を加え、細胞の最終密度を5×106細胞/ml〜5×107細胞/mlに調節した。細胞を4℃で60分間、そして−20℃で70分間貯蔵し、−80℃の超低温で一晩凍結保存し、その後、液体窒素タンクに入れた。
グリア細胞のための分化培地(嗅神経鞘細胞用の培養培地:自己血清の体積比率=87:13)を調合し、その後の使用のために4℃で貯蔵した。グリア細胞のための調合された分化培地を加え、分化培養を常法手順に従って行った。
Claims (9)
- 下記の工程:
(1)上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜に由来する単一の嗅神経鞘細胞を37℃および5%CO2の条件のもとで嗅神経鞘細胞用の培養培地において培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程;
(2)工程(1)で得られる培養上清をろ過することによって得られる前記細胞を再び嗅神経鞘細胞用の培養培地と混合し、37℃および5%CO2の条件のもとで培養し、前記細胞を接着させて成長させる工程
を含む、嗅神経鞘細胞の調製方法。 - 前記嗅神経鞘細胞が、ヒト嗅粘膜に由来する嗅神経鞘細胞である、請求項1に記載の方法。
- 嗅神経鞘細胞用の前記培養培地が、20ng/ml〜60ng/mlのEGF、20ng/ml〜80ng/mlのFGF、1ml〜2mlのN2(100×)、2ml〜3mlのB27(50×)および0.1μg/mlのT3(Sigma)を最終濃度で含む神経栄養因子が補充される、基礎培養培地としてのDMEM/DF12(Gibco)であり、
好ましくは、ヒト嗅粘膜に由来する嗅神経鞘細胞用の前記培養培地が、DMEM/DF12(Gibco)と、20ng/mlのEGF(Pepro Tech)、20ng/mlのFGF(Pepro Tech)、1%のN2(Gibco)、2%のB27(Gibco)およびT3(Sigma)の神経栄養因子とからなる、請求項1または2に記載の方法。 - 請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法であって、
単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックを酵素により消化して、単一の細胞を得る工程を含み;
好ましくは、単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックをコラゲナーゼIおよび中性プロテアーゼにより消化して、単一の細胞を得る工程を含み、
好ましくは、前記中性プロテアーゼが組織用のディスパーゼIIであり;
より好ましくは、単一の嗅神経鞘細胞のための前記調製方法が、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックを1mm3の大きさで、振動下、37℃での水浴においてコラゲナーゼIおよび中性プロテアーゼにより消化して、単一の細胞を得る工程(ただし、コラゲナーゼIおよび中性プロテアーゼの、上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の前記組織ブロックに対する体積比率が2:1である)を含み;
好ましくは、前記コラゲナーゼIが0.1%の濃度で使用され、かつ、前記中性プロテアーゼが0.2%の濃度で使用される、
方法。 - 前記上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜の組織ブロックが、その表面の残留血液を除くために前記消化の前に洗浄され;好ましくは、前記表面の前記残留血液が、ペニシリンおよび生理食塩水の1:1の比率での溶液によって除かれ、より好ましくは、清浄化された嗅粘膜が、培養皿において、滅菌ハサミにより、大きさが1mm3の組織ブロックに切断される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記工程(1)の培養の接種密度が1×104細胞/mlであり;好ましくは、前記細胞が90%にまで接着して成長し;
好ましくは、前記工程(2)の培養の接種密度が1×104細胞/mlであり;より好ましくは、前記細胞が90%にまで接着して成長する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。 - 請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法であって、前記調製方法がさらに、前記嗅神経鞘細胞の継代培養または凍結保存を行う工程を含み;
好ましくは、前記継代培養の期間中に、継代される前記細胞の培養上清が集められ、ろ過され、嗅粘膜由来の嗅神経鞘細胞用の培養培地と1:3の比率で混合されて、継代のための培養培地を調合し;
好ましくは、前記調製方法がさらに、前記嗅神経鞘細胞の凍結保存を行う工程を含み;好ましくは、前記凍結保存が超低温での凍結保存であり;好ましくは、超低温での前記嗅神経鞘細胞の前記凍結保存が、工程(2)における前記細胞が90%にまで接着して成長したときの前記培養上清をろ過して、嗅神経鞘細胞の前記凍結保存のための凍結保存培地を調製する工程を含み;より好ましくは、嗅神経鞘細胞用の前記凍結保存培地が、自己血清、前記培養上清、DMEM/F12およびDMSOからなり;さらに好ましくは、嗅神経鞘細胞用の前記凍結保存培地が、5:2:2:1の体積比での自己血清、前記培養上清、DMEM/F12およびDMSOからなる、
方法。 - 前記嗅神経鞘細胞の分化培養を行う工程をさらに含み、好ましくは、前記嗅神経鞘細胞の分化培養を行う前記工程が、グリア細胞を分化させるための培養培地を前記嗅神経鞘細胞に加え、分化のために培養することを含み、より好ましくは、グリア細胞を分化させるための前記培養培地が、87:13の体積比での嗅神経鞘細胞用の培養培地および自己血清からなる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 下記の工程:
工程1.神経栄養因子を用いて、嗅神経鞘細胞用の培養培地を調合する工程;
工程2.組織の採取:上鼻甲介および中鼻甲介の嗅粘膜組織の適量を局所麻酔下で集める工程;
工程3.組織ブロックの前処理:得られた組織ブロックの表面の残留血液を洗い流し、前記組織ブロックを1mm3の大きさでのブロックに加工する工程;
工程4.2つの酵素の組合せによる消化:はさみで切り刻んだ前記組織ブロックを集め、2体積のコラゲナーゼIおよび中性プロテアーゼを加え、振動下、37℃での水浴において消化する工程;
工程5.初代培養:前記消化によって得られる単一の細胞を集め、前記単一の細胞を遠心分離チューブに入れ、嗅神経鞘細胞用の培養培地と十分に混合し、その後、細胞培養フラスコに接種し、37℃および5%CO2でインキュベーターにおいて培養する工程;
工程6.継代培養:前記細胞がおよそ90%にまで接着して成長したとき、継代される前記細胞の培養上清を集め、ろ過し、前記上清を嗅神経鞘細胞用の培養培地と1:3の比率で混合して、前記継代のための培養培地を調合する工程;
工程7.超低温での凍結保存:前記細胞がおよそ90%にまで接着して成長したとき、凍結保存される細胞の上清を集め、ろ過して、(自己血清、前記細胞培養上清、DMEM/F12およびDMSOからなる)嗅神経鞘細胞に特有の凍結保存培地を調合し、凍結保存を常法手順に従って行う工程;
工程8.分化培養:グリア細胞を分化させるための調合された培養培地(嗅神経鞘細胞用の培養培地:前記自己血清=87:13)を加え、分化のための培養を常法手順に従って行う工程
を含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の調製方法。
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