CN116855442A - 皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用 - Google Patents

皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用，该皮肤类器官的构建方法包括以下步骤：S1、人源表皮细胞的提取及培养；S2、真皮细胞的培养；S3、内皮祖细胞的培养；S4、将步骤S1‑S3获得的表皮细胞、真皮细胞、内皮祖细胞混合均匀，然后采用本发明制备的培养基进行培养，获得皮肤类器官。本发明首先提供了一种皮肤类器官培养基，其能够有效提高类器官的形成效率；本发明建立了成分明确的皮肤类器官培养体系，能都在4‑5天内高效获得皮肤类器官，并且获得的皮肤类器官能促进大面积皮肤伤口的愈合，加速伤口部位的表皮化和过度增殖表皮的重塑，这将有利于功能性皮肤创伤的修复，具有广阔的应用前景。

Description

皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，特别涉及一种皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用。
背景技术
皮肤是人体的第一道防线，严重皮肤创伤会造成体液流失、感染，甚至威胁患者生命。目前皮肤创伤治疗方法存在皮源有限、免疫排异等问题。类器官有望为临床治疗皮肤创伤提供新型细胞来源，促进创面治疗领域的技术研究。由于皮肤结构复杂，包括表皮、真皮和皮肤附属器等结构，其中表皮由外胚层发育而来，属于上皮细胞，增殖活跃；而真皮由中胚层发育而来，主要包括成纤维细胞及其产生的纤维、基质等，在调控表皮及附属器的增殖和分化方面发挥重要作用，细胞类型多样、调控机制复杂导致目前皮肤类器官体系的研究仍比较薄弱。
研究表明，体外三维培养小鼠表皮干细胞能形成具有表皮类似结构的表皮类器官；体外培养汗腺干细胞能获得汗腺类似结构的汗腺类器官；而体外培养毛囊干细胞获得的也是表皮类似结构。有研究者体外将诱导多功能干细胞诱导形成外胚层细胞后，继续培养在体外获得了具有毛囊和汗腺结构的皮肤类器官。但诱导多功能干细胞具有潜在的多分化能力和致瘤性，以及培养周期长等缺点，利用成体干细胞获得皮肤类器官的方法有待进一步地开发。另有研究将表皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞在体外共培养，在血小板提取物的作用下培养获得了皮肤类器官。但是血小板提取物成分复杂，且易携带病原微生物，这种培养体系中获得的皮肤类器官难以用于在体的组织修复与再生。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种皮肤类器官培养基、皮肤类器官、其制备方法与应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：本发明的第一方面，提供一种皮肤类器官培养基，包括：基础培养基和添加在其中的生长因子，所述生长因子包括Wnt3a、IGF、VEGF和bFGF。
优选的是，所述基础培养基包括添加B27的DMEM-F12、BSA、N-Acetyl-L-cysteine、EGF、bFGF、A83-01、FSK、Penicillin-Streptomycin；
优选的是，所述生长因子的浓度具体为：50-200ng/mL的Wnt3a、10-40ng/mL的IGF、0.25-1ng/mL的VEGF和5-20ng/mL的bFGF。
本发明的第二方面，提供一种皮肤类器官的构建方法，包括以下步骤：
S1、人源表皮细胞的提取及培养；
S2、真皮细胞的培养；
S3、内皮祖细胞的培养；
S4、将步骤S1-S3获得的表皮细胞、真皮细胞、内皮祖细胞混合均匀，然后采用如上所述的培养基进行培养，获得皮肤类器官。
优选的是，按细胞数量比，表皮细胞：真皮细胞：内皮祖细胞＝1-4：0.5-2：0.5-2。
优选的是，所述步骤S1具体为：
S1-1、将人源性皮肤组织依次用碘伏、70％乙醇、PBS浸洗后，去除样本中的皮下组织，并剪成条状，表皮朝上放在消化液里，4℃消化过夜；
S1-2、将真皮与表皮分离，将表皮切块，置于胰蛋白酶中，37℃消化5分钟，吹打5分钟；用70μm的细胞过滤网过滤后，1000rpm离心5分钟，收集表皮细胞；
S1-3、按1×106个/mL单细胞悬液接种于孔板中，37℃，5％CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，每两天更换培养基；待细胞密度为80～90％时进行传代，用0.25％ EDTA的胰酶37℃消化2～5分钟后，终止并收集细胞，将2×105个/mL单细胞悬液接种于孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，每两天更换培养基，获得表皮细胞。
优选的是，所述步骤S2具体为：
S2-1、将步骤S1-2得到的与表皮分离的真皮组织切块，转移入胰蛋白酶中，37℃消化30分钟，终止消化并用70μm的细胞过滤网过滤，1000rpm离心5分钟，弃上清，收集真皮细胞；
S2-2、将步骤S2-1收集的真皮细胞用包含90wt％的DMEM和10％wt的FBS的真皮干细胞培养基制成1×106个/mL的单细胞悬液，接种于孔板中，37℃，5％ CO2培养箱中24h后，弃未贴壁细胞，PBS洗一次，后每三天更换培养基；
S2-3、待细胞密度为90～95％时进行消化传代，用0.25％ EDTA的胰酶37℃消化1～2分钟，终止消化并离心收集细胞，铺板后加入培养基重悬细胞制成2×105个/mL单细胞悬液，接种于孔板或培养瓶中，于37℃，5％ CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，获得真皮细胞。
优选的是，所述步骤S3具体为：
S3-1、取新鲜抗凝脐带血，等体积比例加入RPMI 1640培养基，轻柔混合均匀，加入适量Ficoll，2000rpm离心30分钟，取中间的白膜层，为脐带血单个核细胞；
S3-2、将脐带血单个核细胞加入含内皮细胞诱导因子VEGF、bFGF、EGF、地塞米松、10％胎牛血清的M199培养基中，放到孔板中培养，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，1-4周后出现内皮祖细胞克隆，挑取单个克隆，进行扩增培养，获得内皮祖细胞。
本发明的第三方面，提供一种皮肤类器官，其通过如上所述的方法构建得到。
本发明的第四方面，提供一种如上所述的皮肤类器官在制备治疗皮肤创伤的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明首先提供了一种皮肤类器官培养基，其能够有效提高类器官的形成效率；本发明建立了成分明确的皮肤类器官培养体系，能都在4-5天内高效获得皮肤类器官，并且获得的皮肤类器官能促进大面积皮肤伤口的愈合，加入伤口部位的表皮化和过度增殖表皮的重塑，这将有利于功能性皮肤创伤的修复，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明中提取的表皮、真皮和内皮细胞的原代培养图；
图2为不同生长因子组合条件下皮肤类器官的形成效率测试结果；
图3为皮肤类器官中不同种类细胞的分布；
图4为实施例2制备的皮肤类器官治疗急性大面积皮肤损伤的测试结构；
图5为移植皮肤类器官对皮肤创伤表皮再生的影响的测试结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
下列实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下列实施例中所用的材料试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下列实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种皮肤类器官培养基，包括：基础培养基和添加在其中的生长因子，所述基础培养基包括添加B27(50×)的DMEM-F12、BSA(0.1wt％)、N-Acetyl-L-cysteine(1.25μM)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)、A83-01(1μM)、FSK(10μM)、Penicillin-Streptomycin(100U/ml)；所述生长因子包括50-200ng/mL的Wnt3a、20ng/mL的IGF、0.5ng/mL的VEGF和10ng/mL的bFGF。
实施例2
一种皮肤类器官及其构建方法，该方法包括以下步骤：
S1、人源表皮细胞的提取及培养：
S1-1、将人源性皮肤组织依次用碘伏、70％乙醇、PBS浸洗后，去除样本中的皮下组织，并剪成条状，表皮朝上放在消化液里，4℃消化过夜；
S1-2、小心将真皮与表皮分离，用手术刀将表皮切成长约1mm小块，置于胰蛋白酶中，37℃消化5分钟，吹打5分钟；用70μm的细胞过滤网过滤后，1000rpm离心5分钟，收集表皮细胞；
S1-3、按1×106个/mL单细胞悬液接种于6孔板中，37℃，5％CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，每两天更换培养基；待细胞密度为80～90％，细胞增殖状态良好，呈紧密的铺路石状时进行传代，用0.25％ EDTA的胰酶37℃消化2～5分钟后，终止并收集细胞，将2×105个/mL单细胞悬液接种于孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，每两天更换培养基，获得表皮细胞。
细胞冻存时，用细胞冻存液(70％ DMEM+20％ FBS+10％ DMSO)制备1×106个/mL的单细胞悬液，每个冻存管中加入1mL的单细胞悬液，标记后放入程序降温盒中，转移至-80℃冰箱过夜冻存，48小时后移植液氮罐中长期保存。复苏时将细胞从液氮中取出后迅速置于37℃的水浴锅中融化(约2分钟)，将细胞悬液转移至预热的培养基中，1000rpm，离心3分钟，收集细胞并进行培养。
S2、真皮细胞的培养：
S2-1、将步骤S1-2得到的与表皮分离的真皮组织用手术剪刀剪成长约1mm的小块，转移入胰蛋白酶中，37℃消化30分钟，终止消化并用70μm的细胞过滤网过滤，1000rpm离心5分钟，弃上清，收集真皮细胞；
S2-2、将步骤S2-1收集的真皮细胞用包含90wt％的DMEM和10％wt的FBS的真皮干细胞培养基制成1×106个/mL的单细胞悬液，接种于24孔板中，3℃，5％ CO2培养箱中24h后，弃未贴壁细胞，PBS洗一次，后每三天更换培养基；
S2-3、待细胞密度为90～95％，细胞排布呈放射状、或漩涡状，细胞状态良好时进行消化传代，用0.25％ EDTA的胰酶37℃消化1～2分钟，终止消化并离心收集细胞，铺板后加入培养基重悬细胞制成2×105个/mL单细胞悬液，接种于6孔板或培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，获得真皮细胞。冻存和复苏方法同上述表皮细胞。
S3、内皮祖细胞的培养：
S3-1、取4ml新鲜抗凝脐带血，等体积比例加入RPMI1640培养基，轻柔混合均匀，加入4ml Ficoll，2000rpm离心30分钟，取中间的白膜层，为脐带血单个核细胞；
S3-2、将脐带血单个核细胞加入含内皮细胞诱导因子VEGF、bFGF、EGF、地塞米松、10％胎牛血清的M199培养基中，放到六孔板中培养，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，大约两周后出现内皮祖细胞克隆，挑取单个克隆，进行扩增培养，获得内皮祖细胞。
参照图1，为提取的表皮、真皮和内皮细胞的原代培养图。
S4、取步骤S1-S3获得的2.5×105个表皮细胞、1.25×105个真皮细胞、1.25×105个内皮祖细胞混合均匀，即细胞数量比，表皮细胞：真皮细胞：内皮祖细胞＝2：1：1，加入到低吸附六孔板中，采用实施例1培养基进行培养，获得皮肤类器官。
本实施例中，为研究各类生长因子对类器官形成效率的影响，设置了若干对比，在对比中仅添加部分生长因子，其中，W表示添加100ng/ml的Wnt3a，I表示添加20ng/ml的IGF，V表示添加0.5ng/ml的VEGF，F表示添加10ng/ml的bFGF；每天更换一半体积的培养基，并利用倒置显微镜对自组装类器官拍照，绘制类器官的生长曲线，获得类器官的最优培养体系。
将从表皮、内皮、成纤维细胞按照2:1:1的比例混合，并在低吸附细胞培养板上进行培养，不同培养条件下，三种细胞形成皮肤类器官的效率不同。参照图2，为不同生长因子组合条件下皮肤类器官的形成效率测试结果，图2(A)为不同生长因子组合条件下皮肤类器官的生长情况，比例尺，100μm；图2(B)不同培养条件下皮肤类器官的生长曲线。在仅含有IGF(I)、VEGF(V)、bFGF(F)，而不加入Wnt(W)的培养条件下，三种细胞几乎不能形成皮肤类器官。在只含有Wnt(W)的培养条件下，三种细胞能形成皮肤类器官，但体积较小，说明Wnt(W)的培养条件下，是形成皮肤类器官的必要因子。VEGF(V)的加入能增加皮肤类器官的体积，而IGF(I)和bFGF(F)的加入能进一步提高类器官的形成效率，在培养约96h后，类器官达到最大体积(图2)。
分别用DiO染料标记表皮(紫色)、内皮(绿色)和成纤维细胞(红色)，培养4-5天后，收集皮肤类器官制备冰冻切片，并在荧光显微镜下观察三种细胞在皮肤类器官中的分布情况。参照图3，为皮肤类器官中不同种类细胞的分布，结果显示，在仅含有IGF(I)、VEGF(V)、bFGF(F)，无Wnt(W)存在时，不能形成有结构的皮肤类器官。而在仅有Wnt(W)存在时，也不能形成有结构的皮肤类器官。在VEGF(V)和Wnt(W)存在时，能形成表皮分布于外圈的结构，但成纤维细胞分布不规律。而在IGF(I)、VEGF(V)、bFGF(F)，Wnt(W)都存在的培养条件下获得的皮肤类器官中，表皮细胞呈层状分布，位于皮肤类器官中的外圈；成纤维细胞位于皮肤类器官的内圈；内皮细胞也位于皮肤类器官的内圈，并与成纤维细胞共存，具有与正常皮肤相似的规则的细胞分层排布。
实施例3
1、对实施例2制备的皮肤类器官进行治疗急性大面积皮肤损伤的效果检测
取8-12周龄的BABL/C小鼠，用剃毛刀剃去小鼠背部的背毛，再用脱毛膏去掉短的绒毛，用含70％乙醇的无纺布擦净多余的脱毛膏及绒毛。超净工作台中在小鼠背部上方和下方分别制作两个直径为8mm的皮肤全层切除的伤口模型。将小鼠被随机分成三组，分别将单个细胞组合(2D，Cell)、类器官(3D,Organoids)重悬在50％基质胶/PBS中，并移植到伤口上，以不含细胞的50％基质胶/PBS(Control)处理的伤口作为对照组。在治疗后第0、4、7、10、14、17和21天观察和记录伤口愈合情况，并用ImageJ软件测量和分析伤口大小。
参照图4，为实施例2制备的皮肤类器官治疗急性大面积皮肤损伤的测试结构，图4(A)为细胞混合物、皮肤类器官及无细胞对照组治疗后，皮肤创伤的愈合情况；图4B为基于创伤面积计算的各组伤口的愈合率。结果显示在治疗后0-14天内，皮肤类器官治疗组(Organoids)伤口面积显著小于对照组(Control)和细胞组(Cell)，表明类器官(Organoids)能促进伤口愈合。
2、皮肤创伤愈合过程中的组织学检测(H&E染色)
取以上小鼠皮肤伤口组织，加入到10倍组织体积的4％的多聚甲醛中，4℃，固定24小时。将固定后的组织依次放置于70％乙醇(2小时)，80％乙醇(1小时)，95％乙醇I(30分钟)，95％乙醇II(30分钟)，100％乙醇I(45分钟)，100％乙醇II(45分钟)中脱水后，转移到二甲苯中，直至组织透明。石蜡包埋后切取5-10μm厚度的组织薄片。取石蜡切片脱蜡和水化后，放到苏木精溶液中染色5分钟，水洗，分化液分化30秒，水洗，加入尹红溶液染色30秒-1分钟，水洗脱水后，封片，并在显微镜下观察拍照观察。
参照图5，为移植皮肤类器官对皮肤创伤表皮再生的影响的测试结果，图5(A)为移植后7天，14天，21天，H&E检测对照组、2D细胞混合组、3D皮肤类器官组治疗后伤口的组织学变化；图5(B)为统计学分析不同处理组伤口修复过程中，表皮厚度的变化情况(n＝5)。结果显示，治疗后第7天时，三组伤口边缘处角质细胞均开始增殖迁移；治疗后第14天时，三组伤口基本完成上皮化，3D类器官组再生表皮最厚，显著高于2D细胞组和对照组，2D细胞组再生表批厚度亦高于对照组，对照组再生表皮最薄；而到治疗后第21天时，3D类器官组表皮最薄，显著低于2D细胞组和对照组(Control)，2D细胞组表皮厚度显著低于对照组，对照组再生表皮最厚(图5A，5B)。上述结果表明，3D类器官处理加速了伤口处的表皮化，并在完成表皮化后，最先进入重塑阶段，形成与正常皮肤相近的表皮结构。
实施例4
本实施例提供一种实施例2的皮肤类器官在制备治疗皮肤创伤的药物中的应用。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (10)

1.一种皮肤类器官培养基，其特征在于，包括：基础培养基和添加在其中的生长因子，所述生长因子包括Wnt3a、IGF、VEGF和bFGF。
2.根据权利要求1所述的皮肤类器官培养基，其特征在于，所述基础培养基包括添加B27的DMEM-F12、BSA、N-Acetyl-L-cysteine、EGF、bFGF、A83-01、FSK、Penicillin-Streptomycin。
3.根据权利要求2所述的皮肤类器官培养基，其特征在于，所述生长因子的浓度具体为：50-200ng/mL的Wnt3a、10-40ng/mL的IGF、0.25-1ng/mL的VEGF和5-20ng/mL的bFGF。
4.一种皮肤类器官的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、人源表皮细胞的提取及培养；
S2、真皮细胞的培养；
S3、内皮祖细胞的培养；
S4、将步骤S1-S3获得的表皮细胞、真皮细胞、内皮祖细胞混合均匀，然后采用如权利要求1-3中任意一项所述的培养基进行培养，获得皮肤类器官。
5.根据权利要求4所述的皮肤类器官的构建方法，其特征在于，按细胞数量比，表皮细胞：真皮细胞：内皮祖细胞＝1-4：0.5-2：0.5-2。
6.根据权利要求4所述的皮肤类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S1具体为：
S1-1、将人源性皮肤组织依次用碘伏、70％乙醇、PBS浸洗后，去除样本中的皮下组织，并剪成条状，表皮朝上放在消化液里，4℃消化过夜；
S1-2、将真皮与表皮分离，将表皮切块，置于胰蛋白酶中，37℃消化5分钟，吹打5分钟；用70μm的细胞过滤网过滤后，1000rpm离心5分钟，收集表皮细胞；
S1-3、按1×106个/mL单细胞悬液接种于孔板中，37℃，5％CO2培养24h后，去除未贴壁细胞，每两天更换培养基；待细胞密度为80～90％时进行传代，用0.25％EDTA的胰酶37℃消化2～5分钟后，终止并收集细胞，将2×105个/mL单细胞悬液接种于孔板中，于37℃，5％CO2培养箱中继续培养，每两天更换培养基，获得表皮细胞。
7.根据权利要求4所述的皮肤类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S2具体为：
S2-1、将步骤S1-2得到的与表皮分离的真皮组织切块，转移入胰蛋白酶中，37℃消化30分钟，终止消化并用70μm的细胞过滤网过滤，1000rpm离心5分钟，弃上清，收集真皮细胞；
S2-2、将步骤S2-1收集的真皮细胞用包含90wt％的DMEM和10％wt的FBS的真皮干细胞培养基制成1×106个/mL的单细胞悬液，接种于孔板中，37℃，5％CO2培养箱中24h后，弃未贴壁细胞，PBS洗一次，后每三天更换培养基；
S2-3、待细胞密度为90～95％时进行消化传代，用0.25％EDTA的胰酶37℃消化1～2分钟，终止消化并离心收集细胞，铺板后加入培养基重悬细胞制成2×105个/mL单细胞悬液，接种于孔板或培养瓶中，于37℃，5％CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，获得真皮细胞。
8.根据权利要求4所述的皮肤类器官的构建方法，其特征在于，所述步骤S3具体为：
S3-1、取新鲜抗凝脐带血，等体积比例加入RPMI1640培养基，混合均匀，加入Ficoll，2000rpm离心30分钟，取中间的白膜层，为脐带血单个核细胞；
S3-2、将脐带血单个核细胞加入含内皮细胞诱导因子VEGF、bFGF、EGF、地塞米松、10％胎牛血清的M199培养基中，放到孔板中培养，于37℃、5％CO2培养箱中培养，每三天更换培养基，1-4周后出现内皮祖细胞克隆，挑取单个克隆，进行扩增培养，获得内皮祖细胞。
9.一种皮肤类器官，其特征在于，其通过如权利要求4-8中任意一项所述的方法构建得到。
10.一种如权利要求9所述的皮肤类器官在制备治疗皮肤创伤的药物中的应用。
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CN117343904A (zh) * 2023-10-17 2024-01-05 赛领生物科技(南京)有限公司 一种瘢痕疙瘩类器官培养基及培养方法
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