JP6425319B2 - 複数の再生毛包原基の製造方法、毛包組織含有シートの製造方法、毛包組織含有シート及び培養基板の使用 - Google Patents
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Description
本願は、2015年10月30日に、日本に出願された特願2015−214547号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
[1]規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら混合培養することにより、前記微小凹部内に毛髪再生能を有する毛包原基を形成させる工程を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなり、前記微小凹部1つあたりに播種される前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の合計細胞数が4.0×10 3 cells以上1.28×10 5 cells以下であることを特徴とする複数の再生毛包原基の製造方法。
[2]Wntシグナル活性化剤を用いない、[1]に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
[3][1]又は[2]に記載の製造方法で得られた複数の再生毛包原基を、前記微小凹部内に保持された状態で、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備えることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
[4]前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下である、[3]に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
[5][3]又は[4]に記載の製造方法で得られた毛包組織含有シートであって、毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的に配置されており、前記毛包原基の密度が20個/cm 2 以上500個/cm 2 以下であることを特徴とする毛包組織含有シート。
[6]さらに、前記毛包原基が毛包を形成している、[5]に記載の毛包組織含有シート。
[7]前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、[5]又は[6]に記載の毛包組織含有シート。
[8]前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、[7]に記載の毛包組織含有シート。
[9]複数の毛髪再生能を有する再生毛包原基を製造するための培養基板の使用であって、前記培養基板は、規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版を備え、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなり、前記培養基板の少なくとも上面及び底面から前記微小凹部に含まれる間葉系細胞及び上皮系細胞に対して酸素を供給しながら混合培養する前記培養基板の使用。
[10]前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンである、[9]に記載の使用。
[11]前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下である、[9]又は[10]に記載の使用。
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる工程を備える、再生毛包原基の集合体の製造方法を提供する。
本明細書において、「上皮系細胞」とは、上皮組織由来の細胞及びその細胞を培養して得られる細胞を意味する。例えば、バルジ領域の外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、万能細胞万能細胞(例えば、胚性幹(ES)細胞、胚性生殖(EG)細胞、人工多能性(iPS)幹細胞等)から誘導された毛包上皮系細胞等が挙げられる。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
本明細書において、「毛包」とは、表皮が内側に筒状に入り込んだ部分であって、毛を産生する皮膚の付属器官を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基」とは、例えば、本実施形態の製造方法等により作製された毛包原基を意味する。
本明細書において、「再生毛包原基の集合体」とは、上述の再生毛包原基が複数集まった状態のものを意味する。本実施形態の製造方法では、簡便に、複数の上述の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した再生毛包原基の集合体を得ることができる。また、再生毛包原基の集合体は毛包原基が分化し、毛包を形成していてもよい。
これに対し、本発明者らは、間葉系細胞及び上皮系細胞の懸濁液を一緒に播種し、本実施形態の製造方法を用いて共培養することにより、簡便に、複数の毛包原基が哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で規則的に整列した再生毛包原基の集合体を得ることに初めて成功した。
毛包原基を形成させる際に使用するマイクロ凹版は、複数の微小凹部が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版は、市販のものを用いてもよいし、後述の実施例1の方法等で作製してもよい。また、マイクロ凹版における微小凹部の密度は、20個/cm2以上500個/cm2以下であることが好ましく、50個/cm2以上250個/cm2以下であることがより好ましく、100個/cm2以上200個/cm2以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された状態で培養することができる。後述するとおり、この規則的な配置且つ高密度の毛包原基をそのままの配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植することで、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、混合スフェロイドを収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば、20μm以上1mm以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、1mm以下であってよい。
得られる毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版の微小凹部の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版の微小凹部を調製すればよい。
まず、間葉系細胞及び上皮系細胞を上述のマイクロ凹版に播種する。続いて、酸素を供給しながら混合培養することにより、毛包原基を形成させる。このとき、播種する細胞が多いほど、毛包原基の形成効率が高く、毛包原基の大きさも大きくなるが、播種する細胞数はマイクロ凹版の微小凹部の大きさに応じて適宜調整すればよい。培養時間は、1日以上5日以下(好ましくは、3日)であってよく、培養温度は25℃以上40℃未満(好ましくは、37℃)であってよい。
一実施形態において、本発明は、間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的且つ哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で配置されている、毛包組織含有シートを提供する。
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、前記微小凹部内に形成された毛包原基を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程と、を備える、毛包組織含有シートの製造方法を提供する。
毛包組織含有シートを製造する際に使用するマイクロ凹版3は、上述のとおり、複数の微小凹部4が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版3は、市販のものを用いてもよいし、後述の実施例1の方法等で作製してもよい。また、マイクロ凹版3における微小凹部4の密度は、20個/cm2以上500個/cm2以下であることが好ましく、50個/cm2250個/cm2以下であることがより好ましく、100個/cm2200個/cm2以下であることがさらに好ましい。密度が上記範囲であることにより、哺乳動物の毛穴の密度と同程度の密度で毛包原基が配置された毛包組織含有シートを得ることができる。
微小凹部の開口部の直径及び深さについて、間葉系細胞1及び上皮系細胞2の混合スフェロイドを収容し培養できる大きさであれば特別な限定はないが、直径については、哺乳動物の毛穴と同程度の大きさであってよく、例えば、20μm以上1mm以下であってよい。また、深さについては、毛包組織含有シートの移植後の被験動物の皮膚への定着の観点から、1mm以下であってよい。
得られる毛包組織含有シートにおける毛包原基の配置及び大きさは、マイクロ凹版3の微小凹部4の開口形状、直径及び深さ等に依存するため、被験動物の種類、移植する部位等に合わせて、適宜マイクロ凹版3の微小凹部4を調製すればよい。
これらの材質を単独で使用してもよいし、組み合わせて使用してもよい。
上述の<再生毛包原基の集合体の製造方法>と同様に、まず、間葉系細胞1及び上皮系細胞2の混合スフェロイドを、マイクロ凹版3に播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる。このとき、播種する細胞が多いほど、毛包原基の形成効率が高く、毛包原基の大きさも大きくなるが、播種する細胞数はマイクロ凹版3の微小凹部4の大きさに応じて適宜調整すればよい。培養時間は、1日以上5日以下(好ましくは、3日)であってよく、培養温度は25℃以上40℃未満(好ましくは、37℃)であってよい。
細胞の由来として、好ましくは、動物由来細胞であり、より好ましくは脊椎動物由来細胞であり、特に好ましくはヒト由来細胞である。
続いて、培地を除去して、生体適合性ハイドロゲルを含む溶液を添加して、生体適合性ハイドロゲルをゲル化させる。溶液中の生体適合性ハイドロゲルの濃度は、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。また、ゲル化させるための時間についても、必要とするゲルの硬さに応じて、適宜調整することができる。ゲル化させる温度等の条件については、特別な限定はなく、例えば37℃のC02インキュベーター内で培養する方法等が挙げられる。
続いて、マイクロ凹版から毛包原基を含むゲル化した生体適合性ハイドロゲルを取り外すことで、毛包組織含有シートが得られる。
支持体の材質としては、移植後に、毛包原基の上皮系細胞側の部分と被験動物側の上皮系細胞との連結を促進させることができるものであれば、特別な限定はない。例えば、ナイロン等のポリマーや合成又は天然の生体吸収可能なポリマーより作られた繊維、ステンレス等の金属繊維、炭素繊維、及びガラス繊維等の化学繊維、並びに天然の動物繊維(生体由来の毛髪等)や植物繊維等を挙げることができ、より具体的には、ナイロン糸やステンレス線等を挙げることができる。支持体の直径及び長さは、再生対象となる部分により適宜設計することができる。直径は、例えば、5μm以上100μm以下であってよく、20μm以上50μm以下であってよい。また、長さは、例えば、1mm以上10mm以下であってよく、4mm以上6mm以下であってよい。
一実施形態において、本発明は、規則的な配置の微小凹部からなるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる工程と、前記毛包原基を前記微小凹部の規則的な配置を保ちながら、被験動物の毛包欠損部に移植する工程と、を備える再生毛包原基の集合体の移植方法を提供する。
上述の<再生毛包原基の集合体の製造方法>と同様に、間葉系細胞及び上皮系細胞の混合スフェロイドを、マイクロ凹版に播種し、混合培養することにより毛包原基を形成させる。
規則的な配置の微小凹部内において形成された毛包原基を、例えば、上述の微小凹部と同様の規則的な配置である複数のチップ、ニードル又はノズルを有するマルチピペットを用いて吸引する。続いて、被験動物の毛包欠損部に規則的な配置のまま毛包原基を移植する。規則的な配置を保つことにより、正常な毛包組織の配置をより正確に再現した毛包組織を再生することができる。マルチピペットは手動のものでも、全自動のものでもよい。
本実施形態の毛包組織含有シートは、当業者に公知の方法で対象となる部位に移植することができる。例えば、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。
本実施形態の毛包組織含有シートの大きさは、被検動物(ヒト又は非ヒト動物を含む各種哺乳動物、好ましくはヒト)の年齢、性別、症状、治療部位、治療時間等を勘案して適宜調節される。
本実施形態の毛包組織含有シートにおいて、皮膚接合用のテープやバンド、縫合等により、毛包組織含有シートと移植対象部位とを固定してもよい。
又は、支持体が、自然と移植部位より抜けるまで放置することもできる。生体吸収性の材料の支持体は、自然と移植部位より抜けるか、分解又は吸収されるまで放置することができる。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための再生毛包原基の集合体を提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛包組織含有シートを提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための再生毛包原基の集合体の製造方法を提供する。
また、本発明の一側面は、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療のための毛包組織含有シートの製造方法を提供する。
また、本発明の一側面は、治療的に有効量の毛包組織含有シートを含む医薬組成物を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を製造するための上記再生毛包原基の集合体の使用を提供する。
また、本発明の一側面は、前記医薬組成物を含む、毛包再生治療剤を製造するための上記毛包組織含有シートの使用を提供する。
また、本発明の一側面は、上記毛包組織含有シートの有効量を、治療を必要とする患者に移植することを含む、疾患や事故等による表皮の欠損又は脱毛等の毛髪欠損部位の治療方法を提供する。
また、適用可能な疾患としては、脱毛を伴う任意の疾患であって、例えば男性型脱毛症(Androgenetic Alopecia:AGA)、女子男性型脱毛症(Female Androgenetic Alopecia:FAGA)分娩後脱毛症、びまん性脱毛症、脂漏性脱毛症、粃糠性脱毛症、牽引性脱毛症、代謝異常性脱毛症、圧迫性脱毛症、円形脱毛症、神経性脱毛症、抜毛症、全身性脱毛症、症候性脱毛症等が挙げられ、これらに限定されない。
(1)マイクロ凹版の作製
マイクロ凹版の作製方法の概略図を図2Aに示す。具体的には、CADソフト(V Carve Pro 6.5)を用いて、作製するマイクロ凹版のパターンをコンピューターで設計した。続いて、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した(工程(I))。この凹鋳型にエポキシ樹脂(クリスタルリジン:日新レジン社製)を流しこみ(工程(II))、1日硬化させた後(工程(III))、離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した(工程(IV))。続いて、形成した凸鋳型を6cmディッシュ底面に固定し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を流し込み(工程(V))、固化した(工程(VI))。続いて、離型することで、PDMSに規則的なパターンが形成されたマイクロ凹版を作製した(工程(VII))。なお、マイクロ凹版のパターンデザインは、日本人の頭髪の平均毛包密度に合わせて作製した。作製したマイクロ凹版を図2Bに示す。高さ1cm、2×2cm四方の容器の底面に直径約1mm、高さ500μmのウェルが約100ウェル/cm2の密度で配置された容器を形成した。
胎齢18日のC57BL/6マウスから上皮系細胞及び間葉系細胞を採取した。続いて、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を1mL(1×104cells/ウェル)加え、3日間培養した。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium;DMEM)(10%ウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum;FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)含有)とHuMedia−KG2培地(倉敷紡績社製)を1:1で混合した培地(以下、「DMEM−KG2混合培地」とも呼ぶ。)を用いた。培地交換は毎日行った。
マイクロ凹版にて形成された毛包原基のコラーゲンゲルへの転写方法の概略図を図3の(A)に示す。毛包原基が形成されたマイクロ凹版(工程[a])から培地を除き、4℃で30分冷却したコラーゲンゲル溶液(新田ゼラチン社製)を1mL加え、滅菌ガーゼを支持体としてゲル内に包埋した(工程[b])。続いて、シーソー型攪拌機で撹拌しながら、4℃で50分間、ゲルをならした。続いて、CO2インキュベーターにて37℃で40分間静置した。さらに、DMEM−KG2混合培地を加え、CO2インキュベーターにて37℃で1時間培養した。続いて、容器の端をつつくようにしてゲルをはがすことで、毛包原基の規則的な配置を保ったままコラーゲンゲルに転写して、マウス毛包組織含有シートを作製した(工程[c])。工程[a]〜[c]でのコラーゲンゲルを位相差顕微鏡で観察した結果を図3の(B)に示す。図3の(B)において、黒矢頭は毛包原基を示している。
(1)マウス毛包組織含有シートの移植
ヌードマウス(ICR nu/nuマウス、5週齢)の皮膚に移植創を作製した。続いて、実施例1において作製したマウス毛包組織含有シートを移植部に合わせてトリミングし、ヌードマウスの皮膚に挿入した。移植から14日後の再生毛髪の様子を図4に示す。
移植部から発毛が確認され、毛髪は規則的に1〜3mmピッチで発毛した。さらに、移植した毛包原基は組織内に定着し、毛周期(発毛→脱毛→発毛)を繰り返した。
以上のことから、移植したマウス毛包組織含有シートは、正常な毛包を形成していることが確認された。
(1)マイクロ凹版の作製
実施例1(1)と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
妊娠マウス(C57BL/6jjcl、妊娠2週間目)から間葉系細胞を1.5×107cells、上皮系細胞を1.5×106cells採取した。続いて、間葉系細胞を含む懸濁液1mLにVybrant(登録商標) Cell−labelling Solutions(Molecular probes社製)を5μL加え、20分間培養して、細胞を染色した。続いて、遠心分離を行い、上清を除去後、DMEM−KG2混合培地を加え、間葉系細胞及び上皮系細胞を表1に示す細胞密度でマイクロ凹版に播種した。
培養中の間葉系細胞及び上皮系細胞の混合細胞集塊(以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。)について、培養開始から1、2、3日目に位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。
培養開始から1日目の細胞の明視野での観察結果を図5Aに、培養開始から1日目及び3日目の暗視野での観察結果を図5Bに示す。
培養開始から1、2、3日目の混合スフェロイドを4%パラホルムアルデヒド固定液に1時間漬けて固定した。続いて、DAPI(4’,6−diamidino−2−phenylindole)染色液(WAKO社製)を添加し、10分間インキュベーションして、核を染色した。染色された混合スフェロイドを、位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。培養開始から3日目の暗視野での観察結果を図5Cに示す(「Microscope」と記載されている画像である)。図5Cにおいて、NucleiとはDAPIにより青色に染色された核を示し、DermalとはVybrant(登録商標) Cell−labelling Solutionsにより赤色に染色された間葉系細胞を示す。
培養開始から1、2、3日目の混合スフェロイドをクエン酸アセトン固定液に30秒漬けて固定した。続いて、Fast blue RR salt(Sigma社製)とナフトールAS−BS(Sigma社製)の混合液を添加し、30分間インキュベーションして、アルカリホスファターゼ(alkaline phosphatase;ALP)を染色した。染色された混合スフェロイドを、位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。培養開始から3日目の明視野での観察結果を図5Cに示す(「ALP」と記載されている画像である)。
培養開始から1、2、3日目の混合スフェロイドを4%パラホルムアルデヒド固定液に1時間漬けて固定した。続いて、エタノールを添加し、脱水させた後に、t−ブタノールに置換した。続いて、凍結乾燥させた後に、走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope;SEM)で観察した。培養開始から3日目の観察結果を図5Cに示す(「SEM」と記載されている画像である)。
培養開始から3日目の混合スフェロイドをヌードマウス(ICR nu/nuマウス、5週齢)の皮下に直接注入し、移植した。移植から14日目のヌードマウスの様子を図6Aに、21日目のヌードマウスの様子を図6Bに示す。また、移植から18日目のヌードマウスの移植部あたりの毛髪の再生本数(図7A参照)と再生効率(=発毛部/移植部×100(%))(図7B参照)を示したグラフを図7A及び図7Bに示す。さらに、移植から18日目、30日目、42日目、57日目のヌードマウスの移植部の様子を図8に示す。図8において、D18は移植から18日目、D30は移植から30日目、D42は移植から42日目、D57は移植から57日目を示す。
図5A及び図5Bから、培養開始から1日目において、赤い蛍光で示された間葉系細胞は上皮系細胞を覆うように局在化し、培養開始から3日目において、上皮系細胞と間葉系細胞はそれぞれ分離し、それぞれが重なりあった毛包原基構造を形成したことが確かめられた。
図5Cから、培養開始から1日目において、混合スフェロイドはそれぞれ上皮−間葉の2極化した構造を形成し、細胞数が小さくなるほど、2つの球が密着したような構造を形成することが確かめられた。また、ALP染色の結果から、細胞数に関わらず、間葉系細胞が紫色に染色された。
以上のことから、混合スフェロイドを構成する間葉系細胞は毛乳頭細胞に分化し、毛包形成及び毛幹新生を開始し始めていることが示唆された。また、今回作製した混合スフェロイドは毛幹新生能を持つ、「再生能力の高い毛乳頭」を形成していることが示された。
図6Bから、移植後21日目において、黒ずんだ部分から発毛が観察されることが確かめられた。
図7A及び図7Bから、細胞数が大きい移植体ほど移植部から生える本数が多く、再生効率が高い傾向にあることが確認された。
図8から、移植した混合スフェロイドから発毛した毛は毛周期を繰り返すことが示された。また、毛周期は生体とほぼ同様の3週間程度で繰り返されることが確かめられた。
(1)再生毛包の染色
作製した混合スフェロイドが生体と同様の構造を持つ毛包を形成しているかを確認するために、毛包上皮幹細胞に特異的に発現するCD34と毛乳頭細胞が産生するVersicanを凍結切片の免疫組織化学染色により染色した。具体的な染色方法について、以下に説明する。
実施例2(2)と同様の方法を用いて作製された混合スフェロイドを、実施例2(3)と同様の方法を用いてヌードマウスに移植した。移植後18日目のヌードマウスの移植部の皮膚を切り出した。続いて、20%ホルマリン(Wako社製)に1日浸漬することで、組織の固定を行った。続いて、10%、20%、30%スクロース溶液(Wako社製のスクロースを希釈して調製した溶液)にそれぞれ1時間ずつ浸した。スクロース置換した切片を凍結組織切片作製用包埋剤(Optimal Cutting Temperature Compound:O.C.T Compound)(サクラファインテック社製)を静かに流し込み、混合スフェロイドを封入した。続いて、クライオミクロトームを用いて微小の厚さにカットした。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。
得られたスライドガラスにキシレンを1mL滴下し30分間静置した後、溶液を除去した。続いて、キシレンを1mL滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、90%エタノール溶液を1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、70%エタノール溶液を1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、蒸留水を1mL滴下し3分間静置した後、蒸留水を除去した。続いて、マイヤー・ヘマトキシリン染色液を1mL滴下し3分間静置した後、溶液を除去した。続いて、流水に13分間浸し、洗い流した。続いて、エマシンYを1mL滴下し4分間静置した後、溶液を除去した。続いて、90%エタノール溶液を1mL滴下し1分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノール溶液を1mL滴下し1分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。続いて、100%エタノールを1mL滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。続いて、キシレンを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。最後に、キシレンを1mL滴下し、同じ操作をもう一度繰り返した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック(封入剤)を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図9の(A)に示す。
得られたスライドガラスにPBSを1mL滴下し5分静置した後、溶液を除去した(洗浄)。続いて、PBSを1mL滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。続いて、5%スキムミルク含有ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Dulbecco’s Phosphate−Buffered Saline:D−PBS)を200μL滴下し、30分間静置し、ブロッキングを行った。続いて、D−PBSで20μg/mLとなるように希釈した、ラットに免疫したマウスCD34抗体(Abcam社製)又はウサギに免疫したマウスVersican抗体(Millipore社製)を一次抗体としてスライドガラスに1mL滴下し、4℃で一晩インキュベートした。続いて、0.1%Tween−20含有PBS(PBS−T)を1mL滴下し10分間静置した後、溶液を除去した(洗浄)。同じ操作を2回繰り返して、洗浄を行った。D−PBSで20μg/mLに希釈したウサギ抗ラットIgG抗体(ライフテクノロジー社製)又はヤギ抗ウサギIgG抗体を二次抗体として、スライドガラスに200μL滴下し、アルミホイルで覆い、1時間常温でインキュベートした。続いて、0.1%Tween−20含有PBS−Tを1mL滴下し10分間静置した後、溶液を除去した(洗浄)。同じ操作を2回繰り返し、洗浄を行った。続いて、PBSで10ng/mLに希釈したDAPI(4’,6−Diamidino−2−phenylindole)溶液をスライドガラスに200μL滴下し、9分間インキュベーションすることで、核染色を行った。続いて、PBSを1mL滴下し5分静置した後、溶液を除去した(洗浄)。続いて、PBSを1mL滴下し、同じ操作をもう一度行い、洗浄した。スライドガラスが乾いたら、マウントクイック(封入剤)を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図9の(B)(マウスVersican抗体)及び図9の(C)(マウスCD34抗体)に示す。図9の(C)において、バルジ領域とは、毛を作る「毛包幹細胞」と、色素を作る「色素幹細胞」が存在する部分であり、毛乳頭への発毛指令を司る部分である。
図9の(A)から、毛包のないヌードマウスの皮下に毛組織が新たに形成されたことが確認できた。
図9の(B)及び図9の(C)から、Versicanは毛球部、CD34はバルジ領域に発現しており、実際の毛包と同様の位置に毛の幹細胞群が存在することが確認できた。
以上のことから、混合スフェロイドは生体と同等の毛包を再生できることが示唆された。
実施例1(1)で作製した酸素透過性の高いマイクロ凹版(以下、「Oxychip」とも呼ぶ。)と、実施例1(1)で作製したマイクロ凹版をアクリルで周りを覆った酸素不透過性のマイクロ凹版(以下、「Non−oxychip」とも呼ぶ)で形成させた混合スフェロイドを比較することで、培養中の酸素供給が毛包形成に与える影響を解析した。具体的な試験方法を以下に示す。
実施例1(1)と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。作製したマイクロ凹版の内、周りをアクリルで覆い酸素を不透過としたもの(Non−oxychip)も準備した。
実施例1(2)と同様の方法を用いて、Oxychipに上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を1mL(1×104cells/ウェル)加え、3日間培養した。Non−oxychipについても、同様に細胞混合液を播種し、3日間培養した。
実施例2(2)と同様の方法を用いて、培養中の混合スフェロイドについて、培養開始から1、2、3日目に位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。培養開始から3日目の明視野及び暗視野での観察結果を図10に示す。
試験例2(1)(切片の作製)と同様の方法を用いて、混合スフェロイドの切片を作製した。
試験例2(1)(HE染色)と同様の方法を用いて、切片を染色した。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図11に示す。
培養開始から3日目の混合スフェロイドを、実施例2(3)と同様の方法を用いて、ヌードマウス(ICR nu/nuマウス、5週齢)の皮下に直接注入し、移植した。移植から18日目のヌードマウスの様子を図12に示す。
図10から、Oxychipで培養した混合スフェロイドは、上皮−間葉構造を再構成することで毛包原基構造を形成することが確かめられた。一方、Non−oxychipで培養したものは上皮−間葉構造の再構成が観察されず、凝集体が崩壊していることが確かめられた。
図11から、Oxychipを用いた場合では、顕微鏡観察と同様に正常な毛包原基が形成していることが確認できた。また、Non−oxychipを用いた場合では、混合スフェロイドは崩壊しており、多くの細胞の核において染色されないことが明らかとなった。このことから、酸素枯渇によってネクローシスを起きたと推察できる。
図12から、Oxychipで作製した毛包原基は移植から18日目で毛髪を形成したのに対し、Non−oxychipで作製した毛包原基は毛髪を再生することができないことが確かめられた。
(1)マイクロ凹版の作製
実施例1(1)と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
妊娠マウス(C57BL/6jjcl、妊娠2週間目)から上皮系細胞を1.5×106cells採取した。続いて、ヒト毛乳頭細胞(Promo cell社製)を含む懸濁液1mLにVybrant(登録商標) Cell−labelling Solutions(Molecular probes社製)を5μL加え、20分間培養して、細胞を染色した。続いて、遠心分離を行い、上清を除去後、ヒト毛乳頭細胞増殖培地(Follicle Dermal Papilla Cell Growth Medium;DPCGM)(Promo cell社製)とHuMedia−KG2との1:1混合培地を加え、ヒト毛乳頭細胞及びマウス上皮系細胞を表1に示す細胞密度でマイクロ凹版及び96ウェルプレートに播種した。
培養中のヒト毛乳頭細胞及びマウス上皮系細胞の混合細胞集塊(以下、「混合スフェロイド」とも呼ぶ。)について、培養開始から1、3日目に位相差蛍光顕微鏡を用いて観察した。
培養開始から培養開始から1日目及び3日目の暗視野での96ウェルプレートにて培養した各細胞数の混合スフェロイドの観察結果を図13Aに、3日目の明視野でのマイクロ凹版にて培養した4.0×103cells/ウェルの混合スフェロイドの観察結果を図13Bに、3日目の明視野でのマイクロ凹版にて培養した4.0×103cells/ウェルの混合スフェロイドの観察結果を図13Cに示す。
ヌードマウス(ICR nu/nuマウス、5週齢)(オリエンタル酵母社から購入)の皮下にオフサルミックランス 20G(日本アルコン社製)で移植穴をあけて、マイクロピペットを用いて、培養開始から3日目の96ウェルプレートにて培養した各細胞数の混合スフェロイドをそれぞれ移植した。各細胞数の混合スフェロイドの移植から18日目のヌードマウスの移植部を肉眼で観察した結果を図14Aに示す。また、各細胞数の混合スフェロイドの移植から18日目のヌードマウスの移植部あたりの毛髪の再生効率(=発毛部/移植部×100(%))及び再生本数を示したグラフをそれぞれ図14B及び図14Cに示す。
図13Aから、培養開始から1日目において、赤い蛍光で示されたヒト毛乳頭細胞は上皮系細胞を覆うように局在化し、1つの混合スフェロイドを形成した後、培養開始から3日目において、スフェロイド内で同種細胞どうしが集合する傾向が見られた。
また、1.0×103cells/ウェル以上8.0×103cells/ウェル以下では、マウス上皮系細胞とヒト毛乳頭細胞とはそれぞれ分離し、それぞれが重なりあった毛包原基構造を形成したことが確かめられた。
一方、16×103cells/ウェル以上では、マウス上皮系細胞塊の周囲で複数個のヒト毛乳頭細胞塊が融合した1つの混合スフェロイドを形成した。
また、図13B及び図13Cから、マイクロ凹版にて培養した混合スフェロイドについても、96ウェルプレートにて培養した混合スフェロイドと同様に、自発的な毛包原基構造の形成が観察された。
図14Aから、移植後18日目において、4.0×103cells/ウェル以上の細胞数の混合スフェロイドを移植した移植部では、発毛が観察されることが確かめられた。
また、図14B及び図14Cから、4.0×103cells/ウェル以上の細胞数の混合スフェロイドの移植体において、平均再生効率及び平均再生本数は、毛包原基を構成する細胞数に依存せず、平均再生効率が約40%程度であり、また、平均再生本数が約1〜2本となることが確認された。
(1)再生毛包の染色
ヒト毛乳頭細胞を用いて作製した混合スフェロイドが生体と同様の構造を持つ毛包を形成しているかを確認するために、抗Nuclei抗体(clone235−1)及びヒストファインマウスステインキットを用いて、凍結切片の免疫組織化学染色により染色した。具体的な染色方法について、以下に説明する。
実施例3(2)と同様の方法を用いて作製された混合スフェロイドを、実施例3(3)と同様の方法を用いてヌードマウスに移植した。移植後18日目のヌードマウスの移植部の皮膚を切り出した。続いて、ブアン固定液(ピクリン酸飽和水溶液15mL、20v/v%ホルマリン5mL、及び氷酢酸1mLの混合溶液)に1日浸漬することで、組織の固定を行った。続いて、70、90、100 v/v%エタノール、100v/v%エタノール及び2−ブタノールの1:1混合溶液、2−ブタノール、2−ブタノール及びパラフィンの1:1混合溶液、並びにパラフィンに、それぞれ1時間ずつ浸した後、パラフィンブロックを作製した。続いて、回転式ミクロトームを微小の厚さにカットし、パラフィン切片を作製した。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。
試験例2(1)(HE染色)と同様の方法を用いて、切片を染色した。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図13Aに示す。
実施例3(2)と同様の方法を用いて作製された混合スフェロイドを、実施例3(3)と同様の方法を用いてヌードマウスに移植した。移植後18日目のヌードマウスの移植部の皮膚を切り出した。続いて、10%ホルマリン(Wako社製)に1日浸漬することで、組織の固定を行った。続いて、70、90、100 v/v%エタノール、100v/v%エタノール及び2−ブタノールの1:1混合溶液、2−ブタノール、2−ブタノール及びパラフィンの1:1混合溶液、並びにパラフィンに、それぞれ1時間ずつ浸した後、パラフィンブロックを作製した。続いて、回転式ミクロトームを微小の厚さにカットし、パラフィン切片を作製した。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。
得られたスライドガラスについて、抗Nuclei抗体(clone235−1)(Millipore社製)及びヒストファインマウスステインキット(ニチレイバイオサイエンス社製)を用いて、ヒト由来細胞の免疫染色を行った。位相差蛍光顕微鏡(オリンパス社製、IX−71)で観察した結果を図15Bに示す。
毛のキューティグル構造を確認するために、4.0×103cells/ウェルの細胞数の混合スフェロイドの移植後18日目のヌードマウスの移植部を、走査型電子顕微鏡(Scanning Electron Microscope;SEM)を用いて観察した結果を図15Cに示す。
図15A及び図15Bから、移植部において毛包が形成されたこと、また、形成した毛乳頭がヒト由来細胞からなることが確認できた。
図15Cから、キューティクル構造を有する毛の再生が確認できた。
以上のことから、ヒト毛乳頭細胞を用いた毛包原基を免疫不全マウスに移植することでマウス皮下から毛髪を再生できることが示された。
Claims (11)
- 規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を播種し、前記マイクロ凹版の少なくとも上面及び底面から前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞に対して酸素を供給しながら混合培養することにより、前記微小凹部内に毛髪再生能を有する毛包原基を形成させる工程を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなり、
前記微小凹部1つあたりに播種される前記間葉系細胞及び前記上皮系細胞の合計細胞数が4.0×10 3 cells以上1.28×10 5 cells以下であることを特徴とする複数の再生毛包原基の製造方法。 - Wntシグナル活性化剤を用いない、請求項1に記載の複数の再生毛包原基の製造方法。
- 請求項1又は2に記載の製造方法で得られた複数の再生毛包原基を、前記微小凹部内に保持された状態で、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備えることを特徴とする毛包組織含有シートの製造方法。
- 前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下である、請求項3に記載の毛包組織含有シートの製造方法。
- 請求項3又は4に記載の製造方法で得られた毛包組織含有シートであって、
間葉系細胞及び上皮系細胞を含む毛包原基と、
生体適合性ハイドロゲルと、を含有し、
前記毛包原基が、前記生体適合性ハイドロゲル上に規則的に配置されており、
前記毛包原基の密度が20個/cm 2 以上500個/cm 2 以下であることを特徴とする毛包組織含有シート。 - さらに、前記毛包原基が分化し、毛包を形成している、請求項5に記載の毛包組織含有シート。
- 前記生体適合性ハイドロゲルがゲル化する細胞外マトリックス成分である、請求項5又は6に記載の毛包組織含有シート。
- 前記細胞外マトリックス成分がコラーゲンである、請求項7に記載の毛包組織含有シート。
- 複数の毛髪再生能を有する再生毛包原基を製造するための培養基板の使用であって、
前記培養基板は、規則的な配置の微小凹部を有するマイクロ凹版を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなり、
前記培養基板の少なくとも上面及び底面から前記微小凹部に含まれる間葉系細胞及び上皮系細胞に対して酸素を供給しながら混合培養する前記培養基板の使用。 - 前記酸素透過性を有する材質がポリジメチルシロキサンである、請求項9に記載の使用。
- 前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下である、請求項9又は10に記載の使用。
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