JP6999132B2 - 再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明の第1態様に係る再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法は、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる毛包原基形成工程と、前記毛包原基と角化細胞と線維芽細胞とを同時に播種し、共培養することにより、培養皮膚を形成させる培養皮膚形成工程と、を備える方法であって、前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる。
本実施形態の再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法は、毛包原基形成工程と、培養皮膚形成工程と、を備える方法である。
毛包原基形成工程は、間葉系細胞及び上皮系細胞から毛包原基を微小凹部内に形成させる工程である。具体的には、まず、間葉系細胞1及び上皮系細胞2を含む細胞混合懸濁液を調製する。このとき、間葉系細胞1及び上皮系細胞2の混合比は、間葉系細胞:上皮系細胞=1:2~2:1であることが好ましく、1:1.5~1.5:1であることがより好ましく、1:1であることがさらに好ましい。
毛包原基を形成させる際に使用するマイクロ凹版3は、複数の微小凹部4が規則的に配置されているものが好ましい。マイクロ凹版3は、市販のものを用いてもよいし、後述の実施例1に記載の方法等で作製してもよい。
毛包原基形成工程で用いられる培地6としては、特別な限定はなく、細胞の生存増殖に必要な成分(無機塩、炭水化物、ホルモン、必須アミノ酸、非必須アミノ酸、ビタミン)等を含む基本培地であればよい。
前記公知の基本培地としてより具体的には、例えば、DMEM、Minimum Essential Medium(MEM)、RPMI-1640、Basal Medium Eagle(BME)、Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium:Nutrient Mixture F-12(DMEM/F-12)、Glasgow Minimum Essential Medium(Glasgow MEM)等が挙げられる。
培養皮膚形成工程は、前記毛包原基形成工程で得られた毛包原基と角化細胞と線維芽細胞とを同時に播種し、共培養することにより、培養皮膚を形成させる工程である。
本実施形態の培養皮膚含有シートの製造方法は、上記実施形態の再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法から得られた再生毛包原基を有する培養皮膚を用いる方法である。
転写工程では、上記実施形態の再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法から得られた再生毛包原基を有する培養皮膚を生体適合性ハイドロゲルに転写する。
本明細書において、「生体適合性ハイドロゲル」とは、生体への適合性を有するゲルであって、高分子が化学結合によって網目構造をとり、その網目に多量の水を保有した物質を意味する。より具体的には、天然物由来の高分子や合成高分子の人工素材に架橋を導入してゲル化させたものをいう。
本実施形態の培養皮膚含有シートは、支持体上に、毛包原基、角化細胞及び線維芽細胞を含む培養皮膚を備える。
本実施形態の培養皮膚含有シートの製造キットは、規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版と、支持体と、を備える。
本実施形態の培養皮膚含有シートは、当業者に公知の方法で、被検体の対象となる部位に移植することができる。例えば、シャピロ式植毛術やチョイ式植毛器を用いた植毛、空気圧を利用したインプランター等を使用し、移植することができる。シャピロ式植毛術とは、移植部位をマイクロメス等で移植創を作った後に、ピンセットを用いて移植する方法である。
一実施形態において、本発明は、治療的に有効量の上述の製造方法により得られた培養皮膚含有シートを含む毛包再生治療剤を提供する。
1.マイクロ凹版の作製
マイクロ凹版の作製方法の概略図を図4に示す。具体的には、CADソフト(V Carve Pro 6.5)を用いて、作製するマイクロ凹版のパターンをコンピューターで設計した。次いで、切削機を用いて、設計したパターン通りにオレフィン系基板を切削することで、パターンをもつ凹鋳型を作製した(工程(I))。この凹鋳型にエポキシ樹脂(クリスタルリジン:日新レジン社製)を流しこみ(工程(II))、1日硬化させた後(工程(III))、離型することで、パターンをもつ凸鋳型を形成した(工程(IV))。次いで、形成した凸鋳型を6cmディッシュ底面に固定し、ポリジメチルシロキサン(PDMS)を流し込み(工程(V))、固化した(工程(VI))。次いで、離型することで、PDMSに規則的なパターンが形成されたマイクロ凹版を作製した(工程(VII))。なお、マイクロ凹版のパターンデザインは、日本人の頭髪の平均毛包密度に合わせて作製した。マイクロ凹版のサイズとして具体的には、高さ1cm、2cm×2cm四方の容器の底面に直径約1mm、高さ500μmのウェルが約100ウェル/cm2の密度で配置された容器が得られた。
(1)間葉系細胞及び上皮系細胞の採取
胎齢18日齢のC57BL/6マウス胎児より背部皮膚を採取し、中尾らが報告した方法(参考文献1:Toyoshima, K., et al., “Fully functional hair follicle regeneration through the rearrangement of stem cells and their niches”, Nat. Commun., vol.3, no.784, 2012.)を一部改変した方法を用いて、間葉系細胞及び上皮系細胞を採取した。より具体的には、妊娠マウスC57BL/6jjclの子宮内の胎齢18日齢のマウス胎児の背部皮膚を採取し、Dispase(登録商標)II(Wako社製)による処理を4℃で30rpmの振盪条件で1時間行い、上皮層と間葉層とを分離した。次いで、上皮層は100U/mLのコラゲナーゼ(Wako社製)による処理を1時間20分、さらにトリプシンによる処理を10分行い、上皮系細胞を単離した。一方、間葉層は100U/mLのコラゲナーゼ(Wako社製)による処理を1時間20分行い、間葉系細胞を単離した。
次いで、ポロキサマー処理したマイクロ凹版に、採取した上皮系細胞及び間葉系細胞の細胞混合懸濁液を、それぞれの細胞が1×104cells/ウェルずつ(全細胞数2×104cells/ウェル)となるように注入し、3日間培養した。培地は、ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium;DMEM)(10%ウシ胎児血清(Fetal Bovine Serum;FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)含有)とHuMedia-KG2培地(倉敷紡績社製)を1:1で混合した培地(以下、「DMEM-KG2混合培地」とも呼ぶ。)を用いた。培地交換は毎日行った。
次いで、3日間培養した毛包原基約100個を15mLの遠心チューブに回収した。次いで、そこにヒト線維芽細胞(NB1RGB、理研セルバンク)とヒト成人ケラチノサイト(J-TEC)とをそれぞれ1×106cellsずつ加えた。次いで、遠心を行った(1000rpm、3分間)。上澄みを回収した後、300μLのDMEM-KG2混合培地を添加し、よく懸濁した。次いで、得られた細胞懸濁液を、セルカルチャーインサートを設置した24ウェルプレートに添加し、1日培養を行った。この際、セルカルチャーインサートの外側には600μLのDMEM-KG2混合培地をあらかじめ加えておいた。対照群として、毛包原基を加えず、ヒト線維芽細胞とヒトケラチノサイトとをそれぞれ1×106cellsずつを、セルカルチャーインサートを設置した24ウェルプレートに添加し、1日培養を行ったものも準備した。結果を図5に示す。図5において、「毛包原基なし」は、対照群として調製した毛包原基を有しない培養皮膚含有シートを示し、「毛包原基あり」は、毛包原基を有する培養皮膚含有シートを示す。
1.培養皮膚含有シートの移植
移植の手順について、図6に示す。なお、動物の飼育及び動物実験は横浜国立大学動物実験委員会の指針に遵守して行った。
(1)組織切片の作製
移植から21日目の毛包原基を有する培養皮膚含有シートの移植部を含む皮膚を切り出した。次いで、20%ホルマリン(Wako社製)に1日浸漬することで、組織の固定を行った。次いで、10%、20%、30%スクロース溶液(Wako社製のスクロースを希釈して調製した溶液)にそれぞれ1時間ずつ浸した。スクロース置換した切片を凍結組織切片作製用包埋剤(Optimal Cutting Temperature Compound:O.C.T Compound)(サクラファインテック社製)を静かに流し込み、混合スフェロイドを封入した。次いで、クライオミクロトームを用いて微小の厚さにカットした。カットされた切片をスライドガラスに垂直に押し当て、転写した。
以下の(i)~(xvii)に示す手順に従い、切片のHE染色を行った。
(i)切片を固定したスライドガラスにキシレンを1mL滴下し30分間静置した後、溶液を除去した。
(ii)上記(i)と同じ操作をもう一度繰り返した。
(iii)100%エタノールを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。
(iv)上記(iii)と同じ操作をもう一度繰り返した。
(v)90%エタノール溶液を1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。
(vi)70%エタノール溶液を1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。
(vii)蒸留水を1mL滴下し3分間静置した後、蒸留水を除去した。
(viii)マイヤー・ヘマトキシリン染色液を1mL滴下し6分間静置した後、溶液を除去した。
(ix)流水に13分間浸し、洗い流した。
(x)エオシンYを1mL滴下し3分間静置した後、溶液を除去した。
(xi)90%エタノール溶液を1mL滴下し1分間静置した後、溶液を除去した。
(xii)100%エタノール溶液を1mL滴下し1分間静置した後、溶液を除去した。
(xiii)100%エタノールを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。
(xiv)上記(xiii)と同じ操作をもう一度繰り返した。
(xv)キシレンを1mL滴下し5分間静置した後、溶液を除去した。
(xvi)上記(xv)と同じ操作をもう一度繰り返した。
(xvii)スライドガラスが乾いたら、マウントクイック(封入剤)を少量垂らし、気泡が入らないようにマイクロカバーガラスをゆっくりかぶせ、封入した。
次いで、Cutometer DUAL MPA580及びTewameter TM300(それぞれCourage+Khazaka社製)を用いて、「1.」において、移植から21日目の毛包原基を有する培養皮膚含有シートの移植部での経皮水分蒸発量(transepidermal water loss;TEWL)を測定した。また、基準値として、非移植部でのTEWL、対照群として、毛包原基を有しない培養皮膚含有シートの移植部でのTEWLも測定した。結果を図10に示す。図10において、縦軸は、非移植部でのTEWLを1としたときの相対比である。また、「Host」とは、非移植部でのTEWLの測定値を示す。「ESS」とは、毛包原基を有しない培養皮膚含有シートの移植部でのTEWLの測定値を示す。「ESS+HFG」とは毛包原基を有する培養皮膚含有シートの移植部でのTEWLの測定値を示す。
1.マイクロ凹版の作製
実施例1の「1.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版を作製した。
実施例1の「2.」と同様の方法を用いて、マイクロ凹版の凹部内に毛包原基を形成させた。
図11は、従来の培養皮膚含有シートの作製方法を示す概略工程図である。この作製方法を応用して、再生毛包原基を埋め込んだ従来の培養皮膚含有シートを形成させた。
1.培養皮膚含有シートの移植
移植の手順について、試験例1と同様の手順に従い、比較例1で作製した再生毛包原基を埋め込んだ従来の培養皮膚含有シートを移植した。具体的には以下に示すとおりである。
Claims (12)
- 規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる毛包原基形成工程と、
前記毛包原基と角化細胞と線維芽細胞とを同時に播種し、共培養することにより、培養皮膚を形成させる培養皮膚形成工程と、を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる
再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法。 - 前記マイクロ凹版における前記微小凹部の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下である請求項1に記載の再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法。
- 前記培養皮膚形成工程において、間葉系細胞増殖用培地及び上皮系細胞増殖用培地を混合した培地を用いる請求項1又は2に記載の再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法。
- 規則的な配置の微小凹部を備えるマイクロ凹版に、間葉系細胞及び上皮系細胞を同時に播種し、酸素を供給しながら共培養することにより、前記微小凹部内に毛包原基を形成させる毛包原基形成工程と、
前記角化細胞及び前記線維芽細胞を、前記毛包原基が形成された前記マイクロ凹版の前記微小凹部内に同時に播種し、共培養することにより、培養皮膚を形成させる培養皮膚形成工程と、を備え、
前記マイクロ凹版が酸素透過性を有する材質からなる
再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法。 - 請求項1~4のいずれかに記載の再生毛包原基を有する培養皮膚の製造方法により得られる再生毛包原基を有する培養皮膚を、生体適合性ハイドロゲルに転写する工程を備える培養皮膚含有シートの製造方法。
- 前記生体適合性ハイドロゲルがコラーゲンである請求項5に記載の培養皮膚含有シートの製造方法。
- 支持体としての生体適合性ハイドロゲルに、間葉系細胞と上皮系細胞とを含む毛包原基、角化細胞及び線維芽細胞を含む培養皮膚を備え、前記上皮系細胞は、外毛根鞘最外層細胞、毛母基部の上皮系細胞、又は毛包上皮系細胞である、培養皮膚含有シート(ただし、前記間葉系細胞として、育毛・発毛成分のコード領域を少なくとも含むポリヌクレオチドが導入された毛乳頭細胞を除く。)。
- 支持体上に、毛包原基、角化細胞及び線維芽細胞を含む培養皮膚を備え、
前記支持体上における前記培養皮膚の密度が20個/cm2以上500個/cm2以下である培養皮膚含有シート。 - 前記支持体がコラーゲンを含む請求項7又は8に記載の培養皮膚含有シート。
- 支持体としての生体適合性を有する材質からなるマイクロ凹版に、毛包原基、角化細胞及び線維芽細胞を含む培養皮膚を備える培養皮膚含有シート。
- 前記毛包原基、角化細胞及び線維芽細胞を、前記毛包原基、前記角化細胞及び前記線維芽細胞を含む混合スフェロイドとして含む請求項7~10のいずれかに記載の培養皮膚含有シート。
- 毛包原基、角化細胞及び線維芽細胞を含む混合スフェロイドを含む、再生毛包原基を有する培養皮膚。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005305177A (ja) | 2005-05-11 | 2005-11-04 | Toyobo Co Ltd | 組織付属器官様構造体を含む人工組織およびその製造方法 |
JP2008125540A (ja) | 2006-11-16 | 2008-06-05 | Lion Corp | 人工皮膚 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2005305177A (ja) | 2005-05-11 | 2005-11-04 | Toyobo Co Ltd | 組織付属器官様構造体を含む人工組織およびその製造方法 |
JP2008125540A (ja) | 2006-11-16 | 2008-06-05 | Lion Corp | 人工皮膚 |
JP2016016267A (ja) | 2014-07-10 | 2016-02-01 | 国立大学法人大阪大学 | 人工皮膚及びその製造方法 |
WO2016115034A1 (en) | 2015-01-12 | 2016-07-21 | Wake Forest University Health Sciences | Multi-layer skin substitute products and methods of making and using the same |
WO2017073625A1 (ja) | 2015-10-30 | 2017-05-04 | 国立大学法人横浜国立大学 | 再生毛包原基の集合体の製造方法、毛包組織含有シート、及び毛包組織含有シートの製造方法 |
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