WO2022265021A1

WO2022265021A1 - アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ｄｓｃ）細胞とを含む組成物、毛髪を再生するためのキット、毛髪を再生するための組成物を製造する方法及び毛髪を再生する方法

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Publication number: WO2022265021A1
Application number: PCT/JP2022/023853
Authority: WO
Inventors: さやか小坂; 哲典松本
Original assignee: 株式会社資生堂
Priority date: 2021-06-15
Filing date: 2022-06-14
Publication date: 2022-12-22
Also published as: CN117337185A; JPWO2022265021A1; KR20240021761A

Abstract

本発明は、アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む、組成物；アテロコラーゲンを含む第１剤と、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤とを含む、毛髪を再生するためのキット；アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを混合する工程を含む、毛髪を再生するための組成物を製造する方法；それを必要とする対象において毛髪を再生する方法であって、アテロコラーゲンと、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む組成物を前記対象の皮膚に適用する工程、を含む、方法を提供する。

Description

アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む組成物、毛髪を再生するためのキット、毛髪を再生するための組成物を製造する方法及び毛髪を再生する方法

　本発明は、アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む組成物、毛髪を再生するためのキット、毛髪を再生するための組成物を製造する方法及び毛髪を再生する方法を提供する。

　毛髪は皮膚に存在する毛包によって産生される。毛包とは、毛を取り囲む組織層であり、外胚葉由来の毛母（毛母細胞）、内毛根鞘、外毛根鞘や、中胚葉由来の真皮毛根鞘、毛乳頭などから構成されている。毛乳頭を取り囲む毛母細胞が、毛乳頭から供給される栄養やタンパク質によって誘導されて分裂を繰り返し、角質化することによって毛を形成する。

　毛髪の発育に問題が生じることで薄毛・脱毛症が生じる。薄毛・脱毛症には、壮年性脱毛症、円形脱毛症、休止期脱毛症などがあり、最も頻度が多いのが壮年性脱毛症である。壮年性脱毛症は、男性において、主に男性ホルモンの影響によって引き起こされるものであり、男性型脱毛症とも呼ばれる。毛は、成長期、退行期及び休止期からなるヘアサイクルを繰り返しながら生え替わる。男性型脱毛症は、このヘアサイクルの中でも成長期が短くなり、細く短い毛髪の割合が増えることで引き起こされる症状である。

　現在、壮年性脱毛症の治療として、外用剤のミノキシジルや、経口薬のフィナステリドが主に用いられている。これらの治療法は、いずれも有効性や安全性が確認されているが、必ずしも全ての壮年性脱毛症に有効というわけではない。

　その他、壮年性脱毛症の治療として、自家植毛術が実施されている。自家植毛術とは、側頭部や後頭部から採取した毛根を含む毛髪を、自己の脱毛部に移植する術式である。しかしながら、当該術式は、自己の毛髪を別の場所へ植え替える術式であるため、毛髪の総数を増やすものではない。

　近年、様々な疾患に対する再生医療技術が開発されており、毛髪再生分野においても新たな技術が研究開発されている。例えば、毛包の中でも、毛包の再外層に位置する真皮毛根鞘、特に毛球部の底部に位置する毛球部毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅａｔｈ　ｃｕｐ　ｃｅｌｌ：ＤＳＣ）細胞には高い毛包誘導能力を有することが示唆されており、ＤＳＣ細胞を移植した実験では発毛が認められたことが報告されている（非特許文献１～３）。また、ＤＳＣ細胞が、発毛において重要な役割を有する毛乳頭（Ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ：ＤＰ）細胞の前駆細胞であることも示されており、ＤＳＣ細胞に注目が集まっている（非特許文献４）。

Ｊａｈｏｄａ　ＣＡ.，ｅｔ　ａｌ．，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈａｉｒ　ｇｒｏｗｔｈ　ｂｙ　ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ　ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ　１９８４；３１１：５６０－５６２．ＭｃＥｌｗｅｅ　ＫＪ.，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｕｌｔｕｒｅｄ　ｐｅｒｉｂｕｌｂａｒ　ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅａｔｈ　ｃｅｌｌｓ　ｃａｎ　ｉｎｄｕｃｅ　ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅａｔｈ　ａｎｄ　ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００３；１２１：１２６７－１２７５．Ｔｓｕｂｏｉ　Ｒ．，　ｅｔ　ａｌ．，　Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ　ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｆｏｒ　ｍａｌｅ　ａｎｄ　ｆｅｍａｌｅ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｈａｉｒ　ｌｏｓｓ　ｕｓｉｎｇ　ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅａｔｈ　ｃｕｐ　ｃｅｌｌｓ：　Ａ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　ｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄｅｄ　ｄｏｓｅ－ｆｉｎｄｉｎｇ　ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙ．　Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．　２０２０　Ｊｕｌ；８３（１）：１０９－１１６Ｒａｈｍａｎｉ　Ｗ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｈａｉｒ　ｆｏｌｌｉｃｌｅ　ｄｅｒｍａｌ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌｓ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅａｔｈ，ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｅｒｍａｌ　ｐａｐｉｌｌａ，ａｎｄ　ｍｏｄｕｌａｔｅ　ｈａｉｒ　ｔｙｐｅ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．２０１４　Ｄｅｃ．８；３１（５）：５４３－５８．

　本発明の目的は、毛髪の再生に寄与する、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む新たな組成物、キット及びそれらを製造する方法を提供することである。また、本発明の目的は、それらを用いた毛髪の再生方法を提供することにある。

　本発明者らが鋭意研究を行った結果、アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞と混合することにより、皮膚に移植された場合においてもＤＳＣ細胞の生存率の維持及び移植組織への生着率が向上することが示唆され、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は、以下の発明を包含する。

　［１］　アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む、組成物。
　［２］　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、項目１に記載の組成物。
　［３］　前記毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞と、前記アテロコラーゲンとが、皮膚に適用される直前に混合することによって調製される、項目１又は２に記載の組成物。
　［４］　毛髪を再生するために用いられる、項目１～３のいずれか１項に記載の組成物。
　［５］　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、項目１～４のいずれか１項に記載の組成物。

　［６］　アテロコラーゲンを含む第１剤と、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤とを含む、毛髪を再生するためのキット。
　［７］　前記第１剤と前記第２剤が混合された場合に、前記アテロコラーゲンが０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれるよう調整される、項目６に記載のキット。
　［８］　前記第１剤と、前記第２剤とが、皮膚に適用される直前に混合して調製される、項目６又は７に記載のキット。
　［９］　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、項目６～８のいずれか１項に記載のキット。

　［１０］　アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを混合する工程を含む、毛髪を再生するための組成物を製造する方法。
　［１１］
　前記アテロコラーゲンを、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれるように混合する、項目１０に記載の方法。
　［１２］　前記アテロコラーゲンと、前記毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを、皮膚に適用する直前に混合して調製する、項目１０又は１１に記載の方法。
　［１３］　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、項目１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
　［１４］　それを必要とする対象において毛髪を再生する方法であって、
アテロコラーゲンと、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む組成物を前記対象の皮膚に適用する工程、
を含む、方法。
　［１５］　前記組成物において、アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、項目１４に記載の方法。
　［１６］　前記組成物が、皮膚に適用する直前に調製される、項目１４又は１５に記載の方法。
　［１７］　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、項目１４～１６のいずれか１項に記載の方法。

　［１８］　それを必要とする対象において毛髪を再生する方法であって、
（１－１）前記対象の皮膚にアテロコラーゲンを含む第１剤を適用する工程；及び
（１－２）前記第１剤が適用された前記皮膚の部位に、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤を適用する工程、
並びに／又は
（２－１）前記対象の皮膚に前記第２剤を適用する工程；及び
（２－２）前記第２剤が適用された前記皮膚の部位に、前記第１剤を適用する工程
を含む、方法。
　［１９］　前記第１剤が、アテロコラーゲンを０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含む、項目１８に記載の方法。
　［２０］　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、項目１８又は１９に記載の方法。

　［２１］　毛髪を再生するための医薬の製造のための、アテロコラーゲン及び毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の使用。
　［２２］　前記アテロコラーゲンが、前記医薬において０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、項目２１に記載の使用。
　［２３］　前記アテロコラーゲンと、前記毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とが、皮膚に適用される直前に混合することによって調製される、項目２１又は２２に記載の使用。
　［２４］　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、項目２１～２３のいずれか１項に記載の使用。

　［２５］　アテロコラーゲンとの併用により、毛髪を再生する組成物の製造のための毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の使用。
　［２６］　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％の濃度で併用される、項目２５に記載の使用。

　［２７］　毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を有効成分として含む、それを必要とする対象の皮膚においてアテロコラーゲンが適用された部位に適用されることを特徴とする、毛髪を再生するための組成物。
　［２８］　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％の濃度で適用される、項目２７に記載の組成物。

　［２９］　皮膚適用部位における毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の生着を促進するために用いられる、アテロコラーゲンを含む組成物。
　［３０］　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、項目２７に記載の組成物。

　本発明によれば、皮膚移植後におけるＤＳＣ細胞の生存率及び生着率が向上し、ＤＳＣ細胞による毛髪を再生する能力が向上することが期待できる。

図１は、アテロコラーゲンと混合したＤＳＣ細胞の生存率を示す。図２は、各濃度のアテロコラーゲンと混合して培養したＤＳＣ細胞の形態を示す。図３は、エクスビボにおいてブタ皮膚組織に移植したＤＳＣ細胞のみ（Ａ）又はアテロコラーゲンと混合したＤＳＣ細胞（Ｂ）の局在を観察した結果を示す。

　以下、本発明を実施するための形態について説明するが、本発明の技術的範囲は下記の形態のみに限定されない。なお、本明細書中で引用されている文献は、参照することにより本発明に取り込まれ得る。

　一実施形態において、本発明は、アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む、組成物を提供する。

　毛の皮膚内部最深部の膨らんだ部分を毛球部（ｈａｉｒｂｕｌｂ）といい、毛球部の中央部にある間葉系細胞からなる部分を毛乳頭（ｄｅｒｍａｌｐａｐｉｌｌａ：ＤＰ）という。毛乳頭には毛細血管や神経が入り込んでいて、食物からの栄養や酸素を取り入れ、毛の発生や成長をつかさどっている。毛乳頭に接したところに毛母細胞（ｈａｉｒ　ｍａｔｒｉｘ　ｃｅｌｌ）があり、毛はこの部位で産生される。すなわち毛母細胞は、毛乳頭に入り込んでいる毛細血管から栄養や酸素を取り込み、分裂を繰り返すことにより毛が形成される。

　本明細書において、「毛包（Ｈａｉｒ　Ｆｏｌｌｉｃｌｅ：ＨＦ）」とは、上皮系細胞であるの毛母（毛母細胞）、内毛根鞘、外毛根鞘や、間葉系細胞であるの真皮毛根鞘、毛乳頭、及びメラノサイトなどを含む、毛を取り囲む組織層をいう。

　本明細書において、「真皮毛根鞘（Ｄｅｒｍａｌ　Ｓｈｅａｔｈ：ＤＳ）」とは、毛包の最外層を包む一層又は数層の真皮性細胞層（ビメンチン陽性）よりなる組織であって、平滑筋型αアクチン（α－ＳＭＡ）陽性細胞を含む。真皮毛根鞘は、毛球部の最下端において毛乳頭と連続している。本明細書において、真皮毛根鞘には、毛球部毛根鞘と上部真皮毛根層が含まれる。

　本明細書において、「毛球部毛根鞘（ｄｅｒｍａｌ　ｓｈｅａｔｈ　ｃｕｐ：ＤＳＣ）」とは、真皮毛根鞘の一部であり、毛球部の底部に位置する組織をいう。「毛球部毛根鞘細胞（ＤＳＣ細胞）」は、毛球部毛根鞘を構成する細胞である。ＤＳＣ細胞は、毛乳頭細胞の前駆細胞であることが知られており、ＤＳＣ細胞を皮膚に移植することにより、移植部位において毛包が誘導されることが知られている。

　本明細書において、「上部真皮毛根鞘（Ｕｐｐｅｒ　Ｄｅｒｍａｌ　Ｓｈｅａｔｈ：ＵＤＳ）」とは、真皮毛根鞘のうち、上記の毛球部毛根鞘の部分を除いた組織をいう。

　本発明において使用されるＤＳＣ細胞は、いずれの動物由来であってもよいが、脊椎動物由来が好ましく、哺乳動物由来がより好ましく、ヒト由来であることが最も好ましい。また、本発明に用いられ得るＤＳＣ細胞は、移植対象から採取された自家のＤＳＣ細胞であってもよく、他家のＤＳＣ細胞であってもよい。

　本発明に用いられ得るＤＳＣ細胞は、公知の方法によって調製すればよく、特に限定されない。

　一実施態様において、本発明に用いられるＤＳＣ細胞は、ヒト毛包（好ましくはヒト頭皮毛包）を単離し、単離されたヒト毛包から毛乳頭領域の組織をさらに単離して反転させたのちに、毛乳頭を除去して、ＤＳＣ細胞を含む毛球部毛根鞘領域を培養して増殖させたものを用いてもよい。具体的には、例えば、頭皮を５ｍｍほどの短冊状に切り、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等で洗浄した後、必要によりタンパク質分解酵素等を用いまたは外科的に処理し、表皮層および真皮層を除き、皮下脂肪層のみにし、次いで毛包を物理的手段、例えばピンセット等で単離する。毛包から毛球部を切り取り、この毛球部下部から毛乳頭を露出させて毛乳頭を除去し、毛球部毛根鞘領域からＤＳＣ細胞を単離することができる（非特許文献３）。

　ＤＳＣ細胞の培養は、動物細胞の培養に用いられる市販の栄養培地をそのまま、または改性したもので培養（初代培養および継代培養）することができる。ＤＳＣ細胞の培養に使用できる代表的な培地としては、ウシ胎児血清を含むダルベッコ変性イーグル培地、チャン培地（Ｃｈａｎｇ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ）、ＭｅｓｅｎＰＲＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｅｒ社）等が挙げられる。培地には、さらに必要に応じて細胞増殖因子、ホルモンやその他の微量栄養素を加えることができる。これらの具体的なものとしては、トランスフエリン、インスリン、トリヨードチロニン、グルカゴン、ハイドロコーチゾン、テストステロン、エストラジオール、プロゲステロン、セレン等が挙げられる。

　本発明に用いられ得るＤＳＣ細胞は、多能性幹細胞または組織幹細胞から分化したＤＳＣ細胞であってもよい。多能性幹細胞は、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞またはＭｕｓｅ細胞などであってもよく、これらの多能性幹細胞から、分化誘導することによって得られるＤＳＣ細胞を用いてもよい。

　「アテロコラーゲン」とは、コラーゲン分子の両端に存在する、抗原性の高いテロペプチドをプロテアーゼによって切断除去したコラーゲンであり、水に可溶となったコラーゲンをいう。本発明に用いられる得るアテロコラーゲンは、各種動物（例えば、哺乳動物（ヒト、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ等）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類（サメ、鮭等））の真皮、靭帯、腱、骨、軟骨などを構成するコラーゲンを原材料とするものであってよく、好ましくは、哺乳動物由来（例えば、ウシ又はブタ）のアテロコラーゲンである。また、本発明に用いられ得るアテロコラーゲンは、市販のものを用いることができ、例えば、株式会社高研（日本）により製造販売されるウシ真皮を原料とするアテロコラーゲンを利用することができるが、これに限定されない。

　本発明において、アテロコラーゲンは、組成物中において、又は、移植部位において０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％、例えば０．１（ｖ／ｖ）％～１．０（ｖ／ｖ）％含まれてもよい。上記の濃度のアテロコラーゲンが足場として存在することにより、ＤＳＣ細胞が３次元的に伸展し、移植した場合においても、生着率が向上するという優れた効果を発揮する。

　一実施態様において、本発明の組成物は、皮膚に適用される直前に混合することによって調製されるものであってもよく、例えば、アテロコラーゲンを含む第１剤と、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤とを含む、毛髪を再生するためのキットとして提供されるものであってもよい。本発明がキットとして提供される場合、アテロコラーゲンを含む第１剤と、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤が混合された場合に、アテロコラーゲンが０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％、例えば０．１（ｖ／ｖ）％～１．０（ｖ／ｖ）％含まれるよう調整されるものが提供されてもよい。

　本発明の組成物、あるいはキットにおける第１剤又は第２剤は、上記のＤＳＣ細胞やアテロコラーゲンの他、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。本明細書において「薬学的に許容可能な担体」とは、各国政府の規制機関により承認されており、動物、特にヒトにおいて使用することができる、希釈液、アジュバント、賦形剤、又はベヒクル等をいう。一実施形態において、本発明に含まれてもよい担体としては、生理学的緩衝溶液、生理食塩水、細胞培養培地、及び水などが挙げられるが、これらに限定されない。本発明に用いることができる生理学的緩衝溶液は、例えば、緩衝生理食塩水、リン酸緩衝液、ハンク平衡塩溶液、トリス緩衝生理食塩水、及びＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水が含まれるが、これらに限定されない。

　本発明を皮膚に適用することにより、毛髪を再生し得る。従って、本発明は、薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられ得る。

　一実施態様において、本発明は、アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを混合する工程を含む、毛髪を再生するための組成物を製造する方法を提供する。本発明の製造方法において、アテロコラーゲンを、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％、例えば０．１（ｖ／ｖ）％～１．０（ｖ／ｖ）％含まれるように混合することが好ましい。また、本製造方法は、アテロコラーゲンと、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを、皮膚に適用する直前に混合して調製することが好ましい。

　一実施態様において、本発明は、それを必要とする対象において毛髪を再生する方法であって、
　アテロコラーゲンと、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む組成物を前記対象の皮膚に適用する工程、を含む、方法を提供する。

　本発明の組成物を皮膚、例えば、発毛を所望する部位（例えば、頭皮、眉部など）に適用する方法は公知の適用方法を用いることができ、例えば、注射器に充填された本発明に用いられる組成物を、皮膚における発毛を所望する部位に注射することによって投与することができる。アテロコラーゲンと、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞は、上述のように、適用する直前に混合されて注射器に充填されてもよく、アテロコラーゲンと、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とが、別々の注射器に充填されてもよい。後者の場合は、皮膚における発毛を所望する同じ部位に注射することによって投与される。したがって、他の態様において、本発明は以下の態様が提供され得る。

　それを必要とする対象において毛髪を再生する方法であって、
（１－１）前記対象の皮膚にアテロコラーゲンを含む第１剤を適用する工程；及び
（１－２）前記第１剤が適用された前記皮膚の部位に、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤を適用する工程、
並びに／又は
（２－１）前記対象の皮膚に前記第２剤を適用する工程；及び
（２－２）前記第２剤が適用された前記皮膚の部位に、前記第１剤を適用する工程
を含む、方法。

　一実施態様において、本発明は、毛髪を再生するための医薬の製造のための、アテロコラーゲン及び毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の使用、を提供する。

　また、他の態様において、本発明は、アテロコラーゲンとの併用により、毛髪を再生する組成物の製造のための毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の使用を提供する。

　また、本発明は、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を有効成分として含む、それを必要とする対象の皮膚においてアテロコラーゲンが適用された部位に適用されることを特徴とする、毛髪を再生するための組成物を提供する。すなわち、対象において、アテロコラーゲンが適用された皮膚の部位に、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を有効成分として含む毛髪を再生するための組成物が適応されることで、ＤＳＣ細胞が生着し、毛髪が再生され得る。

　さらにまた、本発明は、皮膚適用部位における毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の生着を促進するために用いられる、アテロコラーゲンを含む組成物を提供する。一実施態様における当該組成物において、アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％、例えば０．１（ｖ／ｖ）％～１．０（ｖ／ｖ）％含まれるものであり、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞と当該組成物を併用して、発毛を所望する皮膚の部位に適用した場合、
毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の生着が促進され、発毛が促進される。

　以下に、本発明を実施例に基づいて更に詳しく説明するが、これらは本発明を何ら限定するものではない。

　＜実施例１：細胞懸濁液との混合性＞

　ＤＳＣ細胞を細胞凍結液で希釈した。アテロコラーゲン（製品名：アテロコラーゲンインプラント１％（ｖ／ｖ）（株式会社高研、日本））、ヒアルロン酸（製品名：アルツディスポ関節注（生化学工業株式会社、日本））、又は架橋ヒアルロン酸（製品名：サイビスクディスポ関節注（サノフィ社、フランス）；ジュビダームビスタ（登録商標）ウルトラ（アラガン社、米国））と１：１で混合し、ピペッティングして、目視で混合性を確認した。

　その結果、ＤＳＣ細胞は、０．５％（ｖ／ｖ）のアテロコラーゲン又はヒアルロン酸と均一に混合することが確認された。一方で、ＤＳＣ細胞は、架橋ヒアルロン酸とは均一に混合されなかった。

＜実施例２：細胞生存率の確認＞
　アテロコラーゲンと混合した場合のＤＳＣ細胞の生存率を調べた。

　細胞凍結液で凍結していたＤＳＣ細胞を温浴にて融解し、アテロコラーゲン（製品名：アテロコラーゲンインプラント１％（株式会社高研、日本））と１：１で混合した。コントロールは、細胞凍結液で細胞数が同じとなるように希釈した。それぞれのサンプルを６ウェルの低接着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に１００μＬで分注し、４℃、室温（２１～２４℃）、３７℃にて、０時間（マテリアルとの混合直後）、１時間又は３時間インキュベートした。その後、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）　ｆｉｘａｂｌｅ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ　ａｓｓａｙ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に含まれるカルセイン及びＥｔＤｈ－１により各サンプルを染色した。生細胞はカルセインにより緑色蛍光を発する。死細胞はＥｔＤｈ－１により赤色蛍光を発する。蛍光顕微鏡で各サンプルを観察し、緑色細胞又は赤色細胞の数をカウントすることにより、生存率を算出した。

　図１に示すように、アテロコラーゲンと混合したＤＳＣ細胞は、保存温度である４℃及び室温や、３７℃で３時間インキュベートした後であっても、生存率が維持されていた（図１）。

＜実施例３：吐出実験＞
　足場マテリアルと混合したＤＳＣ細胞を注射器より吐出した後においても、細胞が生存しているかどうかを確認した。

　細胞凍結液で凍結していたＤＳＣ細胞を温浴にて融解し、アテロコラーゲン（製品名：アテロコラーゲンインプラント１％（株式会社高研、日本））と１：１で混合し、吐出前のサンプルをサンプリングした。コントロールは、細胞凍結液で細胞数が同じとなるように希釈し、同様に吐出前にサンプリングした。

　注射器にサンプルを充填した後、３１ゲージの針を装着し、針から吐出したサンプルを回収した。針のつまりは目視にて確認した。回収したサンプルをそれぞれ、実施例２と同様の方法で、生存率を算出した。

　３１Ｇ針吐出の前後において、細胞生存率はほとんど変わらなかった。また、目視により、針の詰まりは確認されなかった（表１）。

＜実施例４：アテロコラーゲン内の細胞形態の観察＞
　アテロコラーゲンと混合したＤＳＣ細胞の、アテロコラーゲンゲル化後の細胞形態を観察した。

　細胞凍結液で凍結していたＤＳＣ細胞を温浴にて融解し、アテロコラーゲン（製品名：アテロコラーゲンインプラント１％または３％（株式会社高研、日本））の終濃度が０．１（ｖ／ｖ）％、０．２５（ｖ／ｖ）％、０．５（ｖ／ｖ）％又は１．０（ｖ／ｖ）％となるように混合し、それぞれのサンプルをガラスボトムディッシュに１００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。コントロールには、アテロコラーゲンと混合していないＤＳＣ細胞のみを用い、同様にガラスボトムディッシュに１００μＬ／ｗｅｌｌで播種した。３日間、３７℃、５％ＣＯ_２でインキュベートし、４（ｗ／ｖ）％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で一晩固定した後、ＰＢＳで洗浄した。Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８　Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。各サンプルは共焦点レーザー顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）にて観察・撮影し、高精細３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェアＩｍａｒｉｓ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて解析した。

　その結果、０．１（ｖ／ｖ）％のアテロコラーゲン中のＤＳＣ細胞は、アテロコラーゲンと混合していないコントロールのＤＳＣ細胞と類似した形態を示した（図２）。一方で、０．２５（ｖ／ｖ）％以上のアテロコラーゲン中で培養したＤＳＣ細胞は、コラーゲン線維を足場にして３次元的に伸展する様子が観察された（図２）。

＜実施例５：エクスビボのおけるＤＳＣ細胞の組織内滞留実験＞
　アテロコラーゲンと混合したＤＳＣ細胞を、エクスビボの豚皮膚組織に移植した場合に、保持され得るかどうかを確認した。

　ＤＳＣ細胞標識にはＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ（商標）　Ｇｒｅｅｎ　ＣＭＦＤＡ　Ｄｙｅ　（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、添付のプロトコルに従って染色した。豚皮膚組織は東京芝浦臓器(株)より購入し、１ｃｍ角にトリミングしたものを２片、未凍結にて使用した。２片のうち一方には培地のみで懸濁した標識ＤＳＣ細胞を３１Ｇ注射針（株式会社ユニシス）装着したシリンジを用いて皮内に注入した。もう一方には終濃度０．５（ｖ／ｖ）％アテロコラーゲンに懸濁した標識ＤＳＣ細胞を同様に皮内に注入した。３７℃に静置してゲル化させた後４％ＰＦＡで固定し、透明化に供した。組織透明化はＣＵＢＩＣ－Ｌ（ＴＣＩ）及びＣＵＢＩＣ　Ｒ＋（ＴＣＩ）を使用し、Ｋ．　Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．（Ｋ．　Ｔａｎａｋａ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　ｆｏｒ　Ｔｉｓｓｕｅ　Ｃｌｅａｒｉｎｇ　Ｂａｓｅｄ　ｏｎ　Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ．　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ，　２４　（２０１８）　２１９６－２２１０）を参考に実験を行った。脱脂後に組織の核染色をＰｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉｏｄｉｄｅ（同仁化学研究所）により実施した。サンプルはＬｉｇｈｔＳｈｅｅｔ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察・撮影し、高精細３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェアＩｍａｒｉｓ（Ｚｅｉｓｓ）を用いて解析した。

　図３の点線内の部分を観察すると、皮膚内に注入されたＤＳＣ細胞由来の蛍光が観察できた。アテロコラーゲンと混合したＤＳＣ細胞は、エクスビボの皮膚組織に注入した後においても、より多くの細胞が保持されている傾向が観察できた（図３）。

Claims

　アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む、組成物。
　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、請求項１に記載の組成物。
　前記毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞と、前記アテロコラーゲンとが、皮膚に適用される直前に混合することによって調製される、請求項１又は２に記載の組成物。
　毛髪を再生するために用いられる、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
　アテロコラーゲンを含む第１剤と、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤とを含む、毛髪を再生するためのキット。
　前記第１剤と前記第２剤が混合された場合に、前記アテロコラーゲンが０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれるよう調整される、請求項６に記載のキット。
　前記第１剤と、前記第２剤とが、皮膚に適用される直前に混合して調製される、請求項６又は７に記載のキット。
　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、請求項６～８のいずれか１項に記載のキット。
　アテロコラーゲンと毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを混合する工程を含む、毛髪を再生するための組成物を製造する方法。
　前記アテロコラーゲンを、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれるように混合する、請求項１０に記載の方法。
　前記アテロコラーゲンと、前記毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを、皮膚に適用する直前に混合して調製する、請求項１０又は１１に記載の方法。
　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
　それを必要とする対象において毛髪を再生する方法であって、
アテロコラーゲンと、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とを含む組成物を前記対象の皮膚に適用する工程、
を含む、方法。
　前記組成物において、アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、請求項１４に記載の方法。
　前記組成物が、皮膚に適用する直前に調製される、請求項１４又は１５に記載の方法。
　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
　それを必要とする対象において毛髪を再生する方法であって、
（１－１）前記対象の皮膚にアテロコラーゲンを含む第１剤を適用する工程；及び
（１－２）前記第１剤が適用された前記皮膚の部位に、毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を含む第２剤を適用する工程、
並びに／又は
（２－１）前記対象の皮膚に前記第２剤を適用する工程；及び
（２－２）前記第２剤が適用された前記皮膚の部位に、前記第１剤を適用する工程
を含む、方法。
　前記第１剤が、アテロコラーゲンを０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含む、請求項１８に記載の方法。
　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、請求項１８又は１９に記載の方法。
　毛髪を再生するための医薬の製造のための、アテロコラーゲン及び毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の使用。
　前記アテロコラーゲンが、前記医薬において０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、請求項２１に記載の使用。
　前記アテロコラーゲンと、前記毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞とが、皮膚に適用される直前に混合することによって調製される、請求項２１又は２２に記載の使用。
　薄毛及び／又は脱毛症の治療に用いられる、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の使用。
　アテロコラーゲンとの併用により、毛髪を再生する組成物の製造のための毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の使用。
　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％の濃度で併用される、請求項２５に記載の使用。
　毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞を有効成分として含む、それを必要とする対象の皮膚においてアテロコラーゲンが適用された部位に適用されることを特徴とする、毛髪を再生するための組成物。
　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％の濃度で適用される、請求項２７に記載の組成物。
　皮膚適用部位における毛球部毛根鞘（ＤＳＣ）細胞の生着を促進するために用いられる、アテロコラーゲンを含む組成物。
　前記アテロコラーゲンが、０．０５（ｖ／ｖ）％～１．２５（ｖ／ｖ）％含まれる、請求項２７に記載の組成物。