JP2022031757A - 毛包およびデノボ乳頭の作製方法ならびにインビトロ試験およびインビボ移植のためのそれらの使用 - Google Patents
毛包およびデノボ乳頭の作製方法ならびにインビトロ試験およびインビボ移植のためのそれらの使用 Download PDFInfo
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Abstract
Description
毛包からの各種細胞の単離
標準のプロトコールの修正法(例えば、「Magerl et al.」に記載)を使用し、ヒトの毛包からDPF、CTSF、MC、KCを単離した。パンチ生検から単離した毛包、またはFUT毛髪移植から切り出した毛包を、ピンセットを使用して毛幹に固定し、結合組織鞘を切開し、毛球を反転させ、真皮乳頭および毛幹が毛母体と共に露出するよう、別のピンセットを使用して直径方向に注意深く互いを分離させる。この方法で、毛球の近位部は結合組織鞘線維芽細胞および真皮乳頭と共に、針/カニューレを使用して、極めて容易に毛包の残りの部分から分離することができる。この過程で、他に必要な毛母体角化細胞およびメラニン細胞を含有する毛幹もまた、その後の培養のために最適に切り離される。
間質血管細胞群(SFV)の作製
例えば、確立されたPureGraft(商標)法(Cytori GmbH、Switzerland)により、チューメセント脂肪吸引溶液の1リットル画分を腹部または臀部の皮下脂肪から取り出し、調製する。この方法では、チューメセント溶液を除去するために遠心分離および濃縮を実施する。その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Gibco)で希釈した、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)からの0.15%(重量/体積)Collagenase NB 6(GMPグレード)(0.12U/mgコラゲナーゼ;SERVA Electrophoresis GmbH)中、37℃で60分間解離を行った。180gで10分間の遠心分離後、脂質に富んだ上清を捨て、細胞のペレットをPBSで1回洗浄する。溶解緩衝液(0.15M塩化アンモニウム、Sigma-Aldrich)中で2分間のインキュベーションを行うことにより、赤血球を溶解させる。得られた間質血管細胞群(SVF)を完全培地(CM、Gibco)に取る。
外毛根鞘からの細胞(ORS KC)の作製
頭髪または顎鬚を有する対応部位を洗浄および消毒(70%エタノール)し、ゴムでコーティングしたピンセットで毎回20~30本の毛髪を引き抜く。組織層が付着している毛髪のみを容器に移し、PBS中で濯ぐ。その後、2mlのトリプシン/EDTA溶液中、37℃で20分間毛髪をインキュベートし、続いて、撹拌機により短時間混合する。4mlのトリプシン阻害剤で酵素反応を停止させる。これをPBSで洗浄し、懸濁液を200gで5分間遠心分離する。その後、細胞を培地に取り、引き続き培養に使用するか、または細胞の計数後、引き続きインビトロの毛包作製に使用することができる。
デノボ乳頭の作製
1,500個のDPFおよびCTSF細胞をピペットに取り、384ウエルの超低付着性丸底マルチウエルプレート(Corning)(1:1比のDMEM+10%FCSおよびDermaLife培地中)の窪みに移すか、または最初にSVF細胞または内皮細胞と混合し、その後マルチウエルプレートの窪みに移す。後者は200gで2分間遠心分離し、室温、20rpmで20分間インキュベートする。より長期の培養では、毎日培地を変える。
インビトロの毛包作製
分離した、または引き抜いた毛幹の組織分離で生じるメラニン細胞および角化細胞の混合物を細胞培養培地に取り、ピペットにより各デノボ乳頭(15,000細胞/マルチウエルプレートの窪み)に加える。この懸濁液を200gで1分間遠心分離し、室温、20rpmで30分間インキュベートする。より長期の培養では、毎日培地を変える。
毛包からの各種細胞の単離
標準のプロトコールの修正法(例えば、「Magerl et al.」に記載)を使用し、ヒトの毛包からDPF、CTSF、MC、KCを単離した。パンチ生検から単離した毛包、またはFUT毛髪移植から切り出した毛包を、ピンセットを使用して毛幹に固定し、結合組織鞘を切開し、毛球を反転させ、真皮乳頭および毛幹が毛母体と共に露出するよう、別のピンセットを使用して直径方向に注意深く互いを分離させる。この方法で、毛球の近位部は結合組織鞘線維芽細胞および真皮乳頭と共に、針/カニューレを使用して、極めて容易に毛包の残りの部分から分離することができる。この過程で、他に必要な毛母体角化細胞およびメラニン細胞を含有する毛幹もまた、その後の培養のために最適に切り離される。
間質血管細胞群(SFV)の作製
例えば、確立されたPureGraft(商標)法(Cytori GmbH、Switzerland)により、チューメセント脂肪吸引溶液の1リットル画分を腹部または臀部の皮下脂肪から取り出し、調製する。この方法では、チューメセント溶液を除去するために遠心分離および濃縮を実施する。その後、リン酸緩衝生理食塩水(PBS;Gibco)で希釈した、クロストリジウム・ヒストリチカム(Clostridium histolyticum)からの0.15%(重量/体積)Collagenase NB 6(GMPグレード)(0.12U/mgコラゲナーゼ;SERVA Electrophoresis GmbH)中、37℃で60分間解離を行った。180gで10分間の遠心分離後、脂質に富んだ上清を捨て、細胞のペレットをPBSで1回洗浄する。溶解緩衝液(0.15M塩化アンモニウム、Sigma-Aldrich)中で2分間のインキュベーションを行うことにより、赤血球を溶解させる。得られた間質血管細胞群(SVF)を完全培地(CM、Gibco)に取る。
外毛根鞘からの細胞(ORS KC)の作製
頭髪または顎鬚を有する対応部位を洗浄および消毒(70%エタノール)し、ゴムでコーティングしたピンセットで毎回20~30本の毛髪を引き抜く。組織層が付着している毛髪のみを容器に移し、PBS中で濯ぐ。その後、2mlのトリプシン/EDTA溶液中、37℃で20分間毛髪をインキュベートし、続いて、撹拌機により短時間混合する。4mlのトリプシン阻害剤で酵素反応を停止させる。これをPBSで洗浄し、懸濁液を200gで5分間遠心分離する。その後、細胞を培地に取り、引き続き培養に使用するか、または細胞の計数後、引き続きインビトロの毛包作製に使用することができる。
デノボ乳頭の作製
1,500個のDPFおよびCTSF細胞をピペットに取り、384ウエルの超低付着性丸底マルチウエルプレート(Corning)(1:1比のDMEM+10%FCSおよびDermaLife培地中)の窪みに移すか、または最初にSVF細胞または内皮細胞と混合し、その後マルチウエルプレートの窪みに移す。後者は200gで2分間遠心分離し、室温、20rpmで20分間インキュベートする。より長期の培養では、毎日培地を変える。
インビトロの毛包作製
分離した、または引き抜いた毛幹の組織分離で生じるメラニン細胞および角化細胞の混合物を細胞培養培地に取り、ピペットにより各デノボ乳頭(15,000細胞/マルチウエルプレートの窪み)に加える。この懸濁液を200gで1分間遠心分離し、室温、20rpmで30分間インキュベートする。より長期の培養では、毎日培地を変える。
Claims (15)
- デノボ乳頭の作製方法であって、
a)少なくとも1個の毛包の少なくとも1個の真皮乳頭(DP)から単離した真皮毛乳頭線維芽細胞(DPF)を提供するステップ、
b)少なくとも1個の毛包から単離した結合組織鞘線維芽細胞(CTSF)を提供するステップ、および
c)球状細胞凝集体を形成するために実質的に非付着性の細胞培養条件下で前記DPFと前記CTSFとを共培養するステップ
を含むことを特徴とするデノボ乳頭の作製方法。 - 請求項1に記載の方法において、前記DPFと前記CTSFとを、1~20:1~20の比で共培養することを特徴とする方法。
- 請求項1または2に記載の方法において、前記ステップc)の共培養で、内皮細胞(EC)および/または間質血管細胞群(SVF)を追加的に含むことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至3の何れか1項に記載の方法において、前記デノボ乳頭は、2~20,000個、好ましくは10~15,000個、より好ましくは1,000~10,000個、より一層好ましくは1,500~5,000個の細胞から構成されることを特徴とする方法。
- 請求項1乃至4の何れか1項に記載の方法において、前記デノボ乳頭を細胞外マトリックスタンパク質で被覆することを特徴とする方法。
- 請求項1乃至5の何れか1項に記載の方法において、前記共培養を回転運動、旋回運動または振動運動下で行うことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至6の何れか1項に記載の方法において、前記共培養を少なくとも10分間、好ましくは20分間~48時間行うことを特徴とする方法。
- 請求項1乃至7の何れか1項に記載の方法により作製されてなることを特徴とするデノボ乳頭。
- 毛包の作製方法であって、
a)請求項1乃至7の何れか1項に記載の方法により作製された少なくとも1個のデノボ乳頭を提供するステップ、
b)角化細胞(KC)、メラニン細胞(MC)または結合組織鞘線維芽細胞(CTSF)から選択される少なくとも1種のさらなる細胞集団を提供するステップ、および
c)実質的に非付着性の細胞培養条件下で、前記デノボ乳頭を前記少なくとも1種のさらなる細胞集団と共培養するステップ
を含むことを特徴とする毛包の作製方法。 - 請求項9に記載の方法において、前記デノボ乳頭をKC、MCおよび/またはCTSFと1~10:1~50の比で共培養することを特徴とする方法。
- 請求項9または10に記載の方法において、前記少なくとも1種のさらなる細胞集団は、毛包から得ることができる、および/または毛包から得られることを特徴とする方法。
- 請求項9乃至11の何れか1項に記載の方法において、前記共培養を少なくとも10分間、好ましくは20分間~48時間行うことを特徴とする方法。
- 請求項8乃至12の何れか1項に記載の方法により作製されてなることを特徴とする毛包。
- 請求項8に記載のデノボ乳頭および/または請求項13に記載の毛包を含むことを特徴とする毛髪均等物。
- 請求項14に記載の有効量の皮膚均等物を、任意選択により薬学的に許容される賦形剤と共に含むことを特徴とするトランスプラント。
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