JP2002530069A - 生物工学的組織構築物およびそれを生成および使用する方法 - Google Patents
生物工学的組織構築物およびそれを生成および使用する方法Info
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Abstract
Description
細胞を誘導する生体外での方法に向けられる。組織様特性を有するこの生きた細
胞外マトリックスは、試験または臨床目的のために使用できる。
の構造的および機能的関係を理解するライフサイエンスの概念と結びつける。組
織工学の目標は、組織機能を保持、維持、または改善する生物学的置換の開発お
よび最終使用である。したがって、組織工学を通して、実験室で生物工学的組織
を設計および製造することが可能である。生物工学的組織としては、通常元来の
哺乳類またはヒト組織と関連する細胞、および合成または外因性マトリックスス
カホードを挙げることができる。新たな生物工学的組織は、宿主に移殖された場
合、機能性があり、そして宿主の体に恒久的に組込まれるか、または受容体宿主
患者から得られる細胞によって進行的に生物再生されるに違いない。支持体構成
員またはスカホードなしに等価の組織の作製で、新たな生物工学的組織を作成す
る上での科学的挑戦に至る。
ード構成員の必要なしに、培養細胞および内因的に産生された細胞外マトリック
ス成分の生物工学的組織構築物に向けられる。したがって、本発明は、ヒト細胞
、および例えば、生物工学的組織構築物が、ヒトに使用するために設計される場
合、それらの細胞により産生されるヒト・マトリックス成分から全体的に有利に
作製できる。
構成員のいずれかの添加なしに、細胞外マトリックス成分を産生する、線維芽細
胞のような培養物中の細胞を刺激することによって、組織構築物を産生する方法
にも向けられる。
線維芽細胞のような培養物中の細胞の刺激によって、および/またはウシ血清ま
たは臓器抽出物のような、未定義または非ヒト由来の生物学的成分を使用するこ
となし、組織構築物を産生する方法にも向けられる。
る培養組織構築物を産生する様々な細胞型の一連の種付けによって作成できる。
外マトリックス成分の添加なしに、培養細胞によって産生および自己組立される
。
は担体についての必要なしに形成および直接的に移殖される、培養装置から容易
にそして剥ぎ取り可能に除去されるべき、それについて取扱い可能になる。
する患者に対する移植のような医療目的のために、または安全性試験または医薬
、化粧、および化学製品の確証のような生体外での組織試験または動物移植のた
めに有用である。 (本発明の詳細な説明) これまで、最近工業化された生きた組織構築物は、完全には細胞で組立てられ
ず、そして外因性マトリックス成分または構造または支持のための合成構成員の
添加または組込みのいずれか、または両方に依るに違いない。
元来の特性の多くを示す。それにより生成された組織構築物は、患者に移植する
か、または生体外での試験のために使用しうる。
する細胞外マトリックスを合成および分泌する能力のある場合に、第一の細胞型
および内因的に産生される細胞外マトリックスを包含する細胞−マトリックス構
築物である。
リックス、およびその上、または第一の細胞型によって形成される細胞−マトリ
ックス構築物内に沈着した第二の型の細胞の層を包含する二層構築物である。
のような線維芽細胞を含む細胞−マトリックス構築物である。
ノサイトの層と共に、培養皮膚構築物を形成する、表皮から由来するもののよう
な線維芽細胞を含んで、培養二層皮膚構築物になる細胞−マトリックス構築物で
ある。本発明の培養皮膚構築物は、元来の皮膚の多くの物理的、形態学的および
生化学的特徴を発現する。
中に化学的に未定義の成分を利用しないヒト由来細胞を含む定義されたシステム
で形成される、ヒト皮膚構築物である皮膚の表皮層に類似する組織構築物である
。
または非ヒト生物学的成分または細胞でなく、ヒト由来細胞を含む化学的に定義
されるシステムで作製される。
産生細胞、および、さらに簡単には、マトリックスが、細胞を培養することによ
って、完全に細胞で合成され、そして組立てられる「マトリックス」と称される
、内因的に産生される細胞外マトリックス成分の構造的層を包含する。この層は
、ここで、細胞が、それらのマトリックス内およびそれらを通して、それら自身
を分泌し、含有するので、「細胞−マトリックス構築物」または「細胞−マトリ
ックス層」と称される。培養組織構築物は、外因性マトリックス成分を必要とし
せず、したがって、含まない、すなわち、マトリックス成分は、培養細胞によっ
て産生されずに、他の手段によって導入される。いっその好ましい具体例では、
ヒト皮膚の線維芽細胞によって産生される細胞−マトリックス構築物は、元来の
皮膚に類似するコラーゲンの優勢な濃度を示すことが示される。電子顕微鏡によ
って立証されるとおり、マトリックスは、生来のコラーゲンに類似する原線維お
よび原線維束の組織を包装することと同様に、4分の1差の67nm結合パター
ンを示すコラーゲンを含む自然界で多孔性である。遅延還元SDS−PAGEは
、生来のヒト皮膚に見られる優勢なコラーゲン型であるこれらの構築物中のI型
およびIII型コラーゲンの両方の存在を検出した。標準免疫組織化学(IHC
)技術を用いて、皮膚の細胞−マトリックス構築物は、コラーゲン原線維に結合 されることが知られ、そして生体内で原線維の直径を調節すると思われているデ ルマタン硫酸プロテオグリカンである、デコリンに対して陽性に染色する。デコ リンは、TEMを用いて構築物中で可視化もされうる。産生した組織は、例えば 、修復中の間葉または組織で見られる細胞外マトリックス糖タンパク質であるテ ナスシンに対して陽性に染色もする。生体内で修復中の組織とより同様に、培養 基中で産生された組織は、マトリックスが形成されるときにI型対III型コラ ーゲンのそれの比を増大することが示された。理論により結合されることを望ま ない一方で、細胞は、それらの間の開放空間に、主にIII型コラーゲンおよび フィブロネクチンから構成される顆粒組織に類似のゆるいマトリックスで、すば やく充填し、そしてその後、このゆるいマトリックスを、主にI型コラーゲンか ら構成される周密マトリックスで再生すると思われる。産生された細胞−マトリ ックスは、ヒアルロン酸(HA)のようなグリコサアミノグリカン(GAG); フィブロネクチン;ビグリカンおよびベルシカンのようなデコリンに加えてプロ テオグリカン;およびジヒアルロン酸;ジコンドロイチン−O−硫酸;ジコンド ロイチン−4−硫酸;ジコンドロイチン−6−硫酸;ジコンドロイチン−4,6 −硫酸;ジコンドロイチン−4−硫酸−UA−2S;およびジコンドロイチン− 6−硫酸−UA−2Sのような硫酸グリコサアミノグリカンのプロファイルを含 むことが示された。これらの構造的および生化学的特性は、構築物が培養基中で 発生するとき、それら自身を示し、そして構築物がその最終形態に近づくときに 明らかに明白である。十分に形成された培養皮膚の細胞−マトリックス構築物で のこれらの成分の存在は、その構築物が、正常な真皮のものに近づく構造的およ び生化学的特性を示すことを示す。
のリストであるときに、皮膚の線維芽細胞から形成され、他の型の線維芽細胞か
ら形成される培養細胞−マトリックス構築物が、これらの特性の多く、およびそ
れらが起源する組織型についての他の表現型を生じることが認識されるべきであ
る。ある種の場合には、線維芽細胞は、化学的露出または接触、物理的ストレス
のいずれかにより、またはトランスジェニック手段により非表現型成分を発現す
るように誘導されうる。本発明の別の好ましい具体例は、その上に沈着した細胞
の第二層を有する細胞−マトリックス層である。細胞の第二層を、細胞−マトリ
ックス層で培養して、生物工学的に二層化した組織構築物を形成する。さらに好
ましい具体例では、第二層の細胞は、上皮起源のものである。最も好ましい具体
例では、第二層は、第一の細胞−マトリックス層と一緒に、皮膚層を形成する皮
膚の線維芽細胞および内因性マトリックスから形成された細胞−マトリックス構
築物が、生きた皮膚構築物を包含する培養ヒト・ケラチノサイトを包含する。十
分に形成されたときに、表皮層は、基底層、超基底層、顆粒層および角質層を示
すケラチノ細胞の多層化され、層にされ、そして十分に分化された層である。皮
膚構築物は、透過型電子顕微鏡(TEM)によって示されるときに、皮膚−表皮
接合部に存在する十分に発達した基底膜を有する。基底膜は、TEMによって可
視化されるときにIII型コラーゲンから構成される原線維に足場をつけること
により印される、ヘミデスモソームの周囲で最も厚くみえる。足場原線維は、基 底膜から出ること、および皮膚層中のコラーゲン原線維を捕捉することを見るこ とができる。他の基底膜成分と同様に、これらの足場原線維は、ケラチノサイト によって分泌されることも知られている。ケラチノサイトが、それら自身での基 底膜成分を分泌する能力がある場合、認識可能な基底膜は、線維芽細胞の不在下 で形成しないことも知られている。本発明の皮膚構築物の免疫組織化学的染色は 、基底膜タンパク質であるラミニンが存在することも示された。
の細胞型である、細胞外マトリックス産生細胞型を、基質に蒔き、培養および誘
導して、それらの周囲に組織化細胞外マトリックスを合成および分泌して、細胞
−マトリックス構築物を形成する。本発明の別の好ましい方法では、細胞−マト
リックス構築物の表面に、第二の細胞型の細胞を蒔き、そして培養して、二層組
織構築物を形成する。より好ましい方法では、元来のヒト皮膚に類似の特性を示
す十分な厚みの皮膚構築物が、ケラチノサイトのようなヒト上皮細胞が、播種さ
れ、そして、十分に分化した層化表皮層を形成するのに十分な条件下で培養され
る皮膚層である、皮膚の細胞およびマトリックスの細胞−マトリックスを形成す
るマトリックス合成を誘導するのに十分な条件下で、ヒト皮膚の線維芽細胞のよ
うな線維芽細胞を培養することによって形成される。
少なくとも1つの細胞外マトリックス産生細胞型を培養すること;および (b)段階(a)の細胞を刺激して、細胞外マトリックス成分を合成、分泌お
よび組織化させ、それらの細胞により合成される細胞およびマトリックスから構
成される組織構築物を形成し、段階(a)および(b)が、同時にまたは連続し
て行われるうることを包含する。
成するために、さらに、方法は、(c)形成された組織−構築物の表面で第二の
型の細胞を培養して、二層組織構築物を産生する段階を包含する。
ス成分を産生および分泌し、そして細胞外マトリックス成分を組織化して、細胞
−マトリックス構築物を形成する能力のある任意の細胞型でありうる。1つ以上
の細胞外マトリックス産生細胞型を、培養して、細胞−マトリックス構築物を形
成しうる。異なる細胞型または組織起源の細胞を、混合物として一緒に培養して
、生来の組織で見られるものと類似の相補的成分および構造を生じうる。例えば
、細胞外マトリックス産生細胞型は、それと混合した他の細胞型を有して、第一
の細胞型によって正常に産生されない多量の細胞外マトリックスを産生しうる。
代替的には、細胞外マトリックス産生細胞型は、本発明の特定の皮膚構築物での
ようなマトリックス態様の細胞−マトリックス構築物の全般的形成に実質的に寄
与することなしに、組織中に特殊化された組織構造を形成する他の細胞型と混合
することもできる。
本発明に使用するための好ましい細胞型は、間葉から由来する。さらに好ましい
細胞型は、線維芽細胞、間質細胞、および他の支持接触性組織細胞であり、最も
好ましくは、ヒトの皮膚構築物の産生のためにヒト真皮で見られるヒト皮膚の線
維芽細胞である。線維芽細胞は、一般に、本質的にコラーゲンである、多量の細
胞外マトリックスタンパク質を産生する。線維芽細胞によって産生される数種の
型のコラーゲンがあるが、しかし、I型コラーゲンは、生体内で最も有効である
。ヒト線維芽細胞株は、制限されないが、新生男児包皮、真皮、腱、肺、臍帯、
軟骨、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸を含めた多数の起源から誘導されう
る。ヒト細胞としては、線維芽細胞に限定されず、平滑筋細胞、軟骨細胞、およ
び間葉起源の他の接触性組織細胞が挙げられる。組織構築物の産生に使用される
マトリックス産生細胞の起源が、本発明の培養法を使用した後に類似または模倣
すべきものである組織型から由来することは、要求されないが、好ましい。例え
ば、皮膚構築物が産生される具体例では、好ましいマトリックス産生細胞は、線
維芽細胞、好ましくは皮膚起源のものである。別の好ましい具体例では、毛包の
皮膚乳頭からの顕微解剖によって単離される線維芽細胞は、マトリックス単独、
または他の線維芽細胞に結合して産生するのに使用されうる。角膜構築物が産生
される具体例では、マトリックス産生細胞は、角膜間質から由来する。細胞供与
体は、発達および年齢で変化しうる。細胞は、胚、新生児、または成人を含めた
より年齢の高い個体の供与組織から由来しうる。間葉幹細胞のような胚先祖細胞
は、本発明に使用でき、そして所望の組織に発達するまで分化を誘導しうる。
胞は、ヒト起源から得られる細胞に限定されない。他の哺乳類種から得られる細
胞は、限定されないが、ウマ、イヌ、ブタ、ウシ、およびヒツジ起源が挙げられ
る;またはマウスまたはラットのようなげっ歯類種が使用しうる。さらに、自発
的に、化学的に、またはウイルスで形質移入または組換え細胞または遺伝子操作
した細胞である細胞も、本発明に使用されうる。1つ以上の細胞型を組込む具体
例のものについては、2つまたはそれ以上の起源から得られる正常な細胞のキメ
ラ混合物;正常で遺伝的に修飾した、または形質移入した細胞の混合物;または
2つまたはそれ以上の種または組織起源の細胞の混合物が使用されうる。
治療法のレベルを増大させる必要のある患者についての薬物送出移殖片として作
用する組織構築物を作製する細胞−マトリックス構築物の産生に使用しうる。細
胞は、連続量の時間、または患者に存在する症状により生物学的、化学的、また
は熱的に信号発生されるときに必要とされる場合、移殖片組換え細胞産物、成長
因子、ホルモン、ペプチドまたはタンパク質を介して患者に生成および送出しう
る。長期または短期のいずれかの遺伝子産物発現は、培養組織構築物の指示によ
って望みうる。長期発現は、培養組織構築物が、延長された期間、患者に治療用
製品を植付けて送出するときに望ましい。対照的に、短期発現は、培養組織構築
物が、培養組織構築物の細胞が正常なまたは正常に近い治癒を促進するか、また
は創傷部位の乱切を減少させることにある創傷を示す患者に移植される例で望ま
しい。いったん創傷が治ったら、培養組織構築物から得られる遺伝子産物は、も
はや必要とされないか、その部位ではもはや望ましくない。細胞は、ホルモン性
でなく、高いレベルで発現または細胞外マトリックス、そして改善された創傷治
癒にとって治療的に有利である生きた細胞を含ませた移殖片デバイスを、新生血
管形成を促進または指示するか、または瘢痕またはケロイド形成を最小限にさせ
るある種の方法で修飾されたタンパク質または異なる型の細胞外マトリックス成
分を発現するように遺伝子操作されうる。これらの手段は、一般に、当業界で知
られ、そしてSambrookら、分子クローニング、実験室マニュアル、コー
ルド・スプリング・ハーバー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニュ
ーヨーク(1989年)に記述され、参照してここに組込まれる。上述型の細胞
の全ては、本発明に使用される場合、「マトリックス産生細胞」の定義の範囲内
に含まれる。
コラーゲン、特にコラーゲンI型である。原線維コラーゲンは、細胞−マトリッ
クス構造での主要な成分である;しかし、本発明は、このタンパク質またはタン
パク質型のみから構成されるマトリックスに限定されない。例えば、他のコラー
ゲンは、コラーゲン型II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX
、X、XI、XII、XIII、XIV、XV、XVI、XVII、XVIII 、XIXのようなコラーゲンファミリーから得られる原線維性および非原線維性 コラーゲンの両方は、適切な細胞型の使用によって産生されうる。同様に、最近 の方法を用いて産生および沈着されうる他のマトリックスタンパク質としては、 それに限定されないが、エラスチン;デコリンまたはビグリカンのようなプロテ オグリカン;またはテナスシンのような糖タンパク質;ビトロネクチン;フィブ ロネクチン;ラミニン、スロボスポリンI、およびヒアルロン酸(HA)のよう なグリコサアミノグリカン(GAG)が挙げられる。
コ、または回転ボトルのような動物細胞または組織培養物に適切な容器中で培養
される。細胞が育成されうる適切な細胞成長表面は、細胞が、付着でき、そして
細胞−マトリックス構築物を形成するための足場手段を提供できる、任意の生物
学的に適合性のある材料でありうる。ガラス;ステンレス鋼;ポリカルボネート
、ポリスチレン、塩化ポリビニル、ポリビニリデン、ポリジメチルシロキサン、
フルオロポリマー、およびフッ化エチレンプロピレンを含めた重合体;および融
合シリカ、ポリシリコン、またはシリコン結晶を含めたシリコン基質のような材
料が、細胞成長表面として使用しうる。細胞成長表面材料は、化学的に治療また
は修飾されるか、静電気的に負荷されるか、またはポリリシンまたはペプチドの
ような生物学的製品で被覆されうる。ペプチド被覆の例は、RGDペプチドであ
る。
物への培地の二層接触を可能にするか、または培養のみからの接触に対処する膜
の頂部および底部表面の両方を連通する孔を有する細胞成長表面が、好ましい。
二層接触は、培地に、培地中に含まれる栄養に露出する最大限の表面領域につい
ての発達中の構築物の頂部および基底の両方を接触させる。培地は、形成培養組
織構築物の底部のみとも接触し、その結果、頂部表面は、培養皮膚構築物の発達
にあるときに、空気にさらされ得る。好ましい培養容器は、担体挿入物、培地を
含む培養容器中で懸濁される多孔性膜のような培養処理透過構成員を利用するも
のである。典型的には、膜は、蓋で覆われ得るペトリ皿または培養皿のような基
底内に挿入され、そして干渉する環状構成員またはフレームワークの一方の末端
に確保される。多孔性膜を有する担体挿入物を組込む培養容器が、当業界で知ら
れ、そして本発明を行うのに好ましく、そしてそのいくつかが、市販で入手可能
になった分野で、第5,766,937号、第5,466,602号、第5,3
66,893号、第5,358,871号、第5,215,920号、第5,0
26,649号、第4,871,674号、第4,608,342号を含めた多
くの米国特許に記述され、それらの開示は、ここに組込まれる。これらの型の培
養容器が使用される場合、組織構築物は、膜の一方の表面で産生され、好ましく
は上方に向かう表面である頂部が好ましく、そして培養物は、頂部および基底表
面の両方で細胞培地によって接触される。成長表面での孔は、膜を通した望まし
くない培養物に栄養を供給するための培養培地の継代に対処し、したがって、細
胞が、二層にまたは、基底側から唯一供給させる。好ましい孔サイズは、膜を通
した細胞の成長に対処しないだけ十分に小さく、さらに、毛管作用によるように
、細胞−マトリックス構築物の基底表面まで培養培地で含有される栄養の自由な
通路に対処するのみ十分大きなものである。好ましい孔サイズは、約3ミクロン
未満であるが、約0.1ミクロンから約3ミクロンの間、さらに好ましくは約0
.2ミクロンから約1ミクロンまでの間、そして最も好ましくは約0.4ミクロ
ンから約0.6ミクロンサイズ孔が使用される。ヒト皮膚の線維芽細胞の場合に
は、最も好ましい材料は、孔サイズが、約0.4から約0.6ミクロンの間であ
ることを示すポリカルボレートである。最大限の孔サイズは、細胞のサイズのみ
ならず、その形状を変化し、そして膜を通過する細胞の能力にも依存する。組織
様構築物が、表面に付着するが、基質を組込んだり、または包んだりせず、それ
により、最小限の力で剥ぎ取ることによるように、それから脱着可能であること
が重要である。形成された組織構築物のサイズおよび形状は、それが成長する容
器表面または膜のサイズによって検出される。基質は、丸であるか、尖っている
か、または丸められたコーナー角を有する形状、または不規則な形状でありうる
。基質は、平坦であるか、または創傷で干渉するか、生来の組織の物理的構造を
模倣する形状構築物を産生する型として輪郭を描くこともできる。成長基質の大
きな表面領域の原因を示すために、割合と多い細胞を、表面に蒔き、そして多量
の培地が、細胞を十分に包みそして栄養分を与えることが必要とされる。組織構
築物が、最終的に形成される場合、単独層細胞−マトリックス構築物または二層
構築物であろうとなかろうと、患者に移植する前に膜基質から剥ぎ取ることによ
って除去される。
合成または生体吸収性構成員に依存しない。網目構成員は、織物、編物またはフ
ェルト材料として組織化される。網目構成員が使用されるシステムでは、細胞は
、網目構成員上で培養され、そして網目の間隙の側面および範囲内で成長して、
培養組織構築物内に網目を包み、そして組込む。このような網目を組込む方法に
よって形成される最終構築物は、物理的支持体として、そしてバルクとしてそれ
に依る。合成網目構成員に依る培養組織構築物の例は、Naughtonらに対
する米国特許番号第5,580,781号、第5,443,950号、第5,2
66,480号、第5,032,508号、第4,963,489号に見られる
。
培養培地への灌流手段を使用しうる。静電気的システムでは、培養培地は、培地
が運動中である灌流システムと対照的になお、そして比較的運動性がない。培地
の灌流は、細胞の生存性に影響し、そしてマトリックス層の発達を増大する。灌
流手段としては、それに限定されないが、培地を攪拌するために、培養膜を含む
基質担体のすぐ下(下に)に、または隣接する培養皿中に磁性攪拌棒または動力
付き圧縮器を使用すること;培養皿またはチャンバー内に、またはを通して培地
を引き抜くこと;振蘯または回転プラットホーム上で培養皿を温和に曝気するこ
と;またはローラーボトル中で生じた場合、回転させることが挙げられる。他の
灌流手段は、本発明の方法に使用するために当業者によって決定されうる。
生されるべき組織構造に基づいて選択される。使用される培養培地、および細胞
成長を促進するのに必要とされる特定培養条件、マトリックス合成、および生存
性は、育成される細胞の型による。
成は、様々な補足が様々な目的のための必要である場合、作製の各段階で変化す
る。好ましい方法では、細胞−マトリックス層は、定義された条件下で形成され
る、すなわち、化学的に定義された培地で培養される。別の好ましい方法では、
組織構築物は、両方の細胞型が、定義の培養培地で培養される、そこで沈着し、
培養された細胞の第二の層を具備する細胞−マトリックス層を包含する。代替的
に、組織構築物は、定義された培地条件下で作製された細胞−マトリックス層、
および未定義の培地条件下でそこに形成される第二の層を包含する。逆に、組織
構築物は、未定義の培地条件下で作製されうる細胞−マトリックス層、および定
義された培地条件下でその上に形成される第二の層を包含する。
のない培地または、組織抽出物例えば、血清、下垂体抽出物、視床下部抽出物、
胎盤抽出物、または胚抽出物、および供給細胞によって分泌されるタンパク質お
よび因子である。最も好ましい具体例では、培地は、未定義の成分および非ヒト
起源から由来する定義された生物学的成分を含まない。未定義の成分の添加は、
好ましくないが、それらは、組織構築物を首尾よく作製するために、培養基中で
任意の点で開示方法によって使用されうる。本発明は、非ヒト動物源から由来す
る化学的に定義した成分を用いてスクリーニングしたヒト細胞を利用することを
行うときに、結果物である組織構築物は、定義されたヒト組織構築物である。合
成官能当量を添加して、最も好ましい作製方法に使用するために化学的に定義さ
れた定義の全範囲内の化学的に定義された培地を補足しうる。一般に、細胞培養
の当業者は、適切な自然のヒト、ヒト組換え体、または過度の調査または実験な
しに、本発明の培養培地を補足する一般に公知の動物成分に対する合成等価物を
決定できる。診療所でこのような構築物を使用する上での利点は、偶発的動物ま
たは交雑種ウイルス混入および感染の関係が減少されることである。試験のシナ
リオで、化学的に定義された構築物の利点は、試験されるときに、未定義の成分
の存在により、混乱されるべき結果の機会がないことである。
熟者は、本発明の組織構築物を首尾よく産生することについて理にかなった見込
みを動物細胞培養の分野で適切な栄養塩基を決定できる。多くの市販で入手可能
な栄養源は、本発明の実施の上で有用である。これらとしては、ダルベッコの修
飾イーグル培地(DMEM);最小必須培地(MEM);M199;RPMI1
640;イスコフの修飾ダルベッコ培地(EDMEM)のような無機塩、エネル
ギー源、アミノ酸、およびB−ビタミンを供給する市販で入手可能な栄養源が挙
げられる。最小必須培地(MEM)およびM199は、リン脂質前駆体および非
必須アミノ酸での追加の補足を必要とする。追加のアミノ酸、核酸、酵素コファ
クター、リン脂質前駆体、および無機塩を供給する市販で入手可能なビタミン富
化混合物としては、ハムのF−12、ハムのF−10、NCTC109、および
NCTC135が挙げられる。濃度を変化させる上であろうと、全ての基本培地
は、他の基本培地成分と一緒に、グルコース、アミノ酸、ビタミンおよび無機イ
オンの境内で細胞についての基礎的栄養源を提供する。本発明の最も好ましい基
本培地は、カルシウム不含または低カルシウムのダルベッコの修飾イーグル培地
(DMEM)のいずれかの栄養塩基、または代替的に、それぞれ3対1の比から
1対3の比までの間のDMEMおよびハムのF−12を包含する。
本発明の細胞の培養のための定義培養培地は、Parenteauに対する米国
特許番号第5,712,163号、および国際PCT公報番号WO95/314
73号に記述され、それらの開示は、参照してここに組込まれる。他の培地は、
HamおよびMcKeehan、Methods in Enzymology
、58巻:44−93頁(1979年)で開示されるもののように当業界で公知
であるか、または他の適切な化学的に定義された培地については、Botten
steinらで、Methods in Enzymology、58巻:94
−109頁(1979年)に開示される。好ましい具体例では、基本培地は、動
物細胞培養で習熟者に知られている以下の成分で補足される。インシュリン、ト
ランスフェリン、トリヨードチロニン(T3)、および補足についての濃度およ
び置換が、習熟者によって決定されうる、いずれかまたは両方のエタノールアミ
ンおよびo−ホスホリル−エタノールアミン。
の摂取を促進するポリペプチドホルモンである。インシュリンまたはインシュリ
ン様成長因子(IGF)の補足は、グルコースおよびアミノ酸を取込む細胞の能
力の最終的枯渇、および細胞表現型の可能性のある分解がある場合に長期培養に
必要である。インシュリンは、動物、例えばウシ、ヒト源または、ヒト組換えイ
ンシュリンのような組換え手段によって誘導されうる。したがって、ヒト・イン
シュリンは、非ヒト生物学的源から由来しない化学的に定義された成分の資格が
ある。インシュリン補足は、一連の培養に適切であり、そして広範な濃度で培地
に供給される。好ましい濃度範囲は、約0.1μg/mlから約500μg/m
lまでの間、さらに好ましくは約5μg/mlから約400μg/ml、そして
最も好ましくは約375μg/mlである。IGF−1またはIGF−2のよう
なインシュリン様成長因子の補足のための濃度は、培養のために選択された細胞
について当業者によって容易に決定されうる。
る必須の痕跡要素である。鉄は、その遊離形態で細胞に毒性でありうるので、血
清中では、好ましくは約0.05から約50μg/mlの間、さらに好ましくは
約5μg/mlの濃度範囲でトランスフェリンに結合した細胞に供給される。
維持する培地中に含まれるチロイドホルモンの活性形態である。トリヨードチロ
ニンは、約0から約400pMの間の、さらに好ましくは約2から約200pM
の間の濃度範囲で、そして最も好ましくは約20pMで培地に補足される。
いずれかまたは両方を、その機能が、イノシトール経路および脂肪酸代謝での重
要な前駆体であるものに添加する。血清に正常に見られる脂質の補足は、血清不
含培地で必要である。エタノールアミンおよびo−ホスホリル−エタノールアミ
ンは、約10−4から約10−2Mまでの間の濃度範囲で、さらに好ましくは約
1×10−4Mで培地に供される。
チゾン、セレニウムおよびL−グルタミンのような細胞成長を改善する他の成分
をさらに補足される。
よびケラチノサイトトランスグルタミナーゼ含有量のような分化した特徴を増強
するケラチノサイト培養で見られた(Rubinら、J.Cell Physi
ol.、138巻:208−214頁(1986年))。したがって、ヒドロコ
ルチゾンは、ケラチノサイトシート状移殖片または皮膚構築物の形成でのような
これらの特徴が、有益である例で、望ましい添加剤である。ヒドロコルチゾンは
、約0.01μg/mlから約4.0μg/mlの濃度範囲で、最も好ましくは
約0.4μg/mlから16μg/mlの間で提供されうる。
ニウムの痕跡要素を再補足する。セレニウムは、約10-9から約10-7Mまでの
濃度範囲で、最も好ましくは約5.3×10-8Mで培地に供されうる。
、または不十分な量存在する場合に添加されうる。L−グルタミンは、グルタM
AX−ITM(ジブコ・ビーアールエル、ニューヨーク州グランドアイランド)の
商標の下販売されるもののような安定な形態で供給もされる。グルタMAX−I TM は、L−アラニル−L−グルタミンの安定なジペプチド形態であり、そしてL
−グルタミンと相互交換的に使用でき、そしてL−グルタミンに対する置換基と
して当モル濃度で供給される。ジペプチドは、保存での時間を超えて、そして培
地中のL−グルタミンの有効な濃度での不確かさに至りうるインキュベーション
期間じゅう分解からのL−グルタミンに対する安定性を提供する。典型的には、
基本培地に、好ましくは約1mMから約6mMの間、さらに好ましくは約2mM
から約5mMまでの間、そして最も好ましくは4mMのL−グルタミンまたはグ
ルタMAX−ITMを補足する。
て培養物の確立の助けになる培地にも添加されうる。生来の形態でのEGFまた
は組換え形態が使用されうる。ヒト形態、生来の、または組換え体のEGFは、
非ヒト生物学的成分を含まない皮膚等価物を作成するときに、培地で使用するこ
とが好ましい。EGFは、任意の成分であり、そして約1から約15ng/mL
の間、さらに好ましくは約5から10ng/mLの間の濃度で供される。
本発明の成分が、それらの物理的特性に匹敵する従来の方法論を用いて作製およ
び組立てられうると解釈されるべきである。入手可能性または経済性の目的で、
特定の成分を、適切な類似体または機能的に等価な作用剤に置換し、そして類似
の結果を達することが当業者によく知られている。自然に発生する成長因子は、
本発明の作業に使用される場合に、類似の質および結果を示す組換えまたは合成
成長因子に置換されうる。
たは製造後の濾過のような従来の手段によって無菌にさせる。適切な防腐手段は
、以下の実施例を通して使用された。DMEMおよびF−12を、最初に合せ、
そしてその後、個々の成分を添加して培地を完成させる。全ての成分の保存溶液
は、4℃で保存されうる栄養源を除いて、−20℃で保存できる。全ての保存溶
液は、上に列記される500×最終濃度で作製される。インシュリン、トランス
フェリンおよびトリヨードチロニン(全てシグマから得た)の保存溶液は、以下
のとおり作製される:トリホードチロニンは、2:1の比で1N塩酸(HCl)
中の絶対エタノールに最初に溶解される。インシュリンは、希釈HCl(およそ
0.1N)で溶解され、そしてトランスフェリンは、水に溶解される。その後、
3つは、水で500×濃度まで混合および希釈される。エタノールアミンおよび
o−ホスホリル−エタノールアミンは、水で500×濃度まで溶解され、そして
濾過して無菌化する。プロゲステロンを、絶対エタノールに溶解し、そして水で
希釈する。ヒドロコルチゾンを、絶対エタノールに溶解し、そしてリン酸緩衝生
理食塩水(PBS)で希釈する。セレニウムを、水で500×濃度まで溶解し、
そして濾過して無菌化する。EGFは、無菌を購入し、そしてPBSに溶解させ
る。アデニンは、溶解するのが困難であるが、当業者に知られる任意の数の方法
によって溶解されうる。血清アルブミンは、それらを溶液中で安定化するために
、ある種の成分に添加でき、そして現在、ヒトまたは動物源のいずれから誘導さ
れる。例えば、ヒト血清アルブミン(HSA)またはウシ血清アルブミン(BS
A)を、長期保存のために、添加して、プロゲステロンおよびEGF保存溶液の
活性を維持しうる。培地は、作製直後に使用するか、または4℃で保存されるか
のいずれかでありうる。保存の場合、EGFは、使用の時まで添加されるべきで
ない。
培地に、細胞によるマトリックス合成および沈着を促進する追加の剤を補足する
。これらの補足剤は、細胞適合性があり、高度の純度に定義され、そして混入を
含まない。細胞−マトリックス層を生成するのに使用される培地は、「マトリッ
クス産生培地」と称される。
ウム、アスコルビン酸のようなアスコルベート誘導体、またはL−アスコルビン
酸ホスフェートマグネシウム塩n−ハイドレートのようなそのいっそう化学的に
安定な誘導体の内の1つを補足する。アスコルベートを添加して、沈着コラーゲ
ン分子に対する可溶性前駆体である、プロリンの水酸化およびプロコラーゲンの
分泌を促進する。アスコルベートは、I型およびIII型コラーゲン合成のアッ
プレギュレーターと同様に、他の酵素後期翻訳過程のための重要なコファクター
であることも示された。
ミノ酸を有する培地を補足することで、細胞にアミノ酸それら自身を生成させる
必要のないことにより、細胞エネルギーを保存する。プロリンおよびグリシンの
添加は、プロリンの水酸化形態、ヒドロキシプロリンと同様に、それらが、コラ
ーゲンの構造を作る基本的アミノ酸である場合好ましい。
足する。本発明の細胞−マトリックス構築物は、中性高分子なしに生成され得る
が、しかし、理論に結び付けられることを望まないで、マトリックス産生培地で
のその存在は、コラーゲン過程およびサンプルの間にいっそう一定な沈着であり
うる。1つの好ましい中性高分子は、マトリックス沈着コラーゲンに対して、培
養細胞により産生される可溶性先駆体プロコラーゲンの生体外での過程を促進す
ることが示されたポリエチレングリコール(PEG)である。約1000から約
4000MW(分子量)の間、さらに好ましくは約3400から約3700MW
の間の範囲内の組織培養グレードのPEGは、本発明の培地に好ましい。好まし
いPEG濃度は、約5%w/vまたは未満の濃度で、好ましくは約0.01%w
/vから約0.5%w/vまで、さらに好ましくは約0.025%w/vから約
0.2%w/vまでの間、最も好ましくは約0.05%w/vでありうる方法で
使用するためのものである。デキストランのような、好ましくはデキストランT
−40、またはポリビニルピロリドン(PVP)、好ましくは30,000−4
0,000MWの範囲内の他の培養グレードの中性高分子も、約5%w/vまた
は未満の濃度で、好ましくは約0.01%w/vから約0.5%w/vまで、さ
らに好ましくは約0.025%w/vから約0.2%w/vまでの間、最も好ま
しくは約0.05%w/vで使用することもできる。他の細胞培養グレードおよ
びコラーゲン過程および沈着を増強する細胞適合性剤は、哺乳類細胞培養の技術
で習熟した者によって確定されうる。
たは組織化で支援する成分を補足する場合、細胞は、それらの細胞によって合成
された細胞およびマトリックスから構成される組織構築物を形成するのを刺激す
るようである。
イーグル培地(DMEM)(高グルコース処方、L−グルタミンなし)および4
mMのL−グルタミンまたは等価物、5ng/ml上皮成長因子、0.4μg/
mlヒドロコルチゾン、1×10-4Mのo−ホスホリル−エタノールアミン、5
μg/mlインシュリン、5μg/mlトランスレリン、20pMトリヨードチ
ロニン、6.78ng/mlセレニウム、50ng/mlのL−アスコルビン酸
、0.2μg/mlのL−プロリン、および0.1μg/グリシンで補足された
ハムF−12培地の基本的3:1混合物を包含する。産生培地のために、他の薬
理学的剤を、培養物に添加して、分泌される細胞外マトリックスの特性、量、ま
たは型を変化させうる。これらの剤としては、ポリペプチド成長因子、転写因子
、またはコラーゲン転写を上向きに調節する無機塩が挙げられる。ポリペプチド
成長因子の例としては、形質転換成長因子β1(TGF−β1)および組織−プ
ラスミノーゲンアクチベーター(TPA)が挙げられ、その両方は、コラーゲン
合成を上向きに調節することが知られている。Raghowら、Journal
of Clinical Investigation、79巻:1285−
1288頁(1987年);Pardesら、Journal of Inve
stigative Dermatology、100巻:549頁(1993
年)。コラーゲン産生を刺激する無機塩の例は、セリウムである。Shivak
umarら、Journal of Molecular and Cellu
lar Cardiology、24巻:775−780頁(1992年)。
、および気体混合物の十分な環境条件を確保する。好ましい条件は、約5−10
±1%CO2の間の雰囲気および約80−90%の間の相対湿度(Rh)で、約
34℃から約38℃までの間、さらに好ましくは37±1℃である。
れらの分泌マトリックスから形成される皮膚構築物である。好ましくは、ヒト皮
膚線維芽細胞が使用され、真皮から得られるか、またはいっそう好ましくは樹立
細胞保存液またはウイルスおよび細菌混入に対してスクリーニングされ、そして
純度について試験されたバンクから連続して継代されるか、または二次培養され
るものから得られる一次細胞として誘導される。細胞を、育成培地中で十分な条
件下で培養して、それらを、細胞−マトリックス構築物を形成する細胞を培養基
質に播くのに適切な数まで増殖させる。代替的には、凍結細胞保存液から得られ
る細胞を、培養基質に直接播きうる。
そして適切な成長条件下で培養して、細胞の融合シートを形成する。好ましい具
体例では、細胞を、孔を通して、そして上に直接培養物の下から培地を接触させ
るために隠されている多孔性膜に蒔く。好ましくは、細胞を、基本または育成培
地のいずれかに懸濁させ、そして細胞培養表面に、約1×105細胞/cm2から
約6.6×105細胞/cm2までの間、さらに好ましくは約3×105細胞/c
m2から約6.6×105細胞/cm2までの間、そして最も好ましくは約6.6
×105細胞/cm2(表面の平方センチメートル当たりの細胞)の密度で蒔く。
培養物を、育成培地で培養して、培養物を樹立し、そしてそれらが、培地を、細
胞外マトリックスの合成および分泌を上昇調節するために、マトリックス産生培
地に交換することによって、化学的に誘導される時に、約80%から100%融
合の間に培養する。選択的方法では、細胞を、産生培地に直接蒔いて、基本培地
から産生培地に交換する必要性を排除するが、しかし、それは、高い種付け密度
を必要とする方法である。
三次元組織様構造を形成するが、形成する細胞−マトリックス構築物に、培養基
質からそれ自身を接触および剥ぎ取りさせる明らかな収縮力を示さない。培地交
換は、新たなマトリックス産生培地で2から3日毎に行われ、やがて、分泌マト
リックスは、厚みおよび組織化において増大する。細胞−マトリックス構築物を
作製するのに必要な時間は、当初の播種濃度の能力、細胞型、セルラインの年齢
、およびマトリックスを合成および分泌するセルラインの能力に依存する。十分
に形成された場合、本発明の構築物は、細胞によって産生および組織化される線
維性マトリックスにより塊状厚みを示す;それらは、細胞が、互いにゆるく粘着
性でありうる場合、通常に融合であったり、または過度に融合する細胞培養であ
ったりしない。線維性品質は、それらが、医療設定での日常の取扱いで亀裂また
はクラッキングのような物理的損傷に抵抗するので、通常の培養と違って、構築
物に粘着性組織様特性を付与する。培養皮膚構築物の作製で、細胞は、細胞培養
表面上でそれら自身の周囲に、膜の表面を越えて、好ましくは少なくとも厚み約
30ミクロンまたはそれ以上、さらに好ましくは厚み約60から約120ミクロ
ンの間の組織化マトリックスを形成する;しかし、厚みは、120ミクロンの過
剰で得られ、そしてこのような厚み増大が必要とされる試験または医療用途に使
用するのに適している。
トリックス構築物の上向きに面する表面である頂部に塗布される。細胞−マトリ
ックス構築物に、上皮細胞を、その上に蒔き、そして培養して、多層組織構築物
を形成しうる。最も好ましい方法では、皮膚から由来するケラチノサイトは、そ
の細胞構築物上で育成して、皮膚構築物を形成する。他の好ましい具体例では、
角膜ケラチノサイトとも称される角膜上皮細胞を、細胞−マトリックス構築物上
に蒔いて、角膜構築物を形成しうる。口腔粘膜から得られる上皮細胞を、細胞−
マトリックス構築物上で育成して、口腔粘膜の構築物を形成しうる。食道から得
られる上皮細胞を、細胞−マトリックス構築物上に蒔いて、食道組織の構築物を
形成しうる。尿生殖器管から得られる尿管上皮細胞を、細胞−マトリックス構築
物上で育成して、尿管上皮の構築物を形成しうる。上皮由来の他の細胞を選択し
て、それらの細胞が由来する組織の構築物を形成しうる。
それらを培養して、分化したケラチノサイト層を形成する方法は、当業界に知ら
れており、そしてParenteauらに対する米国特許番号第5,712,1
63号に、そしてKempらに対する米国特許番号第5,536,656号に記
述され、その内容は、参照してここに組込まれる。細胞−マトリックス構築物の
表皮化生を行うために、ケラチノサイトを、細胞−マトリックス構築物に蒔き、
そしてその層が、厚み約1から3個の細胞層であるまで、その上で培養する。そ
の後、ケラチノサイトを、分化に誘導して、多層真皮を形成し、そしてその後、
角質化を誘導して、角質層を形成する。
り、そしてそれらの細胞数を拡大する。必要数の細胞が得られるときに、それら
は、培養基質から放出され、懸濁され、計数され、希釈され、そしてその後、細
胞−マトリックス構築物の頂部表面に、約4.5×103細胞/cm2から約5.
0×105細胞/cm2までの間、さらに好ましくは約1.0×104細胞/cm2 から約1.0×105細胞/cm2までの間、そして最も好ましくは約4.5×1
04細胞/cm2の密度で、蒔かれる。その後、構築物を、約60から約90分の
間、37±1℃で、10%CO2でインキュベートして、ケラチノサイトを付着
させる。インキュベーション後、構築物を、表皮化生培地で浸水させる。培養物
での十分な長さの時間の後、ケラチノサイト増殖し、そして拡大して、細胞−マ
トリックス構築物を越えて融合単層を形成する。いったん融合されると、細胞培
地処方を、分化培地に交換して、細胞分化を誘導する。多層上皮が形成されたと
きに、その後、角質化培地を使用し、そして培養物に空気−液体干渉にかける。
ケラチノサイトの分化および角質化について、細胞を、乾燥または低湿度空気−
液体干渉に曝す。乾燥または低湿度干渉は、皮膚の低湿度レベルを複写する試み
として特徴づけうる。やがて、ケラチノサイトは、これらの条件に曝された場合
に、生来の皮膚で見られるほとんどまたは全ての角質および他の特徴を表す。
、角膜の構築物の形成に使用しうる。角膜の上皮細胞は、様々な哺乳類源から由
来しうる。好ましい上皮細胞は、ウサギまたはヒトの角膜上皮細胞(角膜のケラ
チノサイト)であるが、しかし任意の哺乳類角膜ケラチノサイトが使用されうる
。眼の強膜または上皮から由来するもののような他の上皮ケラリノサイトは、置
換されうるが、しかし角膜のケラチノサイトが好ましい。角膜の構築物を形成す
る方法では、バイオセンサー位置を、培養挿入物(細胞−マトリックス構築物を
含む)およびその周囲から除去した。正常なウサギの角膜の上皮細胞を、継代培
養を介して拡張され、トリプシン分解して、それらを培養基質から除去し、培養
培地に懸濁し、そして約7.2×104細胞/cm2から約1.4×105細胞/
cm2までの間の密度で、膜の頂部に蒔種する。その後、構築物を、37±1℃
で、約4時間、10%CO2で、培地なしにインキュベートして、上皮細胞を付
着させる。インキュベーション後、構築物を、角膜の維持培地(CMM)(Joh
nsonら、1992年)に継代培養する。細胞−マトリックス構築物が、上皮
細胞で覆われるまで、上皮細胞を培養する。上皮被覆の完全性は、硫酸ニルブル
ーの溶液(リン酸緩衝生理食塩水中で1:10,000)で培養物を染色するこ
とによる例示として、多様な方法によって確証されうる。およそ7日後、いった
ん細胞−マトリックス構築物が覆われると、構築物を、無菌で、ちょうど構築物
の表面までの液体レベルに達するのに十分な角膜維持培地(CMM)を有する新
たな培養トレイに移し、上皮層の浸水なしに湿潤干渉を維持する。構築物を、3
7±1℃、0%CO2で、60%湿度より大きくて、CMMを用いて、必要な場
合、典型的には週当たり3回、培地交換させながら、インキュベートする。
上皮細胞表面を、湿潤な空気−液体干渉に曝す。湿潤な空気−液体干渉を提供す
る方法は、Parenteauに対する米国特許番号第5,374,515号に
記述されている。ここで使用される場合、語句「湿潤な干渉」は、調節され、そ
の結果構築物の表面が、高湿度であって、乾燥または浸水でない湿潤である培養
環境を意味することが意図される。培養環境での湿気および湿度の正確なレベル
は、重要でないが、角質化細胞の形成を避けるのに十分に湿潤でそして湿度であ
るべきである。湿潤な干渉は、ヒトの眼の類似の湿気レベルを複写する試みとし
て特徴づけることができる。
形成細胞−マトリックス構築物で行われて、厚みのある細胞−マトリックス構築
物または二層細胞−マトリックス構築物を得ることができる。第二の種付けは、
望ましい結果によって、同じ細胞型または染色で、または異なる細胞型または染
色で行われる。第一層の産生に使用された手段およびマトリックス産生培地を用
いて、同じ条件下で、第二の種付けを行う。異なる細胞型で第二の種付けを行う
上での1つの結果は、構築物が、患者に移植されるときに、創傷治癒に影響を及
ぼす異なるマトリックス成分プロファイルまたはマトリックスパッケージング密
度で形成されるマトリックスを有することである。第一の細胞種付けは、真皮の
網状層、いっそう周密に包装されたI型コラーゲンの層、および構成成分の細胞
外マトリックス成分に類似のマトリックスを生じる。第二の細胞種付けは、ゆる
いコラーゲン原線維および細胞外マトリックスによって特徴づけられる真皮の平
行層に類似のマトリックスを生じる。第二の細胞型での別の結果は、改善された
試験片摂取または試験片介入または瘢痕形成の最小化または防止のような創傷治
癒に影響する治療用物質生じうる。
リックスを合成する能力がある場合、2つまたはそれ以上の細胞型の混合細胞集
団は、細胞−マトリックス構築物の形成の間じゅう一緒に培養されうる。第二の
細胞型は、他の組織機能を行うか、または組織構築物の特定の構造的特性を発生
するのに必要とされるものでありうる。例えば、皮膚構築物の産生では、付属器
から得られる皮膚の乳頭細胞または上皮細胞を、マトリックス産生細胞で培養し
て、上皮付属器またはそれらの成分の形成を可能にしうる。汗腺または皮脂腺構
造または成分または毛包構造または成分のような上皮付属器は、マトリックス産
生細胞と一緒に培養したときに、形成しうる。上皮細胞は、腺の付属器構造から
由来でき、そして毛髪は、顕微解剖によるように、深部真皮に配置され、そして
外分泌細胞、筋上皮細胞、腺の分泌細胞、毛包幹細胞が挙げられる。メラノサイ
ト、ランゲルハンス細胞、およびメルケル細胞のような皮膚を構築する皮膚で見
られる他の細胞型も、加えられうる。同様に、血管内皮細胞を、同時培養して、
新たな脈管構造形成についての痕跡成分を生じうる。脂肪細胞を、マトリックス
産生細胞と培養して、再構築手術のために使用される構築物を形成しうる。この
第二の細胞型の送出の代替的態様として、細胞を、これらの構造の局在発生につ
いて、形成または完全に形成された細胞−組織マトリックス上で、または内にス
ポットとして、または細胞の任意の数のスポットの配列として局所に蒔種しうる
。細胞−マトリックス構築物内に細胞を蒔くために、細胞−マトリックス内に、
成長する細胞のために、細胞を、頂部と基底の表面の間に注入して、特定化構造
を形成し、それらの特定機能を作用させうる。
ス産生細胞型を含む第一の種付けを、細胞−マトリックス構築物または細胞層を
生じるのに十分な時間、培養基質に蒔く。いったん第一の細胞−マトリックス構
築物または細胞層が形成されると、マトリックス産生細胞型を含む細胞の第二の
種付けを、第一の細胞−マトリックス構築物または細胞層の頂部表面に蒔き、そ
して第一の構築物上に第二の細胞−マトリックス構築物を形成するのに十分な条
件下で、一回、培養する。第二の細胞−マトリックス構築物上で、第三の種付け
を、蒔き、そして第三の層を生じるのに十分な条件下で培養する。例として、第
三の層の角膜構築物を生じるために、第一の細胞型の細胞は、角膜内皮細胞のよ
うな内皮起源から構成されうる;第二の細胞型は、角膜のケラチノサイトのよう
な接触性組織起源の細胞から構成されうる;そして第三の細胞型は、角膜の表皮
細胞のような表皮起源の細胞を包含しうる。皮膚の三層構築物の別の例として、
第一の種付けの細胞は、脈管構造についての成分を供する血管起源のものであり
得て、第二の種付けの細胞は、皮膚構築物として役割を果す細胞−マトリックス
構築物を形成する皮膚の線維芽細胞を包含でき、そして第三の種付けの細胞は、
表皮層を形成する表皮のケラチノサイトでありうる。
されうる。組織構築物の透化のための方法は、米国特許番号第5,518,87
8号に記述され、そして低温保存の方法は、米国特許番号第5,689,961
号および第5,891,617号に、そして国際PCT出願WO96/2401
8号に記述され、それらの開示は、参照してここに組込まれる。
用できる。試験目的について皮膚構築物を組込む試験システムは、米国特許番号
第4,835,102号に記述され、その開示は、参照してここに組込まれる。
細胞産生した皮膚構築物が、類似の構造を有し、そしていっそう重要には、皮膚
に対する類似の組織化を有するので、それは、吸収、毒性および多くの場合には
、製品の有効性についての生きたヒトまたは動物試験に対する代替または交換と
して価値ある試験システムでありうる。マトリックスの産生は、生体内でのマト
リックスの修復と同様にマトリックスの産生で示される数種の過程を模倣するこ
とが示された。このため、記述されたシステムは、創傷修復および組織発生の分
析での、そしてさらに、創傷修復の化学的および/または物理的刺激剤の試験お
よび分析のために価値ある道具でありうる。
皮膚を保存または修復する哺乳類宿主での移殖または定着のためのものである。
皮膚構築物の移殖のための指示は、それに限定されないが、プラスチックまたは
再構築手術、皮膚創傷、熱傷、乾癬、静脈および糖尿病腫瘍、および基底細胞癌
腫が挙げられる。本発明の皮膚構築物は、創傷組織を保護し、そしてその後宿主
組織の内部成長のためのスカホードとして役割を果すことの両方に有用である。
本発明で産生される組織の組織化のレベルは、創傷修復の作用まで容易で、そし
て可能な速度まで役割をも果すと思われる。
「凝集性」は、物理的単位完全性および組織様作用(handing)特性を維
持できることを意味する。本発明の構築物に凝集特性を優先的に付与する物理的
特性は、塊状濃さおよび線維マトリックス構造である。線維性細胞外マトリック
スは、合成コラーゲンおよび他のマトリックス成分、主に、原線維および原線維
束で配列される原線維コラーゲン細胞から形成され、そしてその構築物にそれら
の塊状を付与する。本発明の細胞−マトリックス構築物は、取扱い可能であり、
すなわち、それらは、担体支持体または特殊化した道具なしに、それらの培養基
質から手動で剥ぎ取ら、そして患者に、または試験装置に使用されうる。構造ま
たは機能に対する決定因子なしに、診療所での通常の操作から引き裂きまたは伸
縮のような損傷に抵抗できる。患者に使用されるときに、それらは、縫合または
ステープルによってその場所に確保されうる。
作製される。熱傷適応症については、移殖されるべき熱傷した創傷部位は、移殖
片を供給され、その結果熱傷の皮膚領域が完全に切除される。切除された床は、
透明で、そして移殖の前に臨床的に未感染であるように見える。手術の切除によ
る深部の部分的厚みの創傷について、予備操作性領域を剃り、必要な場合には、
抗微生物剤、無菌の皮膚洗浄剤で洗浄し、そして正常な生理食塩水で洗浄する。
局所無感覚は、通常、リドカインまたはエピネフリンまたはその両方の皮膚内投
与から構成される。いったん無感覚が達成されると、皮膚採取器を使用して、皮
膚を適切な深さまで取り出し、深部の部分的厚みの創傷を作る。リドカインを含
むエピネフリンとの圧縮により、そして電気メスにより止血を達成できる。その
後、皮膚構築物を、創傷床に使用し、そして必要ならば、その場所に縫合または
ステープルによって確保し、その後適切な包帯で支え、そして包帯を当てる。
創傷に対する皮膚構築物の形態を改善し、そして移殖片の直ぐ下から創傷滲出物
を排出させる手段を提供する。語句「網状構造」は、それにより組織が、スリッ
トで打ち抜かれて、ネット状配列を形成する機械的方法として定義される。網状
構造は、好ましくは、従来の皮膚網状材(登録商標ザイマー;登録商標バイオプ
ラスティー)の使用によって得られる。手動で記録を取るか、またはメスまたは
針で組織を打ち抜くこともできた。網状構造皮膚は、皮膚を伸縮することによっ
て拡張され、その結果スリットは開かれ、そしてその後、創傷床に使用されうる
。拡張網状構造組織は、最大限の達成範囲で創傷領域を提供する。代替的には、
網状化皮膚は、簡単に、非拡張スリットの配列を有するシートとして拡張なしに
使用されうる。網状化皮膚構築物は、単独で、または体の別の領域から得られる
患者自身の皮膚と共に使用しうる。組織構築物は、打ち抜きまたは開窓をも有し
、そして孔が、他の手段によって供されうる。開窓は、レーザー、パンチ、ステ
ープル、針またはピンを用いて手動で実施しうる。
。静脈腫瘍、糖尿病腫瘍、臥位腫瘍のような他の創傷は、開示の皮膚構築物の使
用によって、治癒利益を経験しうる。表皮水疱症のような他の先天性皮膚疾病は
、同様に有益でありうる。
on、MAより入手)は、162cm2組織培養用シャーレ(Costar C
orp.、Cambridge、MA、カタログ番号3150)に5x105細
胞を接種し培養液で培養した。生育培地の組成は、10% 新生子牛血清(NB
CS)(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、
Utah)および4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Wal
kersville、MD)を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(
高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Wal
kersville、MD)である。細胞は10±1% CO2中で37±1℃
のインキュベーターで培養した。培地は2−3日ごとに新鮮なものと交換した。
培養8日後に、細胞がコンフルエンス状態、即ち組織培養用シャーレの底面いっ
ぱいの単層になった時に、培地をシャーレから吸引した。単層細胞を洗浄するた
めに、無菌濾過したリン酸緩衝液生理食塩水を各シャーレの底に添加してその後
吸引した。トリプシン−verseneグルタミン(BioWhittaker
、Walkersville、MD)を各シャ―レに5mL添加し、単層細胞に
完全に行き渡るようにゆっくりと回転させることで、シャーレから細胞を遊離さ
せた。培養物はインキュベーターに戻した。細胞が遊離すると同時に、トリプシ
ン−verseneの作用を停止するために、SBTI(大豆トリプシンインヒ
ビター)5mlを各シャーレに添加し細胞懸濁液と混合した。細胞懸濁液をシャ
ーレから取り出し、無菌の円錐遠心管に等分した。細胞を約800−1000x
gで5分間遠心して集めた。
、6穴トレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径組織培養用挿入体(T
RANSWELL@、Corning Coastar)に3.0x106細胞
/挿入体(6.6x105細胞/cm2)の濃度で接種した。細胞は10±1%
CO2中で37±1℃のインキュベーター内に静置して、培地は2−3日ごとに
新鮮なものと交換し21日間培養した。産生培地の組成は、DMEMおよびHa
ms F−12培地(Quality Biologics Gaithers
burg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX−1TM(Gibc
o BRL、Grand Island、NY)および最終濃度が以下の添加物
を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate B
iotechnology、Lake Placid、NY)、2% 新生子牛
血清(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、U
tah)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Lou
is、MO)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonk
oma、NY、ACSグレード)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノー
ルアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン
(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(
Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(S
igma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigm
a Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwauk
ee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸(WAKO Chemic
als USA、Inc. #013−12061)、0.2μg/ml L−
プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml グリシ
ン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05% ポリエチレン
グリコール(PEG)3400−3700 MW(細胞培養グレード)(Sig
ma、St.Louis、MO)。
マリンで固定しパラフィンで包埋した。ホルマリン固定したサンプルはパラフィ
ンで包埋して、5μm切片をヘマトキシリン−エオジン(H&E)で既知の方法
に従って染色した。H&E染色スライドを用いて、10mm/100μm格子の
ついた10x接眼レンズを用いて任意に選んだ10カ所の顕微鏡視野での厚さを
測定した。
、細胞−マトリックス構造の厚さが発達しているのを示している。
。コラーゲン含量は、既知の方法(Woessner、1961)でのヒドロキ
シプロリンを比色定量する方法を用いて算出した。同じ時点において細胞数も測
定した。前述の操作に用いた2つの異なる細胞種(B156およびB119)で
得られた細胞−マトリックス構造からの、表2はコラーゲン含量を、表3は細胞
データを示している。
を遅延減少SDS−PAGEで解析して、サンプル中のタイプIおよびタイプI
IIコラーゲンアルファバンドで示されるコラーゲン組成を測定した。
フィブロネクチンの同定はパラフィン固定した切片についてZymed His
tostain ストレパビジン−ビオチン システム(Zymed Labo
ratories Inc.、South San Fransisco、CA
)を用いて行った。テナシンの存在の有無は、抗−テナシン一次抗体染色(Da
ko、Carpintheria、CA)および続く二次抗体としてのホースラ
ディッシュパーオキシデイス修飾抗−マウス抗体(Calbiochem)を用
いて、確認した。サンプルは、ジアミノベンジン(Sigma、St.Loui
s、MO)を適用しNucler Fast Redで逆染色することにより可
視化した。
ale、1986)を用いて21日目のサンプルについて行った。結果は、接種
後21日目でのヒト細胞由来皮膚マトリックスサンプル中にはcm2あたり0.
44gのGAGが存在した。
角質細胞(Organogenesis、Inc.Canton、MAより入手
)を細胞−マトリックス構造上に接種し皮膚構造の表皮層を形成した。
細胞を、凍結細胞ストックからコンフルエント状態までに4経代培養してスケー
ルアップさせた。細胞を、トリプシン−verseneを用いてシャーレ底面か
ら遊離させ、プールし、細胞ペレットにするように遠心し、表皮化培地中に再懸
濁させ、カウントして4.5x104細胞/cm2の密度で膜の上に接種した。構
成体は37±1℃、10±1% CO2中で90分間インキュベートし、角質実
質細胞が付着するようにした。インキュベーション後、構成体を表皮化培地に浸
した。表皮化培地の組成は、ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グル
コース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walker
sville、MD)およびHams F−12培地(Quality Bio
logics Gaithersburg、MD)の3:1混合物で、0.4μ
g/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1x
10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1
x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Lou
is、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、M
O)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO
)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)
、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/ml アデ
ニン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、
Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhittak
er、Walkersville、MD)、0.3% キレート化新生子牛血清
(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Uta
h)、0.628ng/ml プロゲステロン(Amersham Arlin
gton Heights、IL)、50μg/ml L−アスコルビン酸ナト
リウム塩(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co
.、Milwaukee、WI)、10ng/ml 表皮成長因子(Life
Technology Inc.、MD)、および50μg/ml 硫酸ゲンタ
マイシン(Amersham Arlington Heights、IL)で
ある。構成体は表皮化培地中で37±1℃、10%CO2中で2日間培養した。
DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittak
er、Walkersville、MD)およびHams F−12培地(Qu
ality Biologics Gaithersburg、MD)の3:1
混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Lou
is、MO)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonk
oma、NY)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sig
ma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、S
t.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St
.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.
Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.
4μg/ml アデニン(Sigma Aldrich Fine Chemi
cals Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(B
ioWhittaker、Walkersville、MD)、0.3% キレ
ート化新生子牛血清(HyClone Laboratories、Inc.、
Logan、Utah)、0.628ng/ml プロゲステロン(Amers
ham Arlington Heights、IL)、50μg/ml L−
アスコルビン酸ナトリウム塩(Sigma Aldrich Fine Che
micals Co.、Milwaukee、WI)、265μg/ml 塩化
カルシウム(Mallinckrodt、Chesterfield、MO)、
および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arling
ton Heights、IL)である。構成体は再度37±1℃、10%CO
2中で2日間培養した。
い培養トレーに移した。その量は9mLで、キャリヤー膜の表面と一致する水面
になり乾燥挿入体が上皮層の層化をさせるのを維持することが出来る。構成体は
37±1℃、10% CO2中、および低湿度中で、2−3日毎に交換した培地
で7日間培養した。この培地の組成は;ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM
)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、W
alkersville、MD)およびHams F−12培地(Qualit
y Biologics Gaithersburg、MD)の1:1混合物で
、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、M
O)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、
NY)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、S
t.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Lo
uis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Lou
is、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Loui
s、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/
ml アデニン(Sigma Aldrich Fine Chemicals
Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWh
ittaker、Walkersville、MD)、2% 新生子牛血清(B
ioWhittaker、Walkersville、MD)、50μg/ml
L−アスコルビン酸ナトリウム塩(Sigma Aldrich Fine
Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、および50μg/
ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington Heig
hts、IL)である。7日後に構成体は、2−3日毎に交換した維持培地で更
に10日間培養した。この維持培地の組成は;ダルベッコ改良イーグル培地(D
MEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittake
r、Walkersville、MD)およびHams F−12培地(Qua
lity Biologics Gaithersburg、MD)の1:1混
合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Loui
s、MO)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonko
ma、NY)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigm
a、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St
.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.
Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.L
ouis、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4
μg/ml アデニン(Sigma Aldrich Fine Chemic
als Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(Bi
oWhittaker、Walkersville、MD)、1% 新生子牛血
清(BioWhittaker、Walkersville、MD)、および5
0μg/ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington
Heights、IL)である。
にかけ光学顕微鏡下でグロス発現を測定した。得られた構成体は、実施例1で述
べた性質を持つマトリックスで囲まれた繊維芽細胞からなる低(皮膚)層を形成
し、多層化しよく分化した角質実質細胞により完全に覆われた。この角質実質細
胞は、生体内皮膚と同様に、基底層、上基底層、顆粒層、および角質層を示した
。皮膚構造体は、伝導電子顕微鏡(TEM)で明らかにされるように皮膚−表皮
接合部によく発達した基底膜が存在した。TEMで観察すると、基底膜はヘミデ
スモゾーム周辺で最も厚く、タイプVIIコラーゲンからなるアンカーリング繊
維で顕著であった。期待されるようにこれらのアンカーリング繊維は、基底膜か ら容易に興奮させられるようでかつコラーゲン繊維を束ねているように見える。 基底膜糖蛋白であるラミニンの存在が以前に報告されたアビジン−ビオチン免疫 酵素法(Guesdon、1979)を用いて確認された。
を3.0x106細胞/ml濃度になるように再懸濁し、6穴トレーの0.4ミ
クロンポアサイズの24mm直径組織培養用挿入体に3.0x106細胞/TW
(6.6x105細胞/cm2)の濃度で接種した。細胞はこの後新生子牛血清を
除いた培地で実施例1と全く同様に培養した。特に、培地の組成は、DMEMお
よびHams F−12培地(Quality Biologics Gait
hersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX−1TM
(Gibco BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物
を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate B
iotechnology、Lake Placid、NY)、0.4μg/m
l ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1x10-4 M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY、カタログN
o.2400ACSグレード)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノール
アミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(
Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(S
igma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Si
gma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma
Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwauke
e、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸(WAKO Chemica
ls USA、Inc. #013−12061)、0.2μg/ml L−プ
ロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml グリシン
(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05% ポリエチレング
リコール(PEG)(Sigma、St.Louis、MO)。サンプルは、前
述の方法で、培養7,14および21日目にコラーゲン濃度および細胞数をチェ
ックした。結果を、表4(細胞数)および表5(コラーゲン)にまとめた。サン
プルはホルマリンで固定し、実施例1で述べたように、ヘマトキシリンおよびエ
オジンで光学顕微鏡用の染色をした。組織学的な評価で、構造体は限定培地で2
%新生子牛血清存在下と同様に生育することが証明された。
細胞により形成された25日目の皮膚構造を用いて、正常ヒト新生児包皮表皮角
質細胞を細胞−マトリックス構造の表面上に接種し皮膚構造の表皮層を形成した
。
細胞を、凍結細胞ストックからコンフルエント状態までに4経代培養してスケー
ルアップさせた。細胞を、トリプシン−verseneを用いてシャーレ底面か
ら遊離させ、プールし、細胞ペレットにするように遠心し、表皮化培地中に再懸
濁させ、カウントして4.5x104細胞/cm2の密度で膜の上に接種した。
構成体は37±1℃、10±1% CO2中で90分間インキュベートし、角質
実質細胞が付着するようにした。インキュベーション後、構成体を表皮化培地に
浸した。表皮化培地の組成は、ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(グル
コース、カルシウム無添加、BioWhittaker、Walkersvil
le、MD)およびHams F−12培地(Quality Biologi
cs Gaithersburg、MD)の3:1混合物で、0.4μg/ml
ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1x10-4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1x10-4 M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、M
O)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5
μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20
pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.7
8ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/ml アデニン(S
igma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milw
aukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、W
alkersville、MD)、50μg/ml L−アスコルビン酸ナトリ
ウム塩(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.
、Milwaukee、WI)、16μM リノール酸(Sigma、St.L
ouis、MO)、1μM 酢酸トコフェロール(Sigma、St.Loui
s、MO)、および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham
Arlington Heights、IL)である。構成体は表皮化培地中で
37±1℃、10±1%CO2中で2日間培養した。
CO2中のインキュベーターで2日間培養した。2日後、構成体を含むキャリヤ
ーを無菌的に十分な量の培地を入れた新しい培養トレーに移し、キャリヤー膜の
表面と一致する水面になり、空気−液体境界のところで構成体が発達するのを維
持することが出来るようにした。形成される表皮層の表面に接触する空気は上皮
細胞層の層化を促す。構成体は37±1℃、10%CO2中で、低温度で2−3
日毎に交換した培地で7日間培養した。この培地の組成は;ダルベッコ改良イー
グル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWh
ittaker、Walkersville、MD)およびHams F−12
培地(Quality Biologics Gaithersburg、MD
)の1:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、S
t.Louis、MO)、5x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ro
nkonkoma、NY)、5x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミ
ン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Si
gma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sig
ma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigm
a、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich
)、24.4μg/ml アデニン(Sigma Aldrich Fine
Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グル
タミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、2.
65μg/ml 塩化カルシウム(Mallinckrodt、Chester
field、MO)、16μM リノール酸(Sigma、St.Louis、
MO)、1μM 酢酸トコフェロール(Sigma、St.Louis、MO)
、1.25mM セリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.64m
M塩化コリン(Sigma、St.Louis、MO)、および50μg/ml
硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington Height
s、IL)である。2−3日毎に交換した培地で14日間培養した。
0、12、および14日目に採取し、実施例1で述べたようにヘモトキシリンお
よびエオジン染色にかけ光学顕微鏡下でグロス発現を測定した。得られた構成体
は、実施例3で述べた性質を持つマトリックスで囲まれた繊維芽細胞からなる低
(皮膚)層を形成し、多層化しよく分化した角質実質細胞の層により覆われた。
キレス腱繊維芽細胞(HATF)に代えて細胞−マトリックスを形成させた。産
生培地で21日間培養した後に、実施例1で述べた操作を用いてサンプルをH&
E染色および厚さの測定に呈した。得られた構造体は、厚さ75.00±27.
58ミクロン(n=2)の細胞−マトリックス組織様構造として観察された。ま
た、この構造体中には内因性に産生される繊維性コラーゲン、デコリン、および
グリコサミノグリカンが存在した。
RIP−43血小板由来成長因子(PDGF)ウイルス産生細胞(Morgan
、J.ら)の1バイアルを溶解し、細胞を2x106細胞/162cm2シャーレ
(Corming Costar、Cambridge、MA)の密度で接種し
た。これらのシャーレには生育培地を入れ、10±1%CO2中で37±1℃で
インキュベーターに静置した。生育培地の組成は、ダルベッコ改良イーグル培地
(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhitta
ker、Walkersville、MD)で、10% 新生子牛血清(HyC
lone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)、お
よび4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersvi
lle、MD)を含む。同じ日にヒト新生児包皮繊維芽細胞(HDFB156)
の1バイアルも溶解し、1.5x106細胞/162cm2シャーレ(Corni
ng Costar、Cambridge、MA)の密度で接種した。3日後に
jCRIP PDGF−43ウイルス産生細胞に新鮮な生育培地を与えた。HD
FB156は上述の生育培地プラス8μg/ml ポリブレン(Sigma、S
t.Louis、MO)で培養した。次の日にHDFB156細胞を以下のよう
に感染させた。jCRIP PDGF−43ウイルス産生細胞からの培養液を集
めて0.45ミクロン濾紙で濾過した。8μg/ml ポリブレンをこの濾過し
た培養液に添加した。それから培養液をHDFの上に置いた。次の2日間HDF
は新鮮な生育培地で培養した。HDFが5代から6代の経代をした日に2.5x
106細胞/162cm2シャーレ(Corning Costar、Cambr
idge、MA)の密度で接種した。細胞は以下のように経代培養し培養液は吸
引した。シャーレをリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄し残存する新生子牛血清を除
いた。トリプシン−verseneを各シャ―レに5ml添加し、単層細胞に完
全に行き渡るようにゆっくりと回転させることで、シャーレ底面から細胞を遊離
させた。培養物はインキュベーターに戻した。細胞が遊離すると同時に、トリプ
シン−verseneの作用を停止するために、SBTI(大豆トリプシンイン
ヒビター)5mlを各シャーレに添加し細胞懸濁液と混合した。細胞/トリプシ
ン/SBTI懸濁液をシャーレから取り出し、無菌の円錐遠心管に等分した。細
胞を約800−1000xgで5分間遠心して集めた。細胞は、接種用のために
生育培地に上記リストした濃度になるように再懸濁した。2日後に細胞に新鮮な
培地を与えた。翌日上記のように細胞を集め、10% 新生子牛血清(NBCS
)と10% ジメチルスルフォキサイド(DMSO)(Sigma、St.Lo
uis、MO)を含む生育培地で1.5x106細胞/mlに希釈した。細胞は
1ml/凍結バイアルに入れて−80℃で保存した。
同じ操作を用いて、ヒト新生児包皮繊維芽細胞の代わりに、上記のように高レベ
ルの血小板由来成長因子(PDGF)を産生するように形質転換したヒト新生児
包皮繊維芽細胞を用いて行った。接種後18日目に、上記のようにサンプルをH
&E染色に呈した。また、サンプルは実施例10にリストしたファイブロネクチ
ンの有無を確認するためにアビジン−ビオチン法を用いて染色した。実施例1で
述べたように、接種後18日目にサンプルをH&E染色に呈し、実施例1で得ら
れたものと同様な、厚さ123.6ミクロン(N=1)の細胞−マトリックスグ
ロスが観察された。トランスフェクトされた細胞から細胞−マトリックス構造中
に排出されるPDGF量は、培養中を通じて(18日間)ELISAで測定して
100 ng/mLであった。一方、対照ではPDGFの排出は検出できなかっ
た。
細胞−マトリックス構造を形成し、無胸腺ヌードマウスに作成した全切開創に移
植した。マウスは、Parenteauら(1996)の方法に従って移植した
。その方法の開示をここに示す。移植は、14、28、および56日目に、切開
口の接着、切開創の縮小、移植損失部分、および血管新生(色)で観察した。移
植部分はマウスで完全に残っている間に写真を撮った。各時点で多くのマウスを
殺して、移植部分およびその周辺部を、マウス皮膚の周辺縁に沿って少なくとも
皮下脂肪肉部まで切開した。移植物とマウス皮膚との接合部は各サンプルで保存
した。体外移植組織サンプルはリン酸緩衝液10%ホルマリンおよびメタノール
で固定した。ホルマリン固定したサンプルを、実施例1で述べた操作に従ってH
&E染色に呈した。移植物は、顕著な縮小もなくマウスの皮膚に取り込まれた。
移植の14日以内にマウスの表皮は移植物を覆った。H&E染色サンプルでは、
14日目の移植物には血管が明らかに認められた。そして実験全体を通じて認め
られた。グロス観察およびH&E染色により、移植物は実験期間中を通して健全
である(生存している細胞を含みグロスマトリックスの異常が見られない、等)
ように見えた。
および別の表皮層の新生児包皮に由来するヒト角質実質細胞を用いて、2層皮膚
構造を形成した。この皮膚構造は、膜から手で剥がし、熟練の技術無しで操作し
、移植部位に置くことができた。本2層皮膚構造体を、Parenteauら(
1966)の方法に従って無胸腺ヌードマウスに作成した全切開創に移植した。
その方法の開示をここに示す。サンプル採取の時点は、移植後7、14、28、
56、および184日目に行った。移植部分はマウスで完全に残っている間に写
真を撮った。各時点で多くのマウスを殺して、移植部分およびその周辺部を、マ
ウス皮膚の周辺縁に沿って少なくとも皮下脂肪肉部まで切開した。移植物とマウ
ス皮膚との接合部は各サンプルで保存した。体外移植組織サンプルはリン酸緩衝
液10%ホルマリンおよびメタノールで固定した。ホルマリン固定したサンプル
を、実施例1で述べた操作に従ってH&E染色に呈した。
ロスの観察でも確かめられた。H&E染色により、移植後7日目以内に宿主の組
織から移植物へ血管が伸びているのが認められた。移植物は、顕著な縮小もなく
実験期間中を通して健全であった。抗−ヒトインボルクリン染色を用いてヒト表
皮細胞が全移植期間中存在していることが認められた。 実施例9:ヒト角膜の角膜実質細胞によるマトリックスのIn Vitro形成 ヒト角膜の角質実質細胞(Organogenesis、Inc.Canto
n、MAより入手)を角膜の基質構造の形成に用いた。コンフルエントになった
ヒト角質実質細胞をトリプシン−verseneを用いて培養基質から遊離させ
た。細胞が遊離した時、大豆トリプシンインヒビターを用いてトリプシン−ve
rseneの作用を中和し、細胞懸濁液を遠心し、上清は捨てて細胞は新鮮な培
地に3.0x106/mlの濃度になるように基礎培地に再懸濁した。細胞は、
6穴トレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径組織培養用transw
ellに3x106細胞/TW(6.6x105細胞/cm2)の濃度で接種した
。これらの培養物は接種培地で一晩放置した。接種培地の組成は;ダルベッコ改
良イーグル培地(DMEM)およびHams F−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4m
M GlutaMAX(Gibco BRL、Grand Island、NY
)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子
(EFG)(Upstate Biotechnology、Lake Pla
cid、NY)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.
Louis、MO)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronk
onkoma、NY)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(
Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigm
a、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma
、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、
St.Louis、MO)、および6.78ng/ml セレン(Sigma
Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee
、WI)である。続いてこの培養物に新鮮な産生培地を与えた。産生培地の組成
は;DMEM)およびHa−12培地(Quality Biologics
Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX
(Gibco BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物
を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate B
iotechnology、Lake Placid、NY)、2% 新生子牛
血清(HyClone Laboratories、Logan、Utah)、
0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO
)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、N
Y)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St
.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Lou
is、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Loui
s、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis
、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich Fin
e Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、50ng/m
l L−アスコルビン酸(WAKO Pure Chemicals)、0.2
μg/ml L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μ
g/ml グリシン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05
% ポリエチレングリコール(PEG)3400−3700 MW(細胞培養グ
レード)(Sigma、St.Louis、MO)である。 細胞は37±1℃、10±1%CO2中で培養し、2−3日毎に新鮮な培地に交
換して20日間(合計21日間)培養した。培養21日後に角質実質細胞は、実
施例1に示した方法で測定して、厚さ約40ミクロンのマトリックス層を形成し
た。また、細胞−マトリックス構造体中には内因性に産生される繊維性コラーゲ
ン、デコリン、およびグリコサミノグリカンが存在した。
on、MAより入手)は、6穴トレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直
径組織培養用キャリヤー(TRANSWELL@、Costar Corp.、
Cambridge、MA)に1x106細胞/TWの濃度で接種し生育培地で
培養した。生育培地の組成は、10% 新生子牛血清(HyClone Lab
oratories、Inc.、Logan、Utah)および4mM L−グ
ルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を含
むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミ
ン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)であ
る。細胞は10±1% CO2中で37±1℃のインキュベーターで培養した。
培地は2−3日毎に新鮮なものと交換し21日間培養した。産生培地の組成は、
DMEMおよびHams F−12培地(Quality Biologics
Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMA
X(Gibco BRL、Grand Island、NY)および以下の添加
物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、2% 新生子
牛血清(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、
Utah)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Lo
uis、MO)、1x10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronko
nkoma、NY、ACSグレード)、1x10−4M O−フォスフォリルエ
タノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml イン
スリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェ
リン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニ
ン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(S
igma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milw
aukee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸(WAKO Pur
e Chemicals)、0.2μg/ml L−プロリン(Sigma、S
t.Louis、MO)、0.1μg/ml グリシン(Sigma、St.L
ouis、MO)、および0.05% ポリエチレングリコール(PEG)(細
胞培養グレード)(Sigma、St.Louis、MO)。
。ホルマリン固定したサンプルはパラフィンで包埋して、5μm切片をヘマトキ
シリン−エオジン(H&E)で既知の方法に従って染色した。H&E染色スライ
ドを用いて、10mm/100μm格子(Olympus America I
nc.、Melville、NY)のついた10x接眼レンズ(Olympus
America Inc.、Melville、NY)を用いて任意に選んだ
10カ所の顕微鏡視野で測定した。
成が類似しており、82.00±7.64ミクロンの厚さがあった。
MAより入手)を5x105細胞/162cm2組織培養用シャーレ(Cormi
ng Costar、Cambridge、MA、カタログ番号3150)の密
度で接種し、以下のように培養した。生育培地の組成は、10% 新生子牛血清
(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Uta
h)および4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walker
sville、MD)を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グル
コース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walker
sville、MD)である。細胞は10±1% CO2中で37±1℃のイン
キュベーターで培養した。培地は2−3日毎に新鮮なものと交換した。コンフル
エンスになったら、細胞を組織培養用シャーレの底部につけたまま培地を吸引し
た。単層細胞を洗浄するために、無菌濾過したリン酸緩衝液生理食塩水を単層細
胞に添加してその後吸引した。トリプシン−verseneグルタミン(Bio
Whittaker、Walkersville、MD)を各シャ―レに5ml
添加し、単層細胞に完全に行き渡るようにゆっくりと回転させることで、シャー
レから細胞を遊離させた。培養物はインキュベーターに戻した。細胞が遊離する
と同時に、トリプシン−verseneの作用を停止するために、SBTT(大
豆トリプシンインヒビター)5mlを各シャーレに添加し細胞懸濁液と混合した
。細胞懸濁液をシャーレから取り出し、無菌の円錐遠心管に等分した。細胞を約
800−1000xgで5分間遠心して集めた。細胞は再懸濁し3.0x106
/mlの濃度になるように希釈し、6穴トレーの0.4ミクロンポアサイズの2
4mm直径transwellに3.0x106細胞/TW(6.6x105細胞
/cm2)の濃度で接種した。細胞は接種培地の中で一晩放置した。接種培地の
組成は;DMEMおよびHams F−12培地(Quality Biolo
gics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM Glu
taMAX(Gibco BRL、Grand Island、NY)および以
下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(EFG)
(Upstate Biotechnology、Lake Placid、N
Y)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis
、MO)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkom
a、NY)、1x10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma
、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.
Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.L
ouis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Lo
uis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、50n
g/ml L−アスコルビン酸(WAKO Pure Chemicals)、
0.2μg/ml L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、お
よび0.1μg/ml グリシン(Sigma、St.Louis、MO)であ
る。細胞は10±1% CO2中で37±1℃のインキュベーター内に静置して
、培地は2−3日ごとに新鮮なものと交換し7日間培養した。産生培地の組成は
、DMEMおよびHams F−12培地(Quality Biologic
s Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaM
AX(Gibco BRL、Grand Island、NY)および以下の添
加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、2% 新生
子牛血清(HyClone、Logan、Utah)、0.4μg/ml ハイ
ドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1x10-4M エタ
ノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1x10-4M O
−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、
5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/
ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng
/ml セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals
Co.、Milwaukee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸
(WAKO Pure Chemicals)、0.2μg/ml L−プロリ
ン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml グリシン(S
igma、St.Louis、MO)、および0.05% ポリエチレングリコ
ール(PEG)(細胞培養グレード)(Sigma、St.Louis、MO)
である。7日後に産生培地を新生子牛血清を含まないものに代えた。この培地は
2−3日毎に新鮮なものと交換し更に20日間、計28日間培養した。
。ホルマリン固定したサンプルはパラフィンで包埋して、5μm切片をヘマトキ
シリン−エオジン(H&E)で既知の通常の方法に従って染色した。H&E染色
スライドを用いて、10mm/100μm格子(Olympus Americ
a Inc.、Melville、NY)のついた10x接眼レンズ(Olym
pus America Inc.、Melville、NY)を用いて任意に
選んだ10カ所の顕微鏡視野で測定した。サンプルは細胞とマトリックスから成
る構造を有し、厚さが71.20±9.57ミクロンであった。また、細胞−マ
トリックス構造体中には内因性に産生される繊維性コラーゲン、デコリン、およ
びグリコサミノグリカンが存在した。
て、実施例1で示した方法に従って細胞−マトリックス構造を作成した。この細
胞−マトリックスを二次産生細胞としての真皮乳頭細胞に局所的に接種した。こ
れを次に三次産生細胞としての角質実質細胞に接種し、細胞−マトリックスおよ
び真皮乳頭細胞の上を覆う持続的な表皮層を形成した。
トリックス構造を形成した。HDFは生育培地中に5x106細胞/162cm2 組織培養用シャーレ(Costar Corp.、Cambridge、MA)
の密度で接種した。生育培地の組成は、10% 新生子牛血清(NBCS)(H
yClone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)
および4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersv
ille、MD)を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコー
ス濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersv
ille、MD)である。コンフルエントになったらHDFをトリプシン−ve
rseneを用いてシャーレから遊離させた。細胞は新鮮な培地に3.0x10
6/mlの濃度になるように再懸濁し、6穴トレーの0.4ミクロンポアサイズ
の24mm直径組織培養用挿入体(TRANSWELLR、Corning C
orstar)に3x106細胞/挿入体(6.6x105細胞/cm2)の濃度
で接種した。HDF培養物は10±1% CO2中で37±1℃のインキュベー
ターで培養した。実施例1で示した方法に従って、新鮮な産生培地を2−3日毎
に与えて23日間培養した。
した。真皮乳頭は毛髪胞の毛髪根に囲まれている特殊な繊維芽細胞の個別分布を
しており、毛髪育成の支持的な役割を果たしている。真皮乳頭は、以前に報告さ
れたMessenger、A.G.の方法(ヒト毛髪胞からの真皮乳頭細胞の培
養。Br.J.Dermatol.110:685−9(1984))を用いて
毛髪法の微小切開により単離できてin vitroで培養できる。この方法は
ここで採り上げられている。真皮乳頭細胞はコンフルエントになったら凝集し、
シャーレ上では代わって新たな凝集を作る。真皮乳頭を4週令のブタでの皮膚バ
イオプシーにより単離した。真皮乳頭からの細胞(PDP)は、20%NBCS
を含むDMEMで8代まで経代培養した。培養3週間後、PDP細胞は真皮乳頭様
構造を呈し、あるいは凝集し、各々の直径は約90−210ミクロンであった。
その後シャーレから激しくピペッティングをすることで凝集物を培養シャーレか
ら採り、ヒトコラーゲンマトリックス上に200凝集物/cm2の濃度で接種し
た。凝集物は、20%NBCSを含むDMEMで更に15日間、新鮮な培地を2−
3日毎に与えて培養した。
種し、培養して細胞−マトリックスおよび真皮乳頭細胞の上を覆う持続的な表皮
層を形成させた。2つの異なる構造を形成した:1つはヒト角質実質細胞とのも
のであり、他はブタ角質実質細胞とのものである。初代培養を確立するために正
常な表皮角質実質細胞を体外移植を用いてヒト新生児包皮(HEP)およびブタ
角質実質細胞(PEP)から単離した。これらの細胞を培養して、ブタ細胞で経
代3まで、ヒト細胞で経代4まで増殖させた。約培養5−6日後に、細胞をトリ
プシン−verseneを用いてシャーレ底面から遊離させ、プールし、細胞ペ
レットにするように遠心し、表皮化培地中に再懸濁させ、カウントして、HEP
細胞で4.5x104細胞/cm2、PEP細胞で1.6x105細胞/cm2密度
で膜の上に接種した。表皮化した培養物は実施例2で述べたように12日間培養
した。
れた皮膚構造は皮膚に類似した基礎形態学的組織を示した。一つは真皮層で内因
性に産生されたマトリックスにより取り囲まれた繊維芽細胞から成っている。こ
のマトリックスは内因性に産生される繊維性コラーゲン、デコリン、およびグリ
コサミノグリカンを含んでいる。真皮層は真皮乳頭細胞の場所に局在している。
他の一つは細胞−マトリックスおよび真皮乳頭を横切る層化し角質実質細胞層で
ある。ヒトあるいはブタ角質実質細胞に覆われた両方の組織構造において、真皮
乳頭は覆っている角質実質細胞の小さな波動を惹起する構造を維持していた。真
皮乳頭細胞の付近に分化した表皮細胞が存在した。
定した培地中で、真皮繊維芽細胞により形成された細胞−マトリックス構造中の
ヒアルロン酸(HA)を測定した。
。細胞−マトリックス構造からの抽出物は、細胞−マトリックス構造を入れた試
験管に10mL 酢酸アンモニウム緩衝液および0.5mg/ml プロテナー
ゼKを添加することで調製した。混合物を60℃で一晩インキュベートした。消
化が完全に終わったら、混合物を遠心し上清をヒアルロン酸アッセイ用の個別の
試験管に入れた。96穴プレートを0.1M NaHCO3に溶かした20μg
/ml HA結合タンパク質の50μlでコートし、4℃で一晩保存した。プレ
ートは0.05% Tween20を含む0.85%食塩水で3回洗浄した。そ
の後各ウエルに250μlのブロッキング液(3% BSAおよび0.9%塩化
ナトリウムを含む10mM リン酸緩衝液、pH7.4)を添加し、プレートは
室温で2時間インキュベートした。それから、プレートは0.05% Twee
n20を含む0.85%食塩水で3回洗浄した。各ウエルに50μlの標準HA
液および両方の実験条件での抽出サンプルを、種々の希釈を含めて、添加し、プ
レートは室温(約20℃)で2時間インキュベートした。それから、プレートは
0.05% Tween20を含む0.85%食塩水で3回洗浄して、各ウエル
に50μlのビオチン化HA(1:2000希釈)を添加し、室温で2時間イン
キュベートした。その後、プレートは0.05% Tween20を含む0.8
5%食塩水で3回洗浄し、各ウエルに50μlのARP−アビジンD(1:30
00希釈)を添加した。プレートは室温で45分間インキュベートした。それか
ら、プレートは0.05% Tween20を含む0.85%食塩水で3回洗浄
して、各ウエルに100μlのオルソ−フェニレンジアミン基質溶液を添加し、
37℃で10分間インキュベートした。反応は1M 塩酸50μlを添加するこ
とで停止した。最終的にプレートリーダーを用いて492nmの吸光度を読み記
録した。
た円形の細胞−マトリックス構造(直径75mm)はそれぞれ約200μgのヒ
アルロン酸を含有し、化学的に限定された培地で形成されたものにはそれぞれ約
1.5mgのヒアルロン酸が含有された。 実施例14:産生された細胞−マトリックス構造の物理的試験および機械的特性 実施例1(細胞−マトリックス構造)、実施例2(角質実質細胞層に覆われた細
胞−マトリックス構造)、および実施例3(化学的に限定した培地で作成した細
胞−マトリックス構造)の各組織構造物の機械的特性を膜膨張法で定量した。こ
れらの試験は臨床的に用いられているアッセイ(例、DermaflexR、C
yberderm Inc.、Media、PAおよびCutameterR、
Courage Khazaka、Colonge、Germany)に類似で
あるが、膜を破裂できる圧を含めてより高い圧を使っている。サンプルの細胞−
マトリックス構造を、等張の生理食塩水を満たした直径10mmの円柱状ウエル
の中心に置いたポリカーボネートブロックの上に水平に置いた。円柱状ウエルの
直径に対応した円形の穴を持つ金属プレートをサンプルの上に置きブロックに留
めた。そして、シリンジポンプで食塩水を更に注入することによりサンプルを膨
張させた。圧伝導計を用いて得られた圧を測定した。加圧を続け破裂強度、実施
例1の方法で得た細胞−マトリックス構造では439.02mmHg;実施例2
の角質実質細胞層に覆われた細胞−マトリックス構造では998.52mmHg
;および実施例3の化学的に限定した培地で作成した細胞−マトリックス構造で
は1542.26mmHgを得た。
ス構造)を実施例1の操作を用いて21日目に採取した。サンプル変性温度をM
ettler Toledo(Highston、NJ)示差走査熱量計(DS
C製品 #DSC12E)を用いて解析した。我々の目的には、溶解温度はアン
プルを45℃から80℃まで毎分1℃の割合で加温することで求めた。サンプル
の平均変性温度は60.8±1.2℃(n=3)であった。
で作成した細胞−マトリックス構造)の操作を用いて作成した表皮マトリックス
の縫合維持および引っ張り張力を、一定の臨床状況での縫合力を求めるために測
定した。21日目の真皮マトリックスの縫合維持力を、Mini−Bionex
858試験システム(MTS systems Corporation、Mi
nneapolis、Minn.)を用いて、血管移植人工補綴のためのアメリ
カ国家標準出版(Instruments、1986)に記載されている方法に
より測定した。
N/mであり、実施例2に従って調製したサンプル(角質実質細胞層に覆われた
細胞−マトリックス構造)では、引っ張り張力は2720N/mであった。
て調製したサンプルでは、0.22Nであった。
mmの直径の両方で作成した。3方法全ての培養操作で作成した構造物は密着性
のある組織用構造であり、最小の力で膜より剥がすことが可能である。従って、
“剥がし可能”であり損傷を与えることなく試験や使用するときに取り扱いやす
い。
を3.0x106/ml濃度になるように再懸濁し、6穴トレーの0.4ミクロ
ンポアサイズの24mm直径組織培養用挿入体に3.0x106細胞/TW(6
.6x105細胞/cm2)の濃度で接種した。この実施例では、細胞は全て化学
的に限定した培地で培養した。
iologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM
GlutaMAX−1TM(Gibco BRL、Grand Island
、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成
長因子(Upstate Biotechnology、Lake Placi
d、NY)、1x10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonk
oma、NY、ACSグレード)、1x10−4M O−フォスフォリルエタノ
ールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランス
フェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイ
ロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン
(Sigma Aldrich Fine Chemicals Compan
y、Milwaukee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸(WA
KO Chemicals USA、Inc. #013−12061)、0.
2μg/ml L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、および
0.1μg/ml グリシン(Sigma、St.Louis、MO)。
の染色をした。組織学的な観察評価で、PEGのない条件2でもPEGが存在す
る条件1とかなり同様なマトリックスを形成することが証明された。構造物のコ
ラーゲン含量を生化学的に測定すると、PEGが存在する条件1では168.7
±7.98μg/cm2;PEGのない条件2では170.88±9.07μg
/cm2、と両方でほとんど同量の値を示した。高濃度のインスリンとハイドロ
コーチゾンを含む条件3では、他の2つの条件よりも早い時点でコラーゲンを含
んでマトリックスの発現が大きいことが示された。また、全ての条件下で細胞−
マトリックス構造体中には内因性に産生される繊維性コラーゲン、デコリン、お
よびグリコサミノグリカンが存在した。本実施例の条件2の方法で作成した培養
真皮構造体を図2に示した。化学的に限定した培地で培養した21日目の培養ヒ
ト真皮繊維芽細胞から形成した細胞−マトリックス構造体の、固定、パラフィン
包埋、ヘマトキシリンおよびエオジン染色した切片の写真を図2に示した。多孔
性の膜は構造物の下で薄い半透明のバンドのように見える。細胞は膜の表面上で
生育し膜をマトリックスの中に取り込まないことが分かる。
電子顕微鏡(TEM)の像を示す。図3Aは、繊維芽細胞間の内因性コラーゲン
繊維の列を示している7600倍率の像である。図3Bは、完全に形成された内
因性コラーゲン繊維の19000倍率の像であり、繊維の配列と束を証明してい
る。
因性に産生するマトリックスを形成した。全てに完全に形成されたコラーゲン繊
維が細胞間で配列され束ねられた形で存在することが示された。これら繊維の性
質、厚さ、および完全な密着性は構造体に引っ張り聴力を与え、培養膜から剥が
し易くするし、それらを患者へ移植するときに取り扱いし易くする。
により作成した21日目の皮膚構造を用いて、正常ヒト新生児包皮表皮角質細胞
を細胞−マトリックス構造上に接種し皮膚構造の表皮層を形成した。
細胞を、凍結細胞ストックからコンフルエント状態までに4経代培養してスケー
ルアップさせた。細胞を、トリプシン−verseneを用いてシャーレ底面か
ら遊離させ、プールし、細胞ペレットにするように遠心し、表皮化培地中に再懸
濁させ、カウントして4.5x104細胞/cm2の密度で膜の上に接種した。
構成体は37±1℃、10±1% CO2中で90分間インキュベートし、角質
細胞が付着するようにした。インキュベーション後、構成体を表皮化培地に浸し
た。表皮化培地の組成は、ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコ
ース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkers
villc、MD)およびHams F−12培地(Quality Biol
ogics Gaithersburg、MD)の3:1混合物で、0.4μg
/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1x1
0-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1x
10-4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Loui
s、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO
)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)
、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、
6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/ml アデニ
ン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Compa
ny、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhit
taker、Walkersville、MD)、50μg/ml L−アスコ
ルビン酸ナトリウム塩(Sigma Aldrich Fine Chemic
als Company、Milwaukee、WI)、16μM リノール酸
(Sigma、St.Louis、MO)、1μM 酢酸トコフェロール(Si
gma、St.Louis、MO)、および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシ
ン(Amersham Arlington Heights、IL)である。
構成体は表皮化培地中で37±1℃、10±1%CO2中で2日間培養した。
7±1℃、10±1%CO2中で2日間培養した。2日後、構成体を含むキャリ
ヤーを無菌的に十分な量の培地を入れた新しい培養トレーに移し、キャリヤー膜
の表面と一致する水面になり、空気−液体境界のところで構成体が発達するのを
維持することが出来るようにした。形成される表皮層の表面に接触する空気は上
皮細胞層の層化を促す。構成体は37±1℃、10% CO2中、および低湿度
中で、2−3日毎に交換した培地で7日間培養した。この培地の組成は;ダルベ
ッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加
、BioWhittaker、Walkersville、MD)およびHam
s F−12培地(Quality Biologics Gaithersb
urg、MD)の1:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(S
igma、St.Louis、MO)、1x10-4M エタノールアミン(Fu
lka、Ronkonkoma、NY)、1x10-4M O−フォスフォリルエ
タノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml イン
スリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェ
リン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニ
ン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(S
igma Aldrich Fine Chemicals Company)
、24.4μg/ml アデニン(Sigma Aldrich Fine C
hemicals Company)、4mM L−グルタミン(BioWhi
ttaker、Walkersville、MD)、2.65μg/ml 塩化
カルシウム(Mallinckrodt,Chesterfield、MO)、
16μM リノール酸(Sigma、St.Louis、MO)、1μM 酢酸
トコフェロール(Sigma、St.Louis、MO)、1.25mM セリ
ン(Sigma、St.Louis、MO)、0.64mM 塩化コリン(Si
gma、St.Louis、MO)、および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシ
ン(Amersham Arlington Heights、IL)である。
2−3日毎に培地を交換し14日間培養した。
0、12、および14日目に採取し、実施例1で述べたようにヘモトキシリンお
よびエオジン染色にかけ光学顕微鏡下でグロス発現を測定した。得られた構成体
は、実施例3で述べた性質を持つマトリックスで囲まれた繊維芽細胞からなる低
(皮膚)層を形成し、多層化しよく分化した角化細胞により覆われた。
にかけ光学顕微鏡下でグロス発現を測定した。得られた構成体は、マトリックス
で囲まれた繊維芽細胞からなる低層と、それを覆う多層化しよく分化した角化細
胞の表皮層とからなる2層の皮膚構造であった。本実施例の2層皮膚構造を図4
に示す。図4は、化学的に限定した培地で培養した真皮繊維芽細胞から形成した
細胞−マトリックス構造と化学的に限定した培地で培養したヒト角質実質細胞か
ら形成した多層化した分化した表皮からなる、化学的に限定した培地で培養した
外から添加したマトリックス成分なしで形成した培養皮膚構造の、固定、パラフ
ィン包埋、ヘマトキシリンおよびエオジン染色した切片の写真を示す。
クス構造を産生することである。ほほ繊維芽細胞を10%NBCS含有DM培地
でT−150シャーレで培養した。7日後に更に細胞数を増やすために、ほほ繊
維芽細胞を採集して、各4.0x106細胞を9個のT−150シャーレに入れ
10%NBCS含有DMEM培地中でコンフルエントになるまで培養し、そこで
採取した。
るために、無菌濾過したリン酸緩衝液生理食塩水を単層細胞に添加してその後吸
引した。トリプシン−verseneグルタミン(BioWhittaker、
Walkersville、MD)を各シャ―レに5ml添加し、単層細胞に完
全に行き渡るようにゆっくりと回転させることで、シャーレから細胞を遊離させ
た。培養物はインキュベーターに戻した。細胞が遊離すると同時に、トリプシン
−verseneの作用を停止するために、SBTT(大豆トリプシンインヒビ
ター)5mlを各シャーレに添加し細胞懸濁液と混合した。細胞懸濁液をシャー
レから取り出し、無菌の円錐遠心管に等分した。細胞を約800−1000xg
で5分間遠心して集めた。
の0.4ミクロンポアサイズの24mm直径transwellに3.0x10 6 細胞/TW(6.6x105細胞/cm2)の濃度で接種した。細胞は37±1
℃、10±1%CO2中でインキュベーターに静置し以下の培地で培養した。培
地の組成は、DMEMおよびHams F−12培地(Quality Bio
logics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM G
lutaMAX(Gibco BRL、Grand Island、NY)およ
び以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(EF
G)(Upstate Biotechnology、Lake Placid
、NY)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Lou
is、MO)、1x10-4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonk
oma、NYカタログNo.2400ACSグレード)、1x10-4M O−フォ
スフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg
/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨ
ードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co
mpany、Milwaukee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン
酸(WAKO ChemicalsUSA、Inc.)、0.2μg/ml L
−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml グリ
シン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05% ポリエチレ
ングリコール(PEG)(Sigma、St.Louis、MO)である。
なものと交換し21日間培養した。21日目にサンプルを組織学的な検討のため
にホルマリンで固定した。タンパクおよびコラーゲン生成量の解析のために3個
のサンプルを使用した。
19μgであった。24mm直径の構造物の総タンパク生成量は、培養21日目
に構造物あたり210μgであった。形態学的には、ほほ繊維芽細胞の細胞−マ
トリックス構造は、口腔の結合組織の培養した組織構造であるが、マトリックス
により取り囲まれたほほの繊維芽細胞を示した。一方、物理的には、構造体は肉
体的な容量と完全さを有している。
明してきたが、請求項の範囲内で一定の変化や修飾が実用化される技術の一つで
あることは明かであろう。
物での細胞数に比較するとき、ヒドロキシプロリンアッセイによって測定される
ときに、コラーゲン濃度での増大を描くグラフである。
維芽細胞から形成される細胞−マトリックス構築物の固定され、パラフィン埋没
されたヘマトシキリンおよびエオシン染色区分の光学顕微鏡写真(対物レンズ2
0×)である。多孔性膜は、構築物より下の薄い半透明バンドとして現れる。
維芽細胞から形成される細胞−マトリックス構築物の2つの倍率の透過型電子顕
微鏡画像を示す。
マトリックスを示す7600×倍率である。
分に形成された内因性コラーゲン線維である。
ら形成される多層化した分化表皮を用いて、化学的に定義された培地中で培養ヒ
ト皮膚の線維芽細胞から形成される細胞−マトリックス構築物を含む、外因性マ
トリックス成分の不在下で化学的に定義された培地中で形成される培養皮膚構築
物の固定されたパラフィン埋設したマトキシリンおよびエオシン染色区分の光学
顕微鏡写真(対物レンズ20×)である。
Claims (30)
- 【請求項1】 細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示す原線維性コラーゲン; (ii)デコリン;および (iii)グリコサミノグリカン を包含し、そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリッ
クス成分または合成構成員の不在下で、培養線維芽細胞によって産生されること
を特徴とする、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、
培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生
する条件下で、線維芽細胞成長を包含する培養組織構築物。 - 【請求項2】 線維芽細胞が、新生男児包皮、真皮、腱、肺、尿道、臍帯、
角膜基質、口腔粘膜、および腸から構成される群から選択される組織から由来す
る請求項1に記載の培養組織構築物。 - 【請求項3】 前記培養細胞が、皮膚の線維芽細胞である請求項1に記載の
培養組織構築物。 - 【請求項4】 前記培養細胞が、毛包の皮膚の乳頭から得られる請求項1に
記載の培養組織構築物。 - 【請求項5】 前記層が、毛包の皮膚の乳頭から得られる培養細胞を有し、
該層に配置される請求項1に記載の培養組織構築物。 - 【請求項6】 前記培養細胞が、化学的に定義された培地で培養される請求
項1に記載の培養組織構築物。 - 【請求項7】 前記培養細胞が、ヒト組織から由来し、そして非ヒト成分を
含まない培地で培養される請求項1に記載の培養組織構築物。 - 【請求項8】 細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示す原線維性I型およびIII型コラーゲン; (ii)デコリン、 (iii)フィブロネクチン (iv)テナスシン;および (iii)グリコサミノグリカン を包含し、そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリッ
クス成分または合成構成員の不在下で培養線維芽細胞によって産生されることを
特徴とする、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、培
養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生す
る条件下で、培養された培養皮膚の線維芽細胞を包含する培養組織構築物。 - 【請求項9】 (a)細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示す原線維性コラーゲン; (ii)デコリン;および (iii)グリコサミノグリカン を包含し、そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリッ
クス成分または合成構成員の不在下で、培養線維芽細胞によって産生されること
を特徴とする、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、
培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を産生
する条件下で培養される培養線維芽細胞の第一の層;そして、 (b)第一の層に沈着した上皮細胞を含む細胞の第二の層 を包含することを特徴とする、少なくとも2つの層を有する培養組織構築物。 - 【請求項10】 上皮細胞が、ケラチノサイト、角膜の上皮細胞、口腔粘膜
から得られる上皮細胞、食道上皮細胞、および尿道上皮細胞から構成される群か
ら選択される請求項9に記載の二層培養組織構築物。 - 【請求項11】 前記第一の層内に含まれる線維芽細胞が、新生男児包皮、
真皮、腱、肺、軟骨、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸から構成される群か
ら選択される組織から由来する請求項9に記載の二層培養組織構築物。 - 【請求項12】 前記第一の層内に含まれる線維芽細胞が、皮膚の線維芽細
胞である請求項9に記載の二層培養組織構築物。 - 【請求項13】 前記第一の層内に含まれる線維芽細胞が、毛包の皮膚の乳
頭から得られる請求項12に記載の二層培養組織構築物。 - 【請求項14】 前記第一の層が、毛包の皮膚の乳頭から得られる培養細胞
を有し、該第一の層に配置される請求項9に記載の二層培養組織構築物。 - 【請求項15】 さらに、上皮細胞の第二の層上に沈着した細胞の第三の層
を包含する請求項9に記載の二層培養組織構築物。 - 【請求項16】 (a)細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示すI型およびIII型コラーゲン; (ii)デコリン; (iii)フィブロネクチン、 (iv)テナスシン;および (iii)グリコサミノグリカン を包含し、そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリッ
クス成分または合成構成員の不在下で培養皮膚の線維芽細胞によって産生される
ことを特徴とする、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共
に、培養線維芽細胞によって合成および組立てられる細胞外マトリックスの層を
生成する条件下で培養される培養皮膚の線維芽細胞の第一の層;そして、 (b)上皮細胞層を、多層化し、層にし、分化し、そして基底層、超基底層、顆
粒層および角質層を示し、そして二層培養皮膚構築物が、第一および第二の層の
接合点に存在する基底膜を有することを特徴とする、第一の層に沈着して、上皮
細胞層を形成するケラチノサイト細胞の第二の層 を包含することを特徴とする、少なくとも2つの層を有する培養皮膚構築物。 - 【請求項17】 培養線維芽細胞を、遺伝的に修飾して、細胞外マトリック
ス成分を産生する請求項1、8、9および16のいずれかに記載の構築物。 - 【請求項18】 培養線維芽細胞を、遺伝的に修飾して、成長因子、ホルモ
ン、ペプチド、またはタンパク質を産生する請求項17に記載の構築物。 - 【請求項19】 (a)第一の細胞培養培地中の培養容器中の多孔性膜上に
、細胞外マトリックスを合成する能力のある線維芽細胞を蒔き、 (b)多孔性膜上で約80%から約100%までの間の融合まで第一の細胞培養
培地中の段階(a)の線維芽細胞細胞を培養し; (c)線維芽細胞を刺激して、第二の培養培地中の培養条件下で細胞外マトリッ
クス成分を合成、分泌、および組織化させ、および (d)細胞が、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、
少なくとも厚さ約30ミクロンの合成細胞外マトリックスの層を形成するまで、
線維芽細胞の培養を継続することを包含し、 細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示す原線維性コラーゲン; (ii)デコリン;および (iii)グリコサミノグリカン を包含し、そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリッ
クス成分または合成構成員の不在下で、培養線維芽細胞によって産生されること
を特徴とする、培養組織構築物を産生する方法。 - 【請求項20】 第一の培養培地、または第二の培養培地のいずれか、また
は第一および第二の培養培地の両方が、化学的に定義される請求項19に記載の
方法。 - 【請求項21】 第一および第二の培養培地が、非ヒト成分を含まない請求
項19に記載の方法。 - 【請求項22】 段階(a)で、線維芽細胞が、約1×105細胞/cm2か
ら約6.6×105細胞/cm2までの間の密度で蒔かれる請求項19に記載の方
法。 - 【請求項23】 線維芽細胞が、新生男児包皮、臍帯、真皮、腱、肺、尿道
、角膜基質、口腔粘膜、および腸から構成される群から選択される組織から由来
する請求項19に記載の方法。 - 【請求項24】 (a)第一の細胞培養培地中の培養容器中の多孔性膜上に
、細胞外マトリックスを合成する能力のある線維芽細胞を蒔き、 (b)多孔性膜上で約80%から約100%までの間の融合まで第一の細胞培養
培地中の段階(a)の線維芽細胞を培養し; (c)段階(a)の線維芽細胞を刺激して、第二の培養培地中の培養条件下で細
胞外マトリックス成分を合成、分泌、および組織化させ、 (d)細胞が、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、
厚さ約30から約110ミクロンの合成細胞外マトリックスの層を形成するまで
、線維芽細胞の培養を継続し、 細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示す原線維性コラーゲン; (ii)デコリン;および (iii)グリコサミノグリカン を包含し、そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリッ
クス成分または合成構成員の不在下で、培養線維芽細胞によって産生され; (e)段階(d)の合成細胞外マトリックスの頂部表面に上皮細胞を蒔き、そし
て、 (f)培養条件下で段階(e)の上皮細胞を刺激して、合成細胞外マトリックス
層内に含まれる培養線維芽細胞、および上皮細胞の第二の層と共に、細胞外マト
リックスの二層組織構築物を形成することを特徴とする、二層培養組織構築物を
産生する方法。 - 【請求項25】 前記細胞外マトリックスを合成する能力のある線維芽細胞
が、新生男児包皮、真皮、腱、肺、軟骨、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸
から構成される群から選択される組織から由来する請求項24に記載の方法。 - 【請求項26】 前記上皮細胞が、ケラチノサイト、角膜の上皮細胞、口腔
粘膜から得られる上皮細胞、食道の上皮細胞、および尿道上皮細胞から構成され
る群から選択される請求項24に記載の方法。 - 【請求項27】 方法が、段階:(a)約1×105細胞/cm2から約6.
6×105細胞/cm2までの間の密度で、第一の化学的に定義された細胞培養培
地中の培養容器中の多孔性膜上に線維芽細胞を蒔き、 (b)約80%から約100%までの間の融合まで第一の化学的に定義された細
胞培養培地中で段階(a)の線維芽細胞を培養し; (c)段階(a)の線維芽細胞を刺激して、第二の化学的に定義された培養培地
中の細胞を培養することによって細胞外マトリックス成分を合成、分泌、および
組織化させ、 (d)細胞が、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、
少なくとも厚さ約30ミクロンの合成細胞外マトリックスの層を形成するまで、
線維芽細胞の培養を継続し、 細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示すI型およびIII型コラーゲン; (ii)デコリン; (iii)テナスシン;および (iv)グリコサミノグリカン を包含し、 そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリックス成分
または合成構成員の不在下で、培養した皮膚の線維芽細胞によって産生され; (e)段階(d)の合成細胞外マトリックスの頂部表面にケラチノサイトを蒔き
、そして、 (f)培養条件下でケラチノサイト細胞を培養して、上皮層を形成することを包
含し、 上皮細胞層が、基底層、超基底層、顆粒層および角質層を示すケラチノサイト
の多層化、層化、分化された層であり、 そして、二層培養皮膚構築物が、第一および第二層の接合点に存在する基底膜
を有することを特徴とする、構造支持体スカホードまたは外因性マトリックス成
分の不在下で、その上に沈着した皮膚層および表皮層を包含する二層培養皮膚構
築物を産生する方法。 - 【請求項28】 請求項1、8、9または16のいずれかの培養組織構築物
を、その治療を必要とする患者に移植または植付けすることを特徴とする、患者
への培養組織構築物の移殖または植付けの方法。 - 【請求項29】 (a)約80%から約100%までの間の融合で、細胞培
養培地中で培養容器中の多孔性膜上に細胞外マトリックスを合成する能力のある
線維芽細胞を蒔き、 (b)線維芽細胞を刺激して、第二の培養培地中の培養条件下で細胞外マトリッ
クス成分を合成、分泌、および組織化し、そして (c)細胞が、合成細胞外マトリックス層内に含まれる培養線維芽細胞と共に、
少なくとも厚さ約30ミクロンの合成細胞外マトリックスの層を形成するまで、
線維芽細胞の培養を継続し、 細胞外マトリックスが、 (i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の包装組
織化を示す原線維性コラーゲン; (ii)テナスシン;および (iii)グリコサミノグリカン を包含し、 そして該細胞外マトリックスが、培養条件の間じゅう外因性マトリックス成分
または合成構成員の不在下で、培養線維芽細胞によって産生されることを特徴と
する、培養組織構築物を産生する方法。 - 【請求項30】 構築物が、物理的単位完全性および組織様取扱い特性を有
する上で凝集性である、請求項1−18のいずれかに記載の構築物。
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