JP2009528856A - 口腔組織の再生および修復 - Google Patents
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Abstract
Description
組織工学の分野は、生物工学的方法と生命科学の原理を組み合わせて、正常な哺乳動物組織と病理的な哺乳動物組織の構造的および機能的関係を理解する。組織工学の目的は、生物学的代替物を開発し、組織機能を回復、維持、または改善するために最終的に適用をすることである。したがって、組織工学によって、実験室レベルで生物工学処理された組織を設計および製造することができる。生物工学的処理された組織は、通常、天然の哺乳動物組織またはヒト組織と合成もしくは外因性のマトリクススカホードとを関連づけた細胞を含むことができる。
本発明は、培養組織構築物を被験者の口腔組織に移植することによって、被験者の口腔の状態を治療するための方法に関する。
本発明は、被験者の口腔の状態を、培養組織構築物を移植することによって治療することに関する。
本発明の培養組織構築物は、口腔歯肉の後退、歯間の乳頭状突起の欠損、歯茎音リッジの欠陥、口腔インプラントの不全の結果、または上顎顔面の腫瘍切除などの口腔の状態を治療するために適用される。
本発明のある好ましい実施態様は、少なくとも1つのタイプの細胞外マトリックス産生細胞および内因的に産生された細胞外マトリックス成分の構造層(より簡単には「マトリックス」と呼ぶ)を含む。該マトリックスは完全に細胞合成され、細胞を培養することによって組み立てられる。この層を本明細書においては、「細胞−マトリックス構築物」または「細胞−マトリックス層」と呼んでいる。なぜなら、該細胞は、マトリックス内およびマトリックスを通して細胞自身を分泌および含有するからである。2000年3月3日(原語:03/03/200)に出願された共係属の米国特許出願第09/523,809号(その内容を本明細書において引用によって援用する)に記載されているように、該培養組織構築物は、外因性のマトリックス成分、すなわち、培養された細胞によって産生されたものではない、他の手段によって導入されたマトリックス成分を必要とせず、したがってそれを含まない。より好ましい実施態様においては、ヒト真皮線維芽細胞によって作製された細胞−マトリックス構築物が、天然の皮膚に類似した有力なコラーゲン濃度を持つことが示された。電子顕微鏡から明らかなように、該マトリックスは、線維状の性質を持ち、4分の1差の67nmバンディングパターンを示すコラーゲンを含み、また、天然のコラーゲンに類似した原線維および原線維束の結合構成を示す。
vivoで原線維の直径を調節すると思われているデルマタン硫酸プロテオグリカンである、デコリンに対して陽性に染色する。デコリンは、TEMを用いて構築物中で可視化もされうる。産生した組織は、例えば、修復中の間葉または組織で見られる細胞外マトリックス糖タンパク質であるテナスシンに対して陽性に染色もする。生体内で修復中の組織とより同様に、培養基中で産生された組織は、マトリックスが形成されるときにI型対III型コラーゲンのそれの比を増大することが示された。
(a)外因性細胞外マトリックス成分または構造的支持体部材の不在下で、少なくとも1つの細胞外マトリックス産生細胞タイプを培養すること;および
(b)ステップ(a)の細胞を刺激して、細胞外マトリックス成分を合成、分泌および組織化させ、それらの細胞により合成される細胞およびマトリックスから構成される組織構築物を形成し、ステップ(a)および(b)が、同時にまたは連続して行われる。
vivoで最も有効である。ヒト線維芽細胞株は、制限されないが、新生男児包皮、真皮、腱、肺、臍帯、軟骨、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸を含めた多数の起源から誘導することができる。ヒト細胞としては、線維芽細胞に限定されず、平滑筋細胞、軟骨細胞、および間葉起源の他の結合組織細胞が挙げられる。組織構築物の産生に使用されるマトリックス産生細胞の起源が、本発明の培養法を使用した後に類似または模倣すべき組織タイプに由来する必要はないが、そうであることが好ましい。例えば、皮膚構築物が産生される実施態様では、好ましいマトリックス産生細胞は、線維芽細胞、好ましくは真皮起源のものである。
in Enzymology、58巻:44−93頁(1979年)で開示されるもののように当業界で公知であるか、または他の適切な化学的に定義された培地については、Bottensteinらで、Methods
in Enzymology、58巻:94−109頁(1979年)に開示される。好ましい具体例では、基本培地は、動物細胞培養で習熟者に知られている以下の成分で補足される。インシュリン、トランスフェリン、トリヨードチロニン(T3)、および補足についての濃度および置換が、当業者によって決定されうる、いずれかまたは両方のエタノールアミンおよびo−ホスホリル−エタノールアミン。
Physiol.、138巻:208−214頁(1986年))。したがって、ヒドロコルチゾンは、ケラチノサイトシート状移殖片または皮膚構築物の形成でのようなこれらの特徴が、有益である例で、望ましい添加剤である。ヒドロコルチゾンは、約0.01μg/mlから約4.0μg/mlの濃度範囲で、最も好ましくは約0.4μg/mlから16μg/mlの間で提供されうる。
of Clinical
Investigation、79巻:1285−1288頁(1987年);Pardesら、Journal
of Investigative
Dermatology、100巻:549頁(1993年)。コラーゲン産生を刺激する無機塩の例は、セリウムである。Shivakumarら、Journal
of Molecular
and Cellular
Cardiology、24巻:775−780頁(1992年)。
本発明の別の実施態様において、当該培養組織構築物は、コラーゲン溶液と収縮性の作用物質とからなる、ゲル混合物を含む。
Cell Behavior," J. Cell Biol. 54, 626-637 (1972); Ehrmann, R. L. and Gey, G. 0., "The Growth of Cells on A
Transparent Gel of Reconstituted Rat-Tail Collagen," J. Natl. Cancer
Inst., 16, 1375-1403 (1956); Emermann, J. T. and Pitelka, D. R., "Hormonal Effects on
Intracellular and Secreted Casein in Cultures of Mouse Mammary Epithelial Cells
on Floating Collagen Membranes," In Vitro, 13, 316- 328 (1977); Michalopoulous, G. and Pitot, H. C, "Primary Culture of
Parenchymal Liver Cells on Collagen Membranes," Exp. Cell Res. 94, 70-78 (1975); Gey, G. 0. Svotelis, M., Foard, M. and Bang, F. B.,
"Long-Term Growth of Chicken Fibroblasts On A Collagen Substrate,"
Exp. Cell Res., 84, 63-71 (1974); and Hillis, W. D. and Band, F. B., "The Cultivation of Human
Embryonic Liver Cells," Exp. Cell Res., 26, 9-36 (1962)。
例えば、バクテリアのペトリ皿を用いた場合、ラティスはその半径が細胞によって縮小されるので、ほぼ完全にディスク形を維持する。線維芽細胞は、ラティス表面だけでなく、コラーゲンラティス全体に均等に広がっているのがわかる。次いで、これによって、ヒトおよび他の哺乳動物の真皮層を刺激する。
適切な成型によって皮膚の球形に調製してもよい。
本実施形態の培養組織構築物は、水和コラーゲンラティスを含むものと、その調製方法および使用方法が似ているが、さらに、コラーゲンの層を含むものである。
(a)コラーゲンおよび少なくとも1つの収縮性の作用物質を含む混合物を形成するステップ;および
(b)ステップ(a)で取得した混合物を、透過性部材と接触した無細胞水和コラーゲンゲルに適用し、組織等価物の形成を可能とする条件下で該混合物およびゲルを維持するステップ、を含む。
1.グルコース利用度
2.表皮の層状化および角質化の程度および量
3.培地のpH
(a)コラーゲンおよび少なくとも1つの収縮性の作用物質を含む混合物を形成するステップ;
(b)ステップ(a)で取得した混合物を、透過性部材と接触した無細胞水和コラーゲンゲルに適用し、組織等価物の形成を可能とする条件下で該混合物およびゲルを維持するステップ、および
(c)ステップ(b)で取得した組織等価物をケラチノサイトとともに播くステップ、を含む。
SIN.RTM.ブタジエン−スチレンポリマーは、Phillips
Petroleumの登録商標である)。いくつかの実施態様において、容器は、組織等価物が容器、例えば、容器の壁または容器の窓を介して見えるように作られていることが望ましい。容器10の好ましい材料としては、ポリスチレンおよびPETGがある。
Pont de
Nemours and
Companyの登録商標)、ポリカーボネートおよびナイロンがあげられる。封着剤は、外側容器の内容物をあらゆる溶液、または表皮25に付与される物質から分離して保持することが望ましい場合、例えば、組織等価物を介しての物質の拡散または透過を測定する場合、特に有用である。
and Loop
Fasteners(Velcro Corporationの登録商標)といった、機械的に抑制する手段を必要とせずに、組織等価物の過度の放射方向への収縮を阻止する。
実施例1:ヒト新生児包皮繊維芽細胞によるコラーゲンマトリックスの形成 ヒト新生児包皮繊維芽細胞(Organogenesis、Inc.Canton、MAより入手)は、162cm2組織培養用シャーレ(Costar
Corp.、Cambridge、MA、カタログ番号3150)に5×105細胞を接種し培養液で培養した。成長培地の組成は、10%ウシ胎児血清(NBCS)(HyClone
Laboratories、Inc.、Logan、Utah)および4mM
L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)である。細胞は10±1%
CO2中で37±1℃のインキュベーターで培養した。培地は2〜3日ごとに新鮮なものと交換した。培養8日後に、細胞がコンフルエンス状態、すなわち組織培養用シャーレの底面いっぱいの単層になった時に、培地をフラスコから吸引した。単層細胞を洗浄するために、無菌濾過したリン酸緩衝液生理食塩水を各フラスコの底に添加してその後吸引した。トリプシン−バーゼン液グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を各フラスコに5mL添加し、単層細胞に完全に行き渡るようにゆっくりと回転させることで、フラスコから細胞を遊離させた。培養物はインキュベーターに戻した。細胞が遊離すると同時に、トリプシン−バーゼン液の作用を停止するために、SBTI(大豆トリプシンインヒビター)5mlを各フラスコに添加し細胞懸濁液と混合した。細胞懸濁液をフラスコから取り出し、無菌の円錐遠心管に等分した。細胞を約800−1000xgで5分間遠心して集めた。
Coastar)に3.0×106細胞/挿入体(6.6×105細胞/cm2)の濃度で接種した。細胞は10±1%
CO2で37±1℃のインキュベーター内に静置して、培地は2〜3日ごとに新鮮なものと交換し21日間培養した。産生培地の組成は、DMEMおよびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX−1(登録商標)(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および最終濃度が以下のようになる添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate Biotechnology、Lake
Placid、NY)、2% 新生子牛血清(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)、0.4μg/ml
ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY、ACSグレード)、1×10−4M
O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、50ng/ml
L−アスコルビン酸(WAKO Chemicals USA、Inc.
#013−12061)、0.2μg/ml L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml グリシン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05% ポリエチレングリコール(PEG)3400−3700MW(細胞培養グレード)(Sigma、St.Louis、MO)。
Histostain ストレパビジン−ビオチン システム(Zymed
Laboratories Inc.、South San
Fransisco、CA)を用いて行った。テナシンの存在の有無は、抗テナシン一次抗体染色(Dako、Carpintheria、CA)および続く二次抗体としての抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識抗体(Calbiochem)を用いて、確認した。サンプルは、ジアミノベンジン(Sigma、St.Louis、MO)を適用しNucler
Fast Redで逆染色することにより可視化した。
実施例1で示した方法で作成した真皮構築物を用いて、正常ヒト新生児包皮表皮ケラチノサイト(Organogenesis、Inc.Canton、MAより入手)を細胞−マトリックス構築物上に播種し、皮膚構造の表皮層を形成した。
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/ml アデニン(Sigma
Aldrich Fine
Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、0.3%
キレート化新生子牛血清(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)、0.628ng/ml プロゲステロン(Amersham Arlington
Heights、IL)、50μg/ml L−アスコルビン酸ナトリウム塩(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Co.、Milwaukee、WI)、10ng/ml 表皮成長因子(Life Technology
Inc.、MD)、および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington
Heights、IL)である。構築物は表皮化培地中で37±1℃、10%CO2中で2日間培養した。
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Co.、Milwaukee、WI)、24.4μg/ml アデニン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Company)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、0.3% キレート化新生子牛血清(BioWhittaker、Walkersville、MD)、0.628ng/ml プロゲステロン(Amersham Arlington
Heights、IL)、50μg/ml L−アスコルビン酸ナトリウム塩、265μg/ml 塩化カルシウム(Mallinckrodt、Chesterfield、MO)、および50μg/ml
硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington Heights、IL)である。構築物を再び37±1℃、10%CO2中で2日間培養した。
Biologics Gaithersburg、MD)の1:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/ml アデニン(Sigma
Aldrich Fine
Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、2%新生子牛血清(BioWhittaker、Walkersville、MD)、50μg/ml
L−アスコルビン酸ナトリウム塩(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、および50μg/ml
硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington Heights、IL)である。7日目に構築物を供給し、2〜3日毎に維持培地を交換しながら更に10日間培養した。この維持培地の組成は;ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)およびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の1:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Co.、Milwaukee、WI)、24.4μg/ml アデニン(Sigma
Aldrich Fine
Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、1%
新生子牛血清(BioWhittaker、Walkersville、MD)、および50μg/ml
硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington Heights、IL)である。
実施例1に記載した処置を用いてヒト新生児包皮線維芽細胞を増殖させた。次いで細胞を3.0×106細胞/mlの濃度になるように再懸濁し、6ウェルトレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径組織培養用挿入体に、3.0×106細胞/TW(6.6×105細胞/cm2)の濃度で播種した。その後これらの細胞を、新生子ウシ血清を除いた培地で実施例1と全く同様に維持した。より詳細には、培地の組成は、DMEMおよびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX−1TM(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY、カタログNo.2400ACSグレード)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Co.、Milwaukee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸(WAKO Chemicals
USA)、0.2μg/ml L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml グリシン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05% ポリエチレングリコール(PEG)(Sigma、St.Louis、MO)。サンプルは、前述の方法で、培養7、14および21日目にコラーゲン濃度および細胞数をチェックした。結果を、表4(細胞数)および表5(コラーゲン)にまとめた。サンプルはホルマリンで固定し、実施例1で述べたように、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、光学顕微鏡分析を行った。組織学的な評価で、構造体は限定培地で2%新生子ウシ血清存在下と同様に生育することが証明された。サンプルはまた、実施例1で述べた処置を用いてフィブロネクチンの陽性染色を行った。
実施例3で示した方法に類似した化学的に限定した条件下で、ヒト皮膚線維芽細胞により形成された25日目の真皮構築物を用いて、正常ヒト新生児包皮表皮ケラチノサイトを細胞−マトリックス構築物の表面上に接種し、皮膚構造の表皮層を形成した。
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/ml アデニン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、4mM
L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、50μg/ml
L−アスコルビン酸ナトリウム塩(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、16μM
リノール酸(Sigma、St.Louis、MO)、1μM 酢酸トコフェロール(Sigma、St.Louis、MO)、および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington
Heights、IL)である。構築物は、表皮化培地中で37±1℃、10±1%CO2中で2日間培養した。
CO2中、インキュベーターで2日間培養した。2日後、構築物を含むキャリヤーを無菌的に十分な量の培地を入れた新しい培養トレーに移し、キャリヤー膜の表面と一致する水面になり、空気−液体界面で構築物が発達するのを維持することが出来るようにした。形成される表皮層の表面に接触する空気は、上皮細胞層の層状化を促す。構築物は37±1℃、10%CO2中で、低湿度で2〜3日毎に培地を交換しながら7日間培養した。この培地の組成は;ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)およびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の1:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、5×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、5×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Co.、Milwaukee、WI)、24.4μg/ml アデニン(Sigma
Aldrich Fine
Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、2.65μg/ml
塩化カルシウム(Mallinckrodt、Chesterfield、MO)、16μM
リノール酸(Sigma、St.Louis、MO)、1μM 酢酸トコフェロール(Sigma、St.Louis、MO)、1.25mM セリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.64mM塩化コリン(Sigma、St.Louis、MO)、および50μg/ml
硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington Heights、IL)である。2〜3日毎に培地を交換しながら14日間培養した。
Vitro形成
実施例1で述べたのと同じ方法を用いて、ヒト新生児包皮線維芽細胞をヒトアキレス腱線維芽細胞(HATF)に代えて細胞−マトリックス構築物を形成した。産生培地で21日間培養した後に、実施例1に記載した処置を用いてサンプルをH&E染色し、厚さを測定した。得られた構築物は、厚さ75.00±27.58ミクロン(n=2)の細胞−マトリックス組織様構築物として可視化された。また、この構築物中には内因的に産生される筋原線維コラーゲン、デコリン、およびグリコサミノグリカンが存在した。
トランスフェクトしたヒト真皮線維芽細胞を以下の処置によって産生させた。1バイアルのjCRIP−43血小板由来成長因子(PDGF)ウイルス発生体(Morgan、J.ら)を溶解し、細胞を2×106細胞/フラスコ162cm2(Corming
Costar、Cambridge、MA)の密度で播種した。これらのフラスコには成長培地を入れ、10±1%CO2中で37±1℃でインキュベーターに静置した。成長培地の組成は、ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)で、10%
新生子ウシ血清(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)、および4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を含む。同じ日に、1バイアルのヒト新生児包皮線維芽細胞(HDFB156)も溶解し、1.5×106細胞/フラスコ162cm2(Corning
Costar、Cambridge、MA)の密度で播種した。3日後にjCRIP
PDGF−43ウイルス発生体に新鮮な成長培地を与えた。HDFB156は上述の成長培地プラス8μg/ml
ポリブレン(Sigma、St.Louis、MO)で培養した。次の日にHDFB156細胞を以下のように感染させた。jCRIP
PDGF−43ウイルス発生体からの培養液を集めて0.45ミクロンフィルターで濾過した。8μg/ml
ポリブレンをこの濾過した培養液に添加した。それから培養液をHDFの上に置いた。次の2日間、HDFを新鮮な成長培地で培養した。HDFが5代から6代の継代をした翌日に2.5×106細胞/フラスコ162cm2(Corning
Costar、Cambridge、MA)の密度で播種した。細胞は以下のように継代培養し、培養液は吸引した。フラスコをリン酸緩衝液生理食塩水で洗浄し、残存する新生子ウシ血清を除いた。トリプシン−バーゼン液を各フラスコに5ml添加し、単層に完全に行き渡るようにゆっくりと回転させることで、フラスコ底面から細胞を遊離させた。培養物はインキュベーターに戻した。細胞が遊離すると同時に、トリプシン−バーゼン液の作用を停止するために、SBTI(大豆トリプシンインヒビター)5mlを各フラスコに添加し細胞懸濁液と混合した。細胞/トリプシン/SBTI懸濁液をフラスコから取り出し、無菌の円錐遠心管に等分した。細胞を約800〜1000xgで5分間遠心して集めた。該細胞を、播種用に成長培地に上記リストした濃度になるように再懸濁した。2日後に細胞に新鮮な培地を与えた。翌日上記のように細胞を集め、10%
新生子牛血清(NBCS)と10% ジメチルスルフォキサイド(DMSO)(Sigma、St.Louis、MO)を含む成長培地で1.5×106細胞/mlに希釈した。該細胞を1ml/凍結バイアルに入れて−80℃で保存した。
ng/mLであった。一方、対照ではPDGFの排出は検出できなかった。
実施例1の方法に従って、新生児包皮に由来するヒト真皮線維芽細胞を用いて細胞−マトリックス構築物を形成し、無胸腺ヌードマウスに作成した全切開創に移植した。マウスは、Parenteauら(1996)の方法に従って移植した。その開示を本明細書に引用によって援用する。移植は、14、28、および56日目に、切開口の接着、切開創の縮小、移植損失部分、および血管新生(色)で観察した。移植部分はマウスで完全に残っている間に写真を撮った。各時点で多くのマウスを屠殺して、移植部分およびその周辺部を、マウス皮膚の周辺縁に沿って少なくとも皮下脂肪肉部まで切開した。移植物とマウス皮膚との接合部はサンプルごとに保存した。体外移植組織サンプルを、リン酸緩衝液10%ホルマリンおよびメタノールで固定した。ホルマリン固定したサンプルを、実施例1で述べた操作に従ってH&E染色に呈した。移植物は、顕著な縮小もなくマウスの皮膚に取り込まれた。移植の14日以内にマウスの表皮は移植物を覆った。H&E染色サンプルでは、14日目の移植物には血管が明らかに認められた。そして実験全体を通じて認められた。肉眼での観察およびH&E染色により、移植物は実験期間中を通して健全である(生存している細胞を含みマトリックスの異常は、肉眼的には認められない、等)ように見えた。
実施例2の方法に従って、真皮層の新生児包皮に由来するヒト真皮線維芽細胞および別の表皮層の新生児包皮に由来するヒト角質実質細胞を用いて、2層皮膚構造を形成した。この皮膚構築物は、膜から手で剥がし、キャリアサポートを用いずに処理し、移植部位に置くことができた。この2層皮膚構築物を、Parenteauら(1966)の方法に従って無胸腺ヌードマウスに形成した全切開創に移植した。その開示を本明細書において引用によって援用する。サンプルの採取は、移植後7、14、28、56、および184日目に行った。移植部分はマウスで完全に残っている間に写真を撮った。各時点で多くのマウスを屠殺して、移植部分およびその周辺部を、マウス皮膚の周辺縁に沿って少なくとも皮下脂肪肉部まで切開した。移植物とマウス皮膚との接合部は各サンプルで保存した。体外移植組織サンプルはリン酸緩衝液10%ホルマリンおよびメタノールで固定した。ホルマリン固定したサンプルを、実施例1で述べた操作に従ってH&E染色に呈した。
ヒト角膜のケラチノサイト(Organogenesis、Inc.Canton、MAより入手)を角膜の基質構築物の形成に用いた。コンフルエントになったヒトケラチノサイト培養物を、トリプシン−バーゼン液を用いて培養基質から遊離させた。細胞が遊離した時、大豆トリプシンインヒビターを用いてトリプシン−バーゼン液の作用を中和し、細胞懸濁液を遠心し、上清は捨てて細胞は新鮮な培地に3.0×106/mlの濃度になるように基礎培地に再懸濁させた。細胞は、6ウェルトレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径組織培養用トランスウェルに3×106細胞/TW(6.6×105細胞/cm2)の濃度で播いた。これらの培養物を、播種培地で一晩放置した。播種培地の組成は;ダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)およびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(EFG)(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M
O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、および6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)である。続いてこの培養物に新鮮な産生培地を与えた。産生培地の組成は;DMEM)およびF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、2% 新生子牛血清(HyClone
Laboratories、Logan、Utah)、0.4μg/ml
ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M
O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、50ng/ml
L−アスコルビン酸(WAKO Pure Chemicals)、0.2μg/ml
L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml
グリシン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05%
ポリエチレングリコール(PEG)3400−3700 MW(細胞培養グレード)(Sigma、St.Louis、MO)である。
Vitro形成
ヒト新生児包皮線維芽細胞(Organogenesis、Inc.Canton、MAより入手)は、6ウェルトレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径組織培養用キャリヤー(TRANSWELL(登録商標)、Costar
Corp.、Cambridge、MA)に1×105細胞/TWの濃度で播き、成長培地で培養した。成長培地の組成は、10%
新生子ウシ血清(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)および4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)である。細胞は10±1%
CO2中で37±1℃のインキュベーターで培養した。培地は2〜3日毎に新鮮なものと交換し21日間培養した。産生培地の組成は、DMEMおよびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、2% 新生子牛血清(HyClone
Laboratories、Inc.、Logan、Utah)、0.4μg/ml
ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY、ACSグレード)、1×10−4M
O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、50ng/ml
L−アスコルビン酸(WAKO Pure Chemicals)、0.2μg/ml
L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml
グリシン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05%
ポリエチレングリコール(PEG)(細胞培養グレード)(Sigma、St.Louis、MO)。
America Inc.、Melville、NY)のついた10x接眼レンズ(Olympus
America Inc.、Melville、NY)を用いて任意に選んだ10カ所の顕微鏡視野で測定した。この方法によって作製した該構築物は、構造および生化学的組成において、実施例1において作成したものと類似しており、厚みの測定値は、82.00±7.64である。
ブタ真皮線維芽細胞(Organogenesis、Inc.Canton、MAより入手)を5×105細胞/162cm2組織培養用フラスコ(Corming
Costar、Cambridge、MA、カタログ番号3150)の密度で播き、以下のように培養した。成長培地の組成は、10%
新生子牛血清(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)および4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)である。細胞は10±1%
CO2中で37±1℃のインキュベーターで培養した。培地は2〜3日毎に新鮮なものと交換した。コンフルエンスに達したら、すなわち、細胞が組織培養用フラスコの底部にぎっしり詰まった状態の層を形成したら、培地を吸引した。単層を洗浄するために、無菌濾過したリン酸緩衝液生理食塩水を単層に添加してその後培養皿から吸引した。トリプシン−バーゼン液グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を各フラスコに5ml添加し、単層細胞に完全に行き渡るようにゆっくりと回転させることで、フラスコから細胞を遊離させた。培養物はインキュベーターに戻した。細胞が遊離するとすぐ、トリプシン−バーゼン液の作用を停止するために、SBTT(大豆トリプシンインヒビター)5mlを各フラスコに添加し細胞懸濁液と混合した。細胞懸濁液をフラスコから取り出し、無菌の円錐遠心管に等分した。細胞を約800〜1000xgで5分間遠心して集めた。細胞を再懸濁し3.0×106/mlの濃度になるように希釈し、6ウェルトレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径トランスウェルに3.0×106細胞/TW(6.6×105細胞/cm2)の濃度で播いた。細胞を播種培地中で一晩維持した。播種培地の組成は;DMEMおよびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(EFG)(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M
O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、50ng/ml
L−アスコルビン酸(WAKO Pure Chemicals)、0.2μg/ml
L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.1μg/ml
グリシン(Sigma、St.Louis、MO)である。細胞は10±1%
CO2中で37±1℃のインキュベーター内に静置して、培地は2〜3日ごとに新鮮なものと交換しながら7日間培養した。産生培地の組成は、DMEMおよびハムF−12培地(Quality
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、2% 新生子ウシ血清(HyClone、Logan、Utah)、0.4μg/ml
ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M
O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Co.、Milwaukee、WI)、50ng/ml
L−アスコルビン酸(WAKO Pure Chemicals)、0.2μg/ml
L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml
グリシン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05%
ポリエチレングリコール(PEG)(細胞培養グレード)(Sigma、St.Louis、MO)である。7日後に産生培地を新生子牛血清を含まないものに代えた。この培地は2〜3日毎に新鮮なものと交換しながら、更に20日間、計28日間培養した。
America Inc.、Melville、NY)のついた10x接眼レンズ(Olympus
America Inc.、Melville、NY)を用いて任意に選んだ10カ所の顕微鏡視野で測定した。サンプルは細胞とマトリックスから成る構造を有し、厚さが71.20±9.57ミクロンであった。また、細胞−マトリックス構築物中には内因的に産生される筋原線維コラーゲン、デコリン、およびグリコサミノグリカンが存在した。
一次マトリックス産生細胞タイプとして正常ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いて、実施例1で示した方法に従って細胞−マトリックスを作成した。この細胞−マトリックスを二次産生細胞としての真皮乳頭細胞に局所的に播種した。次にこれを三次産生細胞としての角質実質細胞に播種し、細胞−マトリックスおよび真皮乳頭細胞の上を覆う連続的な表皮層を形成した。
Corp.、Cambridge、MA)の密度で接種した。成長培地の組成は、10%
新生子ウシ血清(NBCS)(HyClone Laboratories、Inc.、Logan、Utah)および4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)を含むダルベッコ改良イーグル培地(DMEM)(高グルコース濃度、L−グルタミン無添加、BioWhittaker、Walkersville、MD)である。コンフルエントに達したら、HDFをトリプシン−バーゼン液を用いてプレートから遊離させた。細胞は新鮮な培地に3.0×106/mlの濃度になるように再懸濁させ、6ウェルトレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径組織培養用挿入体(TRANSWELL(登録商標)、Corning
Corstar)に3×106細胞/挿入体(6.6×105細胞/cm2)の濃度で播いた。HDF培養物は、10±1%
CO2中で37±1℃のインキュベーターで培養した。実施例1で示した方法に従って、新鮮な産生培地を2−3日毎に与えて23日間培養した。
vitroで培養できる。この方法を本明細書において引用によて援用する。真皮乳頭細胞はコンフルエントになったら凝集し、フラスコ上では代わって新たな凝集を作る。真皮乳頭を4週齢のブタでの皮膚バイオプシーにより単離した。真皮乳頭からの細胞(PDP)は、20%NBCSを含むDMEMで8代まで継代培養した。培養3週間後、PDP細胞は真皮乳頭様構造を呈し、あるいは凝集し、各々の直径は約90〜210ミクロンであった。その後培地を激しくピペッティングをすることによって、プレートから凝集物を培養プレートから採り、ヒトコラーゲンマトリックス上に200凝集物/cm2の濃度で播いた。凝集物は、20%NBCSを含むDMEMで更に15日間、新鮮な培地を2c3日毎に与えて培養した。
実施例1および3の方法に従って、それぞれ、血清含有培地および化学的に限定した培地中で、真皮線維芽細胞により形成された細胞−マトリックス構築物中のヒアルロン酸(HA)を測定した。
NaHCO3溶液に溶かした20μg/ml
HA結合タンパク質の50μlでコーティングし、4℃で一晩保存した。プレートは0.05% Tween20を含有する0.85%食塩水で3回洗浄した。その後、各ウェルに250μlのブロッキング液(3%
BSAおよび0.9%塩化ナトリウムを含む10mM リン酸緩衝液、pH7.4)を添加し、プレートを室温で2時間インキュベートした。その後、プレートを、0.05%
Tween20を含有する0.85%食塩水で3回洗浄した。次いで、プレートに50μlの標準HA液および両方の実験条件での抽出サンプルを、種々の希釈を含めて、添加した。プレートを、室温(約20℃)で2時間インキュベートした。それから、プレートを、0.05% Tween20を含有する0.85%食塩水で3回洗浄して、各ウェルに50μlのビオチン化HA(1:2000希釈)を添加し、室温で2時間インキュベートした。その後、プレートを、0.05%
Tween20を含有する0.85%食塩水で3回洗浄し、各ウェルに50μlのHRP−アビジンD(1:3000希釈)を添加した。次いで、プレートを室温で45分間インキュベートした。それから、プレートを、0.05%
Tween20を含有する0.85%食塩水で3回洗浄して、各ウェルに100μlのオルソ−フェニレンジアミン基質溶液を添加し、37℃で10分間インキュベートした。反応は1M 塩酸50μlを添加することで停止した。最終的にプレートリーダーを用いて492nmの吸光度を読み記録した。
実施例1(細胞−マトリックス構築物)、実施例2(ケラチノサイト層に覆われた細胞−マトリックス構築物)、および実施例3(限定培地で作成した細胞−マトリックス構築物)の各組織構造物の機械的特性を膜膨張法で定量した。これらの試験は臨床的に用いられているアッセイ(例、Dermaflex(登録商標)、Cyberderm
Inc.、Media、PAおよびCutameter(登録商標)、Courage
Khazaka、Colonge、Germany)に類似しているが、膜を破裂できる圧を含めてより高い圧を使っている。サンプルの細胞−マトリックス構築物を、等張の生理食塩水を満たした直径10mmの円柱状ウェルの中心に置いたポリカーボネートブロックの上に水平に置いた。円柱状ウェルの直径に対応した円形の穴を持つ金属プレートを、サンプルの上に置きブロックに留めた。そして、シリンジポンプで追加の食塩水を注入することによりサンプルを膨張させた。圧伝導計を用いて得られた圧を測定した。装置が破壊されるまで加圧を続け破裂強度、実施例1の方法で得た細胞−マトリックス構築物では439.02mmHg;実施例2のケラチノサイト層に覆われた細胞−マトリックス構築物では998.52mmHg;および実施例3の限定培地で作成した細胞−マトリックス構築物では1542.26mmHgを得た。
Toledo(Highston、NJ)示差走査熱量計(DSC製品
#DSC12E)を用いて解析した。目的のために、溶解温度はサンプルを45℃から80℃まで毎分1℃の割合で加温することによって求めた。サンプルの平均変性温度は、60.8±1.2℃(n=3)であった。
systems Corporation、Minneapolis、Minn.)を用いて、血管移植人工補綴のためのアメリカ国家標準出版(American National standards publication for Vascular Graft
Prosthesis)(Instruments、1986)に記載されている方法により測定した。
Vitro形成
実施例1で述べた処置を用いてヒト新生児包皮線維芽細胞を増殖させた。細胞を3.0×106/ml濃度になるように再懸濁し、6ウェルトレーの0.4ミクロンポアサイズの24mm直径組織培養用挿入体に3.0×106細胞/TW(6.6×105細胞/cm2)の濃度で播いた。この実施例では、実施例を通して細胞は全て化学的に限定した培地で培養した。
GlutaMAX−1TM(Gibco BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml
ヒトリコンビナント表皮成長因子(Upstate Biotechnology、Lake Placid、NY)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY、ACSグレード)、1×10−4M
O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml
トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM
トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml
セレン(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company、Milwaukee、WI)、50ng/ml
L−アスコルビン酸(WAKO Chemicals USA、Inc.)、0.2μg/ml
L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.1μg/ml
グリシン(Sigma、St.Louis、MO)。
1.5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、M
O)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.L ouis、MO)、および0.05%
ポリエチレングリコール(PE G)(Sigma、St.Louis、MO)。
2.5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、M O)および0.4μg/ml
ハイドロコーチゾン(Sigma、St .Louis、MO)。
3.375μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis
、MO)および6μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St .Louis、MO)。
上記、実施例15で述べた条件2(PEGなし)の方法でヒト真皮線維芽細胞により作成した21日目の皮膚構造を用いて、正常ヒト新生児包皮表皮ケラチノサイトを細胞−マトリックス構築物上に接種し皮膚構造の表皮層を形成した。
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Aldrich)、24.4μg/ml アデニン(Sigma
Aldrich Fine
Chemicals Company、Milwaukee、WI)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、50μg/ml
L−アスコルビン酸ナトリウム塩(Sigma Aldrich Fine Chemicals Company、Milwaukee、WI)、16μM
リノール酸(Sigma、St.Louis、MO)、1μM 酢酸トコフェロール(Sigma、St.Louis、MO)、および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington
Heights、IL)である。構築物は表皮化培地中で37±1℃、10±1%CO2中で2日間培養した。
Biologics Gaithersburg、MD)の1:1混合物で、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、5×10−4M エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NY)、5×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Company)、24.4μg/ml アデニン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Company)、4mM L−グルタミン(BioWhittaker、Walkersville、MD)、2.65μg/ml 塩化カルシウム(Mallinckrodt,Chesterfield、MO)、16μM リノール酸(Sigma、St.Louis、MO)、1μM 酢酸トコフェロール(Sigma、St.Louis、MO)、1.25mM
セリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.64mM 塩化コリン(Sigma、St.Louis、MO)、および50μg/ml 硫酸ゲンタマイシン(Amersham Arlington
Heights、IL)である。2〜3日毎に培地を交換し14日間培養した。
本実験の目的はヒト頬組織から単離した頬線維芽細胞から細胞−マトリックス構築物を産生することである。頬線維芽細胞を10%NBCS含有DM培地でT−150フラスコ中で培養した。7日後に更に細胞数を増やすために、頬線維芽細胞を採集して、各4.0x106細胞を9個のT−150フラスコに入れ10%NBCS含有DMEM培地中でコンフルエントになるまで培養し、採取した。
Biologics Gaithersburg、MD)の3:1混合物、4mM GlutaMAX(Gibco
BRL、Grand Island、NY)および以下の添加物を含む;5ng/ml ヒトリコンビナント表皮成長因子(EFG)(Upstate
Biotechnology、Lake Placid、NY)、0.4μg/ml ハイドロコーチゾン(Sigma、St.Louis、MO)、1×10−4M
エタノールアミン(Fulka、Ronkonkoma、NYカタログNo.2400ACSグレード)、1×10−4M O−フォスフォリルエタノールアミン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml インスリン(Sigma、St.Louis、MO)、5μg/ml トランスフェリン(Sigma、St.Louis、MO)、20pM トリヨードサイロニン(Sigma、St.Louis、MO)、6.78ng/ml セレン(Sigma Aldrich
Fine Chemicals
Company、Milwaukee、WI)、50ng/ml L−アスコルビン酸(WAKO ChemicalsUSA、Inc.)、0.2μg/ml
L−プロリン(Sigma、St.Louis、MO)、0.1μg/ml
グリシン(Sigma、St.Louis、MO)、および0.05%
ポリエチレングリコール(PEG)(Sigma、St.Louis、MO)である。
粗コラーゲン溶液を下記のようにして調製した。450gmラットから凍結ラット尾を70%EtOH中、20分間解凍した。層流フードの中で70%EtOH中、腱束を刺激した。腱鞘から個々の腱を引き出し、切り刻み、1つの尾につき250mlずつ、希釈酢酸中に入れた(1 :1 ,000)。この溶液を4℃で48時間放置した。その時点で、切り刻んだ腱が容積全体を占めるほどに膨張した。この粘性溶液を、SW25ローター中にあるBeckman L超遠心分離機にて、23krpmで1時間遠心分離にかけた。該上清を引き出し、粗コラーゲン溶液(タンパク質「C」)として4℃で保存した。
H., Rosebrough, N. J., Farr, N. J. and Randall, R. J., J. Biol. Chem., 193,
265-275 (1951) and Waddel, W. J., J. Lab and
Clin. Med. 48, 311-314 (1956)に記載の方法によって測定した。
McCoyの培地中に懸濁させた1.0mlの5X McCoyの5a培地、1.0mlのウシ胎児血清、0.25mlの0.1M NaOH、1.5mlのコラーゲン溶液および1.0mlの線維芽細胞を含有している。該皿にまず上記量のMcCoyの培地、血清およびNaOHを注入し、その後取り除き、線維芽細胞懸濁液を調製した。ゲルはすぐ硬化するため、コラーゲン溶液と線維芽細胞を同時に添加する際には、速度が重要である。皿を、37℃、5%CO2雰囲気、100%湿度でインキュベーターに入れた。線維芽細胞を取り込んだゲルは、10分後には完全に硬化していた。
Genetic Cell Repository at the Institute for Medical Research in Camden, N.J.から取得した。これらの細胞を成長させ、20%血清、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むMcCoyの5a改良培地にて維持した。培養物は、マイコプラスマを含んでいなかった。M.I. T. Cell Culture Centerでは、10番目の集団ごとに濃度を倍にして細胞を調製、冷凍した(PDL)。
実施例18に記載の処置によって作製した、570μg/mlタンパク質「C」、7.5×106ヒト包皮線維芽細胞、株1519、19th
PDL含有する水和コラーゲンラティスの収縮を測定した。皿中で培地を、1、4および8日目に変えた。取得日を図3にプロットで示す。それによれば、ラティスの面積がわずか7日間で112倍に減少することを示している。1日以内に、面積が7倍に収縮することが認められた。
水和コラーゲンラティスのタンパク質濃度がラティスの収縮に及ぼす影響を下記のようにして測定した。3種の水和コラーゲンラティスを、それぞれが含有するタンパク質「R」の濃度を異ならせた以外、実施例18と同様の処置によって調製した。ヒト包皮線維芽細胞、株1519、19th
PDLを用い、4日目に培地を取り換えた。
細胞数が水和コラーゲンラティスの収縮に及ぼす影響を下記のようにして測定した。720μg/mlタンパク質「R」を含有する多くの水和コラーゲンラティスを実施例18に記載の処置によって測定した。ヒト包皮線維芽細胞、株1519を用い、3、7および10日目に培地を取り換えた。
異なる集団倍加数(PDL)の細胞の水和コラーゲンラティスにおける収縮能、すなわち、異なる数の細胞分割を行う細胞を下記のようにして、測定した。培養物を、実施例18に記載の処置によって調製し、720μg/mlのタンパク質「R」を含有する水和コラーゲンラティスから形成した。3、7および10日目に培地を取り換えた。
PDLの細胞は、同量の比率でラティスを収縮できたが、50th PDLはできなかった。
サイトカラシンBが細胞の水和コラーゲンラティス収縮能に及ぼす影響を下記のようにして測定した。水和コラーゲンラティスを実施例18のようにして作製した。タンパク質「C」含有量は、570μg/mlとした。線維芽細胞(ヒト包皮、株1519、19th
PDL)細胞の培養物中の濃度は、5×l05であった。10.0μg/mlサイトカラシンBを各培養物に添加し、培地を4日目と8日目に取り換えた。
インヒビターコルセミドがタンパク質ラティスの収縮に及ぼす影響を下記のようにして測定した。水和コラーゲンラティスを含有する培養物を、実施例18に記載の処置によって調製した。それは、570μg/mlタンパク質「C」を含有していた。コルセミドを含有しない対照を除き、それぞれに0.36μg/mlコルセミドを添加した。試験培養物と対照培養物の双方に同数の細胞を添加し、得られた結果を図7にプロットで示した。45th
PDL細胞は、19th PDL細胞を追い抜いた。一方、45th PDL未処理細胞は、19th
PDL未処理細胞に遅れをとっていた。ラティスの収縮の率および程度を調節するためにコルセミドを使用できることは明らかである。
1.0μg/mlサイトシンアラビノサイドが異なるPDLの細胞によるコラーゲンラティス収縮に及ぼす影響を以下のようにして測定した。タンパク質「C」を570μg/mlで含有する水和コラーゲンラティスを含む培養物を調製した。ヒト包皮線維芽細胞、株1519、19th
PDLまたは47th PDLを、サイトシンアラビノサイドを含有しない対照とサイトシンアラビノサイドを含有する試験培養物の双方に添加した。得られたデータを図8にプロットして示した。47th
PDL細胞が、下のPCL細胞よりも少数であるにも関わらずすぐれた特性を示すことがわかった。これらの実験においては、サイトシンアラビノサイドを用いて、DNA合成を遮断し、それによって、細胞数をラティス定数内に維持した。
実施例18の処置によって、水和コラーゲンラティスを作製した。それは500μg/mlタンパク質「C」を含有していた。バイオプシーによって取得したヒト包皮線維芽細胞を、EDTAとトリプシンの溶液を用いて培養プレートから除去した。単一細胞の懸濁液を遠心分離して、細胞をペレット化し、その後、該細胞を培養培地中に再度懸濁させ、水和コラーゲンマトリックス上に、線維芽細胞導入後7日間置いた。3日以内に、ケラチノサイトがラティス基質に付着した。ケラチン化のプロセスが開始し、引き続き、不透明のcorniumを形成した。電子顕微鏡を用いて組織学的観察を行った。
皮膚生検材料をモルモットから取得し、真皮を表皮から外科手術的に分離した。真皮を酵素的に乖離して構成細胞中に入れ、それを組織培養皿に入れ、増殖させた。各実験動物からの細胞を個別の培養皿で成長させ、同一性を保存した。組織を、モルモットからの線維芽細胞を採用した以外は、実施例18の処置と同様に収縮した水和コラーゲンラティスをin
vitroで作製した。収縮させた後、ラティスのいくつかを、第2の生検材料からの表皮細胞またはケラチノサイトを用いて実施例26によって配置した。各移植物中の線維芽細胞を、移植物のレシピエントとなる動物から取得した。
移植の可能性のあるレシピエントからの小さな生検材料を1.0mm2断片に切断した。線維芽細胞は、断片から成長させ、Lux組織培養皿に置いた。4〜7日後、該断片を除去して、捨てるか、または新たなプレートに移した。1以上のプレートの細胞をほぼコンフルエントになるまで広げた。細胞がトリプシンとの反応により除去された時点で、洗浄し、その後、組織−培養フラスコに広げた。真皮等価物1平方センチメートルあたり5×104細胞が必要であった。そして、適切な数の細胞を、トリプシンを用いて基質から除去することによって投入した。その後、細胞をコラーゲン溶液、ラット血清および組織培養培地と結合させた。コラーゲンをラット尾の腱を0.02M酢酸中に抽出し、遠心分離によって精製することによって取得した。酸性pH、タンパク質1.5mg/mlに維持したら、コラーゲンは粘性で、やや不透明な溶液となった。それはI型コラーゲンのみからなり、検出可能なSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動によって検出可能なタンパク質を含有していなかった。コラーゲンが細胞および他の成分と結合した瞬間に、コラーゲンを原線維の形状で溶液から析出させるNaOHを用いてpHを7.2に調節した。このようにして、流体が捕捉されたラティスが形成された。ラティス中のサンプルをある程度均一に分散させた。コラーゲン原線維の活性短縮のプロセスによって、ラティスを固い粘度の組織に変換した。その結果、捕捉された流体が失われ、もとのラティスの量の何倍も減少した。組織が得られ、それは真皮等価物(DE)を含んでいた。
生検材料断片からトリプシンを用いて分離した表皮細胞を真皮等価物上に懸濁液として分散させた。2〜4日以内に、表皮細胞は、連続シートを形成し、真皮基層を覆った。この間に、細胞のコンフルエントシートが分化を始めた。デスモソーム結合、トノフィラメント(tonofilament)、およびケラトヒアリン顆粒剤が明らかになり、ケラチン化のプロセスが進み、透過性の角質層を形成した。可能であれば全体のプロセスがin
vitroでDEに起こるが、この研究では、表皮細胞が、皮膚等価物(SE)として機能するコンフルエントシートを形成するとすぐ、二層化組織を移植に供した。
一方、複屈折は、時間とともに強度を増加させ、そのパターンは一般的に、正常真皮のバスケット織の形状特徴を有していた。しかしながら、移植物が正常組織と接するトランジション領域においては、10週目までに、バスケット織パターンが成長し始めていた。
マサチューセッツ州ボストンの赤十字センターから期限切れの血小板濃縮物を入手した。ラットおよびブタの尾の腱のコラーゲンを実施例18に記載のようにして抽出した。ブタ皮膚コラーゲンは、Shriners’ Burns Institute(ボストン)のPaul Ehrlich博士から供給してもらった。そして、テロゲン、ウシコラーゲンをCollagen Corporation, Palo Alto, Califから取得した。Waddelに記載の方法 (Waddel, W. J., J. Lab and Clin. Med. 48, 311−14 (1956)を参照されたい)による改良を用いてコラーゲン濃度を測定した。以下の式を採用した:μg/ml=0.D.215−0.D.225/64.6。
Laboratories)、1.5mlのラット尾の腱のコラーゲン、0.25mlの0.1N
NaOH(コラーゲンを中和するのに必要なNaOHの濃度は、用いられるコラーゲン調製物の酸性度に依存してやや変化する)、0.45mlのFBS(Flow
Laboratories)。この混合物を、0.5mlの5x血小板濃縮物とともに、60mmのFalcon0007ペトリ皿の表面に小滴ずつ注いだ。別法として、すべての成分を別々の容器で組み合わせてから、空のペトリ皿に注いだ。得られたラティスを37℃で90%空気/10%CO2雰囲気で、湿度100%でインキュベートした。鋳造されたラティスの合計量を増減させることによってラティスの厚みを調節した。鋳造処置の関数としてのラティスの収縮率には相違は認められなかった。
Chemicals)の追加の効果を調べる実験も行った。
鋳造および破壊時間の測定後、組織等価物に対するグラム重量を試すことによって測定した。
タンパク質の濃度とソースが血小板によるラティスの収縮に及ぼす影響を、様々な濃度の異なるソースから得たコラーゲンを用いて調べた。他に記載がなければ実施例29に記載の方法で行った。得られたデータを図11A乃至11Dにプロットで示した。
インヒビターサイトカラシンBおよびコルセミドが血小板による水和コラーゲンラティスの収縮に及ぼす影響を、下記の点を除き、実施例29に記載の一般的な処置にしたがって測定した。
Pharmaceutical Company)を、濃縮DMEM培地に直接添加し、5mlのラティス量中の最終濃度をそれぞれ10μg/ml、5μg/mlとした。得られたデータを図12にプロットで示した。
血小板によって収縮させた水和コラーゲンラティスから形成され、ウサギの耳への移植に適した組織等価物を以下のようにして調製した。移植の可能性のあるレシピエントから心臓穿刺によって取得した10mlのウサギ血液から血小板を採取し、実施例29に記載のように、分画遠心分離法によって濃縮した。さらに実施例29に記載の方法にしたがってウサギ血小板ゲルを鋳造した。収縮後、実施例28に記載の処置にしたがって、ラティスに同じウサギから得た生検材料に由来する表皮細胞を播いた。
t.Sevenミクロン切片中に包埋し、回転式マイクロトームで切断し、これらをヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
皮膚の小片をメスフィッシャー(Fischer)344ラットの背中から除去した(Charles
River Breeding
Labs)。これらの生検材料を外部組織からトリミングし、2〜3mm3片とし、Lux組織培養皿の表面で乾燥させた。生検材料から成長した該線維芽細胞を、10%ウシ胎児血清、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびファンギゾン(Flow
Laboratories)を添加したダルベッコ改良イーグル最小基本培地(DMEM)中で10%CO2雰囲気で37℃で培養した。
体重約350〜400gの雄フィシャー(Fisher)ラットを、フェノバルビタールナトリウムで麻酔した。ラティスとほぼ同じ大きさの移植床を各動物の背中からの全厚の皮膚を除去することによって調製した。該ラティスを傷の部位に置き、ワセリン含浸テルファ(Telfa)パッドで被覆し、テルファ(Telfa)パッドをアール(Earle)の塩溶液に浸漬させた。多層の粘剤付き包帯を体に巻くことによって、これらの包帯を巻いた。移植物を最初に塗布した後、9〜13ヶ月間隔で、動物に再び麻酔をかけ、移植物全体を切除した。移植物の半分をリン酸緩衝ホルマリンに固定し、エタノール中で脱水し、パラフィン包埋を行った。移植物の他方の半分の中央部の被覆脂肪組織をトリミングして、2〜3mm3片とし、組織培養物中に置き、残留線維芽細胞を成長させた。
移植物から成長した線維芽細胞集団を継代培養して、3〜6本のT−150フラスコ中の急速に分解した細胞を得た。線維芽細胞を2μg/mlコルヒチンで4時間処理し、フラスコを振り、低張培地(1部のDMEMから3部の希釈H2O)中で膨張させ、ガラススライド上で空気乾燥させ、アセトオルセインで染色した。各時点での20乃至30の完全染色体を撮影し、カリオタイプを調製し、線維芽細胞集団全体中の雌細胞の割合を測定した。
A.図16に記載の装置と類似の装置を用いて、以下に記載の作業を行った。操作を行うためにカバーをはずすが、それ以外では、無菌性を保持するため所定位置に保った。装置に関連する情報を以下に記載する:
直径38mm
容量35ml
内側容器20:
直径24mm
容量4ml
透過性部材24:
Nucleporeのポリカーボネート膜、孔径3ミクロン、厚さ5ミクロン
(1)プレミックス:
10×MEM 16.2ml
L−グルタミン(200mM) 1.6ml
ゲンタマイシン(50mg/ml) 0.2ml
ウシ胎児血清 18.0ml
炭酸水素ナトリウム(71.2mg/ml) 5.0ml
内部容器20および外部容器10の双方から、ステップCに記載の培地を除去した。50μlのヒト表皮細胞懸濁液(3.33×106細胞/ml)を、上記ステップCで形成した組織等価物中に入れた。次いで、該容器を36℃、10%CO2で4時間インキュベートした。次いで、12.0mlのmSBMを外部チャンバーに、4mlをウェルに添加した。そして、該装置を同じインキュベーターに戻した。
表皮化の2日後、培地を除去し、mSBMプラスカルシウムと取り換えた。
表皮化の2日後、下記の処置を行った:内部および外部のチャンバーから培地を除去した。内側容器20を除去し、2体積分のcSBMプラスカルシウムをしみこませたコットンパッドを外部チャンバー10の底部に置き、9.0mlのcSBMプラスカルシウムを添加した。そして内側容器20を取り換え、35.5℃、10%CO2でインキュベートした。
4日ごとに培地を除去し、新鮮な主SBMプラスカルシウムと取り換えた。
2%アガロース水溶液を、高圧蒸気滅菌法によって殺菌し、40℃に冷却し、等量の2倍濃縮主SBMと混合した。吸収コットンパッドを除去し、13mlの混合物を外側領域14に注ぎ、36℃(10%CO2)に設定し、装置をインキュベーターに戻して、出荷まで保存した。
培養組織構築物がフリーの自家移植に匹敵する、付着した歯肉の機能的領域を提供し得るかどうかを判断することを主な目的とする。
Claims (29)
- 被験者の口腔状態を治療する方法であって、前記方法は、培養組織構築物を前記被験者の口腔組織に移植することを含み、前記培養組織構築物は、1層の細胞外マトリックスを含み、前記細胞外マトリックスは、培養された線維芽細胞を含み、外因性のマトリックス成分またはスカホード支持体を含まない、方法。
- 前記口腔の状態は、口腔歯肉の後退、歯間の乳頭状突起の欠損、歯茎音の欠陥、口腔インプラントの不全、歯分岐部欠陥、および上顎顔面の腫瘍切除からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスは、
(i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の結合構成を示す原線維性コラーゲン;
(ii)デコリン;および
(iii)グリコサミノグリカンを含む、請求項1に記載の方法。 - 前記培養線維芽細胞は、新生男児包皮、真皮、腱、肺、尿道、臍帯、角膜基質、口腔粘膜、および腸からなる群から選択される組織に由来する、請求項1に記載の方法。
- 前記培養線維芽細胞は、真皮の線維芽細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記培養線維芽細胞は、ヒト組織に由来する、請求項1に記載の方法。
- 被験者の口腔の状態を治療する方法であって、前記方法は、培養組織構築物を被験者の口腔組織に移植するステップを含み、前記培養組織構築物は、細胞外マトリックスの第一の層および前記第一の層の上に配置された第二の細胞層を含み、前記細胞外マトリックスは、外因性のマトリックス成分およびスカホード支持体の不存在下で培養された線維芽細胞を含み、前記第二の細胞層は上皮細胞を含む、方法。
- 前記口腔の状態は、口腔歯肉の後退、歯間の乳頭状突起の欠損、歯茎音の欠陥、口腔インプラントの不全、歯分岐部欠陥、および上顎顔面の腫瘍切除からなる群から選択される、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスは、
(i)4分の1差の67nm結合パターンを示す原線維および原線維束の結合構成を示す原線維性コラーゲン;
(ii)デコリン;および
(iii)グリコサミノグリカンを含む、請求項7に記載の方法。 - 前記上皮細胞が、ケラチノサイト、角膜の上皮細胞、口腔粘膜から得られる上皮細胞、食道の上皮細胞、および尿道上皮細胞から構成される群から選択される請求項7に記載の方法。
- 前記第1の層に含有される前記培養線維芽細胞は、新生男児包皮、真皮、腱、肺、軟骨、尿道、角膜基質、口腔粘膜、および腸からなる群から選択される組織に由来する、請求項7に記載の方法。
- 前記第1の層に含有される前記培養線維芽細胞は、真皮線維芽細胞である、請求項7に記載の方法。
- 前記細胞外マトリックスはさらに、フィブロネクチンおよびテナシンを含む、請求項12に記載の方法。
- 前記培養された線維芽細胞および前記上皮細胞は、ヒト組織に由来する、請求項7に記載の方法。
- 前記培養組織構築物は、前記第1の層の上に配置されて表皮細胞層を形成する第2のケラチノサイト細胞の層を含む、請求項7に記載の方法。
- 前記表皮細胞層は、基質層、超基質層、顆粒層および角質層を示す多層化、層化、分化された層であり、前記二層の培養皮膚構築物が、第一および第二層の接合点に存在する基底膜を有する、請求項15に記載の方法。
- 被験者の口腔の状態を治療するための方法であって、前記方法は、培養組織構築物を被験者の口腔組織に移植するステップを含み、前記培養組織構築物は、コラーゲン溶液と収縮性の作用物質からなるゲル混合物を含む、方法。
- 前記口腔の状態は、口腔歯肉の後退、歯間の乳頭状突起の欠損、歯茎音の欠陥、口腔インプラントの不全、歯分岐部欠陥、および上顎顔面の腫瘍切除からなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
- 前記収縮性の作用物質は、線維芽細胞を含む、請求項17に記載の方法。
- 前記線維芽細胞は、ヒト組織に由来する、請求項19に記載の方法。
- 前記線維芽細胞は、新生男児包皮、真皮、腱、肺、尿道、臍帯、角膜基質、口腔粘膜、および腸からなる群から選択される組織に由来する、請求項19に記載の方法。
- 被験者の口腔の状態を治療するための方法であって、前記方法は、培養組織構築物を前記被験者の口腔組織に移植するステップを含み、前記培養組織構築物は、細胞を含まずにコラーゲンゲルを含む第1の層と、第1の層上に配置された第2の層とを含み、前記第2の層は、コラーゲンと収縮性の作用物質を含有する第2のコラーゲンゲルを含む、方法。
- 前記口腔の状態は、口腔歯肉の後退、歯間の乳頭状突起の欠損、歯茎音の欠陥、口腔インプラントの不全、歯分岐部欠陥、および上顎顔面の腫瘍切除からなる群から選択される、請求項22に記載の方法。
- 前記収縮性の作用物質は、線維芽細胞を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記線維芽細胞は、新生男児包皮、真皮、腱、肺、尿道、臍帯、角膜基質、口腔粘膜、および腸からなる群から選択される組織に由来する、請求項24に記載の方法。
- 前記第2の層は、ヒト表皮細胞を含む、請求項22に記載の方法。
- 前記線維芽細胞は、ヒト組織に由来する、請求項24に記載の方法。
- 前記線維芽細胞は、遺伝子的に修飾され、細胞外マトリックス成分を生成する、請求項1、7、17および22のいずれか1項に記載の方法。
- 前記線維芽細胞は、遺伝子的に修飾され、成長因子、ホルモン、ペプチド、またはタンパク質を生成する、請求項28に記載の方法。
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