TW201538730A

TW201538730A - 用於治療骨骼、關節及軟骨之組合物及方法

Info

Publication number: TW201538730A
Application number: TW104104886A
Authority: TW
Inventors: Rolf Hoffmann; Kevin John Mcelwee
Original assignee: Replicel Life Sciences Inc
Priority date: 2014-02-12
Filing date: 2015-02-12
Publication date: 2015-10-16
Also published as: WO2015123477A1; US20170173084A1; US10500233B2

Abstract

本發明係關於利用毛囊源性非球根真皮鞘細胞用於治療關節之組合物及方法。

Description

用於治療骨骼、關節及軟骨之組合物及方法

本發明係關於出於多種醫療目的治療關節以及相鄰骨骼或軟骨之組合物及方法，且更特定而言係關於包含自體或同種異體非球根真皮鞘(NDBS)細胞之組合物，其用於治療及修復關節，包括(例如)關節損傷及骨關節炎，以及用於多種其他醫療目的。

關節係骨骼(兩個或更多個)互連處之身體部分。關節設計為容許運動及機械支撐。其係按其結構及功能來分類。

結構分類闡述骨骼如何彼此連接，而功能分類闡述連接骨骼之間之運動程度。分類顯著重疊。

關節損傷定義為關節病，且若有至少一個關節具有額外發炎，則該病症稱為關節炎。大多數關節損傷涉及關節炎。

骨關節炎(OA)亦稱為退化性關節炎、退化性關節病或骨關節炎，其係一些機械異常之群組，包括關節、關節軟骨亦及軟骨下骨骼之退化。骨關節炎係世界範圍內關節炎之最常見形式，且在多個國家係慢性失能之主要病因，例如在美國其影響近兩千七百萬人。典型臨床症狀可包括關節疼痛、壓痛、僵硬及有時關節積液。可基於病史及臨床檢查作出診斷。X射線確認診斷但並非強制性。通常其他成像技術(例如超音波或MRI)並非必需，但有時實施該等技術以在臨床上診斷骨關節炎或潛在病因。有時實施關節鏡檢查。

骨關節炎可分類為原發性或繼發性，此主要取決於是否存在潛在病因。

原發性骨關節炎係與老化相關之慢性退化性病症。隨著老化，由於蛋白多糖量減少，軟骨水含量降低。在健康軟骨中，倘若膠原蛋白纖維施加壓縮力，則水含量經細微平衡。在骨關節炎發作期間，軟骨中流體之量增加，且另外膠原蛋白損失。由此膠原蛋白纖維變得易於降解及退化。分解產物釋放至滑膜腔中，隨後將發炎。在此系列事件後，軟骨及軟骨下骨骼被破壞且新骨骼過度生長或骨贅，其隨後最終引發骨關節炎。

繼發性骨關節炎可由於來自機械應力之不同損傷及關節之後續不當癒合所致。此應力之來源多種多樣且可包括：由先天性或致病性原因引起之骨骼排列不正；由(例如)事故或手術引起之機械損傷；超重或高體重及關節因此不活動導致肌肉變弱而無法支撐關節。週圍神經因創傷或代謝疾病受損導致突然或不協調運動。

一般認為，骨關節炎具有遺傳性背景，此乃因多個研究已顯示，在兄弟姊妹之間該疾病之盛行率較高。一般而言，與年齡相當之男性相比，絕經後女性更有可能發生骨關節炎。其他繼髮型骨關節炎係繼發性且係由其他因素引發，但所引起之病狀與原發性骨關節炎相同。作為實例，彼等疾病可係代謝疾病，例如黑尿症、糖尿病、血色素沉著症、痛風；或先天性病症，例如馬凡氏症候群(Marfan syndrome)；或敗血性關節炎；或其他發炎性疾病，例如派爾特斯病(Perthes' disease)、萊姆病(Lyme disease)及所有其他形式之慢性關節炎(例如類風濕性關節炎)。由於事故或手術對相鄰韌帶及半月板造成之損傷亦可最終引發骨關節炎，其中韌帶劣化或不穩定係觸發因素。由於彼等原因，起始導致軟骨損失之過程。之後，軟骨在骨骼表面上之保護減弱，然後骨骼暴露並受損。此導致繼發於疼痛、區域性肌肉萎縮及韌帶鬆弛發生之運動性降低。

骨關節炎通常影響手、足、脊柱及承受大重量之關節(例如髖)，但可影響任何關節。在骨關節炎進展時，受影響關節變得更大更僵硬且更疼痛。關節在緩慢使用時感覺較佳，但過度或長期使用時感覺較差。在手指處，可能發生所謂的希柏登氏結節(Heberden's node)。

治療一般係多重模式治療且涉及改變生活方式、鍛煉(體重減輕、物理治療、適度鍛煉)及止痛藥之組合。在某一時間點可能需要關節置換手術。對乙醯胺基酚係一線療法且NSAID係輔助療法。注射糖皮質激素(例如氫化可體松(hydrocortisone)及其他)僅短期緩解疼痛，但與諸如感染等有害副作用相關，注射透明質酸亦係如此。

儘管有多種手術及非手術方法可用於治療骨關節炎或其他關節損傷，但該等技術皆不能解決功能性、產生膠原蛋白之免疫調節性纖維母細胞在受損傷關節中之細胞不足問題。

本發明揭示治療關節損傷之新穎組合物及方法，且進一步提供其他相關優點。

簡言之，本發明提供利用毛囊源性非球根真皮鞘(「NDBS」)細胞治療或預防關節損傷之組合物及方法。在本發明之一個態樣內，提供用於分離NBDS細胞之方法，其包含以下步驟：(a)準備活力毛髮；(b)割開在步驟(a)中準備之該毛髮以去除毛囊球(其含有真皮鞘杯及真皮乳頭)；(c)分離非球根真皮鞘組織；及(d)培養該經分離非球根真皮鞘組織以產生NBDS細胞。NBDS細胞可以自體或同種異體方式使用。在本發明之一個實施例內，藉由全層皮膚生檢自個體之枕部頭皮獲得該活力毛髮。在另一實施例內，利用諸如針之顯微操縱器以及解剖刀或剪刀割開該毛髮。在其他實施例內，本文中提供之該等方法進一步包含以下步驟：視情況用例如膠原蛋白消化酶(諸如，膠原蛋白酶、透明質酸酶、DNAse、彈性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶及亮抑肽酶)實施對該經分離非球根真皮鞘組織之酶消化。在其他實施例內，該等細胞經多次繼代。

在本發明之其他態樣內，提供視情況根據如上文所述之方法製備之經分離NBDS細胞。此等NBDS細胞可包含於具有諸如以下之多種成分之組合物內：例如血漿、血清、白蛋白(例如，人類白蛋白)、富血小板血漿(PRP)、纖維蛋白及/或透明質酸。在此等組合物內亦可包括其他成分，包括例如細胞外基質之組分(例如，葡萄糖胺聚糖(GAG)、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角蛋白、透明質酸、彈性蛋白、纖連蛋白、纖維蛋白、複合支架、膠原蛋白及層黏蛋白，或任何其他可溶解或不可溶解細胞外基質)；細胞介素及趨化介素(例如，轉化生長因子β(TGF-β)及其同功型、胰島素樣生長因子(IGF)及其同功型、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、副甲狀腺激素相關蛋白、肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)、巨噬細胞刺激蛋白(MSP)、表皮生長因子(EGF)、介白素6(IL-6)、基質細胞源性因子1(SDF-1)、血小板源性生長因子(PDGF)及纖維母細胞生長因子(FGF))；及/或各種治療劑(例如，止痛劑、消炎劑、抗生素、抗黴菌劑及免疫調節劑)。

在本發明之其他態樣內，提供用於治療個體之關節之方法，其包含向個體之關節投與如本文所述之包含NBDS細胞之組合物之步驟。在一個實施例內，該個體係選自由以下組成之群組之哺乳動物：人類、馬、狗及貓。在各個實施例內，該治療起因於關節損傷。在某些實施例內，關節損傷導致骨關節炎，其可係原發性或繼發性的。在另一實施例內，關節可係整個人類身體中之每一關節，或體內選定關節(例如手或腳趾)。

一或多個實施例之詳細內容陳述於下文說明中。其他特徵、目標及優點將自說明書、圖式及申請專利範圍變得顯而易見。另外，本文中所提及之所有專利及專利申請案之揭示內容皆以全文引用方式併入。

圖1圖解說明人類毛囊之解剖。圖1A顯示經分離人類毛囊，其可在毛根之球根部分上方(即，在真皮乳頭及真皮鞘杯細胞上方，即，在終球上方)，但在皮脂腺管之基部下方割開，以便獲得經分離真皮鞘(參見圖1B)。可將圖1B中繪示之結構分離成至少兩個單獨組分，如在圖1C及圖1D中顯示。圖1C繪示毛髮纖維及相關聯內根鞘，以及主要含有角質細胞之外根鞘，且圖1D係含有NBDS細胞之真皮鞘(有時亦被稱為結締組識鞘、上真皮鞘或較不準確地僅稱為真皮鞘)。與其他類型之細胞相比，NBDS細胞對膠原蛋白1標記係高陽性且對鹼性磷酸酯酶及類固醇硫酸酯酶僅係弱陽性。另外，此等細胞表現諸如CD90之標記及其他幹細胞標記。

圖2係培養物中之NBDS細胞之顯微照片。

如上所述，本發明提供毛囊源性非球根真皮鞘(NDBS)細胞以供治療或預防哺乳動物內最終導致骨關節炎之關節老化及關節損傷。然而，在闡明本發明之前，首先闡明下文使用之某些術語之定義可有助於理解本發明。

非球根真皮鞘細胞或「NBDS」細胞係指真皮源性細胞(或更具體而言，源於毛囊)。在較佳實施例內，在毛根之球根部分上方(即，在真皮乳頭及真皮鞘杯細胞上方)，但在皮脂腺管之基部下方，自毛囊之外真皮鞘獲得鞘細胞。NBDS細胞可藉由若干方法容易地識別，包括例如製備及培養方法(如下所述)；形態學(例如，參見圖2)；以及細胞特異性標記(例如，在培養之前或之後，NBDS細胞主要對CD 90、CD73及CD49b呈陽性，且/或主要對CD34、CD45及KRT14呈陰性)。然而，在所有事件中，細胞必須源於真皮，且更具體而言，源於毛囊。

經擴增非球根真皮鞘細胞或「eNBDS細胞」係指已在培養中擴增數次繼代但保持產生膠原蛋白(例如，I類型膠原蛋白)以及多種細胞介素及趨化介素之能力之NBDS細胞。如上，出人意料地，eNBDS細胞亦可係免疫調節的。在較佳實施例內，細胞可在培養中擴增1、2、3、4、5、10、20或更多次繼代。

「經分離」NBDS細胞係指大於70%、80%、85%、90%、95%、98%或100% NBDS細胞之細胞群。NBDS細胞具有產生膠原蛋白(例如，I類型膠原蛋白)以及多種細胞介素及趨化介素之能力。出人意料地，NBDS細胞亦可具有免疫調節性，使得其尤其適合於肌腱損傷之治療(例如，藉由幫助抑制任何發炎反應)。

在本發明之某些實施例內，可使用可用以將細胞在顯微尺度上可視化之軟體或其他可視化技術來評定視野中之大量細胞之大小、形狀、活力及顆粒性，以及確定NBDS細胞(其係纖維母細胞狀(如圖2中顯示)，其與角質細胞、黑色素細胞、DSC及其他具有不同形態學之細胞類型相反)之數目。因此，在本發明之一個實施例內，提供用於分離NBDS細胞之方法，其包含以下步驟：將來自毛囊之細胞培養至少1、2、3、4、5、6、10或20次繼代，使得產生經分離NBDS細胞群。在較佳實施例內，將細胞放置於允許NBDS細胞黏附之碟或燒瓶中，且每次繼代去除未黏附細胞，且釋放剩餘黏附細胞(例如，藉由胰蛋白酶化)，接著添加新培養基。在此等實施例內，可藉由將細胞培養物中之細胞可視化以評定NBDS細胞對非NBDS細胞之數目來決定何時已獲得足夠的經分離NBDS細胞群。可視化技術包括但不限於直接顯微鏡可視化、針對標記(或其缺失，例如針對角蛋白之缺失)對細胞染色，以及光/雷射分析以觀察不同細胞類型之繞射圖案(一般而言，參見「Laser Scanning Microscopy and Quantitative Image Analysis of Neuronal Tissue」，Lidia Bakota及Roland Brandt編輯，Humana Press,2014；亦參見「Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells：Optical and Spectroscopic Techniques」，Conn編輯，Academic Press,2012)。

在其他實施例內，細胞特異性標記(例如，NBDS細胞主要對CD 90、CD73及CD49b呈陽性的，且/或主要對CD34、CD45及KRT14呈陰性(視情況培養之前或之後))可用於評定NBDS細胞對污染物細胞類型之程度。(「Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue Regeneration」，Krishan、Krishnamurthy及Totey編輯，Wiley-Blackwell,2010)。舉例而言，經分離NBDS細胞可藉由以下步驟製備：a)獲得一或多個活力毛囊；b)自毛囊釋放細胞(例如，經由使用酶，或藉由培養來自毛囊之生長細胞)；及c)分選細胞(例如，藉由流式細胞計或經由使用磁珠)以獲得經分離NBDS細胞群。在本發明之某些實施例內，可視情況如上所述培養該過程中任何階段中之細胞(例如，可如上所述將細胞培養至少1、2、3、4、5、6、10或20次繼代)，且藉由例如流式細胞計或磁珠進一步分離所得細胞。

在較佳實施例內，經分離NBDS細胞中至少70%、80%、85%、90%、95%、98%或100%對上述陽性標記中之一或多者呈陽性，且/或至少80%、90%、95%或98%對上述陰性標記中之一者呈陰性。

在本發明之較佳實施例內(及利用本文中所闡述之技術中之任一者)，經分離NBDS細胞具有在細胞群內小於15%、10%、5%或1%之角質細胞及/或在細胞群內小於15%、10%、5%或1%之黑色素細胞。然而，在其他實施例內，經分離NBDS細胞群源於真皮細胞群(較佳地，來自毛囊)，其具有一些污染細胞類型，包括例如細胞群中之至少1%、5%、10%、0.01%、0.1%或1%角質細胞，及/或至少5%、10%、0.1%、0.1%黑色素細胞。在本發明之其他實施例內，經分離NBDS細胞係至少95%純，且在細胞群內具有至少一種污染細胞類型(例如，至少一種角質細胞)。

「關節損傷」係指由於外部或內部創傷或遺傳傾向性所致之關節損傷。該等損傷最終導致骨關節炎。該等損傷之性質可為原發性或繼發性。

NBDS之製備

如上所述，本發明提供用於分離NBDS細胞之方法。在本發明之一個態樣內，該等方法包含以下步驟：(a)準備活力毛髮；(b)割開在步驟(a)中準備之該毛髮以去除毛囊球(其含有真皮鞘杯及真皮乳頭)；(c)分離非球根真皮鞘組織；及(d)培養該經分離非球根真皮鞘組織以產生NBDS細胞。

為準備活力(或「活」)毛髮，通常自給定個體(例如，哺乳動物，諸如人類、馬、貓或狗)獲得試樣。試樣可自多種部位(例如，對於人類，自頭皮之後頭域、胸部或大腿，以及對於馬，自鬃毛或尾巴)獲得。試樣可經由生檢或其他適合手段(例如，藉由「拔出」，或解剖，或顯微解剖、酶消化、酶消化輔助解剖)獲得。較佳地，選擇發育之生長期之毛囊，但亦可利用其他發育時期(例如，退化期或休止期)。

一旦自個體獲得試樣，然後便分離試樣以分離出毛囊，此通常利用諸如針之顯微操縱器及解剖刀或剪刀，但亦可利用諸如針、剪刀之其他器具。在某些實施例內，可在毛根之球根部分上方(即，在真皮乳頭及真皮鞘杯細胞上方)，但在皮脂腺管之基部下方進一步割開如圖1A中顯示之經分離毛囊，以便獲得經分離上真皮鞘(參見圖1B)。可將圖1B中繪示之結構分離成至少兩個單獨組分，如在圖1C及圖1D中顯示。圖1C繪示毛髮纖維及相關聯內根鞘，以及主要含有角質細胞之外根鞘，且圖1D係含有NBDS細胞之真皮鞘(有時亦被稱為結締組織鞘)。

在某些實施例內，可藉由例如沿著一側縱向切割或藉由使用諸如酶消化之技術(例如，利用膠原蛋白消化酶，諸如膠原蛋白酶、中性蛋白酶及亮抑肽酶)進一步分離上真皮鞘(圖1D)。

然後可在促進細胞增殖之培養基中培養含有NBDS細胞之真皮鞘或經分離NBDS細胞。適宜培養基包括(例如)Williams E、Amniomax、DMEM、Cell Gro MSC培養基、FGM-CD，但任何其他纖維母細胞或幹細胞或造血細胞生長培養基可適宜。培養基可已添加各種濃度之FCS、FCS替代物或人類自體或同種異體血清。在48-72小時後，通常用新鮮培養基更換增殖培養基(但在某些實施例內，其他時間點亦可適宜)。隨後可每2至4天更換培養基。在培養達到約80%(但不限於)匯合時，使細胞自培養燒瓶脫離(通常經由胰蛋白酶化，但亦可利用其他方法，例如刮除細胞)，且接種於更大組織培養燒瓶中。重複此步驟直至獲得期望細胞數(一般介於約10個細胞與數十億細胞之間，但更佳地介於數百萬細胞與數十億細胞之間(例如，介於一百萬細胞與十億細胞之間)。

可視情況將經培養細胞洗滌若干次，並儲存於適宜培養基中，或視情況在適宜培養基中冷凍。

所有細胞培養上清液皆不會被丟棄，此乃因其含有患者細胞產生之個別生長因子、基質分子、幹細胞因子。細胞培養上清液可經冷凍、冷凍乾燥或任何其他適合於特定用途之儲存方法。

包含NBDS細胞之組合物之製備

如上所述，NBDS細胞可包含於具有多種成分(例如血清或血漿、富血小板血漿(PRP)、纖維蛋白、白蛋白(例如，人類白蛋白)及/或透明質酸)之組合物內。亦可利用其他市售產品來製備適合組合物，包括例如TISSEEL及COSEAL(可購自Baxter)、TISSUCOL、BERIPLAST、QUIXIL、TACHOSIL及EVICEL。亦可利用其他基於聚合物之組合物，包括例如聚乙二醇、聚乳酸及聚己內酯。在其他實施例內，可將細胞放置於所製造或所收穫之細胞外基質中(例如，US 2010/0047305或US 2010/0124573)。在其他實施例內，可將細胞放置於生物不可降解或生物可降解支架或其他結構內。尤佳支架或結構包括生物可降解支架(例如，基於膠原蛋白之支架，例如網狀物)。適宜支架之代表性實例包括(例如)美國專利第5,736,372號、第5,759,830號、第8,039,258號及第8,105,380號，其皆係全文以引用方式併入本文中。在本發明之較佳實施例內，在欲將組合物投與關節滑液中時，可期望不包括任何可產生或引起結瘢或纖維化之因子。

在其他較佳實施例內，在一個或兩個或更多個部件中(例如，在摻和各組分之雙管注射器中，或在二腔或多腔藥筒中)提供自由流動且可注射之組合物。此類注射器之代表性實例包括彼等闡述於美國專利第5,750,657號及第8,039,021號中者，該兩個專利以全文引用方式併入。

在此等組合物內亦可包括其他成分，包括例如：細胞外基質之組分(例如，葡萄糖胺聚糖(GAG)、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角蛋白、透明質酸、彈性蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白及層黏蛋白)；細胞介素及趨化介素(例如，轉化生長因子β(TGF-β)及其同功型、胰島素樣生長因子(IGF)及其同功型、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、副甲狀腺激素相關蛋白、肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)、巨噬細胞刺激蛋白(MSP)、表皮生長因子(EGF)、介白素6(IL-6)、幹細胞因子(SCF)、基質細胞源性因子1(SDF-1)、血小板源性生長因子(PDGF)及纖維母細胞生長因子(FGF))；及/或各種治療劑(例如，止痛劑、消炎劑、抗生素、抗黴菌劑、抗病毒劑及免疫調節劑)。

利用NBDS細胞治療關節之方法

亦提供治療或預防關節老化或關節損傷之方法，其包含向個體投與如上所述之包含NBDS細胞之組合物之步驟。通常，藉由注射投與細胞，但在各個實施例內，就採用外科方法而言，可將細胞直接提供至含有滑液、關節軟骨、滑膜、關節附著之半月板或韌帶之滑膜腔或關節囊中。

眾多物種可用本文提供之NBDS細胞及組合物來治療，包括(例如)哺乳動物，例如人類、馬、狗及貓。

利用NBDS細胞或其細胞培養上清液之程序

在各個實施例內，可經由注射遞送NBDS細胞，此可在實施或不實施局部或全身止痛或鎮靜下進行。此可用單針或多針裝置進行。另外，其可以推注形式藉由單次注射來實施，或可藉由多次多層注射來實施。所遞送之體積/細胞數目主要取決於適應症及待治療之區域。典型劑量可自低至0.01ml開始至最多數ml。在本發明之某些態樣中，經注射細胞數目可在10至數十億細胞範圍內，且更佳地100、1,000、10,000、100,000、1,000,000及/或10,000,000至最多十億或更多細胞範圍內。經注射細胞之數目尤其將取決於待治療之區域之大小、可用細胞之總數及經注射之體積，以及期望效力程度。

在本發明之其他態樣內，以適宜製劑提供NDBS細胞培養上清液。特定而言，可將細胞培養上清液本身施加至滑液中，或濃縮並與其他適於使用之成分摻和。在較佳實施例內，在投與前將NDBS細胞培養上清液與透明質酸摻和。

細胞培養上清液用於塗佈外科種植體之使用

單個或多個外科種植體一般用於治療骨關節病或骨骼缺損之其他軟骨。因此，在本發明之一個實施例內，提供醫療種植體，其經如本文所述之細胞培養上清液塗佈，或以其他方式適於釋放該上清液。由於NBDS細胞之細胞培養上清液含有生長因子及可用以促進癒合及種植體適當整合之其他因子。因而，期望塗佈該等種植體以減少纖維包裹並增加種植體或其他醫療裝置之生物適應性。

在本發明之其他態樣內，提供NDBS細胞培養上清液用於塗佈外科種植體以促進向內生長/癒合。

以下實例闡釋本發明且不應被理解為限制本發明之範疇。

實例1 組織取樣

如下所述，自個體獲得來自頭皮之後頭域之皮膚生檢。簡言之，一旦選擇了適合頭皮區域，便用理髮推剪剃掉該區域的毛髮，確保保留一些毛髮茬。然後對生檢區域進行徹底消毒及麻醉。一旦麻醉生效，輕柔地自生檢部位去除4mm至10mm深之打孔生檢，並用縫線縫合切口，可在12至14天之後去除該等縫線。然後在無菌條件下將皮膚生檢包裝至預標記之含有由含有抗生素之DMEM/Hams F12組成之生檢轉運培養基之生檢管中。

實例2 NBDS細胞之分離及培養

對其中已轉運生檢之培養基進行無菌性測試以確保試樣未受污染，或另一選擇係，若試樣已被污染，則確保隨後利用含有抗生素之培養基。然後洗滌生檢若干次以去除生檢轉運培養基及任何碎片以製備用於後續處理之組織。藉由用無菌解剖刀切除皮膚上皮及使用無菌鑷自周圍真皮組織「撥出」或解剖整個毛囊單元，在Hams F10中處理毛囊。用鑷子在儘可能靠近皮膚表面處夾緊毛囊，且藉由夾住毛囊單元中之毛髮向上拔起來暴露毛囊。選擇生長期(毛髮週期之成長期，由可見外根鞘及球根之DSC指示)之毛囊以供進一步處理。

NBDS分離係在Hams F10藉由首先使用精細無菌微型解剖刀或針使毛囊真皮鞘杯細胞及乳頭與毛囊其它部分脫離來實施，並丟棄。去除含有NBDS細胞之真皮鞘，且製備組織以供培養。

將6至10個真皮鞘組織輕柔地放置於3%透明質酸凝膠中並用促進細胞增殖之培養基(例如補充有FGF、10% FCS及抗生素之DMEM/Hams F12)覆蓋。在3至5天後，將新鮮增殖培養基添加至培養物中。隨後，每2至4天更換培養基。當培養已達到約80%至90%匯合時，經由胰蛋白酶化將細胞自培養燒瓶脫離並接種於更大組織培養燒瓶中。將此步驟重複四次繼代以獲得約1億個細胞。

一旦獲得約一億個細胞，用PBS洗滌細胞，經胰蛋白酶化且再懸浮於細胞轉運培養基(CTM：含有10%人類血清白蛋白及5%二甲基亞碸之林格氏(Ringer)乳酸鹽)中。藉由離心使細胞沈澱並彙集在一起。吸出上清液，並將細胞糰粒再懸浮於CTM中。自細胞-CTM混合物去除兩個細胞試樣/等份試樣以供品質控制及細胞計數。在計數細胞後，再次藉由離心使其沈澱，且將所得之糰粒再懸浮於CTM中以給出2千萬個細胞/ml之最終濃度。將最終細胞產物儲存於-130℃以下之液氮中直至裝運。

實例3 NBDS細胞之製備及至關節中之投與

首先藉由施加局部止痛藥(例如，EMLA-乳膏)約一小時來準備欲治療關節上方之皮膚以供注射。之後，洗滌皮膚並將其消毒。然後將如上文所述製備之NBDS細胞以推注形式或以重複方式注射至受影響關節中。

或者，可藉由關節鏡引導將NBDS細胞直接注射至滑液、或受損軟骨或半月板或韌帶中，或注射至因骨關節病所致之骨骼缺損中，以填充期望治療區域之整個表面。

可根據上述詳細說明對該等實施例作出該等及其他改變。一般而言，在以下申請專利範圍中，所用術語不應理解為將申請專利範圍限於說明書及申請專利範圍中所揭示之特定實施例，而應理解為包括所有可能實施例以及該等申請專利範圍所賦予之等效內容之全部範疇。因此，申請專利範圍並不限於本揭示內容。

Claims

一種用於分離NBDS細胞之方法，其包含：(a)準備活力毛髮；(b)割開在步驟(a)中準備之該毛髮以去除毛囊球；(c)分離非球根真皮鞘組織；及(d)培養該經分離非球根真皮鞘組織以產生NBDS細胞。
如請求項1之方法，其中該活力毛髮係藉由生檢自個體之頭皮上之毛髮獲得。
如請求項1之方法，其中經分離NBDS細胞可以自體或同種異體方式使用。
如請求項1之方法，其中該毛髮係利用顯微操縱器及解剖刀或剪刀割開。
如請求項1之方法，其進一步包含實施對該經分離非球根真皮鞘組織之酶消化之步驟。
如請求項4之方法，其中該酶消化係用膠原蛋白酶、透明質酸酶、DNAse、彈性蛋白酶、木瓜酶、XIV型蛋白酶、胰蛋白酶及中性蛋白酶來實施。
如請求項1之方法，其中該等NBDS細胞經多次繼代。
一種組合物，其包含根據如請求項1至7中任一項之方法製備之經分離非球根真皮鞘細胞。
一種組合物，其包含經分離非球根真皮鞘細胞。
如請求項8或9之組合物，其進一步包含血清、血漿或富血小板血漿(PRP)。
如請求項8或9之組合物，其進一步包含纖維蛋白及/或透明質酸。
如請求項8或9之組合物，其進一步包含細胞外基質之組分、細胞介素、趨化介素及治療劑。
如請求項12之組合物，其中該等細胞外基質組分係選自由以下組成之群組：葡萄糖胺聚糖(GAG)、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸角蛋白、透明質酸、彈性蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白及層黏蛋白。
如請求項8或9之組合物，其進一步包含支架。
如請求項14之組合物，其中該支架係生物可降解支架。
如請求項12之組合物，其中該等細胞介素係選自由以下組成之群組：轉化生長因子β(TGF-β)及其同功型、胰島素樣生長因子(IGF)及其同功型、顆粒球-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、副甲狀腺激素相關蛋白、肝細胞生長因子/分散因子(HGF/SF)、巨噬細胞刺激蛋白(MSP)、表皮生長因子(EGF)、介白素6(IL-6)、基質細胞源性因子1(SDF-1)、血小板源性生長因子(PDGF)及纖維母細胞生長因子(FGF)。
如請求項12之組合物，其中該等治療劑係選自由以下組成之群組：止痛劑、消炎劑、抗生素、抗病毒劑、抗黴菌劑及免疫調節劑。
一種治療關節之方法，其包含向個體之關節中投與如請求項8至17中任一項之組合物之步驟。
如請求項18之方法，其中該個體係選自由以下組成之群組之哺乳動物：人類、馬、狗及貓。
如請求項18之方法，其中該治療起因於關節損傷。
如請求項20之方法，其中該關節損傷係急性或慢性骨關節病。
一種組合物，其包含NBDS細胞培養上清液。
如請求項22之組合物，其進一步包含透明質酸。
一種治療關節之方法，其包含向個體之關節中投與如請求項22或23之組合物之步驟。
如請求項24之方法，其中該個體係選自由以下組成之群組之哺乳動物：人類、馬、狗及貓。
如請求項24之方法，其中該治療起因於關節損傷。
如請求項26之方法，其中該關節損傷係急性或慢性骨關節病。