JP2014221070A - 細胞外マトリックス組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は全体として、細胞外マトリックス組成物の作製および使用に関し、より具体的には、低酸素条件の下、適した増殖培地における表面上にて細胞を培養することによって得られるタンパク質に関する。
細胞外マトリックス(ECM)は、哺乳類の組織内にインビボで見られる細胞を取り囲むかまたは支持する複雑な構造実体である。ECMは結合組織といわれることも多い。ECMは、コラーゲンおよびエラスチンなどの構造タンパク質、フィブリリン、フィブロネクチンおよびラミニンなどの特殊なタンパク質、ならびにプロテオグリカンを含む三つの主要な部類の生体分子から主に構成される。
本発明は、1種または複数種の胎児性タンパク質を含むECM組成物を作出するための方法に関する。具体的には、該組成物は、適した増殖培地における表面(例えば、二次元または三次元表面)上にて低酸素条件の下で細胞を培養することによって作製される。培養方法により、種々の用途を有する生理学的に許容される組成物を得るために別々にまたは一緒に使用されうる可溶性画分も不溶性画分もともに産生される。
低酸素条件の下で増殖されたECM組成物における差次的な遺伝子発現
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を組織培養フラスコ中で標準的な単層として培養し、自然に沈積された、胎性様ECM内の、三次元線維芽細胞培養物と比較した。培養物は本明細書において開示されるように増殖された。遺伝子の差次的発現を評価するため、製造元のプロトコルにしたがい広範な遺伝子発現(40,000個未満の遺伝子を含む)を目的にAgilent Whole Human Genome Oligo Microarrays (登録商標)を用いて総RNAのサンプルをそろえた。
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いた低酸素ECMの産生
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いたECMの低酸素培養について2つの例を提供する。
治療用途のための組織工学的ヒト胎児性細胞外マトリックス
胎児性ECMは、瘢痕または癒着の形成がなく迅速な細胞増殖および治癒につながる環境を生み出す。血管形成前の初期胎児期環境を刺激する条件(低酸素および重力の低減)下での3次元のヒト新生児線維芽細胞の増殖は、胎児性特性を有するECMを作出するものと仮定された。遺伝子チップアレイ分析は、従来の組織培養条件に比べて低酸素の組織培養条件の下での5000種を超える遺伝子の差次的発現を明らかにした。産生されたECMは、III型、IV型およびV型コラーゲン、糖タンパク質、例えばフィブロネクチン、SPARC、トロンボスポンジン、ならびにヒアルロン酸に比較的富んでいるという点で胎児間葉組織に類似していた。ECMは、鍵となる増殖因子によって再生幹細胞集団を支持する推定上のニッチにおける増殖因子の提示および結合に重要な調節的役割も果たすので、本発明者らは、培養下の胎児様ECMの発達中の増殖因子発現に及ぼす低酸素の影響について評価した。低酸素は、VEGF、FGF-7およびTGF-βなどの、創傷治癒および器官形成を調節する因子、ならびにWnt 2b、4、7a、10aおよび11を含む複数のWntの発現を高めることもできる。胎児性ヒトECMはまた、MTTアッセイを用いて酵素活性の増大によって測定をした場合、インビトロでヒト線維芽細胞における代謝活性の増大を刺激した。さらに、本発明者らは、ヒトECMに応じた細胞数の増加を検出した。このヒトECMは、生物学的な表面コーティングとして、および瘢痕または癒着なしに新しい組織を増殖させ治癒する種々の治療用途での組織充填処置において用いることができる。
再生医療用途のための天然可溶性WNT活性の作出
皮膚または血液のような、成体組織を再生できる幹細胞または前駆細胞は、胚発生をある程度繰り返して、この再生を達成する。ますます多くの研究から、胚形成中に活性な幹細胞多分化能および系統特異的分化の鍵となる調節因子は、ある種の環境下で成体において再発現されることが明らかにされている。分泌型の形態形成増殖および発生因子のWNTファミリーは、有益な研究ツール、ひいては臨床における治療的処置となる可能性のある増殖因子の一つである。しかしながら、Wntのものは、今日まで商業規模での標準的な組換え発現および精製技法が無効なことが証明されており、WNTに基づく製品の臨床開発を可能にする大規模なWNTタンパク質の産生に関する報告はない。培養下のさまざまな足場に新生児ヒト皮膚線維芽細胞を用い培養下の胎児様ECMを増大させて三次元の組織等価物を作製するための技法が開発されている。この過程において、これらの培養物は、ECM産生に使われる無血清馴化培地中に含有される生物活性のWNTのものの商業規模の供給源となりうることが発見された。ここで、本発明者らはこのWNT製品候補に関するデータを提示する。
低酸素線維芽細胞は独特のECM産生および増殖因子発現を示す
ヒト新生児皮膚線維芽細胞は、インビトロで培養されると、真皮を綿密に模倣する、かつ創傷治癒などの再生医療用途において損傷真皮に取って代わりうるECMを産生する。創傷治癒の過程はまた、胎児期環境を刺激することにより胚発生を繰り返すので、本発明者らは、産生されたECMが組織再生用途のための強化されたECMとなるものとの仮説を立てた。それゆえ、ヒト新生児線維芽細胞に由来するECMを培養液中、低酸素条件下で増殖させて、血管形成前の初期胚に存在する低酸素状態を刺激した。この目標は、培養下の組織発達の間に低酸素状態を用いて胎児性特性を有するECMを作製することであった。
ヒト細胞外マトリックス(hECM)でコーティングされた生体医用材料
ヒト由来の材料(hECM)を用いて作製されたECM組成物を、光活性架橋剤を用いてプロピレンメッシュ上にコーティングした。hECMでコーティングされたポリプロピレンメッシュの抗フィブロネクチン免疫蛍光染色から、ECM材料はコーティングされていないメッシュと比べてメッシュの繊維上に均一なコーティングを形成することが明らかである。HECMでコーティングされたメッシュは、ヘルニア修復および骨盤底修復などの、医療用途向けの移植可能なパッチに適している。ECM材料は、細胞内殖の改善を可能にするフィブロネクチン抗体での免疫蛍光染色によって示されるようにメッシュの個々の繊維をコーティングすることが明らかである。
育毛の刺激のための細胞外マトリックス組成物の使用
本実施例では、ECM組成物の投与による育毛の刺激について例証する。
ヒト細胞外マトリックス組成物(hECM)の作製
新生児ヒト線維芽細胞を用いてヒトECM組成物を作製した。液体培地で馴化されたビーズ様構造に線維芽細胞を播種した。ウシ胎仔血清の必要なしに培養条件を最適化した。数日内に、本明細書において記述される胚培養条件の下で、細胞は密な胚様ECMを産生した。Wntファミリータンパク質、およびいくつかの増殖因子の分泌が認められた。
美容医療用途のためのヒト線維芽細胞由来の低酸素馴化細胞外マトリックス
顔面切除レーザー手術後の局所hECM投与の二重盲検無作為化試験を行った。本試験には年齢40歳から年齢60歳の被験体41名が参加した。本試験群の全員とも従来の侵襲手術もしくは最小侵襲手術、または、過去12ヶ月以内の局所的な老化防止処置はなしであった。レーザー治療には全面の、眼周囲の、口周囲のおよび全顔のフラクショナル切除レーザー治療が含まれた。Palomar Starluz 550pレーザーを用いた(1540-non-ablativeおよび2940 ablative)。被験体に局所hECM組成物を1日1回(異なる濃度で)または偽薬ビヒクルを14日間投与した。試験の終点には臨床写真(3回の盲検評価-皮膚科医)、経表皮水分喪失(TEWL)、パンチ生検、ならびに紅斑、浮腫および痂皮形成の評価が含まれた。
[本発明1001]
適した増殖培地における表面上にて低酸素条件の下で細胞を培養し、それによって1種または複数種の胎児性タンパク質を含む可溶性組成物および不溶性組成物を産生する段階
を含む、1種または複数種の胎児性タンパク質を含む組成物を作製する方法。
[本発明1002]
前記増殖培地が血清を含む、本発明1001の方法。
[本発明1003]
前記増殖培地が無血清である、本発明1001の方法。
[本発明1004]
低酸素の酸素条件が酸素1〜5%である、本発明1001の方法。
[本発明1005]
コラーゲン種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、本発明1001の方法。
[本発明1006]
コラーゲンが、V型α1; IX型α1; IX型α2; VI型α2; VIII型α1; IV型α5; VII型α1; XVIII型α1; またはXII型α1から選択される、本発明1005の方法。
[本発明1007]
Wnt種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、本発明1001の方法。
[本発明1008]
Wnt種がwnt 7aおよびwnt 11である、本発明1007の方法。
[本発明1009]
ラミニン種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、本発明1001の方法。
[本発明1010]
ラミニン種がラミニン8である、本発明1009の方法。
[本発明1011]
無細胞上清が、透析され、凍結乾燥され、かつ緩衝液中で再構成される、本発明1001の方法。
[本発明1012]
無細胞上清が、透析され、乾燥され、かつ緩衝液中で再構成される、本発明1001の方法。
[本発明1013]
前記細胞が線維芽細胞である、本発明1001の方法。
[本発明1014]
前記線維芽細胞が新生児線維芽細胞である、本発明1013の方法。
[本発明1015]
前記表面が三次元である、本発明1001の方法。
[本発明1016]
前記表面がメッシュを含む、本発明1015の方法。
[本発明1017]
前記表面が二次元である、本発明1001の方法。
[本発明1018]
前記表面がビーズを含む、本発明1017の方法。
[本発明1019]
前記細胞が種特異的である、本発明1001の方法。
[本発明1020]
可溶性画分である、本発明1001の方法により調製される組成物。
[本発明1021]
不溶性画分である、本発明1001の方法により調製される組成物。
[本発明1022]
可溶性画分と不溶性画分との組み合わせである、本発明1001の方法により調製される組成物。
[本発明1023]
修復または再生される細胞を本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物と接触させる段階
を含む、細胞の修復および/または再生の方法。
[本発明1024]
前記細胞が骨軟骨細胞である、本発明1023の方法。
[本発明1025]
本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物を含む、組織再生パッチ。
[本発明1026]
本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物を含む、組織培養システム。
[本発明1027]
幹細胞の増殖を補助するために用いられる、本発明1026の組織培養システム。
[本発明1028]
前記幹細胞が、胚幹細胞、間葉系幹細胞または神経幹細胞である、本発明1027の組織培養システム。
[本発明1029]
本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物を含む、被験体での被験体における装置の移植に関連して用いられる表面コーティング。
[本発明1030]
前記装置が、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、薬物送達ポート、カテーテル、またはパッチである、本発明1029のコーティング。
[本発明1031]
創傷治癒の改変、炎症の改変、線維性被膜形成の改変、組織内殖の改変、または細胞内殖の改変に用いられる、本発明1029のコーティング。
[本発明1032]
損傷組織の処置を可能にする条件の下で本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物と損傷組織を接触させる段階
を含む、損傷組織を処置する方法。
[本発明1033]
前記組織が心臓組織である、本発明1032の方法。
[本発明1034]
前記組織が梗塞組織または虚血組織である、本発明1032の方法。
[本発明1035]
前記組織が腸組織である、本発明1032の方法。
[本発明1036]
被験体のしわの部位に、本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物を投与し、それによって皮膚表面の改善を提供する段階
を含む、被験体における皮膚表面の改善のための方法。
[本発明1037]
本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物を含む、生物学的癒着防止剤。
[本発明1038]
本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物を含む、送達部位での細胞の送達または維持のための生物学的ビヒクル。
[本発明1039]
被験体のしわの部位に、本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物を投与し、それによって軟組織の修復または増強を提供する段階
を含む、被験体における軟組織の修復または増強のための方法。
[本発明1040]
本発明1020、1021または1022のいずれかの組成物と細胞を接触させ、それによって育毛を促進する段階
を含む、育毛を促進する方法。
[本発明1041]
前記細胞が毛包細胞である、本発明1040の方法。
[本発明1042]
前記細胞をインビボで接触させる、本発明1040の方法。
[本発明1043]
前記細胞をエクスビボで接触させる、本発明1040の方法。
[本発明1044]
前記細胞が被験体に移植される、本発明1043の方法。
[本発明1045]
適した増殖培地における表面上にて低酸素条件の下で細胞を培養し、それによってWntタンパク質および血管内皮増殖因子(VEGF)を産生する段階
を含む、Wntタンパク質およびVEGFを産生する方法。
[本発明1046]
前記増殖培地が無血清である、本発明1045の方法。
[本発明1047]
低酸素の酸素条件が酸素1〜5%である、本発明1045の方法。
[本発明1048]
Wnt種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、本発明1047の方法。
[本発明1049]
Wnt種がwnt 7aおよびwnt 11である、本発明1048の方法。
[本発明1050]
VEGF種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、本発明1045の方法。
[本発明1051]
VEGF種がVEGF-Aまたはそのアイソフォームである、本発明1050の方法。
[本発明1052]
前記細胞が線維芽細胞である、本発明1045の方法。
[本発明1053]
前記表面が三次元である、本発明1045の方法。
[本発明1054]
前記表面がメッシュを含む、本発明1053の方法。
[本発明1055]
前記表面が二次元である、本発明1045の方法。
[本発明1056]
前記表面がビーズを含む、本発明1055の方法。
Claims (56)
- 適した増殖培地における表面上にて低酸素条件の下で細胞を培養し、それによって1種または複数種の胎児性タンパク質を含む可溶性組成物および不溶性組成物を産生する段階
を含む、1種または複数種の胎児性タンパク質を含む組成物を作製する方法。 - 前記増殖培地が血清を含む、請求項1記載の方法。
- 前記増殖培地が無血清である、請求項1記載の方法。
- 低酸素の酸素条件が酸素1〜5%である、請求項1記載の方法。
- コラーゲン種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、請求項1記載の方法。
- コラーゲンが、V型α1; IX型α1; IX型α2; VI型α2; VIII型α1; IV型α5; VII型α1; XVIII型α1; またはXII型α1から選択される、請求項5記載の方法。
- Wnt種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、請求項1記載の方法。
- Wnt種がwnt 7aおよびwnt 11である、請求項7記載の方法。
- ラミニン種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、請求項1記載の方法。
- ラミニン種がラミニン8である、請求項9記載の方法。
- 無細胞上清が、透析され、凍結乾燥され、かつ緩衝液中で再構成される、請求項1記載の方法。
- 無細胞上清が、透析され、乾燥され、かつ緩衝液中で再構成される、請求項1記載の方法。
- 前記細胞が線維芽細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記線維芽細胞が新生児線維芽細胞である、請求項13記載の方法。
- 前記表面が三次元である、請求項1記載の方法。
- 前記表面がメッシュを含む、請求項15記載の方法。
- 前記表面が二次元である、請求項1記載の方法。
- 前記表面がビーズを含む、請求項17記載の方法。
- 前記細胞が種特異的である、請求項1記載の方法。
- 可溶性画分である、請求項1記載の方法により調製される組成物。
- 不溶性画分である、請求項1記載の方法により調製される組成物。
- 可溶性画分と不溶性画分との組み合わせである、請求項1記載の方法により調製される組成物。
- 修復または再生される細胞を請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物と接触させる段階
を含む、細胞の修復および/または再生の方法。 - 前記細胞が骨軟骨細胞である、請求項23記載の方法。
- 請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物を含む、組織再生パッチ。
- 請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物を含む、組織培養システム。
- 幹細胞の増殖を補助するために用いられる、請求項26記載の組織培養システム。
- 前記幹細胞が、胚幹細胞、間葉系幹細胞または神経幹細胞である、請求項27記載の組織培養システム。
- 請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物を含む、被験体での被験体における装置の移植に関連して用いられる表面コーティング。
- 前記装置が、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、薬物送達ポート、カテーテル、またはパッチである、請求項29記載のコーティング。
- 創傷治癒の改変、炎症の改変、線維性被膜形成の改変、組織内殖の改変、または細胞内殖の改変に用いられる、請求項29記載のコーティング。
- 損傷組織の処置を可能にする条件の下で請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物と損傷組織を接触させる段階
を含む、損傷組織を処置する方法。 - 前記組織が心臓組織である、請求項32記載の方法。
- 前記組織が梗塞組織または虚血組織である、請求項32記載の方法。
- 前記組織が腸組織である、請求項32記載の方法。
- 被験体のしわの部位に、請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物を投与し、それによって皮膚表面の改善を提供する段階
を含む、被験体における皮膚表面の改善のための方法。 - 請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物を含む、生物学的癒着防止剤。
- 請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物を含む、送達部位での細胞の送達または維持のための生物学的ビヒクル。
- 被験体のしわの部位に、請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物を投与し、それによって軟組織の修復または増強を提供する段階
を含む、被験体における軟組織の修復または増強のための方法。 - 請求項20、21または22のいずれか一項記載の組成物と細胞を接触させ、それによって育毛を促進する段階
を含む、育毛を促進する方法。 - 前記細胞が毛包細胞である、請求項40記載の方法。
- 前記細胞をインビボで接触させる、請求項40記載の方法。
- 前記細胞をエクスビボで接触させる、請求項40記載の方法。
- 前記細胞が被験体に移植される、請求項43記載の方法。
- 適した増殖培地における表面上にて低酸素条件の下で細胞を培養し、それによってWntタンパク質および血管内皮増殖因子(VEGF)を産生する段階
を含む、Wntタンパク質およびVEGFを産生する方法。 - 前記増殖培地が無血清である、請求項45記載の方法。
- 低酸素の酸素条件が酸素1〜5%である、請求項45記載の方法。
- Wnt種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、請求項47記載の方法。
- Wnt種がwnt 7aおよびwnt 11である、請求項48記載の方法。
- VEGF種が、酸素約15〜20%の酸素条件において産生される培地と比べて上方制御される、請求項45記載の方法。
- VEGF種がVEGF-Aまたはそのアイソフォームである、請求項50記載の方法。
- 前記細胞が線維芽細胞である、請求項45記載の方法。
- 前記表面が三次元である、請求項45記載の方法。
- 前記表面がメッシュを含む、請求項53記載の方法。
- 前記表面が二次元である、請求項45記載の方法。
- 前記表面がビーズを含む、請求項55記載の方法。
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JPN6013052963; J. Cell. Physiol. Vol. 154, 1993, p. 506-510 * |
JPN6013052964; J. Cell. Physiol. Vol. 191, 2002, p. 42-50 * |
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