BRPI0906972B1

BRPI0906972B1 - Métodos para produção de composições de matriz extracelular e para produção de uma proteína wnt e de um fator de crescimento endotelial vascular

Info

Publication number: BRPI0906972B1
Application number: BRPI0906972-0A
Authority: BR
Inventors: Gail K. Naughton; Frank Ziegler; Mark Baumgartner; Kyle Nickey
Original assignee: Histogen, Inc
Priority date: 2008-01-30
Filing date: 2009-01-30
Publication date: 2021-09-08
Also published as: EP2262891A1; AP3129A; CA2714387A1; KR101650957B1; EP2262891A4; SG10201500237TA; US8257947B2; SG10201906494PA; BRPI0906972A2; KR20110011599A; US20100047305A1; JP2014221070A; CN102066558B; WO2009097559A1; AP2010005380A0; CN102066558A; JP2011510662A; AU2009209022B2; EP2262891B1; BR122020017131B1

Abstract

composições de matriz extracelular. a presente invenção refere-se a um método de produção de composições incluindo proteínas embrionárias.o método inclui a cultura de células sob condições hipóxicas em uma superfície biocompatível bi ou tridimensional in vidro. o método de cultivo produz tanto frações solúveis como não solúveis, que podem ser usadas separadamente ou em combinação para obtenção fisiologicamente aceitáveis em uma variedade de aplicações médicas e terapêuticas.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção refere-se, geralmente, à produção e o uso de composições de matriz extracelular e mais especificamente a proteínas obtidas pelo cultivo de células sob condições hipóxicas em uma superfície em um meio de crescimento adequado.

INFORMAÇÃO ANTECEDENTE

[002] A matriz extracelular (ECM) é uma entidade estrutural com plexa circundando e suportando células que são encontradas in vivo dentro de tecidos mamíferos. A ECM muitas vezes é referida como o tecido conectivo. A ECM é principalmente composta de três classes principais de biomoléculas incluindo proteínas estruturais, tais como colágenos e elastinas, proteínas especializadas, tais como fibrilinas, fibronectinas, e lamininas, e proteoglicanos.

[003] O crescimento de composições de ECM in vitro e seu uso em uma variedade de aplicações terapêuticas e médicas foi descrito na técnica. Uma aplicação terapêutica de tais composições de ECM inclui o tratamento e o reparo de tecido mole e defeitos de pele, tais como rugas e cicatrizes.

[004] O reparo ou aumento de defeitos de tecido mole causados por defeitos, tais como, acne, cicatrizes cirúrgicas ou envelhecimento provaram ser muito difíceis. Diversos materiais foram usados para corrigir defeitos de tecido mole com graus variados de êxito, entretanto, nenhum material foi completamente seguro e eficaz. Por exemplo, o silicone causa uma variedade de problemas fisiológicos e clínicos incluindo efeitos colaterais de longo prazo, tais como nódulos, celulite recorrente e úlceras cutâneas.

[005] Composições de colágeno também foram usadas como um material injetável para aumento de tecido mole. Colágeno é a proteína principal do tecido conectivo e a proteína mais abundante em mamíferos, compondo aproximadamente 25% do conteúdo proteico total. Há atualmente 28 tipos de colágeno descritos na literatura (ver, por exemplo, Tabelas 1 e 2 infra, para uma listagem detalhada). Entretanto, mais de 90% do colágeno no corpo são Colágenos I, II, III, e IV.

[006] Materiais de colágeno diferentes foram usados para o tratamento de defeitos de tecido mole, tais como colágeno bovino injetável reconstituído, colágeno reticulado ou outros colágenos xenogenei- cos. Entretanto, vários problemas existem com tais colágenos. Um problema comum inclui a complexidade e alto custo para produzir os materiais de implante para remoção de substâncias potencialmente imunogênicas para evitar reações alérgicas no indivíduo. Adicionalmente, os tratamentos usando tais colágenos não comprovaram longa duração.

[007] Outros materiais também foram descritos que podem ser usados para reparo ou aumento de tecido mole, tais como, partículas cerâmicas biocompatíveis em géis aquosos (Patente U.S. No. 5.204.382), materiais termoplásticos e/ou que endurecem após aquecimento (Patente U.S. No. 5.278.202), e misturas poliméricas baseadas em ácido lático (Patente U.S. No. 4.235.312). Adicionalmente, uso de composições de ECM naturalmente secretadas também foi descrito (Patente U.S. No. 6.284.284). Entretanto, tais materiais provaram todos ter limitações.

[008] Consequentemente, novos materiais são necessários para reparo e aumento de tecido mole que superam as deficiências dos materiais prévios. A necessidade existe para fornecer um material seguro, injetável, de longa duração, bioabsorvível, de reparo e aumento de te- cido mole.

[009] Composições de ECM cultivada in vitro podem ser adicionalmente usadas para tratar o tecido danificado, tal como, músculo cardíaco danificado e tecido relacionado. As composições são úteis como implantes ou revestimentos biológicos em dispositivos implantáveis, tal como, stents; prótese vascular para promoção da vascularização em órgãos, tais como coração e tecido relacionado; e dispositivos úteis no reparo de hérnia, reparo de assoalho pélvico, reparo de ferida, e reparo de manguito rotador, tais como adesivos e similares.

[010] Doença cardíaca coronária (CHD), também chamada doença de artéria coronária (CAD), doença isquêmica cardíaca e doença cardíaca aterosclerótica, é caracterizada por um estreitamento dos pequenos vasos sanguíneos que fornecem sangue e oxigênio ao coração. Doença cardíaca coronária é normalmente causada por uma condição chamada aterosclerose, que ocorre quando material e placa gordurosos acumulam-se nas paredes das artérias que fazem as artérias estreitarem-se. Como as artérias coronárias se estreitaram, o fluxo de sangue ao coração pode reduzir ou parar, causando dor no peito (angina estável), falta de ar, ataque cardíaco e outros sintomas.

[011] Doença cardíaca coronária (CHD) é a causa principal de morte nos Estados Unidos de homens e mulheres. De acordo com a Associação de Coração Americana, mais de 15 milhões de pessoas têm alguma forma da condição. Enquanto os sintomas e sinais da doença cardíaca coronária são evidentes no estado avançado da doença, a maioria de indivíduos com doença cardíaca coronária não mostram nenhuma evidência da doença por décadas como os progressos de doença antes que um ataque cardíaco súbito ocorra. A doença é a causa mais comum de morte súbita, e é também a razão mais comum de morte de homens e mulheres com mais de 20 anos de idade. De acordo com as tendências presentes nos Estados Unidos, a metade dos homens de 40 anos saudáveis desenvolverá CHD no futuro, bem como uma a cada três mulheres de 40 anos saudáveis.

[012] Métodos correntes para melhorar o fluxo de sangue em um coração doente ou danificado de outra maneira envolvem técnicas cirúrgicas invasivas, tais como, cirurgia de passagem secundária coronária, angioplastia e endarterectomia. Tais procedimentos naturalmente envolvem altos graus de risco inerente durante e após cirurgia, e muitas vezes somente fornece um remédio temporário para isquemia cardíaca. Consequentemente, novas opções de tratamento devem aumentar o êxito de técnicas atualmente disponíveis para tratar CHD e sintomas relacionados.

[013] Composições de ECM cultivadas in vitro podem ser adicionalmente usadas para reparar e/ou regenerar células ou tecido danificados, tais como células condrais ou osteocondrais. O tecido osteo- condral é qualquer tecido que se relaciona ou contém osso ou cartilagem. As composições da presente invenção são úteis para o tratamento de defeitos osteocondrais, tais como doenças degenerativas de tecido conectivo, tal como reumatoide e/ou osteoartrite bem como defeitos em pacientes que têm defeitos de cartilagem devido a trauma.

[014] As tentativas atuais de reparo de defeitos osteocondrais incluem a implantação de condrócitos humanos em enxertos de hidro- gel biocompatíveis e biodegradáveis em tentativas de melhorar as possibilidades de restauração de lesões de cartilagem articular. Adicionalmente, a técnica de cultura de condrócito em contas de alginato ou uma matriz incluindo alginato polissulfatado foi descrita para gerar um tecido cartilaginoso similar à hialina. Entretanto, as tentativas no reparo encondral às lesões da cartilagem articular pelo implante de condrócitos autólogos humanos tiveram êxito limitado. Consequentemente, novas opções de tratamento devem aumentar o êxito de técnicas atualmente disponíveis para tratar defeitos osteocondrais.

[015] Composições de ECM in vitro cultivadas são também úteis em sistemas de cultura tecidual para geração de implante de tecido projetado. O campo da engenharia de tecido envolve o uso da tecnologia de cultura celular para gerar novos tecidos biológicos ou reparo de tecidos danificados. Fornecido em parte, pela revolução da célula- tronco, a tecnologia de engenharia de tecido oferece a promessa de regeneração de tecido e substituição após ferida ou tratamento de doenças degenerativas. Também pode ser usado no contexto de procedimentos cosméticos.

[016] Técnicas de engenharia de tecido podem ser usadas para gerar tanto tecido autólogo como heterólogo ou células usando uma variedade de tipos celulares e técnicas de cultura. Na criação de um implante autólogo, o tecido doador pode ser coletado e dissociado em células individuais, e posteriormente ligado e cultivado em um substrato a ser implantado no sítio desejado do tecido de funcionamento. Muitos tipos celulares isolados podem ser expandidos in vitro usando técnicas de cultura celular, entretanto, células dependentes de ancora- mento requerem ambientes específicos, muitas vezes incluindo a presença de um suporte tridimensional, para atuar como um molde de crescimento.

[017] A tecnologia de engenharia de tecido corrente fornece ge ralmente, implantes artificiais. Terapia de transplante celular bem- sucedida depende do desenvolvimento de substratos adequados tanto em cultura tecidual in vitro como in vivo. Dessa forma o desenvolvimento de uma ECM que contém materiais somente naturais e é adequado para implante teria mais das características do tecido endógeno. Consequentemente, a geração do material de ECM natural é um desafio contínuo no campo da engenharia de tecido.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[018] A presente invenção é baseada em parte na descoberta seminal que células cultivadas em superfícies (por exemplo, bidimensionais ou tridimensionais) sob condições que estimulam o primeiro ambiente embrionário (por exemplo, hipoxia e forças gravitacionais reduzidas) produzem composições de ECM com propriedades fetais. As composições de ECM produzidas pelo cultivo de células sob condições hipóxicas em uma superfície contendo uma ou mais proteínas embrionárias têm uma variedade de aplicações benéficas.

[019] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método de produção de composições de ECM contendo uma ou mais proteínas embrionárias. O método inclui células cultivadas sob condições hipóxicas em uma superfície (por exemplo, bidimensional ou tridimensional) em um meio de crescimento adequado para produzir uma fração solúvel e não solúvel. Em vários aspectos, as composições incluem fração solúvel ou não solúvel separadamente, bem como combinações da fração solúvel e insolúvel. Em vários aspectos, as composições produzidas incluem a regulação para cima da expressão gênica e a produção de lamininas, colágenos e fatores Wnt. Em outros aspectos, as composições produzidas incluem a regulação para baixo da expressão gênica de lamininas, colágenos e fatores Wnt. Em outros aspectos, as composições são espécies específicas e incluem células e/ou material biológico de uma única espécie animal. Enquanto as composições de ECM cultivadas in vitro são úteis no tratamento de seres humanos, tais composições podem ser aplicadas a outras espécies animais. Consequentemente, tais composições são bem adequadas para aplicações veterinárias.

[020] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método de produção de uma proteína Wnt e um fator de crescimento en- dotelial vascular (VEGF). O método inclui células cultivadas sob condições hipóxicas em uma superfície (por exemplo, bidimensional ou tridimensional) em um meio de crescimento adequado, por meio disso produzindo a proteína Wnt e o VEGF. Em vários aspectos, o meio de crescimento é sem soro e as condições de oxigênio hipóxicas são oxigênio 1 a 5%. Em aspectos relacionados, as espécies Wnt são reguladas para cima em comparação com meios produzidos em condições de oxigênio de aproximadamente oxigênio 15 a 20%. Em um aspecto exemplar, as espécies Wnt são wnt 7a e wnt 11.

[021] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um método de reparo e/ou regeneração de células pelo contato das células a serem consertadas ou regeneradas com as composições de ECM descritas neste pedido. Em um aspecto, as células são células osteo- condrais. Consequentemente, o método contempla o reparo de defeitos osteocondrais.

[022] Em outra modalidade, as composições de ECM são úteis como implantes ou revestimentos biológicos em dispositivos implantáveis. Em vários aspectos, as composições da presente invenção estão incluídas em implantes ou utilizadas como revestimentos biológicos em dispositivos implantáveis, tais como, stents e prótese vascular para promover a vascularização em órgãos, tais como coração e tecido relacionado. Em um aspecto relacionado, as composições estão incluídas na regeneração de adesivos ou implantes de tecido, úteis em reparo de hérnia, reparo de assoalho pélvico, reparo de ferida, reparo de manguito rotador e similares.

[023] Ainda em outra modalidade, a presente invenção inclui um método para melhora de uma superfície cutânea em um indivíduo incluindo administração ao indivíduo no sítio de uma ruga, das composições de ECM descritas neste pedido. Ainda em uma modalidade adicional, a presente invenção inclui um método de reparo ou aumento de tecido mole em um indivíduo incluindo administração ao indivíduo no sítio de uma ruga, as composições de ECM descritas neste pedido.

[024] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um siste- ma de cultura tecidual. Em vários aspectos, o sistema de cultura é composto das composições de ECM descritas neste pedido, tais como sendo incluídas em materiais de suporte bidimensionais ou tridimensionais. Em outro aspecto, as composições de ECM descritas neste pedido servem como um suporte ou suporte bidimensional ou tridimensional para o crescimento de vários tipos celulares. Por exemplo, o sistema de cultura pode ser usado para suportar o crescimento de célu-las-tronco. Em um aspecto, as células-tronco são células-tronco embrionárias, células-tronco mesenquimais ou células-tronco neuronais.

[025] Em outra modalidade, as composições da presente inven ção podem ser usadas para fornecer um revestimento superficial usado em associação com implante de um dispositivo em um indivíduo para promover endotelialização e vascularização.

[026] Em outra modalidade, as composições da presente inven ção podem ser usadas para fornecer um método de tratamento do tecido danificado. O método inclui contato do tecido danificado com uma composição gerada pelo cultivo de células sob condições hipóxicas em uma superfície bidimensional ou tridimensional contendo uma ou mais proteínas embrionárias sob condições que permitem o tratamento do tecido danificado.

[027] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um veículo biológico para entrega celular ou manutenção em um sítio de entrega incluindo as composições de ECM descritas neste pedido. O veículo pode ser usado em tais aplicações como injeções de células, tais como células-tronco, no músculo cardíaco danificado ou para reparo de ligamento e tendão.

[028] Em outra modalidade, a presente invenção fornece um método para estimular ou promover o crescimento capilar. O método inclui contato de uma célula com as composições de ECM descritas neste pedido. Em um aspecto exemplar, a célula é uma célula de folículo piloso. Em vários aspectos a célula pode ser contatada in vivo ou ex vivo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[029] A figura 1 mostra representações gráficas da formação de FBGC 2 semanas após implante da rede de polipropileno recoberta com hECM. A figura 1A mostra o número de FBGCs por fibra 2 semanas após implante por fibras não recobertas (primeira coluna) e recobertas com hECM (segunda coluna). A figura 1B mostra o número de FBGCs por fibra 2 semanas após implante por fibras não recobertas (colunas 1 a 3) e recobertas com ECM (colunas 4 a 6). * indica p <0,05.

[030] A figura 2 mostra representações gráficas da formação de FBGC 2 semanas após implante da rede de polipropileno recoberta com hECM. A figura 2A mostra o número de FBGCs por fibra 5 semanas após implante para fibras não recobertas (primeira coluna) e recobertas com hECM (segunda coluna). A figura 2B mostra o número de FBGCs por fibra 5 semanas após implante para fibras não recobertas (colunas 1 e 3) e recobertas com hECM (colunas 2 e 4).

[031] A figura 3 mostra representações pictóricas de células de folículo piloso humano. A figura 3A é uma imagem de células de folícu- lo piloso humano após cultura celular por quatro semanas na presença de hECM e transplante subsequente em um camundongo e crescimento por 4 semanas adicionais, enquanto a figura 3B é uma imagem de células de folículo controle.

[032] A figura 4 mostra uma representação gráfica da resposta metabólica fibroblástica para composições de matriz extracelular (tanto ECM de camundongo como ECM humana) como mostrado pelo ensaio de MTT.

[033] A figura 5 é uma representação gráfica do número de célu las em resposta à exposição de fibroblasto humano a hECM como medido pelo Ensaio Pico Green.

[034] A figura 6 é uma representação gráfica das avaliações deeritema de 41 indivíduos humanos tomados nos dias 3, 7 e 14 pós- tratamento com laser. A severidade do eritema foi avaliada em uma escala de 0 (nenhum) a 4 (severo). Cada grupo de 4 conjuntos de dados (0,1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, e controle da esquerda para direita) representa avaliações no dia 3 (esquerdo), 7 (meio) e 14 (direito).

[035] A figura 7 é uma representação gráfica das avaliações de edema de 41 indivíduos humanos tomados nos dias 3, 7 e 14 pós- tratamento com laser. A severidade do eritema foi avaliada em uma escala de 0 (nenhum) a 2,5 (severo). Cada grupo de 4 conjuntos de dados (0,1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, e controle da esquerda para direita) representa avaliações no dia 3 (esquerdo), 7 (meio) e 14 (direito).

[036] A figura 8 é uma representação gráfica de avaliações de crostas de 41 indivíduos humanos tomados nos dias 3, 7 e 14 pós- tratamento com laser. A severidade do eritema foi avaliada em uma escala de 0 (nenhum) a 3,5 (severo). Cada grupo de 4 conjuntos de dados (0,1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, e controle da esquerda para direita) representa avaliações no dia 3 (esquerdo), 7 (meio) e 14 (direito).

[037] A figura 9 é uma representação gráfica dos valores de per da de água transepidérmica (TWEL) de 41 indivíduos humanos tomados nos dias 3, 7 e 14 pós-tratamento com laser. A severidade de TWEL foi avaliada em uma escala de 0 (nenhum) a 4 (severo). Cada grupo de 4 conjuntos de dados (0,1X hECM, 1X hECM, 10X hECM, e controle da esquerda para direita) representa avaliações no dia 3 (esquerdo), 7 (meio) e 14 (direito).

[038] A figura 10 é uma representação gráfica de análise de perfi- lometria de imagem tridimensional de réplicas de silicone da área periocular. Os pontos de dados foram tomados para 22 indivíduos antes do tratamento com laser, 4 semanas pós-tratamento e 10 semanas pós-tratamento. A série de dados A representa valores da administração de hECM; a série de dados B representa o controle.

[039] A figura 11 é uma representação gráfica da análise pós- cirurgia a laser com uso de petrolato.

[040] A figura 12 é uma representação gráfica da análise do eri- tema cutâneo com pontos de dados tomados nos dias 0, 3, 5, 7, 10 e 14 pós-cirurgia a laser.

[041] A figura 13 é uma representação gráfica da análise por me-xameter com pontos de dados tomados nos dias 0, 3, 5, 7, 10 e 14 pós-cirurgia a laser.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[042] A presente invenção refere-se a um método para produzir composições de ECM que incluem uma ou mais proteínas embrionárias. Em particular, as composições são geradas pelo cultivo de células sob condições hipóxicas em uma superfície (por exemplo, bidimensional ou tridimensional) em um meio de crescimento adequado. O método de cultura produz tanto frações solúveis como não solúveis que podem ser usadas separadamente ou em combinação para obter composições fisiologicamente aceitáveis tendo uma variedade de aplicações.

[043] As composições da presente invenção têm uma variedade de aplicações incluindo, mas não limitadas a, promoção de reparo e/ou regeneração de células ou tecidos danificados, usadas em adesivos e implantes para promover a regeneração tecidual (por exemplo, reparo de hérnia, reparo de assoalho pélvico, reparo de manguito rotador e reparo de ferida), uso em sistemas de cultura tecidual para cultura de células, tais como células-tronco, uso em revestimentos superficiais usados em associação com dispositivos implantáveis (por exemplo, marcapassos, stents, enxertos de stent, próteses vasculares, válvulas cardíacas, derivações, portas ou cateteres de entrega de fármaco, adesivos de reparo de hérnia e assoalho pélvico), promoção de reparo de tecido mole, aumento, e/ou melhora de uma superfície cutânea, tais como rugas, uso como um agente antiadesão biológico ou como um veículo biológico para entrega celular ou manutenção em um sítio da entrega.

[044] A invenção é baseada em parte, na descoberta que as cé lulas cultivadas em superfícies bi- ou tridimensionais sob condições que estimulam o ambiente embrionário inicial (hipoxia e forças gravita- cionais reduzidas) antes da angiogênese produz composições de ECM com propriedades fetais, incluindo a geração de proteínas embrionárias. O crescimento de células sob condições hipóxicas demonstra uma ECM única com propriedades fetais e expressão de fator de crescimento. Diferente da cultura de ECM sob condições de cultura tradicionais, mais de 5000 genes são diferencialmente expressos na ECM cultivada sob condições hipóxicas. Isto resulta em uma ECM cultivada que tem propriedades diferentes e uma composição biológica diferente. Por exemplo, uma ECM produzida sob condições hipóxicas é similar ao tecido mesenquimal fetal em que é relativamente rico em colá- genos tipo III, IV, e V, e glicoproteínas, tais como fibronectina, SPARC, trombospondina e ácido hialurônico.

[045] Hipoxia também aumenta a expressão de fatores que regu lam a cicatrização de ferida e organogênese, tais como VEGF, FGF-7, e TGF-β, bem como múltiplos fatores Wnt incluindo wnts 2b, 4, 7a, 10a e 11. A ECM humana embrionária cultivada também estimula um aumento da atividade metabólica em fibroblastos humanos in vitro, como medido pela atividade enzimática aumentada. Adicionalmente, há um aumento no número celular em resposta à ECM embrionária cultivada.

[046] Antes que as presentes composições e métodos sejam descritos, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a com-posições, métodos e condições particulares experimentais descritas, como tais composições, métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada neste pedido é para fins de descrição de modalidades particulares somente, e não é destinada a ser limitante, uma vez que o escopo da presente invenção será limitado somente nas reivindicações adicionadas.

[047] Como usado neste relatório descritivo e reivindicações adi cionadas, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de outra maneira. Dessa forma, por exemplo, as referências "para o método" incluem um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo descrito neste pedido que ficará evidente para aqueles versados na técnica na leitura desta revelação e similares.

[048] Em várias modalidades, a presente invenção envolve mé todos para produção de composições de ECM que incluem uma ou mais proteínas embrionárias e aplicações das mesmas. Em particular, as composições são geradas pelo cultivo de células sob condições hi- póxicas em uma superfície bidimensional ou tridimensional em um meio de crescimento adequado. As composições são derivadas pelo cultivo de células em uma estrutura bi- ou tridimensional que resulta em um sistema de cultura celular multicamada. Células cultivadas em um suporte de estrutura, conforme a presente invenção, crescem em múltiplas camadas, formando uma matriz celular. Crescimento das células cultivadas sob condições hipóxicas resulta na expressão gênica diferencial como resultado de condições de cultura hipóxicas contra cultura tradicional.

[049] ECM é uma composição de proteínas e biopolímeros que substancialmente compreendem o tecido que é produzido pela cultura de células. Células estromais, tais como fibroblastos, são um tipo de célula dependente de ancoragem requerendo cultivo enquanto liga-se a materiais e superfícies adequadas para cultura celular. Os materiais de ECM produzidos pelas células cultivadas são depositados em um arranjo tridimensional que fornece espaços para formação de estruturas similares a tecido.

[050] Os materiais de cultura que fornecem arquiteturas tridimensionais são referidos como suportes. Espaços para deposição da ECM estão na forma de aberturas, por exemplo, na rede de tecido ou espaços intersticiais criados em uma configuração compactada de contas esféricas, chamadas de microcarreadores.

[051] Como usado neste pedido, "composição de matriz extrace-lular" inclui tanto frações solúveis como não solúveis ou qualquer porção das mesmas. A fração não solúvel inclui aquelas proteínas de ECM secretadas e componentes biológicos que são depositados no suporte ou plataforma. A fração solúvel incluída refere-se a meios de cultura nos quais as células foram cultivadas e nos quais as células secretaram o agente(s) ativo e inclui aquelas proteínas e componentes biológicos não depositados na plataforma. Ambas as frações podem ser coletadas, e opcionalmente ainda processadas, e usadas individualmente ou em combinação em uma variedade de aplicações como descrito neste pedido.

[052] O suporte ou plataforma usados para cultura de células es-tromais podem ser de qualquer material e/ou formato que: (a) permite a células se ligarem a ele (ou pode ser modificado para permitir células se ligarem a ele); e (b) permite células crescerem em mais de uma camada (isto é, formar um tecido tridimensional). Em outras modalidades, uma folha ou membrana ou contas substancialmente bidimensionais podem ser usadas para cultura de células que estão suficientemente em forma tridimensional.

[053] Em um aspecto, o material biocompatível é formado em uma estrutura ou suporte, onde a estrutura tem espaços intersticiais de ligação e crescimento de células em um tecido tridimensional. As aberturas e/ou espaços intersticiais da estrutura em algumas modalidades são de um tamanho apropriado para permitir às células expandirem-se através das aberturas ou espaços. Manutenção de células ativamente crescentes estiradas através da estrutura parece aumentar a produção do repertório de fatores de crescimento responsáveis pelas atividades descritas neste pedido. Se as aberturas forem muito pequenas, as células podem alcançar rapidamente a confluência mas serem incapazes de sair facilmente da rede. Estas células capturadas podem exibir a inibição de contato e cessar a produção dos fatores apropriados necessários para suportar a proliferação e manter culturas de longo prazo. Se as aberturas forem muito grandes, as células podem ser incapazes de expandir-se através da abertura, que pode levar a uma redução na produção celular estromal dos fatores apropriados necessários para suportar a proliferação e manter culturas de longo prazo. Tipicamente, os espaços intersticiais são pelo menos aproximadamente 100 um, pelo menos 140 um, pelo menos aproximadamente 150 um, pelo menos aproximadamente 180 um, pelo menos aproximadamente 200 um ou pelo menos aproximadamente 220 um. Usando um tipo de rede de matriz, como exemplificado neste pedido, encontra-se que as aberturas variando de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 220 μm funcionarão satisfatoriamente. Entretanto, dependendo da estrutura e da complexidade da estrutura, outros tamanhos são permissíveis. Qualquer forma ou estrutura que permita às células expandir-se e continuar replicando e crescendo por longos períodos de tempo podem funcionar para elaborar os fatores celulares conforme os métodos neste pedido.

[054] Em alguns aspectos, a estrutura é formada de polímeros ou fios que são entrelaçados, tecidos, enlaçados ou de outra maneira arranjados para formar uma estrutura, tal como uma rede ou tecido. Os materiais também podem ser formados pela moldagem do material ou fabricação em uma espuma, matriz ou suporte similar à esponja. Em outros aspectos, a estrutura está na forma de fibras emaranhadas feitas pela compressão de polímeros ou outras fibras em conjunto para gerar um material com espaços intersticiais. A estrutura pode tomar qualquer forma ou geometria para o crescimento de células na cultura. Dessa forma, outras formas da estrutura, como ainda descritas abaixo, podem ser suficientes para gerar o meio condicionado apropriado.

[055] Diversos materiais diferentes podem ser usados para formar a plataforma ou estrutura. Estes materiais incluem materiais não poliméricos e poliméricos. Os polímeros, quando usados, podem ser qualquer tipo de polímero, tais como homopolímeros, polímeros ran- dômicos, copolímeros, polímeros de bloco, polímeros de cobloco (por exemplo, di, tri, etc.), polímeros lineares ou ramificados, e polímeros interligados ou não interligados. Exemplos não limitantes dos materiais para uso como plataformas ou estruturas incluem, entre outros, fibras de vidro, polietileno, polipropilenos, poliamida (por exemplo, náilon), poliéster (por exemplo, dacron), poliestireno, poliacrilatos, compostos de polivinila (por exemplo, cloreto de polivinila; PVC), policarbonatos, politetrafluoretilenos (PTFE; TEFLON), thermanox (TPX), nitrocelulose, polissacarídeos (por exemplo, celuloses, quitosana, agarose), polipep- tídeos (por exemplo, seda, gelatina, colágeno), ácido poliglicólico (PGA) e dextrana.

[056] Em alguns aspectos, a estrutura ou contas podem ser feitas de materiais que degradam ao longo do tempo sob condições de uso. Biodegradável também se refere à absortividade ou degradação de um composto ou composição quando administrados sob condições in vivo ou in vitro. A biodegradação pode ocorrer pela ação de agentes bioló- gicos, diretamente ou indiretamente. Exemplos não limitantes de materiais biodegradáveis incluem, entre outros, polilactídeos, poliglicolídeo, poli(carbonato de trimetileno), poli(lactídeo-co-glicolídeo) (isto é, PLGA), tereftalato de polietileno (PET), policaprolactona, material de sutura de categute, colágeno (por exemplo, espuma de colágeno equino), ácido polilático ou ácido hialurônico. Por exemplo, estes materiais podem ser entremeados em uma estrutura tridimensional, tal como uma esponja de colágeno ou gel de colágeno.

[057] Em outros aspectos, onde as culturas devem ser mantidas por longos períodos de tempo, criopreservadas e/ou onde integridade estrutural adicional é desejada, a estrutura pode ser compreendida de um material não biodegradável. Como usado neste pedido, um material não biodegradável refere-se a um material que não degrada ou se decompõe significativamente sob condições no meio de cultura. Materiais não degradáveis exemplares incluem, como exemplos não limi- tantes, náilon, dacron, poliestireno, poliacrilatos, polivinila, politetrafluo- roetilenos (PTFE), PTFE expandido (ePTFE) e celulose. Uma estrutura não degradante exemplar compreende uma rede de náilon, disponível sob a marca Nitex®, uma rede de filtração de náilon tendo um tamanho de poro médio de 140 μm e um diâmetro médio de fibra de náilon de 90 μm (#3-210/36, Tetko, Inc, N.Y.).

[058] Em outros aspectos, as contas, plataforma ou estrutura são uma combinação de materiais biodegradáveis e não biodegradáveis. O material não biodegradável fornece estabilidade à plataforma durante a cultura enquanto o material biodegradável permite a formação de espaços intersticiais suficientes para gerar redes celulares que produzem fatores celulares suficientes para aplicações terapêuticas. O material biodegradável pode ser recoberto com o material ou tecido não biodegradáveis, entrelaçado ou formado em uma rede. Várias combinações de materiais biodegradáveis e não biodegradáveis podem ser usadas. Uma combinação exemplar são redes de poli(tereftalato de etileno) (PET) recobertos com um filme de polímero biodegradável fino, poli[ácido D-L-lático-co-glicólico), a fim de obter uma estrutura polar.

[059] Em vários aspectos, a plataforma ou material de estrutura podem ser pré-tratados antes da inoculação com células para aumentar a ligação celular. Por exemplo, antes da inoculação com células, as telas de náilon em algumas modalidades são tratadas com ácido acético 0,1 M, e incubadas em polilisina, soro fetal bovino, e/ou colágeno para recobrir o náilon. O poliestireno pode ser similarmente tratado usando ácido sulfúrico. Em outras modalidades, o crescimento de células na presença da estrutura de suporte pode ser ainda aumentado pela adição à estrutura ou revestimento dele com proteínas (por exemplo, colágenos, fibras de elastina, fibras reticulares), glicoproteí- nas, glicoaminoglicanos (por exemplo, sulfato de heparana, condroiti- na-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatana, sulfato de queratana, etc.), fibronectinas, e/ou glicopolímeros (poli[N-p-vinilbenzil- D-lactoamida], PVLA) a fim de melhorar a ligação celular. Tratamento da plataforma ou estrutura é útil onde o material é um substrato pobre para a ligação de células.

[060] Em um aspecto, a rede é usada para a produção de ECM. A rede é um material tecido com náilon 6 em uma forma de tecedura lisa com aberturas de aproximadamente 100 μm e aproximadamente 125 μm de espessura. Na cultura, células de fibroblasto ligam-se ao náilon por interações proteicas carregadas e crescem nos vazios da rede produzindo e depositando proteínas de ECM. Aberturas de rede que são excessivamente grandes ou pequenas podem não ser eficazes mas podem diferenciar-se daquelas acima sem alterar substancialmente a capacidade de produzir ou depositar ECM. Em outro aspecto, outros materiais tecidos são usados para a produção de ECM, tais como poliolefinas, em configurações de tecedura fornecendo geometria adequada para crescimento celular e deposição de ECM.

[061] Por exemplo, a rede de náilon é preparada para cultura em qualquer uma das etapas da invenção pelo corte no tamanho desejado, lavagem com ácido acético 0,1 a 0,5M seguida por enxágue com água de alta pureza e então vapor esterilizado. Para uso como um suporte tridimensional para produção de ECM, a rede é ajustada em quadrados aproximadamente 10 cm x 10 cm. Entretanto, a rede pode ser qualquer tamanho apropriado para a aplicação desejada e pode ser usada em qualquer um dos métodos da presente invenção, incluindo métodos de cultura de inoculação, crescimento celular e produção de ECM e preparação da forma final.

[062] Em outros aspectos, o suporte para gerar os tecidos cultivados é composto de microcarreadores, que são contas ou partículas. As contas podem ser microscópicas ou macroscópicas e podem ser ainda dimensionadas para permitir a penetração em tecidos ou compactadas formar uma geometria particular. Em algumas modalidades de penetração de tecido, a estrutura das culturas celulares compreende partículas que, em combinação com as células, formam um tecido tridimensional. As células ligam-se às partículas e entre si para formar um tecido tridimensional. O complexo das partículas e células é de tamanho suficiente a ser administrado em tecidos ou órgãos, tal como por injeção ou cateter. Contas ou microcarreadores são considerados tipicamente um sistema ou suporte bidimensional.

[063] Como usado neste pedido, "microcarreadores" referem-se a uma partícula que tem o tamanho de nanômetros a micrômetros, onde as partículas podem ser de qualquer formato ou geometria, sendo irregulares, não esféricas, esféricas ou elipsoides.

[064] O tamanho dos microcarreadores adequados para os fins deste pedido pode ser de qualquer tamanho adequado para a particu lar aplicação. Em algumas modalidades, o tamanho de microcarreado- res adequado para tecidos tridimensionais pode ser aqueles administráveis por injeção. Em algumas modalidades, os microcarreadores têm uma faixa de tamanho de partícula de pelo menos aproximadamente 1 μm, pelo menos aproximadamente 10 μm, pelo menos aproximadamente 25 μm, pelo menos aproximadamente 50 μm, pelo menos aproximadamente 100 μm, pelo menos aproximadamente 200 μm, pelo menos aproximadamente 300 μm, pelo menos aproximadamente 400 μm, pelo menos aproximadamente 500 μm, pelo menos aproximadamente 600 μm, pelo menos aproximadamente 700 μm, pelo menos aproximadamente 800 μm, pelo menos aproximadamente 900 μm, pelo menos aproximadamente 1000 μm.

[065] Em alguns aspectos em que os microcarreadores são feitos de materiais biodegradáveis. Em alguns aspectos, os microcarreado- res compreendendo duas ou mais camadas de polímeros biodegradáveis diferentes podem ser usados. Em algumas modalidades, pelo menos uma primeira camada externa tem propriedades biodegradáveis para formar tecidos tridimensionais em cultura, enquanto que pelo menos uma segunda camada interna biodegradável, com propriedades diferentes da primeira camada, é feita para erodir quando administrada em um tecido ou órgão.

[066] Em alguns aspectos, os microcarreadores são microcarrea- dores porosos. Microcarreadores porosos referem-se a microcarreado- res tendo interstícios pelos quais as moléculas podem difundir-se dentro ou fora da micropartícula. Em outras modalidades, os microcarrea- dores são microcarreadores não porosos. Uma micropartícula não porosa refere-se a uma micropartícula na qual as moléculas de um tamanho escolhido não se difundem dentro ou fora da micropartícula.

[067] Microcarreadores para uso nas composições são biocom- patíveis e têm baixa ou nenhuma toxicidade a células. Microcarreado- res adequados podem ser escolhidos dependendo do tecido a ser tratado, tipo de dano a ser tratado, o tamanho do tratamento desejado, longevidade da cultura celular in vivo, e tempo necessário para formar tecidos tridimensionais. Os microcarreadores podem compreender vários polímeros, naturais ou sintéticos, carregados (isto é, aniônicos ou catiônicos) ou não carregados, biodegradáveis, ou não biodegradáveis. Os polímeros podem ser homopolímeros, copolímeros randômi- cos, copolímeros de bloco, copolímeros de enxerto, e polímeros rami-ficados.

[068] Em alguns aspectos, microcarreadores compreendem mi- crocarreadores não biodegradáveis. Microcápsulas e microcarreadores não biodegradáveis incluem, mas não limitados a, aqueles feitos de polissulfonas, poli(cloreto de acrilonitrila-co-vinila), acetato de vinileti- leno, copolímeros de hidroxietilmetacrilato-metil-metacrilato. Estes são úteis para fornecer propriedades de volume de tecido ou em modalidades onde os microcarreadores são eliminados pelo corpo.

[069] Em alguns aspectos, os microcarreadores compreendem suportes degradáveis. Estes incluem microcarreadores feitos a partir de polímeros de ocorrência natural, exemplo não limitante o qual inclui, entre outros, fibrina, caseína, albumina sérica, colágeno, gelatina, lecitina, quitosana, alginato ou poliaminoácidos, tais como poli-lisina. Em outros aspectos, microcarreadores degradáveis são feitos a partir de polímeros sintéticos, exemplos não limitantes os quais incluem, entre outros, polilactídeo (PLA), poliglicolídeo (PGA), poli(lactídeo-co- glicolídeo) (PLGA), poli(caprolactona), polidioxanona carbonato de tri- metileno, poli-hibroxialconatos (por exemplo, poli(hidroxibutirato), po- li(glutamato de etila), poli(DTH iminocarboni(iminocarbonato de bisfe- nol A), poli(ortoéster) e policianoacrilatos.

[070] Em alguns aspectos, os microcarreadores compreendem hidrogéis, que são redes de polímero tipicamente hidrofílicas preen- chidas com água. Hidrogéis têm a vantagem de disparo seletivo para o aumento do polímero. Dependendo da composição da rede polimérica, o aumento da micropartícula pode ser provocado por uma variedade de estímulos, incluindo pH, força iônica, térmica, elétrica, ultrassom e atividades enzimáticas. Exemplos não limitantes de polímeros úteis em composições de hidrogel incluem, entre outras, aquelas formadas de polímeros de poli(lactídeo-co-glicolídeo); poli(N-isopropilacrilamida); poli(ácido metacrílico-g-polietilenoglicol); ácido poliacrílico e po- li(oxipropileno-co-oxietileno)glicol; e compostos naturais, tais como sulfato de crondroitina, quitosana, gelatina, fibrinogênio ou misturas de polímeros sintéticos e naturais, por exemplo quitosana-poli(óxido de etileno). Os polímeros podem ser interligados reversivelmente ou irreversivelmente para formar géis adaptáveis para formação de tecidos tridimensionais.

[071] Em aspectos exemplares, os microcarreadores ou contas para uso na presente invenção são compostos inteiramente ou compostos em parte de dextrana.

[072] Conforme a presente invenção, o método de cultura é apli cável à proliferação de tipos diferentes de células, incluindo células estromais, tais como fibroblastos, e particularmente fibroblastos de prepúcio neonatal humano primário. Em vários aspectos, as células inoculadas na plataforma ou estrutura podem ser células estromais compreendendo fibroblastos, com ou sem outras células, como ainda descrito abaixo. Em algumas modalidades, as células são células es- tromais que são tipicamente derivadas do tecido conectivo, incluindo, mas não limitadas a: (1) osso; (2) tecido conectivo frouxo, incluindo colágeno e elastina; (3) o tecido conectivo fibroso que forma ligamentos e tendões, (4) cartilagem; (5) a ECM do sangue; (6) tecido adiposo, que compreende adipócitos; e (7) fibroblastos.

[073] Células estromais podem ser derivadas de vários tecidos ou órgãos, tais como pele, coração, vasos sanguíneos, medula óssea, músculo esquelético, fígado, pâncreas, cérebro, prepúcio, que pode ser obtido por biópsia (onde apropriado) ou na autópsia. Em um aspecto, fibroblastos fetais podem ser obtidos em alta quantidade a partir do prepúcio, tal como prepúcios neonatais.

[074] Em alguns aspectos, as células compreendem fibroblastos, que podem ser de uma origem fetal, neonatal, adulta ou combinação das mesmas. Em alguns aspectos, as células estromais compreendem fibroblastos fetais, que podem suportar o crescimento de uma variedade de diferentes células e/ou tecidos. Como usado neste pedido, um fibroblasto fetal refere-se a fibroblastos derivados de fontes fetais. Como usado neste pedido, um fibroblasto neonatal refere-se a fi- broblastos derivados de fontes fetais. Sob condições apropriadas, fi- broblastos podem dar origem a outras células, tais como células ósseas, células gordurosas, e células de músculo liso e outras células de origem mesodérmica. Em algumas modalidades, os fibroblastos compreendem fibroblastos dérmicos, que são fibroblastos derivados da pele. Fibroblastos dérmicos humanos normais podem ser isolados a partir do prepúcio neonatal. Estas células são tipicamente criopreser- vadas no fim da cultura primária.

[075] Em outros aspectos, o tecido tridimensional pode ser feito usando células-tronco ou progenitoras, sozinhas, ou em combinação com algum dos tipos celulares discutidos neste pedido. Células-tronco e progenitoras incluem, por meio de exemplo e não limitação, células- tronco embrionárias, células-tronco hematopoiéticas, células-tronco neuronais, células-tronco epidérmicas e células-tronco mesenquimais.

[076] Em algumas modalidades, um tecido tridimensional "específico" pode ser preparado pela inoculação do suporte com células derivadas de um órgão particular, isto é, pele, coração, e/ou a partir de um indivíduo particular que é posterior para receber as células e/ou tecidos cultivados em cultura conforme os métodos descritos neste pedido.

[077] Para certos usos in vivo é preferencial obter as células es-tromais dos próprios tecidos do paciente. O crescimento de células na presença de estrutura de suporte estromal pode ser ainda aumentado pela adição à estrutura, ou revestindo o suporte de estrutura com proteínas, por exemplo, colágenos, lamininas, fibras elásticas, fibras reticulares, glicoproteínas; glicoaminoglicanos, por exemplo, sulfato de heparina, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de derma- tana, sulfato de queratana, etc.; uma matriz celular e/ou outros materiais.

[078] Dessa forma, uma vez que os sistemas de cultura bidimen sionais ou tridimensionais descritos neste pedido são adequados para o crescimento de tipos celulares diversos e tecidos, e dependendo do tecido a ser cultivado e tipos de colágeno desejados, as células estro- mais apropriadas podem ser selecionadas para inocular a estrutura.

[079] Enquanto os métodos e aplicações da presente invenção são adequados para uso com tipos celulares diferentes, tais como tecido de células específicas ou tipos diferentes de células estromais como discutido neste pedido, a derivação das células para uso com a presente invenção também pode ser espécie específica. Consequentemente, as composições de ECM podem ser geradas que são espécie específica. Por exemplo, as células para uso na presente invenção podem incluir células humanas. Por exemplo, as células podem ser fibroblastos humanos. Do mesmo modo, as células são de outras espécies animais, tais como células equinas (cavalo), caninas (cão) ou felinas (gato). Adicionalmente, células de uma espécie ou linhagem de espécies podem ser usadas para gerar composições de ECM para uso em outras espécies ou linhagens relacionadas (por exemplo, alogenei- co, singeneico e xenogeneico). Também deve ser apreciado que as células derivadas de várias espécies podem ser combinadas para gerar composições de ECM multiespécies.

[080] Consequentemente, os métodos e composições da presen te invenção são adequados em aplicações envolvendo animais não- humanos. Como usado neste pedido, "veterinária" refere-se à ciência médica em questão ou ligada a tratamento médico ou cirúrgico de animais, especialmente animais domésticos. Animais veterinários comuns podem incluir mamíferos, anfíbios, aves, répteis e peixes. Por exemplo, mamíferos típicos podem incluir cães, gatos, cavalos, coelhos, primatas, roedores, e animais de produção, tais como vacas, cavalos, cabras, ovelhas e porcos.

[081] Como discutido acima, células adicionais podem estar pre sentes na cultura com as células estromais. Estas células adicionais podem ter diversos efeitos benéficos, incluindo, entre outros, suporte de crescimento de longo prazo em cultura, aumento da síntese de fatores de crescimento, e promoção da ligação de células ao suporte. Tipos celulares adicionais incluem como exemplos não limitantes, células de músculo liso, células de músculo cardíaco, células endoteliais, células de músculo esquelético, células endoteliais, pericitos, macrófa- gos, monócitos e adipócitos. Tais células podem ser inoculadas na estrutura junto com fibroblastos, ou em alguns aspectos, na ausência de fibroblastos. Estas células estromais podem ser derivadas de tecidos ou órgãos apropriados, incluindo, por meio de exemplo e não limitação, pele, coração, vasos sanguíneos, medula óssea, músculo esquelético, fígado, pâncreas e cérebro. Em outros aspectos, um ou mais tipos celulares, excluindo fibroblastos, são inoculados para suporte. Ainda em outros aspectos, os suportes são inoculados somente com células de fibroblasto.

[082] Fibroblastos podem ser prontamente isolados pela desa gregação de um órgão apropriado ou tecido que deve servir como fon- te dos fibroblastos. Por exemplo, o tecido ou órgão pode ser desagregado mecanicamente e/ou tratado com enzimas digestivas e/ou agentes quelantes que enfraquecem as ligações entre células vizinhas que permitem dispersar o tecido em uma suspensão de células individuais sem quebra celular apreciável. Dissociação enzimática pode ser realizada pela moagem do tecido e tratamento do tecido moído com algumas das diversas enzimas digestivas sozinhas ou em combinação. Estas incluem mas não são limitadas a tripsina, quimiotripsina, colage- nase, elastase, hialuronidase, DNase, pronase e/ou dispase, etc. Ruptura mecânica também pode ser realizada por diversos métodos incluindo, mas não limitados ao uso de trituradores, misturadores, peneiras, homogeneizadores, células de pressão, ou sonicador para citar apenas alguns. Em um aspecto, o tecido de prepúcio extirpado é tratado usando enzimas digestivas, tipicamente colagenase e/ou tripsinase para desassociar as células a partir de estruturas encapsulantes.

[083] O isolamento de fibroblastos, por exemplo, pode ser reali zado como se segue: amostras de tecido frescas são tipicamente lavadas e moídas em solução salina balanceada de Hank (HBSS) a fim de remover o soro. O tecido moído é incubado de 1 a 12 horas em uma solução recentemente preparada de uma enzima dissociadora, tais como tripsina. Após tal incubação, as células dissociadas são suspensas, precipitadas por centrifugação e plaqueadas em placas de cultura. Todos os fibroblastos se ligarão antes de outras células, por isso, células estromais apropriadas podem ser seletivamente isoladas e cultivadas. Os fibroblastos isolados então podem ser cultivados à confluência, suspensos da cultura confluente e inoculados na estrutura tridimensional, ver Naughton et al., 1987, J. Med. 18 (3&4):219-250. Inoculação da estrutura tridimensional com uma alta concentração de células estromais, por exemplo, aproximadamente 106 a 5x107 célu- las/ml, resultará no estabelecimento do suporte estromal tridimensional em períodos de tempo mais curtos.

[084] Uma vez que o tecido foi reduzido a uma suspensão de células individuais, a suspensão pode ser fracionada em subpopulações das quais os fibroblastos e/ou outras células estromais e/ou elementos podem ser obtidos. Isto também pode ser realizado usando técnicas padrão para separação celular incluindo, mas não limitadas a, clonagem e a seleção de tipos celulares específicos, destruição seletiva de células não desejadas (seleção negativa), separação baseada em aglutinabilidade celular diferencial na população variada, procedimentos congelamento-descongelamento, propriedades de aderência diferencial das células na população variada, filtração, centrifugação convencional e zonal, elutriação centrífuga (centrifugação contracorrente), separação gravitacional unitária, distribuição contracorrente, eletroforese e sorteamento celular ativado por fluorescência. Para uma revisão de seleção clonal e técnicas de separação celular, ver Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Techniques, 2nd Ed., A. R. Liss, Inc, New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137-168.

[085] Em um aspecto, as células de fibroblasto isoladas podem ser cultivadas para produzir bancos de células. Bancos de células são criados para considerar o início de várias quantidades e regulação de tempo de lotes de cultura e permitir o teste de preempção de células contaminantes e características celulares específicas. Fibroblastos dos bancos celulares são posteriormente cultivados para aumentar o número celular para níveis apropriados de suportes de semeadura. Operações envolvendo exposição ambiental de células e célula contatando materiais são realizadas por práticas assépticas para reduzir o potencial de contaminação de materiais estranhos ou micróbios indesejáveis.

[086] Em outro aspecto da invenção, após isolamento, as células podem ser cultivadas por várias passagens a uma quantidade ade- quada para construir bancos de células-mestras. Os bancos de células então podem ser, coletados e enchidos em vasos apropriados e conservados em condições criogênicas. Células em frascos congelados de bancos de células-mestras podem ser descongeladas e cultivadas por passagens adicionais (normalmente duas ou mais). As células então podem ser usadas para preparar bancos de células de trabalho criogenicamente conservados.

[087] Uma etapa da expansão celular usa frascos de células no estágio de banco de células de trabalho para aumentar ainda mais as quantidades de células para inoculação em estruturas ou suportes, tais como rede (por exemplo, tridimensional) ou microcarreadores (por exemplo, contas, bidimensionais). Cada passagem é uma série de etapas de subcultura que incluem inoculação de superfícies de crescimento celular, incubação, alimentação das células e coleta.

[088] O cultivo de bancos de células e expansão celular pode ser conduzido pela inoculação de vasos de cultura, tais como frascos de cultura, garrafas rotatórias ou microcarreadores. Células estromais, tais como fibroblastos, ligam-se nas superfícies de crescimento desejadas e crescem na presença de meios de culturas. Vasos de cultura, tais como frascos de cultura, garrafas rotatórias e microcarreadores são especificamente configurados para cultura celular e são comu- mente produzidos a partir de vários materiais plásticos qualificados para as aplicações desejadas. Microcarreadores tipicamente são contas microscópicas ou macroscópicas e são tipicamente feitos de vários materiais plásticos. Entretanto, podem ser feitos de outros materiais, tais como vidros ou materiais sólidos/semissólidos de base biológica, tais como colágenos ou outros materiais, tais como Dextrana, um complexo de açúcar modificado como discutido acima.

[089] Durante a cultura, os meios usados são periodicamente substituídos com meios frescos durante o curso do crescimento celular para manter a disponibilidade adequada de nutrientes e a remoção de produtos inibitórios do cultivo. Frascos de cultura e garrafas rotatórias fornecem uma superfície para as células crescerem e são tipicamente usados para cultura de células dependentes de ancoragem.

[090] Em um aspecto, a incubação é realizada em uma câmara aquecida a 37°C. Topologias de cultura que requerem a comunicação de meios e o ambiente da câmara usam CO2 5% v/v com ar no espaço de gás da câmara para ajudar na regulação do pH. Alternadamente, vasos equipados para manter a temperatura de cultura e pH podem ser usados tanto para expansão celular como para operações de produção de ECM. Temperaturas abaixo de 35°C ou acima de 38°C e concentrações de CO2 abaixo de 3% ou acima de 12% podem ser não apropriadas.

[091] Coleta de células de superfícies de ligação pode ser condu zida por remoção de meios de crescimento e enxágue das células com uma solução salina tamponada para reduzir a proteína de competição enzimática, aplicação de enzimas desassociantes, em seguida neutralização das enzimas após separação celular. A suspensão celular extraída é coletada e os fluidos da coleta são separados por centrifugação. As suspensões celulares de coletas de subcultura podem ser amostradas para avaliar a quantidade de células e outros atributos celulares recuperados e são posteriormente combinadas com meios frescos e aplicadas como inóculos. O número de passagens usadas para preparar bancos celulares e suporte de inóculo é crítico quanto à realização de características de ECM aceitáveis.

[092] Após um suporte apropriado ser preparado, é inoculado por semeadura com as células estromais preparadas. A inoculação do suporte pode ser feita de uma variedade de maneiras, tais como sedimentação. A rede preparada para cultura da ECM sob condições ae- róbicas é preparada da mesma maneira quanto à rede cultivada hipó- xica à exceção de que uma câmara anaeróbica não é usada para criar condições hipóxicas.

[093] Por exemplo, para ambos, a rede preparada para cultura da ECM tanto sob condições aeróbicas como sob hipóxicas, a rede preparada e esterilizada é colocada em placas de petri estéreis de diâmetro de 150 mm x 15 mm de profundidade e empilhada a uma espessura de aproximadamente 10 peças. As pilhas da rede então são inoculadas por sedimentação. Células são adicionadas a meios frescos para obter a concentração apropriada de células de inóculo. Inóculo é adicionado à pilha da rede onde as células se instalam nas fibras de náilon e ligam-se enquanto em condições incubadas. Após um tempo adequado, as folhas de rede individualmente semeadas podem ser assep- ticamente separadas da pilha e colocadas individualmente em placas de petri separadas de 150 mm x 15 mm contendo aproximadamente 50 ml de meios de crescimento.

[094] Incubação da cultura inoculada é realizada sob condições hipóxicas, que é descoberta produzir uma ECM e meios circundantes com propriedades únicas em comparação com a ECM gerada sob condições de cultura normais. Como usado neste pedido, condições hipóxicas são caracterizadas por uma concentração de oxigênio mais baixa em comparação com a concentração de oxigênio do ar ambiente (aproximadamente oxigênio de 15% a 20%). Em um aspecto, condições hipóxicas são caracterizadas por uma concentração de oxigênio menor que aproximadamente 10%. Em outro aspecto, as condições hipóxicas são caracterizadas por uma concentração de oxigênio de aproximadamente 1% a 10%, 1% a 9%, 1% a 8%, 1% a 7%, 1% a 6%, 1% a 5%, 1% a 4%, 1% a 3% ou 1% a 2%. Em certo aspecto, o sistema mantém o oxigênio de aproximadamente 1 a 3% dentro do vaso de cultura. As condições hipóxicas podem ser criadas e mantidas usando um aparelho de cultura que permite controlar concentrações de gás ambiente, por exemplo, uma câmara anaeróbica.

[095] Incubação de culturas celulares é tipicamente realizada em atmosfera normal com oxigênio de 15 a 20% e CO2 5% para expansão e semeadura, ponto o qual as culturas de baixo oxigênio são divididas para uma câmara hermética que é inundada com nitrogênio 95%/CO2 5% para que um ambiente hipóxico seja criado dentro de meio de cultura.

[096] Por exemplo, placas de petri com rede cultivada para pro dução de ECM sob condições hipóxicas são inicialmente cultivadas em incubação a 37°C e ar 95%/CO2 5% por 2 a 3 semanas. Seguinte ao período de cultivo próximo ao atmosférico, as placas petri da rede são incubadas em uma câmara projetada para cultura anaeróbica que é purgada com uma mistura gasosa de aproximadamente 95% de nitrogênio e 5% de CO2. Meios de crescimento usados são substituídos por meios frescos no nível de oxigênio atmosférico através do período de cultura e após, os meios são trocados, placas petri preenchidas com rede são colocadas na câmara anaeróbica, a câmara é purgada com nitrogênio 95%/CO2 5% então incubadas a 37°C. A rede cultivada é coletada quando elas alcançam o tamanho desejado ou contêm os componentes biológicos desejados.

[097] Durante o período de incubação, as células estromais cres cerão linearmente ao longo e envolverão a estrutura tridimensional antes de começar a crescer nas aberturas da estrutura. As células em crescimento produzem uma miríade de fatores de crescimento, fatores reguladores e proteínas, alguns dos quais são secretados nos meios circundantes, e outros que são depositados no suporte para construir a ECM mais totalmente discutida abaixo. Fatores de crescimento e reguladores podem ser adicionados à cultura, mas não são necessários. Cultura das células estromais produz tanto frações não solúveis como solúveis. As células são cultivadas a um grau apropriado para permitir a deposição adequada de proteínas de ECM.

[098] Durante a cultura dos tecidos tridimensionais, as células proliferadas podem ser liberadas da estrutura e se aderir nas paredes do vaso de cultura onde podem continuar proliferando e formar uma monocamada confluente. Para minimizar esta ocorrência, que pode afetar o crescimento de células, as células liberadas podem ser removidas durante a alimentação ou transferência da cultura celular para um novo vaso de cultura. A remoção da monocamada confluente ou transferência do tecido cultivado para meios frescos em um novo vaso mantém ou restaura a atividade proliferativa das culturas. Em alguns aspectos, remoção ou transferências podem ser feitas em um vaso de cultura que tem uma monocamada de células cultivadas excedendo 25% de confluência. Alternativamente, a cultura em algumas modalidades é agitada para impedir as células liberadas da aderência; em outros, os meios frescos são infundidos continuamente pelo sistema. Em alguns aspectos, dois ou mais tipos celulares podem ser cultivados em conjunto ao mesmo tempo ou um primeiro seguido pelo segundo (por exemplo, fibroblastos e células de músculo liso ou células endote- liais).

[099] Após inoculação dos suportes, a cultura celular é incubada em um meio nutritivo apropriado e condições de incubação que suporta o crescimento de células em tecidos tridimensionais. Muitos meios comercialmente disponíveis, tais como Meio Eagle Modificado de Dul- becco (DMEM), RPMI 1640, Fischer, Iscove e McCoy, podem ser adequados para suportar o crescimento das culturas celulares. O meio pode ser suplementado com sais adicionais, fontes de carbono, ami- noácidos, soro e componentes séricos, vitaminas, minerais, agentes redutores, agentes tamponados, lipídios, nucleosídeos, antibióticos, fatores de ligação e fatores de crescimento. Formulações de diferentes tipos de meios de culturas são descritas em vários trabalhos de refe- rência disponíveis para o versado (por exemplo, Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrates for Serum Free Animal Cell Cultures, Alan R. Liss, New York (1984); Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester, England (1996); Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, 4 th Ed., Wiley-Liss (2000)).

[0100] Os meios de crescimento ou de cultura usados em algumas das etapas de cultura da presente invenção, se sob condições aeróbi- cas ou hipóxicas, podem incluir soro, ou ser livre de soro. Em um aspecto, os meios são Meio Eagle Modificado de Dulbecco com glicose 4,5 g/L, alanil-L-glutamina, Eq 2 mM, e nominalmente suplementado com soro fetal bovino 10%. Em outro aspecto, os meios são meios livres de soro e são Meio Eagle Modificado de Dulbecco com meio de base de glicose 4,5 g/L com Glutamax®, suplementado com albumina sérica 0,5%, heparina 2 μg/ml, FGF básico recombinante 1 μg/ml, inibidor de tripsina de soja 1 μg/ml, suplemento ITS 1X (insulina- transferrina-selênio, Sigma. Cat No. I3146), suplemento de ácido graxo diluído 1:1000 (Sigma. Cat No. 7050), e colesterol diluído 1:1000. Adi-cionalmente, os mesmos meios podem ser usados tanto para cultura hipóxica como para aeróbica. Em um aspecto, os meios de crescimento são modificados a partir de meios baseados em soro para meios livres de soro após semeadura e a primeira semana de crescimento.

[0101] Condições de incubação estarão sob condições apropria das de pH, temperatura e gás (por exemplo, O2, CO2, etc.) para manter uma condição de crescimento hipóxica. Em algumas modalidades, a cultura celular pode ser suspensa no meio durante o período de incubação a fim de maximizar a atividade proliferativa e gerar fatores que facilitam as atividades biológicas desejadas das frações. Além disso, a cultura pode ser "alimentada" periodicamente para remover os meios usados, despopular células liberadas, e adicionar nova fonte nutritiva. Durante o período de incubação, as células cultivadas crescem linearmente ao longo e envolvem os filamentos de suporte tridimensional antes de começar a crescer nas aberturas do suporte.

[0102] Durante a incubação sob condições hipóxicas, em compa ração com a incubação em concentrações de oxigênio atmosféricas normais de aproximadamente 15 a 20%, milhares de genes são diferencialmente expressos. Foi encontrado que vários genes são regulados para cima ou regulados para baixo em tais composições, mais notavelmente ainda certas espécies de laminina, espécies de colágeno e fatores Wnt. Em vários aspectos, ECM tridimensional pode ser definida pela impressão digital característica ou pacote de produtos celulares produzidos pelas células devido ao crescimento em condição hipóxica em comparação com crescimento sob condições normais. Nas composições de ECM especificamente exemplificadas neste pedido, os tecidos tridimensionais e meios circundantes são caracterizados pela expressão e/ou secreção de vários fatores.

[0103] Os tecidos tridimensionais e composições descritos neste pedido têm ECM que está presente no suporte ou na estrutura. Em alguns aspectos, a ECM inclui vários tipos de laminina e colágeno devido ao crescimento sob condições hipóxicas e seleção de células cultivadas no suporte. As proporções de proteínas de ECM depositadas podem ser manipuladas ou aumentadas pela seleção de fibroblastos que elaboram o tipo de colágeno apropriado bem como crescimento das células sob condições hipóxicas nas quais a expressão de espécies de laminina e colágeno específicas é regulada para cima ou regulada para baixo.

[0104] Seleção de fibroblastos pode ser realizada em alguns as pectos usando anticorpos monoclonais de um isotipo ou subclasse apropriados que definem tipos particulares de colágeno. Em outros aspectos, substratos sólidos, tais como contas magnéticas, podem ser usados para selecionar ou eliminar células que se ligaram ao anticorpo. A combinação destes anticorpos pode ser usada para selecionar (positivamente ou negativamente) os fibroblastos que expressam o tipo de colágeno desejado. Alternativamente, o estroma usado para inocular a estrutura pode ser uma mistura de células que sintetizam tipos de colágeno desejados. A distribuição e origens do tipo exemplar do colágeno são mostradas na Tabela I.

[0105] Tabela 1. Distribuições e Origens de Vários Tipos de Colá-geno

[0106] Tipos adicionais do colágeno que podem estar presents nas composições de ECM são mostrados na Tabela 2.

[0107] Tabela 2. Tipos de Colágeno e Gene(s) Correspondente(s)

[0108] Como discutido acima, as composições de ECM descritas neste pedido incluem vários colágenos. Como mostrado na Tabela 3 do Exemplo 1, foi encontrado que a expressão de várias espécies do colágeno é regulada para cima em composições de ECM cultivadas hipóxicas. Consequentemente, em um aspecto da presente invenção, composição de ECM incluindo uma ou mais proteínas embrionárias, inclui a regulação para cima de espécies de colágeno em comparação com aquelas produzidas em condições de oxigênio de aproximadamente oxigênio 15 a 20%. Em outro aspecto, as espécies de colágeno reguladas para cima são tipo V alfa 1; IX alfa 1; IX alfa 2; VI alfa 2; VIII alfa 1; IV, alfa 5; VII alfa 1; XVIII alfa 1; e XII alfa 1.

[0109] Além de vários colágenos, a composição de ECM descrita neste pedido inclui várias lamininas. Lamininas são uma família de he- terotrímeros de glicoproteína compostas de uma subunidade de cadeia alfa, beta e gama agrupadas por um domínio super-hélice. Até o momento, cadeias de laminina 5 alfa, 4 beta e 3 gama foram identificadas que podem ser combinadas para formar 15 isoformas diferentes. Dentro desta estrutura estão domínios identificáveis que possuem a atividade de ligação em direção à outra laminina e moléculas de laminina basais, e receptores ligados à membrana. Os domínios VI, IVb e IVa formam estruturas globulares, e domínios V, IIIb e IIIa (que contêm elementos similares a EGF ricos em cisteína) formam estruturas similares a bastonete. Os domínios I e II das três cadeias participam na formação de uma estrutura de super-hélice de fita tripla (o braço longo).

[0110] Cadeias de laminina possuem funções compartilhadas e únicas e são expressas com modelos específicos temporais (de de-senvolvimento) e espaciais (tecido-sítio específico). As cadeias alfa de laminina são consideradas ser a porção funcionalmente importante dos heterotrímeros, como exibem modelos de distribuição tecido- específica e contêm os sítios de interação celular principais. É conhecido que o endotélio vascular expressa duas isoformas de laminina, com expressão variada dependendo do estágio de desenvolvimento, tipo de vaso e o estado de ativação do endotélio.

[0111] Consequentemente, em um aspecto da presente invenção, composição de ECM incluindo uma ou mais proteínas embrionárias, inclui regulação para cima ou regulação para baixo de várias espécies de laminina quando comparada com aquela produzida em condições de oxigênio de aproximadamente oxigênio 15 a 20%.

[0112] Laminina 8, é composto de cadeias alfa-4, beta-1 e gama-1 de laminina. A cadeia alfa-4 de laminina é largamente distribuída tanto em adultos como durante o desenvolvimento. Em adultos pode ser identificada na membrana basal que rodeia fibras do músculo cardía- co, esqueléticas e lisas, e no septo alveolar do pulmão. Também é conhecido que exista na membrana basal endotelial tanto em tubos capilares como em vasos maiores, e na membrana basal perineural de nervos periféricos, bem como em espaços intersinusoidais, grandes artérias, e arteríolas menores da medula óssea. Laminina 8 é uma isoforma de laminina principal no endotélio vascular que é expressa e aderida por plaquetas e é sintetizada em adipócitos 3T3-L1, com seu nível de síntese mostrado para aumentar a conversão adiposa das células. Pensa-se que laminina 8 é a isoforma de laminina geralmente expressa em linhagens celulares mesenquimais para induzir microva- sos em tecidos conectivos. Laminina 8 também foi identificada nas culturas celulares primárias de medula óssea de camundongo, paredes arteriolares, e espaços intersinusoidais onde é a isoforma de laminina principal na medula óssea em desenvolvimento. Devido à sua localização na medula óssea adulta adjacente a células hematopoiéticas, isoformas de laminina que contêm a cadeia alfa-4 provavelmente terão interações biologicamente relevantes com desenvolvimento de células hematopoiéticas.

[0113] Consequentemente, em outro aspecto da presente inven ção, a ECM inclui regulação para cima de espécies de laminina, tais como laminina 8. Em outro aspecto, lamininas produzidas por tecidos tridimensionais da presente invenção, incluem pelo menos laminina 8, que define uma característica ou assinatura das proteínas laminina presentes na composição.

[0114] As composições de ECM descritas neste pedido podem in cluir vários fatores Wnt. Os fatores da família Wnt estão sinalizando moléculas tendo papéis em uma miríade de vias celulares e processos de interação célula-célula. Sinalização de Wnt foi envolvida em tumori- gênese, modelação precoce mesodérmica do embrião, morfogênese do cérebro e rins, regulação da proliferação de glândula mamária, e doença de Alzheimer. Como mostrado na Tabela 4 do Exemplo 1, foi encontrado que expressão de várias espécies de proteínas Wnt é regulada para cima em composições de ECM cultivadas hipóxicas. Consequentemente, em um aspecto da presente invenção, composição de ECM incluindo uma ou mais proteínas embrionárias, inclui a regulação para cima de espécies Wnt quando comparada com aquelas produzidas em condições de oxigênio de aproximadamente oxigênio 15 a 20%. Em outro aspecto, as espécies Wnt reguladas para cima são wnt 7a e wnt 11. Em outro aspecto, fatores Wnt produzidos por tecidos tridimensionais da presente invenção, incluem pelo menos wnt7a e wnt11, que definem uma característica ou assinatura das proteínas Wnt presentes na composição.

[0115] Os métodos de cultura descritos neste pedido, incluindo cultura sob condições hipóxicas, também foram mostrados para expressão regulada para cima de vários fatores de crescimento. Consequentemente, as composições de ECM descritas neste pedido podem incluir vários fatores de crescimento, tais como um fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Como usado neste pedido, um VEGF destina-se a incluir todos os membros da família de VEGF conhecidos. VEGFs são uma subfamília de fatores de crescimento, mais especificamente do fator de crescimento derivado de plaqueta da família de fatores de crescimento de cistina-knot. VEGFs têm um papel bem- conhecido tanto em vasculogênese como em angiogênese. Vários VEGFs são conhecidos, incluindo VEGF-A, que era outrora conhecido como VEGF antes da descoberta de outras espécies de VEGF. Outras espécies VEGF incluem o fator de crescimento de placenta (PlGF), VEGF-B, VEGF-C e VEGF-D. Adicionalmente, várias isoformas de VEGF humano são bem-conhecidas.

[0116] Conforme a produção aumentada de proteínas Wnt bem como fatores de crescimento pela cultura sob condições hipóxicas co mo descrito neste pedido, a presente invenção fornece ainda um método de produção de uma proteína Wnt e um fator de crescimento en- dotelial vascular (VEGF). O método pode incluir células cultivadas sob condições hipóxicas como descrito neste pedido, em uma superfície em um meio de crescimento adequado, para produzir a proteína Wnt e o VEGF. Em um aspecto exemplar, as espécies Wnt são wnt 7a e wnt 11 e o VEGF é VEGF-A. As proteínas podem ser ainda processadas ou coletadas como descrito ainda neste pedido ou por métodos co-nhecidos na técnica.

[0117] Como discutido ao longo, as composições de ECM da pre sente invenção incluem tanto frações solúveis como não solúveis ou qualquer porção das mesmas. Deve ser entendido que as composições da presente invenção podem incluir uma ou ambas as frações, bem como qualquer combinação das mesmas. Adicionalmente, os componentes individuais podem ser isolados das frações a serem usadas individualmente ou em combinação com outros isolados ou composições conhecidas.

[0118] Consequentemente, em vários aspectos, composições de ECM produzidas usando os métodos da presente invenção podem ser usadas diretamente ou processadas de vários modos, os métodos os quais podem ser aplicáveis tanto às frações não solúveis como solúveis. A fração solúvel, incluindo o sobrenadante sem célula e meios, pode ser submetida à liofilização para conservar e/ou concentrar os fatores. Vários conservantes biocompatíveis, crioprotetores e agentes estabilizantes podem ser usados para conservar a atividade onde necessária. Exemplos de agentes biocompatíveis incluem, entre outros, glicerol, dimetil sulfóxido e trehalose. O liofilizado também pode ter um ou mais excipientes, tais como tampões, agentes de volume e modificadores de tonicidade. Os meios liofilizados podem ser reconstituídos pela adição de uma solução adequada ou diluente farmacêutico, como ainda descrito abaixo.

[0119] Em outros aspectos, a fração solúvel é dialisada. A diálise é uma das técnicas ainda mais comumente usadas para separar componentes de amostra baseados na difusão seletiva através de uma membrana porosa. O tamanho de poro determina o corte de peso molecular (MWCO) da membrana que é caracterizada pelo peso molecular no qual 90% do soluto são conservados pela membrana. Em certos aspectos membranas com qualquer tamanho de poro são contempladas dependendo do corte desejado. Cortes típicos são 5.000 Daltons, 10.000 Daltons, 30.000 Daltons e 100.000 Daltons, entretanto todos os tamanhos são contemplados.

[0120] Em alguns aspectos, a fração solúvel pode ser processada pela precipitação dos componentes ativos (por exemplo, fatores de crescimento) nos meios. Precipitação pode usar vários procedimentos, tais como salinização com sulfato de amônio ou uso de polímeros hi- drofílicos, por exemplo, polietilenoglicol.

[0121] Em outros aspectos, a fração solúvel é sujeita à filtração usando vários filtros seletivos. Processamento da fração solúvel por filtração é útil na concentração de fatores presentes na fração e também remoção de pequenas moléculas e solutos usados na fração solúvel. Os filtros com seletividade de pesos moleculares especificados incluem <5000 Daltons, <10.000 Daltons e <15.000 Daltons. Outros filtros podem ser usados e os meios processados analisados para atividade terapêutica como descrito neste pedido. Filtros exemplares e sistema concentrador incluem aqueles baseados em, entre outros, filtros de fibra oca, discos de filtragem e sondas de filtragem (ver, por exemplo, Amicom Stirred Ultrafitration Cells).

[0122] Ainda em outros aspectos, a fração solúvel é submetida à cromatografia para remover sais, impurezas, ou fracionar vários componentes do meio. Várias técnicas cromatográficas podem ser empre- gadas, tais como técnicas cromatográficas de peneira molecular, troca iônica, fase reversa, e por afinidade. Para processar o meio condicionado sem perda significante de bioatividade, meios cromatográficos brandos podem ser usados. Exemplos não limitantes incluem, entre outros, meios de separação baseados em dextrana, agarose, poliacri- lamida (por exemplo, disponível sob várias marcas, tais como Sephadex, Sepharose e Sephacryl).

[0123] Ainda em outros aspectos, os meios condicionados são formulados como lipossomas. Os fatores de crescimento podem ser introduzidos ou encapsulados no lúmen de lipossomas para entrega e para estender o tempo de vida dos fatores ativos. Como conhecido na técnica, lipossomas podem ser categorizados em vários tipos: vesículas multilamelares (MLV), plurilamelares estáveis (SPLV), pequenas unilamelares (SUV) ou grandes unilamelares (LUV). Os lipossomas podem ser preparados a partir de vários compostos lipídicos, que podem ser sintéticos ou de ocorrência natural, incluindo éteres e ésteres fosfatidil, tais como fosfatidilserina, fosfatidilcolina, fosfatidil etanolami- na, fosfatidilinositol, dimiristoilfosfatidilcolina; esteroides, tais como colesterol; cerebrosídeos; esfingomielina; glicerolipídeos; e outros lipídios (ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.833.948).

[0124] A fração solúvel pode ser usada diretamente sem aditivos adicionais, ou preparada como composições farmacêuticas com vários excipientes, veículos ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Uma "composição farmacêutica" refere-se a uma forma das frações solúveis e/ou não solúveis e pelo menos um veículo, carreador, ou ex- cipiente farmaceuticamente aceitável. Para administração intradérmi- ca, subcutânea ou intramuscular, as composições podem ser preparadas em suspensão, soluções ou emulsões estéreis das composições de ECM em veículos aquosos ou oleosos. As composições também podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspen- são, estabilização ou dispersão. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, ampolas em recipientes multidose, com ou sem conservantes. Alternativamente, as composições podem ser apresentadas em forma de pó para reconstituição com um veículo adequado incluindo, por meio de exemplo e não limitação, água estéril livre de pirógeno,solução salina, tampão, ou solução de dextrose.

[0125] Em outros aspectos, tecidos tridimensionais são prepara ções criopreservadas, que são descongeladas antes do uso. Criopre- servativos farmaceuticamente aceitáveis incluem, entre outros, glice- rol, sacarídeos, polióis, metilcelulose e dimetil sulfóxido. Agentes saca- rídicos incluem monossacarídeos, dissacarídeos e outros oligossaca- rídeos com temperatura de transição vítrea da solução maximamente concentrada congelada (Tg) que é pelo menos -60, -50, -40, -30, -20,-10 ou 0°C. Um sacarídeo exemplar para uso em criopreservação é trehalose.

[0126] Em alguns aspectos, tecidos tridimensionais são tratados para matar as células antes do uso. Em alguns aspectos, a ECM depositada nos suportes pode ser coletada e processada para administração (ver Patentes U.S. Nos. 5.830.708 e 6.280.284, incorporadas neste pedido por referência).

[0127] Em outras modalidades, tecido tridimensional pode ser concentrado e lavado com um meio farmaceuticamente aceitável para administração. Várias técnicas para concentrar as composições estão disponíveis na técnica, tais como centrifugação ou filtração. Exemplos incluem, sedimentação de dextrana e centrifugação diferencial. A formulação de tecidos tridimensionais também pode envolver o ajuste da força iônica da suspensão à isotonicidade (isto é, aproximadamente 0,1 a 0,2) e ao pH fisiológico (isto é, pH 6,8 a 7,5). A formulação também pode conter lubrificantes ou outros excipientes para ajudar na administração ou estabilidade da suspensão celular. Estes incluem, entre outros, sacarídeos (por exemplo, maltose) e polímeros orgânicos, tais como polietilenoglicol e ácido hialurônico. Detalhes adicionais para preparação de várias formulações são descritos na Publicação da Patente U.S. No. 2002/0038152, incorporada neste pedido por referência.

[0128] Como discutido acima, as composições de ECM da presen te invenção podem ser processadas de diversos modos dependendo da aplicação esperada e entrega apropriada ou administração da composição de ECM. Por exemplo, as composições podem ser entregues como suportes ou implantes, ou as composições podem ser formuladas para injeção como descrito acima. Os termos "administração" ou "administrando" são definidos para incluir um ato de fornecimento de um composto ou composição farmacêutica da invenção a um indivíduo em necessidade de tratamento. As frases "administração parenteral" e "administrado parenteralmente" como usado neste pedido significa meios da administração além de administração entérica e tópica, normalmente por injeção, e incluem, sem restrição, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, sub-cutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intra- espinhal e intraesternal. As frases "administração sistêmica", "administrado sistemicamente", "administração periférica" e "administrado peri- fericamente" como usadas neste pedido significa administração de um composto, fármaco ou outro material além de diretamente no sistema nervoso central, tal que se introduza no sistema do indivíduo e, dessa forma, seja submetido ao metabolismo e outros processos similares, por exemplo, administração subcutânea.

[0129] O termo "indivíduo" como usado neste pedido refere-se a qualquer indivíduo ou paciente ao qual os métodos do contexto são realizados. Geralmente o indivíduo é ser humano, embora como será apreciado por aqueles na técnica, o indivíduo pode ser um animal. Dessa forma outros animais, incluindo mamíferos, tais como roedores (incluindo camundongos, ratos, hamsters e porquinhos-da-Índia), gatos, cães, coelhos, animais de produção incluindo vacas, cavalos, cabras, ovelhas, porcos, etc., e primatas (incluindo macacos, chimpanzés, orangotangos e gorilas) estão incluídos dentro da definição de indivíduo.

[0130] As composições de ECM da presente invenção têm uma variedade de aplicações incluindo, mas não limitadas a, promoção de reparo e/ou regeneração de células ou tecidos danificados, uso em adesivos para promover a regeneração de tecido, uso em sistemas de cultura tecidual para cultura de células, tais como células-tronco, uso em revestimentos superficiais usados em associação com dispositivos implantáveis (por exemplo, marcapassos, stents, enxertos de stent, próteses vasculares, válvulas cardíacas, derivações, portas ou catete- res de entrega de fármaco), promoção de reparo de tecido mole, aumento, e/ou melhora de uma superfície cutânea, tais como rugas, uso como um agente antiadesão biológico ou como um veículo biológico para entrega celular ou manutenção em um sítio da entrega.

[0131] Adicionalmente, as composições de ECM derivadas de cul tura de células como descrito em qualquer método neste pedido, podem ser usadas em qualquer outra aplicação ou método da presente invenção. Por exemplo, as composições de ECM geradas pela cultura de células usando o sistema de cultura tecidual da presente invenção podem ser usadas, por exemplo, no reparo e/ou regeneração de células, uso em adesivos para promover regeneração tecidual, uso em sistemas de cultura tecidual para cultura de células, tais como células- tronco, uso em revestimentos superficiais usados em associação com dispositivos implantáveis (por exemplo, marcapassos, stents, enxertos de stent, próteses vasculares, válvulas cardíacas, derivações, portas ou cateteres de entrega de fármaco), promoção de reparo de tecido mole, aumento, e/ou melhora de uma superfície cutânea, tais como rugas, uso como um agente antiadesão biológico ou como um veículo biológico para entrega celular ou manutenção em um sítio da entrega.

[0132] Em várias modalidades, a presente invenção inclui métodos de reparo e/ou regeneração de células ou tecido e promoção de reparo de tecido mole. Uma modalidade inclui um método de reparo e/ou regeneração de células contatando com células a serem consertadas ou regeneradas com as composições de ECM da presente invenção. O método pode ser usado para reparo e/ou regeneração da variedade de células como discutido neste pedido, incluindo células osteocon- drais.

[0133] Em um aspecto, o método contempla o reparo de defeitos osteocondrais. Como usado neste pedido, "células osteocondrais" referem-se a células que pertencem à linhagem condrogênica ou osteo- gênica ou que podem sofrer diferenciação na linhagem condrogênica ou osteogênica, dependendo dos sinais ambientais. Este potencial pode ser testado in vitro ou in vivo por técnicas conhecidas. Dessa forma, em um aspecto, as composições de ECM da presente invenção são usadas para reparar e/ou regenerar, células condrogênicas, por exemplo, células que são capazes de produzir cartilagem ou células que elas mesmas se diferenciam em células produtoras de cartilagem, incluindo condrócitos e células que elas mesmas se diferenciam em condrócitos (por exemplo, células precursoras de condrócito). Dessa forma, em outro aspecto, as composições da presente invenção são úteis em reparo e/ou regeneração do tecido conectivo. Como usado neste pedido, "tecido conectivo" se refere a alguns de diversos tecidos estruturais no corpo de um mamífero incluindo mas não limitado a osso, cartilagem, ligamento, tendão, menisco, derme, hiperderme, mús- culo, tecido gorduroso, cápsula articular.

[0134] As composições de ECM da presente invenção podem ser usadas para tratar defeitos osteocondrais de uma articulação diartroi- dial, tais como joelho, um tornozelo, um cotovelo, um quadril, um pulso, uma articulação de um dedo da mão ou dedo do pé ou uma articulação temporomandibular. Tais defeitos osteocondrais podem ser o resultado de dano traumático (por exemplo, um dano por esportes ou uso excessivo) ou uma doença, tal como osteoartrite. Um aspecto particular relaciona-se ao uso da matriz da presente invenção no tratamento ou prevenção de lesões superficiais da cartilagem osteoartrítica. Adicionalmente a presente invenção é para uso no tratamento ou prevenção de defeitos osteocondrais que resultam do envelhecimento ou do parto. Também deve ser entendido que defeitos osteocondrais no contexto da presente invenção compreendem aquelas condições onde o reparo de cartilagem e/ou osso é necessário no contexto da cirurgia tal como, mas não limitado a, cirurgia cosmética (por exemplo, nariz, orelha). Dessa forma tais defeitos podem ocorrer em qualquer lugar no corpo onde a formação de osso ou cartilagem é interrompida ou onde a cartilagem ou osso são danificados ou não existentes devido a um defeito genético.

[0135] Como discutido acima, os fatores de crescimento ou outros agentes biológicos que induzem ou estimulam o crescimento de células particulares podem estar incluídos nas composições de ECM da presente invenção. O tipo de fatores de crescimento será dependente do tipo celular e aplicação para a qual a composição é destinada. Por exemplo, em caso de células osteocondrais, agentes bioativos adicionais podem estar presentes, tais como fatores de crescimento celular (por exemplo, TGF-β), substâncias que estimulam condrogênese (por exemplo, BMPs que estimulam a formação de cartilagem, tais como BMP-2, BMP-12 e BMP-13), fatores que estimulam a migração de cé- lulas estromais ao suporte, fatores que estimulam deposição na matriz, anti-inflamatórios (por exemplo, anti-inflamatórios não esteroidais), imunossupressores (por exemplo, ciclosporinas). Outras proteínas também podem estar incluídas, tais como outros fatores de crescimento, tais como fatores de crescimento derivados de plaqueta (PDGF), fatores de crescimento similares à insulina (IGF), fatores de crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento celular endotelial humano (ECGF), fator estimulante de colônia de granulócito macrófago (GM-CSF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), proteína morfogenética derivada de cartilagem (CDMP), outras proteínas morfogenéticas ósseas, tais como OP-1, OP-2, BMP3, BMP4, BMP9, BMP11, BMP14, DPP, Vg-1, 60A e Vgr-1, colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares, glicoproteí- nas ou glicoaminoglicanos, tais como sulfato de heparina, condroitina- 4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de dermatana, sulfato de quera- tina, etc. Por exemplo, foi encontrado que fatores de crescimento, tais como TGF-β, com ascorbato, provocam a diferenciação de condrócito e formação de cartilagem por condrócitos. Além disso, o ácido hialurô- nico é um bom substrato para ligação de condrócitos e outras células estromais e pode ser incorporado como parte do suporte ou recoberto no suporte.

[0136] Adicionalmente, outros fatores que influenciam no cresci mento e/ou atividade de células particulares também podem ser usados. Por exemplo, no caso de condrócitos, um fator, tal como uma condroitinase que estimula a produção de cartilagem por condrócitos pode ser adicionado à matriz a fim de manter os condrócitos em um estado hipertrófico como descrito no Pedido de Patente U.S. No. 2002/0122790 incorporado neste pedido por referência. Em outro aspecto, os métodos da presente invenção incluem a presença de algi- natos polissulfatados ou outro polissacarídeo polissulfatado, tal como ciclodextrina polissulfatada e/ou inulina polissulfatada, ou outros componentes capazes de estimular produção da ECM de células de tecido conectivo como descrito na Publicação de Patente Internacional No. WO 2005/054446 incorporada neste pedido por referência.

[0137] A célula ou tecido a serem reparados e/ou regenerados po dem ser contatados in vivo ou in vitro por qualquer um dos métodos descritos neste pedido. Por exemplo, as composições de ECM podem ser injetadas ou implantadas (por exemplo, através de tecido de ECM, um adesivo ou dispositivo recoberto com a presente invenção) no indivíduo. Em outro aspecto, o tecido ou células a serem reparados e/ou regenerados podem ser coletados do indivíduo in vitro e cultivados e posteriormente implantados ou administrados ao indivíduo usando técnicas cirúrgicas conhecidas.

[0138] Como discutido acima, as composições de ECM da presen te invenção podem ser processadas em uma variedade de maneiras. Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção inclui um sistema de cultura tecidual. Em vários aspectos, o sistema de cultura é composto das composições de ECM descritas neste pedido. As composições de ECM da presente invenção podem ser incorporadas no sistema de cultura tecidual em uma variedade de maneiras. Por exemplo, composições podem ser incorporadas como revestimentos, pela impregnação de materiais de suporte como descrito neste pedido, ou como aditivos a meios para cultura de células. Consequentemente, em um aspecto, o sistema de cultura pode incluir materiais de suporte tridimensionais impregnados por qualquer uma das composições de ECM descritas neste pedido, tais como fatores de crescimento ou proteínas embrionárias.

[0139] As composições de ECM descritas neste pedido podem servir de um suporte ou suporte tridimensional para o crescimento de vários tipos celulares. Qualquer tipo celular capaz de cultura celular é contemplado. Em um aspecto, o sistema de cultura pode ser usado para suportar o crescimento de células-tronco. Em outro aspecto, as células-tronco são células-tronco embrionárias, células-tronco mesen- quimais ou células-tronco neuronais.

[0140] O sistema de cultura tecidual pode ser usado para gerar composições de ECM adicionais, tais como tecido implantável. Conse-quentemente, cultura de células usando o sistema de cultura tecidual da presente invenção pode ser realizado in vivo ou in vitro. Por exemplo, o sistema de cultura tecidual da presente invenção pode ser usado para geração de composições de ECM para injeção ou implante em um indivíduo. As composições de ECM geradas pelo sistema de cultura tecidual podem ser processadas e usadas em qualquer método descrito neste pedido.

[0141] As composições de ECM da presente invenção podem ser usadas como um veículo biológico para entrega celular. Como descrito neste pedido, as composições de ECM podem incluir tanto frações solúveis como não solúveis. Como tal, em outra modalidade da presente invenção, um veículo biológico para entrega celular ou manutenção em um sítio de entrega incluindo as composições de ECM da presente invenção, é descrito. As composições de ECM da presente invenção, incluindo células e composições de tecido tridimensionais, podem ser usadas para promover e/ou suportar o crescimento de células in vivo. O veículo pode ser usado em qualquer aplicação apropriada, por exemplo, para suportar injeções de células, tais como células-tronco, no músculo cardíaco danificado ou para reparo de tendão e ligamento como descrito acima.

[0142] Composições celulares apropriadas (por exemplo, células de ECM isoladas da presente invenção e/ou agentes biológicos adicionais) podem ser administradas antes, após ou durante as composições de ECM serem implantadas ou administradas. Por exemplo, as células podem ser semeadas no sítio de administração, defeito e/ou implante antes do sistema de cultura ou veículo de entrega biológico ser implantado no indivíduo. Alternativamente, as composições celulares apropriadas podem ser administradas após (por exemplo, por injeção no sítio). As células atuam neste para induzir a regeneração de tecido e/ou reparo celular. As células podem ser semeadas por qualquer meio que permita a administração das células ao sítio de defeito, por exemplo, por injeção. Injeção das células pode ser por qualquer meio que mantenha a viabilidade das células, tal como, por seringa ou artroscópio.

[0143] Composições de ECM foram descritas para promover a an- giogênese em órgãos e tecidos pela administração de tais composições para promover endotelialização e vascularização no coração e tecidos relacionados. Consequentemente, ainda em outra modalidade, a presente invenção inclui um revestimento superficial usado em associação com implante de um dispositivo em um indivíduo incluindo as composições de ECM descritas neste pedido. O revestimento pode ser aplicado a qualquer dispositivo usado em implante ou penetração de um artigo, tal como um marcapasso, um stent, um enxerto de stent, uma prótese vascular, uma válvula cardíaca, uma derivação, um porto de entrega de fármaco ou um cateter. Em certos aspectos, o revestimento pode ser usado para modificar cicatrização de ferida, modificação de inflamação, modificação de uma formação de cápsula fibrosa, modificação de crescimento tecidual ou modificação de crescimento celular. Em outra modalidade, a presente invenção inclui um para tratamento de tecido danificado, tal como cardíaco, intestinal, tecido infar- tado ou isquêmico. São apresentados abaixo exemplos discutindo geração de composições de ECM contempladas para tais aplicações. A preparação e uso de composições de ECM cultivadas sob condições de oxigênio normais são descritos em Pedido de Patente U.S. No. 2004/0219134 incorporado neste pedido por referência.

[0144] Em outra modalidade, a presente invenção inclui vários dis positivos implantáveis e adesivos de regeneração de tecido incluindo as composições de ECM descritas neste pedido que permitem benefícios, tais como crescimento tecidual. Como discutido neste pedido, as composições de ECM podem servir como revestimentos em dispositivos médicos, tais como adesivos ou outros dispositivos implantáveis. Em vários aspectos, tais dispositivos são úteis para reparo de ferida, reparo de hérnia, reparo de assoalho pélvico (por exemplo, prolapso de órgão pélvico), reparo de manguito rotador e similares. Em aspectos relacionados, revestimentos são úteis para implantes ortopédicos, implantes cardiovasculares, imobilizadores urinários e imobilizadores de marcapasso.

[0145] Por exemplo, a manifestação básica de uma hérnia é uma protrusão dos conteúdos abdominais em um defeito dentro da fáscia. Abordagens cirúrgicas em direção ao reparo de hérnia são concentradas na redução dos conteúdos herniais na cavidade peritoneal e produção de um fechamento firme do defeito fascial usando materiais pro- téticos, alogeneicos ou autógenos. Diversas técnicas foram usadas para produzir este fechamento, entretanto, desvantagens para produtos e procedimentos correntes incluem recidiva de hérnia, onde o fechamento se enfraquece novamente, permitindo os conteúdos abdominais retornarem à deficiência. Em herniorrafias, um adesivo de regeneração de tecido corretivo, tal como uma rede biorreabsorvível ou sintética recoberta com composições de ECM pode ser usado.

[0146] Uma variedade de técnicas é conhecida na técnica por apli car revestimentos biológicos para superfícies de dispositivos médicos que podem ser utilizadas com a presente invenção. Por exemplo, as composições de ECM podem ser recobertas usando interligadores fo- toativos permitindo ligação covalente permanente a superfícies de dis- positivos na ativação do interligador pela aplicação de radiação ultravioleta. Um interligador exemplar é o interligador TriLiteTM, que foi mostrado ser não citotóxico, não irritando o tecido biológico e não sensibili- zante. Materiais de ECM podem ser não separados ou separados em componentes individuais, tais como colágenos humanos, ácido hialu- rônico (HA), fibronectina e similares antes de revestimento ou incorporação em vários dispositivos implantáveis. Além disso, fatores de crescimento adicionais e tais podem ser incorporados para permitir características de implante benéficas, tais como infiltração celular melhorada.

[0147] Em várias modalidades relacionadas, a presente invenção fornece métodos e dispositivos aplicáveis em aplicações cosméti- cas/cosmecêuticas, tais como, mas não limitadas a antienvelhecimen- to, antirruga, enchimentos de pele, cremes hidratantes, aumento de pigmentação, firmador de pele e similares. Consequentemente, em uma modalidade, a presente invenção inclui um método de melhora de uma superfície cutânea em um indivíduo incluindo administração ao indivíduo no sítio de uma ruga, das composições de ECM descritas neste pedido. Em uma modalidade relacionada, a presente invenção inclui um método de reparo ou aumento de tecido mole em um indivíduo incluindo administração ao indivíduo no sítio de uma ruga, das composições de ECM descritas neste pedido. Em várias aplicações cosméticas, as composições podem ser formuladas como apropriado, tais como formulações injetáveis e tópicas. Como discutido ainda nos Exemplos incluídos neste pedido, foi mostrado que composições de ECM formuladas como tópicas são eficazes em várias aplicações estéticas cutâneas, tais como aplicações antirruga, antienvelhecimento bem como um suplemento para cirurgia ablativa a laser. Várias características benéficas da ECM contendo tópicos foram mostradas. Tais benefícios incluem 1) facilitação da reepitelização após recomposição de superfície; 2) redução de sintomas de recomposição de superfície por laser fracionado não ablativo e ablativo (por exemplo, eritema, edema, crosta e desconforto sensorial); 3) geração de pele lisa, até texturizada; 4) geração de hidratação cutânea; 5) redução de aparência de linhas finas/rugas; 6) aumento da firmeza e flexibilidade cutâneas; 7) redução de despigmentação cutânea; e 8) redução de pele avermelhada, manchada.

[0148] As composições da presente invenção podem ser prepara das como conhecido na técnica, entretanto empregando os métodos de cultura inovadores descritos neste pedido (por exemplo, cultura sob condições hipóxicas). A preparação e uso de composições de ECM criadas sob condições de cultura de oxigênio normais para o reparo e/ou regeneração celular, melhora de superfícies cutâneas, e reparo de tecido mole são descritos na Patente U.S. No. 5.830.708, Patente U.S. No. 6.284.284, Pedido de Patente U.S. No. 2002/0019339 e Pedido de Patente U.S. No. 2002/0038152 incorporados neste pedido por referência.

[0149] Em outra modalidade, a presente invenção inclui um agente antiadesão biológico incluindo as composições de ECM descritas neste pedido. O agente pode ser usado em tais aplicações como adesivos antiadesão usados após criação de anastomoses intestinais ou de vaso sanguíneo.

[0150] As composições ou componentes ativos usados neste pe dido, serão geralmente usados em uma quantidade eficaz para tratar ou prevenir a doença particular que é tratada. As composições podem ser administradas terapeuticamente para alcançar o benefício terapêutico ou alcançar profilaticamente o benefício profilático. Por benefício terapêutico entende-se a erradicação ou melhora da condição ou distúrbio subjacente que é tratado. Benefício terapêutico também inclui suspensão ou redução de velocidade da progressão da doença, mes- mo que a melhora seja concretizada.

[0151] A quantidade da composição administrada dependerá de uma variedade de fatores, incluindo, por exemplo, o tipo de composição, a indicação particular que é tratada, o modo de administração, se o benefício desejado é profilático ou terapêutico, a severidade da indicação que é tratada e a idade e peso do paciente, e eficácia da forma de dosagem. A determinação de uma dosagem eficaz está bem dentro das capacidades dos versados na técnica.

[0152] Dosagens iniciais podem ser estimadas inicialmente a partirde ensaios in vitro. Dosagens iniciais também podem ser estimadas de dados in vivo, tais como modelos animais. Modelos animais úteis para testar a eficácia de composições para aumentar o crescimento capilar incluem, entre outros, roedores, primatas e outros mamíferos. Os versados podem determinar dosagens adequadas para administração humana pela extrapolação de dados animais e in vitro.

[0153] As quantidades de dosagem dependerão, entre outros fato res, da atividade dos meios condicionados, do modo de administração, da condição que é tratada e vários fatores discutidos acima. Quantidade de dosagem e intervalo podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis suficientes para manter o efeito terapêutico ou profilático.

[0154] São apresentados abaixo exemplos discutindo geração de composições de ECM contempladas para as aplicações discutidas. Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar ainda as modalidades da presente invenção, mas não são destinados para limitar o escopo da invenção. Enquanto são típicos para aqueles que poderiam ser usados, outros procedimentos, metodologias ou técnicas conhecidas aos versados na técnica podem ser alternativamente usadas.

EXEMPLO 1 EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM COMPOSIÇÕES DE ECM CULTIVADAS SOB CONDIÇÕES HIPÓXICAS

[0155] Fibroblastos de prepúcio neonatal humano primários foram cultivados como monocamadas padrão em frascos de cultura tecidual e em comparação com culturas de fibroblasto tridimensionais, dentro de uma ECM similar à fetal naturalmente depositada. As culturas foram cultivadas como revelado neste pedido. Para avaliar a expressão diferencial de genes, amostras de RNA total foram concluídas usando Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays® para expressão gênica global (incluindo menos de 40.000 genes) seguindo o protocolo do fabricante.

[0156] Em comparação, foi encontrado que fibroblastos regulavam colágeno e expressão gênica de ECM em culturas tridimensionais dentro de uma ECM cultivada hipóxica naturalmente secretada. Regulação para cima e regulação para baixo de expressão de vários colágenos e genes de ECM são evidentes na Tabela 3.

[0157] Tabela 3. Colágeno Diferencial e Expressão de ECM em Culturas de Fibroblasto Tridimensionais Hipóxicas

[0158] Em comparação, foi encontrado que fibroblastos regulavam a expressão gênica de genes da via Wnt em culturas tridimensionais dentro de uma ECM cultivada hipóxica naturalmente secretada. Regulação para cima e regulação para baixo de expressão de vários genes da via Wnt são evidentes na Tabela 4.

[0159] Tabela 4. Expressão Diferencial de Wnt em Culturas de Fi- broblasto Tridimensionais Hipóxicas

[0160] Em comparação, foi encontrado que fibroblastos regulavam a expressão gênica de genes da via da proteína óssea morfogenética (BMP) em culturas tridimensionais dentro de uma ECM cultivada hipó- xica naturalmente secretada. Regulação para cima e regulação para baixo de expressão de vários genes da via BMP são evidentes na Tabela 5.

[0161] Tabela 5. Expressão de BMP diferencial em Culturas de Fibroblasto Tridimensionais Hipóxicas

[0162] Em comparação, foi encontrado que fibroblastos regulavam a expressão de genes adicionais em culturas tridimensionais dentro da ECM cultivada hipóxica naturalmente secretada. Regulação para cima e regulação para baixo da expressão de genes adicionais são evidentes na Tabela 6.

[0163] Tabela 6. Modificações de Expressão Gênica Adicionais Resultantes a partir de Cultura de Baixo Oxigênio de ECM de Fi- broblasto In Vivo.

EXEMPLO 2 PRODUÇÃO DE ECM HIPÓXICA USANDO FIBROBLASTOS DE PREPÚCIO NEONATAL HUMANO PRIMÁRIOS

[0164] Dois exemplos são fornecidos para cultura hipóxica de ECM usando fibroblastos de prepúcio neonatal humano primários.

[0165] Fibroblastos de prepúcio neonatal humano primários foram expandidos em frascos de cultura tecidual na presença de soro fetal bovino 10%, DMEM de alta Glicose 90% com L-glutamina 2 mM (SFB 10%/DMEM). Células foram subcultivadas usando tripsina 0,05%/solução de EDTA até a 3a passagem no momento em que fo- ram semeadas em contas de dextrana Cytodex-1 a 0,04 mg de contas secas/ml de meio (5e6 células/10mg de contas em um frasco giratório de 125 ml enchido com 100 a 120 ml), ou em rede de náilon (25e6 cé- lulas/6 x 100cm2 de náilon). Todas as culturas foram mantidas em atmosfera normal e CO2 5% para expansão e semeadura, ponto o qual as culturas de baixo oxigênio foram repartidas em uma câmara hermética que foi inundada com nitrogênio 95%/CO2 5% para que um ambiente hipóxico possa ser criado dentro do meio de cultura. Este sistema mantém o oxigênio aproximadamente 1 a 5% dentro do vaso de cultura. Células foram bem misturadas no volume mínimo necessário para recobrir náilon ou contas para semeadura, e foram posteriormente misturadas uma vez após 30 minutos, então deixadas incubar-se durante a noite em uma incubadora umidificada a 37°C. Culturas foram alimentadas com SFB 10%/DMEM por 2 a 4 semanas com uma troca de meios de 50 a 70%, a cada 2 a 3 dias enquanto as células proliferaram e então começaram a se depositar a ECM. Culturas foram alimentadas durante outras 4 a 6 semanas usando soro de bezerro bovino 10% com suplemento de ferro, e ácido ascórbico 20 ug/ml no lugar de FBS. Frascos giratórios foram misturados em 15 a 25 rpm inicialmente e durante aproximadamente 2 a 4 semanas, momento em que foram aumentados a 45 rpm e mantidos nesta taxa após isso. Culturas de conta formaram grandes estruturas amorfas contendo ECM tanto quanto 0,5 a 1,0 cm em largura e diâmetro após 4 semanas, e estas culturas foram, por isso, hipóxicas devido à difusão de gás e altos requerimentos metabólicos.

[0166] Em um exemplo adicional, fibroblastos de prepúcio neonatal humano primários foram expandidos em frascos monocamada, e então cultivados em suportes de rede de náilon para suportar o desenvolvimento de uma ECM in vitro. Os fibroblastos foram expandidos em DMEM com alta glicose, L-glutamina 2 mM e soro fetal bovino 10% (v/v). As culturas também foram suplementadas com ácido ascórbico 20 μg/ml. Após 3 semanas em oxigênio ambiente (aproximadamente oxigênio 16% a 20%), culturas duplicadas contendo ECM foram trocadas para condições de cultura hipóxica (oxigênio 1% a 5%) em uma câmara selada com fluxo amplo de dióxido de carbono 5%/nitrogênio 95% (Cat.#MC-101, Billups-Rothenberg, Inc, Del Mar, CA). Para assegurar a depleção de oxigênio atmosférico do meio de cultura, 2 a 3 horas após, a atmosfera foi substituída para assegurar que o meio continha aproximadamente oxigênio 1 a 3%. Ambos os conjuntos de culturas contendo ECM foram cultivados com alimentação duas vezes por semana por outras 4 semanas, e então as culturas foram preparadas para isolamento de RNA. RNA celular total foi isolado usando um kit comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante (Cat.# Z3100, Promega, Inc). Amostras de RNA purificadas foram armazenadas a -80°C, antes do processamento para análise de microar- ranjo de expressão gênica usando Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays®.

[0167] Na análise dos resultados, houve aproximadamente 5.500 transcritos diferencialmente expressos detectados a partir de sondas preparadas de sondas de culturas de oxigênio ambiente em comparação com baixo oxigênio, usando Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays®. Destes, aproximadamente a metade (2.500) foi aumentada mais que 2,0 vezes por baixo oxigênio, e aproximadamente a metade (2.500) foi reduzida mais que 2,0 vezes em baixo oxigênio. Isto indica que baixo oxigênio levou a modificações significantes na expressão gênica in vitro. De particular interesse, transcritos de proteínas de ECM, particularmente diversos genes de colágeno foram regulados para cima, enquanto diversos genes para enzimas degradantes de matriz foram regulados para baixo.

EXEMPLO 3 MATRIZ EXTRACELULAR EMBRIONÁRIA HUMANA TECIDO- PROJETADA PARA APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS

[0168] A ECM embrionária cria um ambiente propício à proliferação celular rápida e cicatrização sem formação de cicatrizes ou adesões. Foi hipotetizado que o crescimento de fibroblastos neonatais humanos em 3 dimensões sob condições que simulam o primeiro ambiente embrionário antes da angiogênese (hipoxia e forças gravitacio- nais reduzidas) geraria uma ECM com propriedades fetais. Análise de arranjo de chip do gene mostrou a expressão diferencial de mais de 5000 genes sob condições hipóxicas contra cultura tecidual tradicional. A ECM produzida foi similar ao tecido mesenquimal fetal em que é relativamente rico nos colágenos tipos III, IV, e V, e glicoproteínas, tais como fibronectina, SPARC, trombospondina e ácido hialurônico. Uma vez que a ECM também desempenha um papel regulador importante na ligação e apresentação de fatores de crescimento em nichos putativos que suportam populações de célula-tronco regenerativas com fato-res de crescimento-chave, foram avaliados os efeitos da hipoxia de acordo com a expressão de fator de crescimento durante o desenvolvimento da ECM similar à fetal na cultura. Hipoxia também pode aumentar a expressão de fatores que regulam cicatrização de ferida e organogênese, tal como VEGF, FGF-7, e TGF-β, bem como múltiplos Wnts incluindo Wnts 2b, 4, 7a, 10a e 11. A ECM humana embrionária também estimulou um aumento da atividade metabólica em fibroblas- tos humanos in vitro, como medido pela atividade enzimática aumentada usando o ensaio de MTT. Adicionalmente, foi dectado um aumento no número de células em resposta à ECM humana. Esta ECM hu-mana pode ser usada como um revestimento superficial biológico, e tratamento de carga tecidual em várias aplicações terapêuticas onde novo crescimento tecidual e cicatrização sem cicatriz ou adesões.

EXEMPLO 4 PRODUÇÃO DE ATIVIDADE WNT SOLÚVEL NATURALMENTE PARA APLICAÇÕES MÉDICAS REGENERATIVAS

[0169] Células-tronco ou progenitoras que podem regenerar teci dos adultos, tais como pele ou sangue, resumem o desenvolvimento embrionário até certo ponto para realizar esta regeneração. Um número crescente de estudos mostrou que os reguladores-chave de célula- tronco pluripotente e diferenciação específica para linhagem ativa durante embriogênese são re-expressos no adulto sob certas circunstâncias. A família WNT de fatores de crescimento e desenvolvimento mor- fogenéticos secretados está entre os fatores de crescimento que podem fornecer potencialmente ferramentas de pesquisa valiosas e consequentemente tratamentos terapêuticos na clínica. Entretanto, Wnt’s têm provado serem refratários à expressão recombinante padrão e técnicas de purificação até agora em uma escala comercial, e não há relatório da produção de proteína WNT em larga escala para permitir o desenvolvimento clínico de produtos baseados em WNT. Técnicas foram desenvolvidas para crescimento de ECM similar à fetal em cultura usando fibroblastos dérmicos humanos neonatais em vários suportes na cultura para gerar equivalentes do tecido tridimensional. Neste processo, foi descoberto que estas culturas podem fornecer uma fonte em escala comercial de WNT’s bioativos contidos no meio condicionado sem soro usado para produção de ECM. Aqui são apresentados dados sobre este candidato de produto WNT.

[0170] Análise de expressão gênica das células demonstrou que pelo menos 3 genes para WNT foram expressos (wnt 5a, wnt 7a e wnt 11), e um pequeno número de genes relacionados à sinalização de wnt foi expresso também; entretanto, sua função não é completamente entendida. Os dados de expressão gênica foram expandidos para um bioensaio in vitro para sinalização de wnt (translocação nuclear de β- catenina em queratinócitos epidérmicos humanos primários) e ativida- de de wnt sobre células-tronco sanguíneas foi avaliada. Ambos os ensaios demonstraram atividade compatível com atividade de wnt canônica. Além disso, meios condicionados destas culturas mostraram atividade de wnt quando injetados na pele de camundongos, induzindo células-tronco de folículo piloso a iniciar a fase anagênica, dessa forma induzindo crescimento capilar. Isto indica que a atividade de WNT estabilizada no meio de condição definido e sem soro não requereu purificação. Este produto pode ser usado para regeneração de folículo piloso e como uma ferramenta de pesquisa valiosa para a cultura de várias células-tronco humanas.

EXEMPLO 5 FIBROBLASTOS HIPÓXICOS DEMONSTRAM EXPRESSÃO DE FATOR DE CRESCIMENTO E PRODUÇÃO DE ECM ÚNICA

[0171] Fibroblastos dérmicos neonatais humanos produzem uma ECM quando cultivados in vitro, que estritamente imitam a derme e que pode substituir a derme danificada em aplicações médicas regenerativas, tais como cicatrização de ferida. Uma vez que o processo de cicatrização de ferida também recapitula o desenvolvimento embrionário, pela simulação do ambiente embrionário,será suposto que a ECM produzida fornecerá uma ECM potencializada para aplicações de regeneração de tecido. Por isso, ECM derivada de fibroblasto neonatal humano foi cultivada sob condições hipóxicas na cultura, para simular a hipoxia que existe no embrião inicial antes da angiogênese. A meta foi gerar uma ECM com propriedades fetais usando condições hipóxi- cas durante o desenvolvimento tecidual na cultura.

[0172] A ECM produzida nestas culturas hipóxicas era similar ao tecido mesenquimal fetal em que é relativamente rico em colágenos tipo III e V, e glicoproteínas, tais como fibronectina, SPARC, trombos- pondina e ácido hialurônico. Uma vez que a ECM também desempenha um papel regulador importante em ligação e apresentação de fato- res de crescimento em nichos putativos que suportam populações de célula-tronco regenerativas com fatores de crescimento-chave,foram avaliados os efeitos da hipoxia de acordo com a expressão de fator de crescimento durante o desenvolvimento de ECM similar à fetal na cultura. Foi mostrado que a hipoxia também pode aumentar a expressão de fatores que regulam a cicatrização de ferida e organogênese, tais como VEGF, FGF-7 e TGF-β.

[0173] A ECM humana também estimulou um aumento da ativida de metabólica em fibroblastos humanos in vitro, como medido pela atividade enzimática aumentada usando o ensaio de MTT. Adicionalmente, um aumento no número de células em resposta à ECM humana foi detectado. Estes resultados apoiam o uso desta ECM humana como um revestimento/suporte em culturas celulares embrionárias e como um revestimento/carga superficial biológico em várias aplicações terapêuticas ou dispositivos médicos.

EXEMPLO 6 MATERIAIS BIOMÉDICOS RECOBERTOS COM MATRIZ EXTRA- CELULAR HUMANA (hECM)

[0174] As composições de ECM geradas usando materiais derivados humanos (hECM) foram recobertas na rede de propileno usando um interligador fotoativo. Marcações imunofluorescentes de antifibro- nectina da rede de polipropileno recoberta com hECM mostram que os materiais de ECM formam um revestimento uniforme nas fibras da rede comparados à rede não recoberta. Rede recoberta com HECM é adequada para adesivos implantáveis para aplicações médicas, tais como reparo de hérnia e reparo de assoalho pélvico. Foi mostrado que os materiais de ECM recobrem as fibras individuais da rede como mostrado por marcação imunofluorescente com anticorpos de fibro- nectina que permitem o crescimento celular melhorado.

[0175] Avaliações de biocompatibilidade foram realizadas em 2 semanas e 5 semanas após implante da rede de polipropileno recoberta com hECM. O número de células gigantes tipo corpo estranho (FBGCs) foi examinado. O número de FBGCs por fibra 2 semanas após implante é mostrado nas figuras 1A e B. O número de células gigantes tipo corpo estranho por fibra 5 semanas após implante é mostrado nas figuras 2A e B. Uma redução de FBGCs da rede de polipro- pileno recoberta com hECM comparada com a rede não recoberta é evidente.

[0176] Um mecanismo de formação de FBGC é o resultado da fu são de macrófago em uma resposta imune a biomateriais implantáveis, tais como polipropileno. Estas grandes células multinucleadas fornecem um meio eficaz de avaliar quantitativamente a resposta inflamatória a biomateriais implantáveis. Uma redução significante da contagem de FBGC por amostra com polipropileno recoberto com ECM humana contra não recoberto foi observada no ponto de tempo de duas semanas. Estes dados sugerem que o revestimento de superfície de ECM humana possa servir como uma aplicação de uma variedade de dispositivos implantáveis.

[0177] Historicamente, a eficácia e longevidade de dispositivos im plantáveis foram desafiadas por respostas imunes específicas incluindo FBGC e formação de cápsula fibrosa. Especificamente FBGCs podem excretar agentes degradativos, tais como superóxido e radicais livres. Estes efeitos negativos são especialmente significantes uma vez que é conhecido que FBGCs permanecem localizadas imediatamente em volta do implante durante a permanência da presença do implante. Formação de cápsula fibrosa, que surge como um encapsulamento de colágeno vascular rígido em volta de um implante, é planejada para isolar implantáveis estranhos do hospedeiro ou tecido hospedeiro. Esta resposta não somente pode causar desconforto no paciente em certos casos, mas pode encurtar o tamanho da viabilidade de dispositivo e até diminuir a eficácia do dispositivo. Dessa forma um re-vestimento que reduz FBGC e encapsulamento fibroso é um resultado altamente desejável para longevidade e função de dispositivos implantáveis.

EXEMPLO 7 USO DE COMPOSIÇÕES DE MATRIZ EXTRACELULAR PARA ES-TIMULAÇÃO DE CRESCIMENTO CAPILAR

[0178] Este exemplo ilustra a estimulação do crescimento capilar pela administração de composições de ECM.

[0179] Células de folículo piloso humano e células tomadas de fo- lículos pilosos foram obtidas para determinar a capacidade das composições de ECM descritas neste pedido para estimular e manter a capacidade de formação de cabelo. Células de folículo piloso foram obtidas de Alderans Research International. Células foram cultivadas na presença de ECM. Análise das células em quatro semanas e oito semanas da cultura mostrou estruturas que pareceram com folículos pilosos bem como estruturas que pareceram com hastes capilares. Após dois meses de cultura contínua, as células permaneceram vivas e crescendo.

[0180] Células cultivadas durante quatro semanas na presença da composição de ECM foram transplantadas em camundongos. Quatro semanas após transplante, os folículos pilosos humanos cultivados formaram folículos muitos grandes quando comparados com células controle que mostraram números somente normais de pequenos folí- culos pilosos restantes como observado usando análise de imagem microscópica.

EXEMPLO 8 GERAÇÃO DE COMPOSIÇÕES DE MATRIZ EXTRACELULAR HUMANAS (hECM)

[0181] Composição de ECM humana foi gerada usando fibroblas- tos humanos neonatais. Fibroblastos foram semeados em estruturas similares a contas condicionadas com meios líquidos. Condições de cultura foram otimizadas sem a necessidade de soro fetal bovino. Em alguns dias, sob condições de cultura embrionária descritas neste pedido, células produziram uma ECM densa similar à embrionária. Secreção de proteínas de família Wnt, bem como vários fatores de crescimento foi observada.

[0182] Culturas foram cultivadas à confluência. As culturas foram posteriormente expostas à água estéril para induzir lise uniforme das células. A hECM acelular então foi lavada para assegurar remoção de todas as células vivas e fragmentos celulares e examinada microscopicamente para confirmar a remoção de fragmentos celulares. A seguir, fibroblastos humanos foram expostos a frascos de cultura recobertos com hECM ou plaqueados em um frasco não tratado e então recoberto com uma camada espessa de matriz. As proteínas de ECM identificadas na hECM são mostradas na Tabela 7.

[0183] Tabela 7. Proteínas de Matriz Extracelular Observadas em hECM

[0184] Foi observado que a hECM induzia um aumento da ativida de metabólica das células, como medidas pela atividade enzimática aumentada usando o ensaio de MTT como mostrado na figura 4. A ECM humana, diferentemente da ECM de camundongo, induziu um aumento dependente de dose na atividade metabólica celular como medido pelo ensaio de MTT. Células foram observadas infiltrarem-se rapidamente e uniformemente no material recoberto com hECM. Além disso, houve um aumento dependente de dose no número de células em resposta à hECM, como medido pelo ensaio Pico Green.

[0185] Revestimentos conhecidos, injetáveis, e os produtos de ma triz implantável são tipicamente colágenos bovinos, proteínas de matriz porcina derivadas dos intestinos ou bexiga urinária, ácido hialurô- nico, ou ECM humana derivada de pele de cadáver. Enquanto estes produtos podem oferecer benefícios criando um ambiente mais fisiolo- gicamente equivalente, nenhum é completamente humano e contém a faixa inteira de proteínas matrizes encontradas em tecido jovem, desenvolvido. A hECM produzida contém os mesmos materiais de ECM encontrados em tecido jovem, saudável. Foi observado que também suportava a proliferação ativa de células humanas bem como o rápido crescimento de células. Há várias vantagens evidentes no uso de hECM em aplicações que envolvem um indivíduo humano. Por exemplo, hECM promove integração rápida de célula hospedeira e cicatri- zação melhorada (atua como suporte normal de células hospedeiras e subsequente remodelamento). Adicionalmente, hECM elimina a preocupação quanto à transmissão viral de animal não humano e tecidos humanos (particularmente BSE de tecido bovino e TSE de tecido humano). Além disso, composição e desempenho de produto consistentes são observados para hECM quando comparados com produtos biológicos, particularmente derme humana e fáscia lata. Adicionalmente, hECM reduz a erosão de tecidos do hospedeiro quando comparada com implantes sintéticos.

EXEMPLO 9 MATRIZ EXTRACELULAR CONDICIONADA HIPÓXICA DERIVADA DE FIBROBLASTO HUMANO PARA APLICAÇÕES ESTÉTICAS MÉDICAS

[0186] Um estudo duplo cego, randomizado de administração de hECM tópica pós-cirurgia a laser ablativo facial foi conduzido. O estudo arrolou 41 indivíduos entre as idades de 40 e 60 anos de idade. Todos os membros do grupo de estudo eram sem cirurgia invasiva ou minimamente invasiva anterior, ou tratamentos antienvelhecimento tópicos dentro dos 12 meses anteriores. O procedimento a laser incluiu o procedimento a laser ablativo fracionado total, periocular, perioral e face total. Um laser Palomar Starluz 550p foi usado (1540-não ablativo e 2940 ablativo). Indivíduos foram administrados com composições de hECM tópicas uma vez por dia (em concentrações diferentes) ou veículo placebo durante 14 dias. Pontos finais do estudo incluíram fotografia clínica (3 avaliações cegas por dermatologistas), perda de água transepidérmica (TEWL), biópsia por punção, e avaliação de eritema, edema e crosta.

[0187] A composição de hECM 10X mais forte forneceu a melhor evolução clínica em sintomas quando comparada ao veículo controle (avaliações foram conduzidas "cegamente" por dois dermatologistas cosméticos, não relacionados com qualquer conduta do estudo clínico). Os resultados são mostrados em figuras 6 (eritema), 7 (edema) e 8 (crosta). Avaliação fotográfica também indicou uma redução da severidade de eritema em vários pacientes nos dias 3, 7 e 14.

[0188] Valores de perda de água transepidérmica (TEWL) também foram avaliados 3, 7 e 14 dias pós-tratamento com laser dos 41 indivíduos. Os resultados são mostrados na figura 9. A composição de hECM 10X mais forte forneceu melhora na função da barreira de estrato córneo como observado no dia 3, e dia 7 quando comparada ao veículo controle. No dia 7, a composição de hECM é estatisticamente significante (em p <0,05) quando comparada ao veículo controle. Esta observação é consistente com o fato que havia indivíduos no dia 7 pós-tratamento com laser fracionado ablativo que demonstravam ree- pitelização.

[0189] Um estudo duplo cego, randômico de administração de hECM tópica para antienvelhecimento (por exemplo, redução de ruga) também foi conduzido. O estudo arrolou 26 indivíduos entre as idades de 40 e 65 anos de idade. Todos os membros do grupo de estudo foram sem cirurgia invasiva ou minimamente invasiva anterior, ou tratamentos antienvelhecimento tópicos dentro dos 12 meses anteriores. Os indivíduos foram administrados com composições de hECM tópicas duas vezes por dia ou veículo placebo por 10 semanas. Pontos finais do estudo incluíram fotografia clínica (2 dermatologistas cosméticos cegos), hidratação superficial por corneômetro, elasticidade por cutô- metro, biópsia por punção, avaliação molecular (Recuperação de informação Genética Epidérmica (EGIR)).

[0190] Avaliação fotográfica da área facial indicou que uma geração de pigmentação mais suave, textura de pele mais lisa, pele mais igualmente tonalizada, e uma redução da aparência de rugas e linhas finas após 10 semanas da administração de hECM.

[0191] Análise de imagem perfilométrica tridimensional de replicas de silicone da área periocular também foi realizada para 22 dos 26 indivíduos. Para realizar a análise, uma fonte de luz colimada foi dirigida em um ângulo de 25° do plano da réplica. A réplica foi colocada em um suporte que fixou a direção da posição de placa da réplica de modo que a réplica possa ser rotacionada para alinhar a direção da placa normal ou paralela à direção da luz incidente. As réplicas foram tomadas da área de pés de galinha adjacentes a cada olho com a direção da placa apontando para a orelha. A orientação de amostragem normal forneceu medidas de textura sensíveis às linhas principais, induzi- das pela expressão (pés de galinha). A orientação de amostragem paralela forneceu medidas de textura sensíveis às linhas menores, finas. Os resultados são mostrados na figura 10.

[0192] Um estudo cego, randômico duplo pós-cirurgia a laser abla-tivo facial de administração hECM tópica foi conduzido. O estudo registrou 49 indivíduos entre as idades de 40 e 60 anos de idade. Todos os membros do grupo de estudo foram sem cirurgia invasiva ou minimamente invasiva anterior, ou tratamentos antienvelhecimento tópicos dentro dos 12 meses anteriores. O procedimento a laser incluiu o procedimento a laser ablativo fracionado total, periocular, perioral e face total. Um laser Palomar Starluz 550p foi usado (1540-não ablativo e 2940 ablativo). Indivíduos foram administrados com composições de hECM tópicas duas vezes por dia ou veículo placebo por 14 dias. Pontos finais do estudo incluíram fotografia clínica (3 avaliações cegas por dermatologistas), Mexameter e estimativa subjetiva.

[0193] Avaliação fotográfica da área facial nos dias 1, 3, 5, 7 e 14 pós-cirurgia mostrou uma redução clara do eritema a cada ponto de tempo quando comparada com placebo.

[0194] Dias de uso de petrolato foram avaliados pós-cirurgia como mostrado na figura 11. A classificação do eritema foi conduzida como mostrado na figura 12. Resultados de Mexameter são mostrados na figura 13 tanto de configurações de laser ablativo (2940) como não ablativo (1540).

[0195] Os resultados dos estudos indicaram várias características benéficas de tópicos contendo hECM. Tais benefícios incluíram 1) faci- litação de reepitelização após recomposição de superfície; 2) redução de sintomas de recomposição de superfície de laser fracionário não ablativo e ablativo (por exemplo, eritema, edema, crosta e desconforto sensorial); 3) geração de pele lisa, até texturizada; 4) geração de hidratação cutânea; 5) redução da aparência de linhas/rugas finas; 6) aumento da firmeza e flexibilidade cutâneas; 7) redução da despig- mentação cutânea; e 8) redução de pele avermelhada, manchada.

[0196] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos acima, será entendido que modificações e variações são englobadas dentro do espírito e escopo da invenção. Consequentemente, a invenção é limitada somente pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Método para produção de uma composição de matriz ex- tracelular (ECM), caracterizado pelo fato de que compreende:cultivar células de fibroblastos humanas sob condições de hipóxia de 1 a 5% de oxigênio por pelo menos 2 semanas em uma superfície de contas em um meio de crescimento adequado, por meio disso produzindo uma composição solúvel e uma não solúvel.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as espécies de colágeno são reguladas positivamente em comparação com uma ECM produzida sob condições de oxigênio de 15 a 20% de oxigênio.

3. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o colágeno é selecionado dentre o tipo V alfa 1; IX alfa 1; IX alfa 2; VI alfa 2; VIII alfa 1; IV, alfa 5; VII alfa 1; XVIII alfa 1 ou XII alfa 1.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as espécies de Wnt são reguladas positivamente em comparação com uma ECM produzida sob condições de oxigênio de 15 a 20% de oxigênio.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que as espécies de Wnt são wnt 7a e wnt 11.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as espécies de laminina são reguladas positivamente em comparação com uma ECM produzida sob condições de oxigênio de 15 a 20% de oxigênio.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a espécie de laminina é laminina 8.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os fibroblastos são fibroblastos neonatais.

9. Método para produção de uma proteína Wnt e de um fa- tor de crescimento endotelial vascular (VEGF), caracterizado pelo fato de que compreende:cultivar células de fibroblastos humanas sob condições de hipóxia de 1 a 5% de oxigênio por pelo menos 2 semanas em uma superfície de contas em um meio de crescimento adequado, por meio disso produzindo a proteína Wnt e VEGF.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o meio de crescimento é sem soro.

11. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as espécies de Wnt são reguladas positivamente em comparação com uma composição produzida sob condições de oxigênio de 15 a 20% de oxigênio.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que as espécies de Wnt são wnt 7a e wnt 11.

13. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as espécies de VEGF são reguladas positivamente em comparação com uma composição produzida em condições de oxigênio de 15 a 20% de oxigênio.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a espécie de VEGF é VEGF-A ou isoforma da mesma.