KR101633585B1 - 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로, in vitro에서 연골유래 세포외기질 소재에 대한 섬유세포의 부착효율이 낮고, 마우스를 이용한 피하유착 동물모델 및 랫을 이용한 장유착 모델에서 우수한 유착방지 효능을 보임을 관찰하였다. 또한 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)을 이용하여 본 소재의 표면 전하를 중성으로 개질할 경우 유착방지 효과가 현저히 증가함을 확인함으로써, 연골세포 유래 세포외기질 소재를 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 유착방지제로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 관한 것이다.
유착이란 분리되어 있어야 할 장기의 조직 면이 외과적 수술이나 염증에 의해 섬유성의 조직으로 연결, 융합되는 것으로 이로 인한 합병증으로 소장폐색, 후천성 여성 불임증, 자궁 외 임신, 만성 복통, 재수술 등이 발생된다. 이러한 유착은 외과적 수술 후 50~90%에서 발생되며 유착에 의해 재수술 받는 환자가 34.6%에 이를 정도로 발생이 잦다. 유착은 창상 발생 이후 나타나는 치유 과정과 비슷하여 치유과정의 방해 없이 유착을 방지하는 방법이 중요하다. 유착은 수술 부위의 치유과정 중에 정상적으로 침착하는 섬유소가 상처 치유과정이 완료됐음에도 불구하고 지속적으로 발생하여 인접하고 있는 다른 조직과 결합되게 만드는 것이다. 이러한 유착을 방지하기 위하여 물리적인 장벽으로 유착방지제를 사용하거나 섬유소 분해 약물을 사용하고 있다.
기존의 유착방지제는 물리적인 장벽의 역할로 셀룰로스 혹은 히알룬산을 이용한 경우가 많으며, 그 밖에 콜라겐 등의 천연 소재들이 많이 이용되고 있다. 하지만 현재 상용화된 제품의 경우 유착 방지의 효과가 높지 않다. 가장 많이 사용되는 유착방지제인 Interceed의 경우 그 사용으로 인한 유착방지의 효과가 60%밖에 되지 않는다(www.ethicon.com). 또한 이런 유착방지제는 외부 물질로 인식되어 염증반응을 유도하거나 상처치유를 오히려 방해하기도 한다. 그리고 유착이 수술 후 장시간에 걸쳐 발생될 수 있음에도 불구하고 현재 사용되는 유착방지제는 빨리 분해되어 지속적인 효과를 얻기 어렵다.
본 발명의 목적은 표면전하가 중성으로 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)/N-하이드록시석시니미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 및 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)으로 처리하여 표면전하가 중성으로 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공한다.
본 발명은 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물에 대한 것으로, in vitro에서 연골유래 세포외기질 소재에 대한 섬유세포의 부착효율이 낮고, 마우스를 이용한 피하유착 동물모델 및 장유착 모델에서 우수한 유착방지 효능을 보임을 관찰하였다. 또한 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)을 이용하여 본 소재의 표면 전하를 중성으로 개질할 경우 유착방지 효과가 현저히 증가함을 확인함으로써, 연골세포 유래 세포외기질 소재를 이용하여 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 유착방지제로 활용할 수 있다.
도 1은 연골세포 유래 세포외기질 막을 나타낸다.
도 2는 연골 유래 세포기질 막의 표면을 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)로 개질한 후 표면전하의 변화를 제타 포텐샬로 측정한 결과이다.
도 3은 연골세포 유래 생체막에 대한 섬유세포의 부착능 평가 결과이다.
도 4는 마우스 피하유착모델에서 연골 유래 생체소재의 유착방지 효과를 관찰한 결과이다(Gross image). 생체막을 사용한 경우 유착 부위가 줄어드는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 장유착 모델에서 연골 유래 생체소재의 유착방지 효과에 대한 조직학적 관찰 결과이다. 생체막 처리시 염증세포의 침입이 줄어드는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 연골세포 유래 생체소재를 이용한 여러 형태를 나타낸다(막, 스펀지, 파우더 및 젤의 유착방지용 생체소재).
도 2는 연골 유래 세포기질 막의 표면을 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)로 개질한 후 표면전하의 변화를 제타 포텐샬로 측정한 결과이다.
도 3은 연골세포 유래 생체막에 대한 섬유세포의 부착능 평가 결과이다.
도 4는 마우스 피하유착모델에서 연골 유래 생체소재의 유착방지 효과를 관찰한 결과이다(Gross image). 생체막을 사용한 경우 유착 부위가 줄어드는 것을 확인할 수 있다.
도 5는 장유착 모델에서 연골 유래 생체소재의 유착방지 효과에 대한 조직학적 관찰 결과이다. 생체막 처리시 염증세포의 침입이 줄어드는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 연골세포 유래 생체소재를 이용한 여러 형태를 나타낸다(막, 스펀지, 파우더 및 젤의 유착방지용 생체소재).
이에, 본 발명에서는 이러한 단점을 극복하기 위해 체내 안정성과 유착방지 효능이 뛰어난 연골세포 유래 세포외기질 소재를 이용한 유착방지제를 개발하였다. 이전의 연구에서 본 연구팀은 연골유래 세포외기질 성분의 생체막을 개발하였고, 이 생체막이 연골손상의 치료를 위한 골수자극술 (bone marrow stimulation technique)에서 혈병의 유실을 방지하기 위한 용도로 사용될 수 있음을 개시하였다. 연골유래 세포외기질 소재는 주로 제2형 콜라겐과 단백당으로 구성되어 있다는 점에서 다른 천연생체소재와 차별화되며, 본 연구팀의 선행 연구에서 본 소재에 대한 혈관내피세포의 부착 효율이 상대적으로 낮아 혈관형성 억제 효과가 있음을 관찰하였으나, 연골유래 세포외기질 소재의 유착방지 효능에 대해서는 기존에 알려진 바가 없다. 외과적 수술 후 조직의 유착에는 신생혈관의 형성이 관여되어 있으나 섬유세포의 부착이 주된 원인으로 알려져 있다. 본 발명에서는 in vitro에서 연골유래 세포외기질 소재에 대한 섬유세포의 부착효율이 낮고, 마우스를 이용한 피하유착 동물모델 및 랫을 이용한 장유착 모델에서 우수한 유착방지 효능을 보임을 관찰하였다. 또한 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)을 이용하여 본 소재의 표면 전하를 중성으로 개질할 경우 유착방지 효과가 현저히 증가함을 관찰하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 표면전하가 중성으로 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착방지용 조성물을 제공한다.
바람직하게는, 상기 표면개질은 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)/N-하이드록시석시니미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 및 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)으로 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 연골세포 유래 세포외 기질막은 in vitro에서 연골세포를 배양하여 분비된 기질막과 in vivo에서 연골세포에 의해 자연적으로 생산된 기질을 이용한 기질막을 모두 포함하는 것이다.
바람직하게는, 상기 연골세포 유래 세포외 기질은 콜라겐 및 단백당(glycosaminoglycan)으로 이루어진다.
바람직하게는, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 동물 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질로서, 더욱 바람직하게는, 동물의 무릎 관절 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질일 수 있다. 더욱 바람직하게는 무균돼지 무릎연골 조직의 세포를 수확하고 고농도로 이식하여 배양한 결과로 형성된 막 형태일 수 있다.
상세하게는, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 수술 부위의 섬유화와 염증을 억제하여 유착 형성을 방지할 수 있다. 상기 유착은 피하 유착 또는 장 유착일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 연고, 분말, 겔, 필름, 슬랩, 랩 및 스펀지 형태의 이식재 또는 차단제로 제공되어 수술 부위의 유착 형성을 방지할 수 있다.
이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.
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실시예
1 > 연골 세포 유래
세포외기질
막 제작
무균돼지 무릎연골 조직의 세포를 수확하고 고농도로 이식하여 배양한 결과로 형성된 막 형태이다. 이렇게 얻은 막을 DNase I과 같은 효소로 탈 세포하고 세척하여 연골 세포 유래 세포외기질 막을 수득한다. 콜라겐과 단백당이 주 구성성분이다 (대한민국 등록특허공보 제10-0816395호 참조) (도 1).
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실시예
2 > 연골 세포 유래
세포외기질
막의 표면 개질
실시예 1에서 획득한 막을 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)/N-하이드록시석시니미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS)를 50mM로 증류수에 준비한 용액에 넣고 12시간 동안 250rpm으로 흔들어 주며 상온에서 처리한다. 그 후, 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)을 10ug/ml로 증류수에 만들어 EDC/NHS 처리된 막을 넣어 24시간 동안 250rpm 으로 흔들어 주며 상온에서 처리한다. 처리가 완료되면 3차수에서 필름을 10분간 3번씩 세척한 후 건조 시킨다. 표면 개질이 완성된 막은 표면 전위차를 측정하기 위해 유리판에 고정하고 10mM의 염화나트륨에 전기적인 힘에 의해 움직일 수 있는 모니터 입자를 넣은 후 고정된 막으로 덮고 전류를 흘려줌으로써 표면의 전하를 측정한다(ELS Zeta potential, Otsuka).
개질하기 전과 후의 표면전하를 제타포텐샬로 측정해 보았을 때, 개질 전은 -32.4±2mV로 음전하가 강하게 존재하는 것을 확인할 수 있으며, PLL을 이용하여 표면 개질을 한 막을 측정한 경우 -3±2mV로 중성에 가까운 표면 전하값을 확인할 수 있다(도 2).
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실시예
3 > 섬유세포 부착
어세이
본 실시예는 세포 배양 디쉬 및 실시예 1과 실시예 2에서 준비된 연골 유래 세포외기질 막을 이용하여 유착기전에서 작용되는 섬유세포의 부착률 차이를 다음과 같이 확인하였다.
실시예 1에서 준비된 연골 유래 세포외기질 막과 실시예 2에서 준비된 개질한 막을 직경 5mm의 별개의 24웰 디쉬에 부착시킨 뒤 건조시켜 고정하고, 이오가스 멸균을 실시하였다. 그리고 각각 막이 코팅된 디쉬와 코팅되지 않은 24well plate에 2 X 104 섬유세포를 이식하여 24시간 동안 부착을 시켰다. 그 후 부착되지 않은 세포를 PBS 버퍼로 세척하고 MTT 어세이를 시행하여 각 표면에 붙은 세포를 확인하였다(460nm 흡광도에서 측정).
그 결과 도 3에 도식된 바와 같이, 필름을 코팅하지 않은 세포배양 디쉬에서 가장 높은 세포 부착률이 나타났으며 연골 유래 세포외기질 막에서는 세포 부착이 낮은 것을 확인하였다. 특히 개질하여 표면 전하가 중성에 가까운 막을 코팅한 결과에서 가장 낮은 세포 부착을 확인할 수 있었다. 이로써 연골 유래 세포외기질 막 자체는 섬유세포의 부착을 저해하는 것을 알 수 있으며, 표면의 전하를 변경하였을 경우 그 효과가 더 증진된 것을 확인하였다.
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실시예
4 > 마우스 피하 유착모델
8주령된 C57BL6 마우스를 이용하여 유착모델을 제작하였다. 마우스 복부의 피부층과 근육층을 각각 절개하였고, 근육층과 피부층을 수처하여 손상된 조직 사이에서 유착이 발생하는 모델을 만들어서 유착 효과를 확인하였다. 유착 조직은 1주에 발생되었으며 근육과 피부를 강하게 부착 시키는 유착 모델이 형성되었다.
상기에서 제작된 피하 유착 모델에서 근육층과 피부층 사이 유착 조직이 형성되는 부위에 seprafilm(genzyme®), 연골 유래 세포외기질 막과 개질된 막을 이식한 후 1주 결과를 확인하였다(도 4 첫 번째 줄). 유착만 유도한 그룹에서는 1주에서 유착 조직이 상처를 감싸고 두껍게 생성되었다. 현재 제품으로 판매되고 있는 seprafilm을 이식한 경우 필름은 흡수되어 확인되지 않으며 근육층과 피부층이 분리되어 있는 것을 확인할 수 있다. 연골유래 세포외기질막을 이식한 경우 근육층과 피부층이 분리되었으며 유착조직 또한 형성되지 않은 것을 볼 수 있다. 대신 상처 부위를 둘러싸고 있는 막의 형태를 확인할 수 있다. 개질된 연골유래 세포외기질 막을이식한 경우 근육과 피부층의 분리가 일어남과 동시에 상처를 중심으로 막을 둘러싼 형태가 개질 전 그룹에 비해 작아서 유착방지 효과가 더 높은 것을 확인할 수 있다.
상기에서 획득한 조직을 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해서 세포와 세포질 염색을 실시하였다(도 4 두번째 줄). 그 결과 연골 유래 세포외기질 막 자체에 세포가 집중 되면서 근육층과 피부층을 물리적으로 방어하면서 두 조직 사이에 유착 조직이 형성되지 못하게 하는 역할을 하였다. 또한 개질된 막에서는 세포의 부착을 저해하여 막 자체만 피부층과 근육층 사이에 존재하면서 두 조직 사이에 유착 조직의 형성을 막는 물리적인 방어 역할을 하는 것을 확인할 수 있다.
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실시예
5 > 랫 장 유착 모델
8주령된 SD 랫을 이용하여 유착모델을 제작하였다. 랫 복부를 절개한 후 맹장의 표면과 복벽에 상처를 내어 두 조직의 상처난 부위를 수처하여 고정시킴으로써 유착이 발생하는 모델을 만들어 유착 효과를 확인하였다. 유착 조직은 1주에 발생되었으며 복벽과 맹장 사이에 강하게 유착조직이 형성되어 두 조직이 붙어 있는 것을 확인하였다. 상기에서 제작된 장 유착 모델에서 복벽과 맹장 사이 유착 조직이 형성되는 부위에 seprafilm(genzyme®), 연골 유래 세포외기질 막과 개질된 막을 이식하여 수처로 고정한 후 1주 결과를 확인하였다 (도 5 첫 번째 줄). 유착만 유도한 그룹에서는 1주에서 맹장이 복벽에 강하게 부착되어 있으며 그 사이에 유착 조직이 두껍게 형성되었다. seprafilm을 이식한 경우 필름을 고정한 양 끝 부위에는 유착이 일어났지만 필름으로 덮여있던 부분에서는 복벽과 맹장이 분리되어 있는 것을 확인할 수 있다. 연골유래 세포외기질막을 이식한 경우 복벽과 근육층이 막에 의해 분리되어 있으나 막과 주변 조직은 서로 붙어 있는 것을 관찰하였다. 반면, 개질된 세포외기질 막을 이식한 경우 복벽과 맹장의 분리가 일어남과 동시에 절개부위 주변에 막이 뚜렷이 구분되어 존재하고 있었다.
상기 조직들을 헤마톡실린과 에오신 염색을 통해서 세포와 세포질 염색을 실시하였다(도 5 두 번째 줄). 그 결과 연골 유래 세포외기질 막의 경우 이식된 막이 복벽과 맹장 사이에 존재하나 막 주위로 세포가 밀집되어 있고 주변 조직이 결합되어 있는 것을 관찰할 수 있다. 반면, 개질된 막의 경우 세포의 부착을 저해하여 막 주변의 복벽과 맹장이 완전히 분리되어 있는 것을 확인할 수 있다.
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실시예
6 > 다양한 형태의 연골 유래
세포외
기질 재료 제작
연골유래 세포외 기질은 조직 자체를 동결파쇄하여 분말 형태로 만들거나, 염화나트륨과 섞어서 압축시킨 후 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)/N-하이드록시석시니미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS)를 사용하여 가교하고 염화 나트륨을 녹여내는 방법 혹은 물과 함께 얼린 후 가교(EDC/NHS) 하고 동결 건조하여 물을 증발시키는 방법으로 스펀지를 만든다. 또한 분말 자체를 녹인 후 가교(EDC/NHS)하거나 체내 삽입함으로써 하이드로겔 형태로 제작할 수 있다.
Claims (5)
- 표면전하가 중성으로 표면개질된 연골세포 유래 세포외 기질막을 유효성분으로 함유하는 유착 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 표면개질은 에틸(디메틸아미노프로필) 카보디이미드(ethyl(dimethylaminopropyl) carbodiimide; EDC)/N-하이드록시석시니미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS) 및 폴리-L-리신(poly-L-lysine; PLL)으로 처리하는 것을 특징으로 하는 유착 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 동물 연골 세포에서 분비되어 형성된 연골세포 유래 세포외 기질인 것을 특징으로 하는 유착 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 연골세포 유래 세포외 기질막은 연고, 분말, 겔, 필름, 슬랩, 랩 및 스펀지 형태로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 이식재 또는 차단제로 제공되는 것을 특징으로 하는 유착 방지용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유착은 피하 유착 또는 장 유착인 것을 특징으로 하는 유착 방지용 조성물.
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