KR101997966B1

KR101997966B1 - 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트

Info

Publication number: KR101997966B1
Application number: KR1020170079287A
Authority: KR
Inventors: 박준영; 김문석; 민병현; 박지훈
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2016-06-30
Filing date: 2017-06-22
Publication date: 2019-07-09
Also published as: KR20180003438A

Abstract

본 발명은 동물의 연골유래조직을 가교제와 반응시켜 가교결합이 형성된 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트 및 이의 제조 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 생체적합성 연골유래조직 시트는 가교제의 가교결합에 의해 생체 내 분해기간을 지연시킬 수 있으며, 가교제의 종류 및 가교 시간에 따른 가교결합의 형성 정도에 따라 분해기간을 조절 할 수 있으므로, 가교제의 종류 및 가교 시간에 따라 가교결합의 형성 정도에 따라 분해기간을 조절할 수 있으므로, 조직공학용 지지체, 약물전달체, 유착방지제로서 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트{Biocompatible sheet derived from articular cartilages with adjustable degradation time in vivo and method for preparing the same}

본 발명은 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

최근 장폐색, 만성 골반 통증 등으로 인하여 많은 수술이 이루어지고 있는데, 수술 도중 혹은 수술 후에 생체 조직 간의 유착이 일어나 이 조직세포들이 증식하고 재생하면서 다른 장기나 조직의 기능에 장애를 일으킨다. 이러한 조직간의 유착을 방지하기 위해 유착 부위에 복강경 등의 수술을 통해 유착 형성을 줄일 수는 있으나, 완전히 없앨 수는 없는 한계가 있다. 따라서 수술 후 조직 내 유착을 방지하기 위한 유착방지 기술이 개발되고 있다.

유착방지제로 이용되기 위해서는 염증이나 면역반응이 발생하지 않아야 하고, 체내에 머물다가 자연히 생분해되어 별도의 제거가 필요 없어야 한다. 이러한 유착방지제는 크게 복강내 점적제와 유착차단제로 나뉘는데, 복강내 점적제의 경우 젤이나 용액 타입으로 나눌 수 있으며, 유착 차단제의 경우 시트나 맴브레인 형태로 나눌 수 있다. 이 중 젤과 용액의 경우 정확한 위치에 도포가 어렵고 유착방지 기능을 하기 전에 다른 부위로 흘러가거나 분해가 일어나므로 유착방지 기능을 제대로 하지 못한다는 단점이 있다. 현재까지 시트 형태의 유착방지제가 임상적으로 가장 뛰어나다고 입증되었으며 많이 상용화되어 있다. 하지만 현재까지 나온 시제품들의 경우 천연재료만을 사용한 경우 건조 상태에서 쉽게 부서져 취급이 용이하지 않은 단점이 있다. 생분해성 고분자를 단독으로 사용한 경우 수술 시 손상된 부위에 내부 장기에 적용 시 장기 표면에 잘 부착되지 않아 부착 시 추가 봉합을 해야 하는 단점이 있다. 그러므로 천연재료에 생분해성 고분자를 가교제로 하는 시트 제작이 필요하다.

천연 소재는 천연물질, 동물, 인체에서 유래한 물질이기 때문에 우수한 생체적합성을 지니고 있다. 대표적인 예로 세포외기질(Extracellular matrix; ECM)이 있는데, 이는 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자들을 공급해주면서 세포가 지낼 수 있는 환경을 제공해준다.

수많은 천연재료 중 연골유래조직은 혈관이 없고, 신경이 없으며 재생이 잘 일어나지 않는 특징을 가지고 있다. 또한, 높은 생체적합성과 면역반응이 거의 일어나지 않는 연골유래조직은 유착방지제로 사용할 수 있는 좋은 재료이다. 하지만 짧은 분해기간과 낮은 물성으로 한계를 가지고 있는데 이러한 한계를 해결하기 위하여, 연골유래조직을 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 물성을 증진시킬 필요가 있다.

따라서, 연골유래조직과 생체적합성을 지닌 가교제를 반응시켜 가교 결합을 형성하여 생체 내 분해기간을 조절할 수 있는 생체적합성 연골유래조직 시트 개발이 필요하다.

대한민국 특허공개공보 제10-2015-0114422호 (2015.10.12)

본 발명의 목적은 인간을 제외한 동물의 연골유래조직을 가교제와 반응시켜 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 포함하는 조직공학용 지지체, 약물전달체 또는 유착방지제를 제공하는데 있다.

본 발명은 인간을 제외한 동물의 연골유래조직을 가교제와 반응시켜 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 제공한다.

또한, 본 발명은 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 포함하는 조직공학용 지지체를 제공한다.

또한, 본 발명은 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 포함하는 약물전달체를 제공한다.

또한, 본 발명은 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 포함하는 유착방지제를 제공한다.

본 발명은 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트 및 이의 제조방법에 대한 것으로, 본 발명의 생체적합성 연골유래조직 시트는 가교제와 가교결합을 형성함으로써 생체 내 분해기간을 조절할 수 있으며, 가교 시간에 따른 가교결합의 형성 정도에 따라 분해기간을 조절할 수 있으므로 조직공학용 지지체, 인공혈관으로서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 가교 결합을 통한 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트의 제조 방법을 모식적으로 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 사용할 수 있는 생분해기간 조절이 가능한 가교제를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 실시예 2-1에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드))(PCLA)과 실시예 2-3에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 가교도를 높이기 위한 작용기(R)를 나타낸다.
도 4는 도 3에서 도입한 작용기(R)나 실시예 2-1과 실시예 2-3에서 제조된 생체적합성 가교제용 고분자의 말단의 히드록시기(-OH)와 반응하는 가교그룹(Cx)을 나타낸다.
도 5는 실시예 2-1에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드))(PCLA) 말단에 카르복실기를 도입하여 제조한 가교제의 화학적 구조 및 이의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 6은 실시예 2-3에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드))(PCLG) 말단에 카르복실기를 도입하여 제조한 가교제의 화학적 구조 및 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 7은 실시예 2-3에 따라 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드))(PCLG) 말단에 Chloroformate를 도입하여 제조한 가교제의 화학적 구조 및 이의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 8은 실시예 2-4에 따라 제조된 말단에 카르복실기가 도입된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드))(PCLG)에 디시클로헥실카보이미드(DCC, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide), N-하이드록시석신이미드(NHS ester, N-Hydroxysuccinimide) 반응을 통하여 제조한 가교제의 화학적 구조 및 이의 NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 9는 실시예 2에서 제조한 생체적합성 가교제의 GPC를 통한 분자량 감소를 나타낸 결과이다.
도 10는 실시예 1과 실시예 3에서 제조한 연골유래조직 시트의 인장 강도 결과를 나타낸 결과이다.
도 11는 실시예 1과 실시예 3에서 제조한 연골유래조직 시트의 접촉각 결과를 나타낸 결과이다.
도 12는 생체적합성 연골유래조직 시트의 가교 유무 및 열처리 조건에 따른 분해거동을 나타낸다.
도 13는 형광물질을 통한 시트의 항유착성을 확인한 결과이다.
도 14는 주사 전자현미경을 통한 시트의 항유착성을 확인한 결과이다.
도 15는 세포 증식확인을 통한 시트의 항유착성을 확인한 결과이다.
도 16은 동물실험을 통한 이미징 평가를 통해 시트의 항유착성을 확인한 결과이다.
도 17은 동물실험을 통한 H&E 염색을 통해 시트의 항유착성을 확인한 결과이다.
도 18은 동물실험을 통한 ED1 염색을 통해 시트의 항유착성을 확인한 결과이다.

이에, 본 발명자들은 생체적합성 재료에 관한 연구에서 면역반응이 거의 일어나지 않는 연골유래조직에 가교제와 반응시켜 가교결합을 형성한 결과, 가교결합의 유무 및 가교 반응 시간에 비례하여 기계적 물성이 향상되어 분해기간을 조절할 수 있는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인간을 제외한 동물의 연골유래조직을 가교제와 반응시켜 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트의 제조 방법을 제공한다. 상기 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트의 제조 방법에 대해서는 도 1에 나타내었다.

또한, 본 발명은 동물의 연골유래조직을 가교제와 반응시켜 가교결합이 형성된 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 연골유래조직 시트를 포함하는 조직공학용 지지체, 인공혈관을 제공한다.

이하 본 발명에 관하여 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명에 따른 연골유래조직 시트는 인간을 제외한 동물, 바람직하게는 인간을 제외한 포유류의 연골유래조직을 분리하고, 이를 가교제와 반응시켜 가교결합이 형성된 것을 특징으로 한다. 상기 동물은 돼지, 소, 토끼, 마우스 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에 따른 연골유래조직 시트 제조 방법에 있어서, 가교제로 사용되는 생분해성 고분자는 직접 합성하여 사용하였다. 생분해성 고분자로는 락타이드(LA, Lactide)와 글리콜라이드(GA, Glycolide)와의 공중합체, 락타이드(LA)와 카프로락톤(CL,ε-Caprolactone)과의 공중합체 및 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA), 글리콜라이드(GA)와의 공중합체 등으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 바람직하게는 락타이드(LA)와 카프로락톤(CL)의 공중합체 및 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA), 글리콜라이드(GA)의 공중합체이다. 선택한 생분해성 고분자의 말단이나 측쇄에 작용기를 붙여 가교제로 사용하기도 하는데 이는 도 2에 나타내었다.

본 발명에서 사용될 수 있는 가교제는 말단 또는 측쇄에 작용기를 가져 연골유래조직과 가교결합을 할 수 있는 생체적합성 고분자로서, 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜(PEG, poly ethylene glycol), 카프로락톤(CL), 글리콜라이드(GA), 락타이드(LA), 또는 이들의 공중합체들로 이루어진 군이다.

상기 폴리에틸렌글리콜(PEG, poly ethylene glycol), 카프로락톤(CL), 글리콜라이드(GA), 락타이드(LA)로 제조된 공중합체에 가교제와의 가교도를 높이기 위해 중간에 말단이나 측쇄에 작용기(R)를 붙이는 데 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH2), Chloroformate, Sulfhydrl기(-SH) 계열로 이루어져 있다. 대표적인 작용기(R)로는 글루타르산 무수물(Glutaric anhydride). 석신산 무수물(Succinic anhydride), 4-Nitrophenyoxyl chloroformate, Thioctic acid 등이 있으며 도 3에 나타내었다.

상기 제조된 생체적합성 고분자의 측쇄나 말단에 붙인 작용기(R)나 생체적합성 고분자의 말단의 히드록시기(-OH)와 반응하는 가교그룹(Cx)을 이용하여 생체적합성 고분자 가교제를 제조한다. 대표적인 가교그룹(Cx)로는 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride)(EDC), 디시클로헥실카보이미드(DCC, N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide), N-하이드록시석신이미드(NHS ester, N-Hydroxysuccinimide), 1,1'-Carbonyldiimidazole(CDI) 등이 있으며 도 4에 나타내었다.

본 발명에서 상기 말단 또는 측쇄에 작용기를 갖는 생체적합성 고분자 가교제는 하기 화학식 1로 표시되는 가교제일 수 있다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 폴리에틸렌글리콜의 반복 단위를 나타내는 것으로 1~100의 정수이며, m은 폴리에스터를 구성하는 구분(segment)을 나타내는 것으로 1~100의 정수이다. R은 생체적합성 가교제용 고분자의 가교도를 높이기 위해 도입한 작용기를 나타내는 것으로 히드록시기(-OH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH₂), Chloroformate, Sulfhydrl기(-SH) 등이다. Cx는 생체적합성 가교제용 고분자에 도입하는 가교 그룹을 나타내는 것으로 CDI, DCC, EDC, NHS ester 등이다.

본 발명에 따른 연골유래조직 시트는 가교제를 이용하여 가교결합을 형성시켜 분해기간을 조절할 수 있는 시트로서 다양한 용도로 활용될 수 있다. 상기 연골유래조직은 혈관이 없고, 신경이 없으며 재생이 잘 일어나지 않는 특징을 가지고 있어 조직 간의 유착을 막을 수 있는 유착방지제로 쓰일 수 있다. 또한, 같은 재료를 가지고 화학적 처리를 다르게 하여 형태를 유지한 채 고름이나 진물 등의 상처부위에 나오는 이물질 등은 흡수하면서 계속해서 상처가 낫기 좋은 환경을 유지시켜 창상용 드레싱 등 많은 분야에 이용될 수 있다.

이하에서는, 본 발명을 한정하지 않는 실시예에 따라 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는것이 아님은 물론이다. 따라서, 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다.

< 실시예 1> 돼지에서의 연골유래조직 분리, 보관 및 연골유래조직 시트의 제조

6개월 된 100kg 정도의 돼지의 다리에서 돼지 연골을 채취한다. 연골 하골 부분이 포함되지 않도록 연골 부분만 잘라내어 인산 완충 수용액으로 씻어준다. 10 mM 저장성 버퍼에 연골을 넣어 4 ℃에서 4시간 동안 교반 후 원심분리기를 이용하여 10분간 3300 rcf로 돌린 후 상층액을 제거 후 10 mM NaCl, pH 7.6의 TBS 버퍼에 4 oC에서 2시간 동안 교반한다. 멸균 3차수를 넣고 원심분리기를 이용하여 10분간 3300 rcf로 5회 반복하여 세척한다. 세척 후 얻어진 조직은 멸균 3차수를 이용하여 돼지연골관절을 동결 건조 시킨다. 동결 건조한 돼지연골관절을 0.5M 펩신으로 이루어진 10 mL 수용액에 4 N의 수산화나트륨을 조금씩 넣어 중화시키면서 24시간 동안 교반한다. 멸균 3차수로 24시간 동안 투석 후 동결 건조하여 연골유래조직을 얻어내었다.

상기에서 얻은 연골유래조직을 1.3 wt%의 농도로 멸균 3차수에 넣어 실리콘 몰드에 부어 37 ℃에서 48시간 동안 건조시켜 연골유래조직 시트를 제조하였다.

< 실시예 2> 생체적합성 가교제의 제조

1. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)를 이용한 생체적합성 가교제용 폴리에틸렌글리콜 /폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA) 제조

생체적합성이 뛰어난 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide))의 가교제를 제조하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로 톨루엔을 용매로 하고, 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)를 넣고 Sn(Oct)₂를 촉매로 하여 130 ℃ 하에서 24시간 동안 교반하여 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)의 생분해성 가교제를 완성하였다.

2. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)를 이용한 생체적합성 가교제용 폴리에틸렌글리콜 /폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA) 말단에 작용기(R)로 카르복실기를 도입

가교도를 높이기 위해 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)의 말단 또는 측쇄에 작용기(R)를 도입하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로 상기 실시예 2-1에서 제조한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)을 초기 개시제로 이용하여 톨루엔을 용매로 하고, 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드)(PCLA)의 히드록시기(OH) 대비 1.5배의 글루타르산 무수물(Glutaric anhydride)을 넣고 아세트산을 촉매로 하여 110 ℃ 하에서 24시간 동안 교반하여 생분해성 가교제를 제조하였고 이를 ¹H-NMR을 통해 측정하였으며 이를 도 5에 나타내었다.

3. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)와 글리콜라이드(GA)를 이용한 생체적합성 가교제용 폴리에틸렌글리콜 / 폴리 ( 카프로락톤 -co- 락타이드 -co- 글리콜라이드 )( PCLG )의 제조

카프로락톤(CL), 락타이드(LA)와 글리콜라이드(GA)의 비율을 조절하여, 생체적합성이 뛰어나며 생분해기간을 조절할 수 있는 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG, polyethylene glycol/poly(ε-caprolactone-co-lactide-co-glycolide))의 가교제를 제조하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로 톨루엔을 용매로 하고, 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA), 글리콜라이드(GA)를 넣고 Sn(Oct)₂를 촉매로 하여 130 ℃ 하에서 24시간 동안 교반하여 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 생분해성 가교제를 완성하였다.

4. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA), 글리콜라이드(GA)를 이용한 생체적합성 가교제용 폴리에틸렌글리콜 / 폴리 ( 카프로락톤 -co- 락타이드 -co- 글리콜라이드 )( PCLG )에 글루타르산 무수물( Glutraric anhydride)을 사용하여 말단이나 측쇄에 작용기(R)로 카르복실기를 도입

연골유래조직과의 가교도를 높이기 위해 제조한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 말단 또는 측쇄에 작용기(R)을 도입하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로 톨루엔을 용매로 하고, 상기 실시예 2-3 에서 제조한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 히드록시기(OH) 대비 1.5배의 글루타르산 무수물(Glutaric anhydride)을 넣고 아세트산을 촉매로 하여 110 ℃ 하에서 24시간 동안 교반하였다. 이를 ¹H-NMR을 통해 측정하였으며 이를 도 6에 나타내었다.

5. 카프로락톤(CL)과 락타이드 (LA), 글리콜라이드(GA)를 이용한 생체적합성 가교제용 폴리에틸렌글리콜 / 폴리 ( 카프로락톤 -co- 락타이드 -co- 글리콜라이드 )( PCLG )에 석신산 무수물( Succinic anhydride)을 사용하여 말단이나 측쇄에 작용기(R)로 카르복실기를 도입

구체적으로 톨루엔을 용매로 하고, 상기 실시예 2-3 에서 제조한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 히드록시기(OH) 대비 1.5배의 석신산 무수물(Succinic anhydride)을 넣고 1,4-Dioxane, 4-Dimethylaminopyridine(DMAP), Triethylamine(TEA)을 넣어 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 제조한 생분해성 가교제의 말단이나 측쇄에 작용기(R)로 카르복실기가 도입된 것을 확인하였다.

6. 카프로락톤(CL)과 락타이드 (LA), 글리콜라이드(GA)를 이용한 생체적합성 가교제용 폴리에틸렌글리콜 / 폴리 ( 카프로락톤 -co- 락타이드 -co- 글리콜라이드 )( PCLG )에 4-Nitrophenyl Chloroformate을 사용하여 말단이나 측쇄에 작용기(R)를 도입

실시예 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)에 가교도를 높이기 위하여 말단 또는 측쇄에 Chloroformate를 도입하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로 톨루엔을 용매로 하고, 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)에 4-Nitrophenoxy Chloroformate를 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)에 몰량 대비 과량으로 넣고 녹인 후 상온에서 Triethylamine(TEA)을 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 몰량 대비 과량으로 넣어주었다. 그리고 24시간 동안 상온에서 교반시켜 생분해성 가교제를 제조하였다. 이를 ¹H-NMR을 통해 측정하였으며 이를 도 7에 나타내었다.

7. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA), 글리콜라이드(GA)를 이용한 생체적합성 가교제용 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)에 Thioctic acid를 사용하여 말단이나 측쇄에 작용기(R)로 Sulfhydrl기(-SH) 도입

상기 실시예 2-3에서 제조한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)에 Thioctic acid를 넣어 생분해성 가교제의 말단에 S-H기가 도입된 것을 확인하였다.

8. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)와 글리콜라이드(GA)를 이용한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 측쇄나 말단에 도입된 작용기(R) 카르복실기에 DCC, NHS ester를 이용하여 가교그룹(Cx) 도입하여 생분해성 가교제 제조

실시예 2-4에서 제조된 카르복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG), DCC, NHS ester를 각각 1.5배씩 넣고 상온에서 24시간 교반하여 생분해성 가교제를 제조하였고 이를 ¹H-NMR을 통해 측정하였으며 이를 도 8에 나타내었다.

9. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)와 글리콜라이드(GA)를 이용한 폴리에틸렌글리콜 /폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)에 가교그룹(Cx) CDI 를 이용하여 생분해성 가교제 제조

실시예 2-3에서 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 히드록시기(-OH)에 CDI를 이용하여 생분해성 가교제를 제조한다. 구체적으로 1,4-Dioxane을 용매로 하여 PCLG를 녹인 후 CDI를 넣어 37 ℃에서 녹인 후 Dimethyl ether를 이용하여 걸러내어 생분해성 가교제가 제조되었음을 확인하였다.

10. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)와 글리콜라이드(GA)를 이용한 폴리에틸렌글리콜 /폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)에 가교그룹 ( Cx ) N,N’-Disuccinimidyl Carbonate(DSC)를 이용하여 생분해성 가교제 제조

구체적으로 1,4-Dioxane을 용매로 하고, 상기 실시예 2-3에서 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)를 넣고 녹인 후 아세톤에 녹인 N,N’-Disuccinimidyl carbonate(DSC)를 넣고 교반한 후 아세톤을 용매로 한 DMAP를 천천히 넣어 6시간 동안 교반하여 생분해성 가교제가 제조되었음을 확인하였다.

11. 카프로락톤(CL)과 락타이드(LA)와 글리콜라이드(GA)를 이용한 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)에 가교그룹(Cx) N-Hydroxysuccinimidyl chloroformate를 이용하여 생분해성 가교제 제조

상기 실시예 2-3에서 제조된 폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)(PCLG)의 말단의 히드록시기(-OH)와 N-Hydroxysuccinimidyl chloroformate를 이용하여 생분해성 가교제를 제조되었음을 확인하였다.

< 실시예 3> 생체적합성 가교제를 사용한 연골유래조직 가교

실시예 1에서 제조된 연골유래조직을 실시예 2에서 제조한 생체적합성 가교제와 10:0, 9:1, 7:1, 4:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:4, 1:9의 비율로 멸균 3차수에 용해시킨 후 6시간 후 65 ℃ 오븐에 각각 0, 5, 10, 90분, 3시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간 동안 넣은 후 표면의 열처리를 통해 가교도를 조절하고 다시 18시간 동안 37 ℃에서 건조하였다. 실시예 2에서 제조한 생체적합성 가교제와 실시예 1에서 제조된 연골유래조직의 가교반응을 하기 반응식 1에 나타내었다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서, n은 폴리에틸렌글리콜의 반복 단위를 나타내는 것으로 1~100의 정수이며, m은 폴리에스터를 구성하는 구분(segment)을 나타내는 것으로 1~100의 정수이다. R은 생체적합성 가교제용 고분자의 가교도를 높이기 위해 도입한 작용기를 나타내는 것으로 히드록시기(-OH), 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH₂), Chloroformate, Sulfhydrl기(-SH) 등이다. Cx는 생체적합성 가교제용 고분자에 도입하는 가교 그룹을 나타내는 것으로 CDI, DCC, EDC, NHS ester 등이다. R’은 연골유래조직의 작용기로써 생체적합성 가교제용 고분자와 가교하는 부분을 나타내는 것으로, 카르복실기(-COOH), 아민기(-NH₂), Sulfhydrl기(-SH) 등이다.

< 실시예 4> 시트의 세포 유착 방지 기능 확인을 위한 세포 배양

인간 제대정맥 내피세포(HUVECs, Human umbilical vein endothelial cells)를 PKH67 형광 세포 링커 키트를 사용하여 분류하였다. 배양된 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 무혈청 배지로 세척하고, 400x g로 5분간 원심 분리를 실시한다. 원심분리가 진행된 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)에 500 μL의 PKH67 고정액을 넣어 희석시킨다. 5분간 실온에서 배양 후 분류 반응을 멈추기 위해서 FBS를 1 mL를 첨가하고, 1분간 배양하였다. 이후 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 새로운 튜브에 옮겨 400x g로 5분간 원심분리를 실시한 후, 성장 배지로 3번 세척하였다. 직경 12 mm의 24-배양용기에 실시예 1과 실시예 3에서 제작한 시트를 넣고 배양 배지 4시간 동안 배양하였다. 배지를 제거한 후 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)를 24-배양용기에 옮긴 후 각각 1, 3, 7일 동안 배양하였다. 7일간 배양하는 과정에서 배양 배지는 매일 갈아주었다.

< 실험예 1>　제조한 생체적합성 가교제의 분해에 대한 관찰 및 평가

상기 실시예 2에서 제조한 생체적합성 가교제를 20 mL 바이알에 넣은 다음, 인산 완충 용액(PBS)을 10 mL씩 넣고, 37 ℃에서, 100 rpm으로 회전시켰다. 온도를 일정하게 유지하면서 4주까지 일정 시간에 시료를 동결 건조하여 각 시간마다 분자량의 감소를 GPC를 통해 확인하였으며, 이에 대한 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, 개시제로 사용하는 폴리에틸렌글리콜의 분자량과 카프로락톤, 락타이드, 글리콜라이드의 비율에 따라 생분해 기간을 조절할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 2> 생체적합성 가교제를 이용하여 제조한 연골유래조직 시트의 물리적 물성 관찰 및 평가

1. 가교제의 비율에 따른 인장강도 평가

상기 실시예 1과 실시예 3에서 제조한 연골유래조직 시트를 1.5×3 cm의 몰드를 이용하여 인장강도 시편으로 제조하였다. 제조된 시편의 인장강도를 UTM(H5KT)를 이용하여 3 mm/min의 속도로 당겨 측정하였으며, 측정 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 가교제의 함량에 따라 물성 조절의 가능성을 확인하였다.

2. 가교제의 비율에 따른 접촉각 측정

상기 실시예 1과 실시예 3에서 제조한 연골유래조직 시트를 1×1 cm의 정사각형의 모양으로 잘랐다. 제조한 시트에 10 μl의 증류수를 떨어뜨리고 접촉각 측정을 통해 친수성 정도를 확인하였으며, 결과를 도 11에 나타내었다.

도 11에 나타낸 바와 같이, 가교를 실시한 연골유래조직 시트가 가교하지 않은 시트보다 친수성이 낮은 것을 확인하였고, 연골유래조직/가교제의 비율에 따라 친수성을 조절할 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 3>　생체적합성 가교제를 이용하여 제조한 연골유래조직 시트의 분 해에 대한 관찰 및 평가

상기 실시예 1과 실시예 3에서 제조한 연골유래조직 시트를 지름 1.6 cm의 원형으로 절단하여 20 mL 바이알에 넣은 다음, 인산 완충 용액(PBS)을 10 mL씩 넣고, 72시간 동안 37 ℃에서, 100 rpm 환경에서 분해정도를 형태학적으로 확인하였다. 생체적합성 연골유래조직 시트의 가교 유무 및 열처리 조건에 따른 분해거동을 도 12에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 가교를 실시한 연골유래조직 시트는 가교하지 않은 연골유래조직 시트보다 분해되지 않고 형태를 유지함을 확인하였다.

< 실험예 4>　세포 실험을 통한 유착방지 기능 확인

1. 형광 물질을 통한 항유착성 평가

실시예 4에서 배양한 시트에서 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)의 형광물질을 관찰하기 위해 상전이 현미경을 사용하여 1, 3, 7일에 배양용기와 가교된 시트를 관찰하였다. 이는 도 13에 나타내었다.

도 13에서 확인할 수 있듯이 가교된 시트의 표면에는 형광물질이 나타나지 않은 것을 보아 시트 내부에 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)가 들어오지 않은 것으로 보아 제조한 시트가 항유착성을 가지는 것을 확인하였다.

2. 주사형 전자현미경을 통한 항유착성 평가

실시예 4에서 배양한 시트에서 인간 제대정맥 내피세포(HUVECs)의 주사형 전자현미경을 사용하여 1, 3, 7일에 배양용기와 가교된 시트를 관찰하였다. 이는 도 14에 나타내었다.

도 14에서 확인할 수 있듯이 가교된 시트의 표면에는 세포가 부착되지 않은 것으로 보아 제조한 시트가 항유착성을 가지는 것을 확인하였다.

3. 세포 증식 확인을 통한 항유착성 평가

실시예 4에서 배양한 시트를 각각 1, 3, 7일에 해당하는 세포의 수를 센 후 평균값을 계산하였다. 각각의 배양지에 MTT 용액을 100 μL을 넣고 37 ℃에서 30분 간 배양한 후, 배지를 제거하고 PBS 100 μL로 세척 후 PBS를 곧바로 제거하였다. 이후 500 μL의 DMSO가 첨가하여 남아 있는 보라색의 포르마잔 알갱이를 녹인 후 100 μL씩 96-배양용기에 옮겨 광도계를 이용하여 590 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 증식률을 확인하였고 이를 도 15에 나타내었다.

도 15에서 확인할 수 있듯이 가교된 시트의 경우 세포 배양용기와 비교하였을 때 현저하게 적은 세포 수를 확인할 수 있었다. 배양 7일 후에도 세포의 증식률이 낮은 것으로 보아 제조한 시트가 항유착성을 가지는 것을 확인하였다.

<실험예 5>. 동물 실험을 통한 유착방지 기능 확인

1. 동물 실험을 통한 이미징 평가

상기 실시예 3에서 제조한 시트를 UV를 이용하여 멸균 후 장유착 모델의 백서 수컷 8주령을 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 건강한 백서 수컷 8주령을 3일간 실험실에 적응시킨 후, 수술을 진행하였다. 백서를 마취시켜 복부의 털을 깎고 포비돈을 이용하여 소독 후 복부의 정중선을 따라 3∼4 cm 정도 개복하였다. 개복 후 복막과 막창자(cecum)의 장막에 각각 1×1 cm의 상처부위를 만들고, 실시예 3에서 제조한 시트를 1.5×1.5 cm크기로 잘라 상처부위를 다 덮도록 한 후 상처부위가 맞닿은 부위에 넣어주고 고정하였다. 수술이 끝난 백서는 물과 먹이를 충분히 주고 7일간 키운 후, 희생시켜 좌하복부에 새로운 절개선을 가하여 유착 정도를 평가하였고, 이를 도 16에 나타내었다.

도 16에 나타난 바와 같이, 8주령 백서는 실시예 3에서 제조된 시트가 유착을 방지하는 기능을 가짐을 확인하였다.

2. 동물 실험을 통한 조직학적 평가

상기 실험예 5-1에서 적출한 조직을 10% 포르말린에 고정하였고, 고정된 조직을 파라핀 블록으로 만들어 4 μm의 두께로 자른 후 슬라이드에 고정하고 조직학적 평가를 하기 위하여 H&E, ED1 염색을 실시하였다. 상기 H&E의 염색법을 통하여 전체적인 세포 거동과 형태를 확인하였고, 이를 도 17에 나타내었다.

또한, 적출한 조직의 염증 반응을 확인하기 위하여 ED1(mouse anti rat CD68: Serotec, UK) 발현을 확인하였으며, 이를 도 18에 나타내었다.

도 17와 도 18에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 유착방지제가 면역반응이 거의 없으며, 항유착성을 나타냄을 확인하였다.

Claims

인간을 제외한 동물의 연골유래조직을 하기 화학식 1로 표시되는 생체적합성 고분자인 가교제와 반응시켜 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 제조하는 방법.
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 폴리에틸렌글리콜의 반복 단위를 나타내는 것으로 1~100의 정수이며, m은 폴리에스터를 구성하는 구분(segment)을 나타내는 것으로 1~100의 정수이고, -R-은 작용기로 -O-, -COO-, -NH-,
및 -S-로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고, Cx는 가교 그룹으로 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필 카보디이미드 하이드로클로라이드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride; EDC), 디시클로헥실카보이미드(N,N'-Dicyclohexylcarbodiimide; DCC), N-하이드록시석신이미드(N-Hydroxysuccinimide; NHS ester) 및 1,1'-카보닐디이미다졸(1,1'-Carbonyldiimidazole; CDI)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나임.
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 동물은 돼지, 소, 토끼, 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 제조하는 방법.
제1항의 방법에 의하여 제조된 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트.
제9항의 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 포함하는 조직공학용 지지체.
제9항의 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 포함하는 약물전달체.
제9항의 생분해기간 조절이 가능한 생체적합성 연골유래조직 시트를 포함하는 유착방지제.