KR102368108B1 - 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직의 하이드로젤, 이의 제조방법 및 이를 이용한 혈관신생 억제용 조성물 - Google Patents

생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직의 하이드로젤, 이의 제조방법 및 이를 이용한 혈관신생 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 통해 동물 연골 유래 조직을 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직을 포함하는 하이드로젤; 이의 제조방법; 및 이를 이용한 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것이다.

Description

생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직의 하이드로젤, 이의 제조방법 및 이를 이용한 혈관신생 억제용 조성물{HYDROGEL OF BIOCHEMICALLY CROSS-LINKED ANIMAL CARTILAGE-DERIVED MATERIAL AND METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME AND COMPOSITION FOR INHIBITING ANGIOGENESIS USING THE SAME}
본 발명은 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직의 하이드로젤, 이의 제조방법 및 이를 이용한 혈관신생 억제용 조성물에 관한 것이다.
연골은 다른 결합조직과 같이 결합조직세포와 무세포기질로 구성되어 있지만, 고유결합조직과는 달리 단단하면서도 어느 정도 유연성이 있는 기질을 함유한 특수한 결합조직이다. 연골의 결합조직세포는 대부분 연골세포 한가지로 구성되어 있으며, 이러한 연골세포들은 연골 기질 안의 연골소강에 위치해 있다.
무세포기질은 섬유와 무형질로 나누어진다. 섬유성분은 대부분 Ⅱ형 아교질(콜라겐)로 구성되어 있으나, 일부 연골에는 탄력섬유가 풍부하게 있다. 무형질은 주로 황산화글리코스아미노글리칸으로 구성되어 있는 단백당이 주성분을 이루고 있다. 연골기질에서는 많은 수의 단백당 분자가 글리코스아미노글리칸의 하나인 히알루론산에 의해 연결 단백질에 의해 연결되어 거대분자를 이룬다. 이러한 거대분자는 아교섬유와도 결합되어 있다. 단백당 분자는 무형질의 당단백질인 콘드로넥틴에 의해 아교섬유에 부착되어 있다.
기타 기질로는 비-콜라겐 단백질과 당단백질 등이 연골의 건조 중량의 10~15%를 차지하고 있으며, 이들은 주로 기질 거대분자의 구조를 안정화시키고 유기조직을 형성하는 것을 도와준다.
한편, 조직 이식시 세포항원은 숙주에 의해서 인식되므로 조직의 염증반응이나 면역 거부반응을 야기할 수 있다. 하지만 무세포기질의 구성물은 일반적으로 동종 수용자에게는 구성물에 대한 내성이 있기 때문에 심혈관, 혈관, 피부, 신경, 골근, 건, 방광, 간 등을 포함한 조직의 다양한 무세포기질은 조직공학과 재생의학의 응용과 관련하여 많은 연구가 진행되고 있다.
이러한 동물 연골 조직에서 유래한 천연 소재는 세포외기질(Extracellular matrix; ECM)로 구성되어 있다. 세포외기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자들을 공급해주면서 세포가 지낼 수 있는 환경을 제공하고, 높은 생체적합성과 면역반응이 거의 일어나지 않는 특징을 가진다. 하지만 생분해 기간이 짧고 물성이 낮아 실제 적용에 한계를 가진다. 따라서, 이러한 한계를 해결하기 위하여 연골 유래 조직을 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 물성을 증진시킬 필요가 있다.
또한, 혈관신생(angiogenesis)은 조직이나 장기로 신규의 혈관을 생성하는 생물학적 과정으로, 정상적인 상태에서 생체는 신생 혈관 생성을 유도하는 인자들과 억제하는 인자들이 평형을 이루고 있으나, 질환이 유발되는 상황에서는 혈관성장을 촉진하는 인자들이 증가하거나, 억제하는 인자가 제대로 작용하지 못하여 신생 혈관 생성이 자율적으로 조절되지 못하고 계속 성장함으로써 질환으로 발전한다. 이러한 혈관신생이 정상적으로 조절되지 못하면 당뇨성 망막병증, 류마티스성 관절염, 염증, 자궁내막증, 노화에 따른 시력감퇴, 건선, 혈관종 등의 병리학적 장애를 유발하게 된다.
따라서, 동물 연골 조직에서 유래한 천연 소재를 이용하여 혈관신생을 억제하기 위한 용도로 사용함에 있어, 최적화에 대한 연구가 필요한 실정이다.
KR 10-2018-0003438 A
본 발명은 생분해 기간을 조절할 수 있으면서도, 기계적 물성이 향상되며, 혈관신생 억제 효능을 가지는 하이드로젤로서, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 통해 동물 연골 유래 조직을 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직을 포함하는 하이드로젤 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 통해 동물 연골 유래 조직을 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직을 포함하는 하이드로젤을 제공한다.
상기 PEG계 가교제는 말단 작용기로서, N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)가 도입되고, 상기 NHS는 상기 동물 연골 유래 조직의 아민기와 반응할 수 있다.
상기 PEG계 가교제의 평균 몰질량이 200 g/mol 내지 10,000 g/mol일 수 있다.
상기 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직이 필름 형태인 경우, 물에 대한 접촉각이 40.0 °내지 65.0 °일 수 있다.
상기 하이드로젤 내 상기 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직의 함량은 5 중량% 내지 30 중량% 일 수 있다.
상기 하이드로젤의 37℃에서 복합 점도는 1.5 Х 100 Pa·s 내지 7.0 Х 103 Pa·s일 수 있다.
본 발명의 일 구현예로, (a) 동물 연골 유래 조직을 분말화하여 동물 연골 유래 조직 분말을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 동물 연골 유래 조직 분말 함유 수용액을 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제 함유 용액과 혼합 및 가교하여, 가교된 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 제조한 가교된 동물 연골 유래 조직을 건조시켜 다시 분말화한 다음, 완충용액에 분산시켜 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
상기 (b) 단계에서 가교제 용액 내 상기 가교제의 함량은 1 중량% 내지 10 중량%일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 하이드로젤을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물은 주사형 제제일 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 통해 동물 연골 유래 조직을 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직을 포함하는 것으로, 상기 하이드로겔은 생분해 기간을 조절할 수 있으면서도, 복합 점도 감소로 인해 향상된 기계적 물성을 가질 수 있다. 특히, 상기 하이드로겔은 주사형 제제로 적합하게 활용될 수 있고, 혈관신생 억제 효능이 탁월하다.
도 1(a)은 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직의 하이드로젤의 제조 방법을 모식적으로 나타낸 것이고, 도 1(b)는 PEG-400에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 결과를 나타낸 것이며, 도 1(c)는 도 1(b)에서 제조된 PEG-400-COOH에 N-hydroxysuccinimide(NHS)를 도입하는 결과를 나타낸 것이다.
도 2(a)는 실시예 1 및 2에서 제조된 돼지 연골 유래 조직의 아민기(-NH2)에 IR783-COOH를 도입하는 방법을 나타낸 것이고, 도 2(b)는 IR783 형광물질에 카르복실기(-COOH)를 도입하는 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 1 및 2에서 제조된 돼지 연골 유래 조직 파우더를 하이드로젤로 제조하여 주사제형으로 사용이 가능함을 보여주는 사진이다.
도 4는 실시예 2에서 제조된 돼지 연골 유래 조직 필름의 가교제를 달리하였을 때 물에 대한 접촉각을 나타낸 사진 및 그 결과이다.
도 5는 실시예 2에서 제조된 돼지 연골 유래 조직 필름의 가교제를 달리 하였을 때 팽윤 전 후 사진 및 그 결과이다.
도 6은 실시예 4에서 제조된 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 가교정도에 따른 유변학적 성질을 나타낸 결과이다.
도 7(a)는 실시예 4에서 제조된 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 압축강도 측정을 통해 주사가능정도를 보여주는 사진이고, 도 7(b)는 도 7(a)에서 압축되는 거리당 받는 힘을 측정한 결과를 제조된 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 가교정도에 따른 압축강도를 나타낸 결과이고, 도 7(c)는 도 7(b)에서 측정된 최대힘 값을 나타낸 결과이며, 도 7(d)는 도 7(b) 및 (c)의 결과를 통해 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 가교정도와 주사기 바늘의 직경에 따라 주사가능 정도를 나타낸 결과이다.
도 8은 실시예 3에서 제조된 형광물질이 도입된 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤을 사용한 동물실험을 통해 시간별 생분해거동을 나타낸 사진이다.
도 9는 실시예 3에서 적출된 조직을 통한 CD31 염색 사진이다.
본 발명자들은 생체적합성이 우수한 동물 연골 유래 조직을 이용한 연구를 수행하던 중에, 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 이용한 경우, 기계적 물성이 우수한 하이드로젤을 제조할 수 있고, 특히, 혈관신생 억제 효능이 탁월함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 통해 동물 연골 유래 조직을 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직을 포함하는 하이드로젤을 제공한다.
상기 하이드로젤은 물을 분산매로 하는 겔을 지칭하는 것으로, 하이드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창한 상태를 말한다.
상기 하이드로겔은 다공성 구조를 가짐으로써, 줄기세포를 포함하여 지지체로 사용하는 경우, 세포에 충분한 산소 및 양분의 공급을 원활하게 하여 세포의 생존율을 높일 수 있는 이점을 가질 수 있다. 또한, 약물을 담지한 약물 전달체로 사용하는 경우, 약물의 분산을 최소화하면서 효과적으로 표적 세포까지 약물을 전달할 수 있다.
상기 동물 유래 연골 조직은 바람직하게 동물 유래 연골 무세포기질(Cartilage acellular matrix; CAM)을 지칭하며, 대부분 콜라겐으로 구성되는 섬유 성분을 포함한다. 상기 연골 조직이 유래되는 동물은 포유류인 것이 바람직하며, 구체적으로 인간, 돼지, 소, 양, 말 및 고양이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 인간 또는 돼지에서 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 PEG계 가교제는 상기 동물 유래 연골 조직(천연소재)을 화학적으로 가교시키기 위한 생화학적 가교제로서, 상기 PEG계 가교제는 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)가 도입되고, 상기 NHS는 상기 동물 연골 유래 조직의 아민기와 반응하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 PEG계 가교제는 다른 가교제를 통하여 가교하였을 때보다 수분 친화도가 증가한다. 이와 같이 수분 친화도가 증가하게 되면 물에 대한 접촉각은 감소하게 되고, 물에 대한 용해도가 증가하게 된다. 물에 대한 용해도가 증가하게 되면 다른 가교제를 통하여 가교하였을 경우에 대비하여 원 재료인 동물 연골 유래 조직을 더 많이 함유한 하이드로젤을 제조할 수 있는 이점이 있다.
구체적으로, 상기 PEG계 가교제의 평균 몰질량이 200 g/mol 내지 10,000 g/mol일 수 있고, 400 g/mol 내지 4,000 g/mol인 것이 바람직하고, 400 g/mol 내지 2000 g/mol인 것이 더욱 바람직하며, 400 g/mol인 것이 가장 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 PEG계 가교제는 낮은 평균 몰질량을 유지함으로써, 상기 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직(필름 형태)의 물에 대한 접촉각을 낮게 유지하면서, 팽윤도를 증가시킬 수 있다. 일 예로, 상기 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직이 필름 형태인 경우, 물에 대한 접촉각이 40.0 ° 내지 65.0 °일 수 있고, 40.0 ° 내지 50.0 °인 것이 바람직하고, 40.0 ° 내지 45.0 °인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 하이드로젤 내 상기 생화학적으로 가교된 동물 연골 유래 조직의 함량은 5 중량% 내지 30 중량%일 수 있다.
한편, 상기 하이드로젤의 복합 점도는 감소된 것을 특징으로 하는데, 상기 하이드로젤의 37℃에서 복합 점도는 1.5 Х 100 Pa·s 내지 7.0 Х 103 Pa·s 일 수 있고, 1.5 Х 100 Pa·s 내지 1.0 Х 102 Pa·s 인 것이 바람직하고, 1.5 Х 100 Pa·s 내지 1.0 Х 101 Pa·s 인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이와 같이 하이드로젤의 복합 점도를 감소시키기 위해서는, 후술하는 가교제 용액 내 가교제의 함량을 조절함으로써 가교정도를 증가시킬 필요가 있다.
또한, 본 발명은 (a) 동물 연골 유래 조직을 분말화하여 동물 연골 유래 조직 분말을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 동물 연골 유래 조직 분말 함유 수용액을 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제 함유 용액과 혼합 및 가교하여, 가교된 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 제조한 가교된 동물 연골 유래 조직을 건조시켜 다시 분말화한 다음, 완충용액에 분산시켜 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 하이드로젤의 제조방법을 제공한다.
상기 하이드로젤에 대해서는 전술한 바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.
그밖에, 상기 (a) 단계에서 동물 연골 유래 조직의 분말화는 a) 동물 연골 유래 조직을 동결건조하여 분쇄하는 단계; b) 상기 단계 a)에서 분쇄한 연골 유래 조직 분말을 탈세포화하는 단계; 및 c) 상기 단계 b)에서 탈세포화한 연골 유래 조직 분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)을 처리한 후, 염기성 용액으로 중화시켜 연골 유래 조직 분말 수용액을 수득하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.
구체적으로, 상기 동물 연골 유래 조직의 분말화는 동물 연골 유래 조직을 동결건조 및 동결분쇄하는 것을 의미할 수 있다. 상기 동결건조 및 동결분쇄는 전처리된 동물 연골 유래 조직을 이용하여 초저온 조건에서 수행될 수 있고, 이때, 초저온 조건이라 함은, -100 내지 -50℃ 및 0.01 mTorr ~ 10 mTorr 조건을 말한다. 또한, 동결분쇄는 공지의 분쇄기를 사용하여 수행될 수 있고, 상기 제조한 동물 연골 유래 조직 분말은 10μm 내지 100μm 크기를 가질 수 있다.
이후, 상기 제조한 연골 유래 조직 분말을 단백질 분해 효소를 포함하는 수용액에 용해시킨 후, 중화시킨 다음, 단백질 분해 효소를 투석 등의 방법에 의해 제거함으로써 수용성 연골 유래 조직 분말을 제조할 수 있다. 이후, 초저온에서 동결건조를 추가할 수 있다. 이때, 단백질 분해 효소로는 연골 유래 조직 분말을 구성하고 있는 콜라겐을 분해할 수 있는 효소가 사용될 수 있고, 펩신인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 (b) 단계에서 가교제 용액 내 가교제의 함량은 1 중량% 내지 10 중량%일 수 있고, 상기 가교제 용액 내 가교제의 함량이 증가함에 따라 가교정도를 증가시킬 수 있는바, 상기 하이드로젤의 복합 점도를 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 혼합 및 가교는 10 rpm 내지 500 rpm의 속도로, 20℃ 내지 80℃에서 1 시간 내지 30 시간 동안 수행될 수 있고, 일 예로, 상기 혼합 및 가교는 10 rpm 내지 500 rpm의 속도로, 20℃ 내지 50℃의 제1온도에서 10 시간 내지 20 시간 동안 수행된 후, 50℃ 초과 내지 65℃의 제2온도에서 5 시간 내지 10 시간 동안 수행된 다음, 65℃ 초과 내지 80℃의 제3온도에서 1 시간 내지 5 시간 동안 수행될 수 있다. 동물 연골 유래 조직은 후술하는 도 1(a)에 나타난 바와 같이, 두 사슬이 꼬여 있는 helix 구조를 가지고 있는데, 온도를 상승시켜 주면 이러한 helix 구조가 파괴되는 denaturation 현상이 발생하고 상온에서 다시 helix 구조를 형성하게 된다. 이러한 과정을 진행하면 물성을 증가시킬 수 있는 이점이 있다.
상기 (c) 단계에서 분산 전에, 카르복실기를 가지는 형광물질 함유 용액과 추가로 혼합 및 가교할 수 있다. 상기 형광물질은 작용기로 카르복실기를 가짐으로써, 콜라겐의 아민기와 화학 반응할 수 있는 이점을 가진다. 이때, 작용기 도입되기 전 형광물질로는 IR 783, IR 780, FITC(Fluorescein isothiocyanate), rhodamine 및 PI(Propidium iodide) 등을 사용할 수 있다.
그 밖에, 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 주사형 제제를 제공할 수 있다.
상기 하이드로젤에 대해서는 전술한 바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.
상기 주사형 제제는 주사기에 주입가능한 형태를 의미하는 것으로, 일 예로, 상기 주사형 제제는 바늘 내부 직경이 10G 내지 36G인 주사기에 주입가능하는 것이 바람직하고, 직경이 10G 내지 28G인 주사기에 주입가능한 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 주사기의 바늘 내부 직경이 너무 작아지게 되면, 압축거리 당 압축강도가 지속적으로 증가하게 되어 주사불가능한 문제점이 있다.
상기 주사형 제제는 조직수복용, 약물전달용 또는 세포전달용일 수 있다. 구체적으로, 상기 하이드로젤은 내부에 약물 또는 생체활성인자를 담지하여 체내에 주사되는 것을 통해, 약물 또는 생체활성인자의 서방출을 위한 전달체로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 하이드로젤은 내부에 줄기세포를 담지하여 체내에 주사되었을 때, 골분화를 위한 지지체로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 혈관신생 억제용 약학 조성물을 제공한다.
상기 하이드로젤에 대해서는 전술한 바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다. 먼저, 상기 하이드로겔은 동물 연골 유래 조직을 이용한 것으로, Small intestinal submucosa(SIS)를 이용한 것에 비해 혈관신생 억제 효능을 크게 향상시킬 수 있다. 또한, 상기 하이드로겔은 생화학적 가교제로서, PEG계 가교제를 사용한 경우로서, 이를 생략한 경우에 비해 혈관신생 억제 효능을 향상시킬 수 있다.
상기 혈관신생 억제라 함은 조직이나 장기로 신규의 혈관을 생성하는 생물학적 과정을 억제하는 것을 의미하는 것으로, 당뇨병성 망막증, 미숙아 망막증, 각막 이식 거부, 신생혈관 녹내장, 홍색증, 증식성 망막증, 건선, 혈우병성 관절, 아테롬성 동맥경화 플라크 내에서의 모세혈관 증식, 켈로이드, 상처 과립화, 혈관 접착, 류마티스 관절염, 골관절염, 자가면역 질환, 크론씨병, 재발협착증, 아테롬성 동맥경화, 장관 접착, 캣 스크래치 질환, 궤양, 간경병증, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 악성 신경화증, 혈전성 미소혈관증, 기관 이식 거부, 신사구체병증, 당뇨병, 혈관형성-의존성 암, 양성 종양, 염증성 질환 및 신경퇴행성 질환으로 이루어진 군 으로부터 선택된 혈관신생 관련 질환 예방 또는 치료를 의미할 수 있다.
상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 경구제 또는 비경구제 형태로 제형화될 수 있고, 주사형 제제로 제형화되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
이와 같은 제형화를 위하여, 상기 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
특히, 비경구제 형태(특히, 주사형 제제)에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 피부, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 하이드로젤은 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 통해 동물 연골 유래 조직을 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직을 포함하는 것으로, 상기 하이드로겔은 생분해 기간을 조절할 수 있으면서도, 복합 점도 감소로 인해 향상된 기계적 물성을 가질 수 있다. 특히, 상기 하이드로겔은 주사형 제제로 적합하게 활용될 수 있고, 혈관신생 억제 효능이 탁월하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다
실시예 1: 돼지에서의 연골 유래 조직 분리 및 수용성 연골 유래 조직 파우더의 제조
무균 조건에서 6개월된 100kg 정도의 돼지의 앞다리 및 뒷다리로부터 관절 연골을 분리하였다. 분리 시에는 연골 하골 부분을 포함하지 않고 연골 부분만 분리회도록 블레이드로 잘라낸 후, 인산 완충 수용액으로 세척하였다. 분리한 관절 연골 조직을 pH 8.0의 10 mM Tris-HCl의 저장 완충액으로 12시간 처리 한 후, 원심분리기를 이용하여 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 침전된 돼지 연골 유래 파우더를 비커에 옮긴 후 SDS 완충액을 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 이후 멸균 3차수를 넣고 원심분리기를 이용해 2,000 rpm에서 10 분간 원심 분리 하여 상층액을 제거한 후 침전된 돼지 연골관절을 비커에 옮기고, DNase 용액을 첨가해 100 rpm으로 12시간 동안 교반하였다. 이후 2,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하고, 상층액을 제거 한 후 액체질소 내에서 pre-cooling 50 초/grinding(60 Hz) 240 초/cooling 50초로 3 cycle 조건으로 동결 분쇄하여 돼지 연골 유래 조직 파우더를 수득하였다. 수득한 파우더를 비커에 담아 DNase 용액을 첨가해 100 rpm으로 12시간 동안 교반하였다. 이후, 용액을 원심분리기를 이용하여 2,000 rpm으로 10 분동안 원심분리하고, 상층액을 제거 후 소량의 멸균 3차수를 첨가해 돼지 연골 유래 파우더를 현탁하여 초저온 냉동고에서 -70℃ 및 5 mTorr 조건에서 48 시간동안 동결건조하였다. 동결 건조된 돼지 연골 유래 파우더를 1 g 당 25 ㎖의 800 unit/㎖ 펩신 수용액을 첨가하여 교반하여 용액을 준비하였다. 준비된 용액에 NaOH 용액을 첨가하여 pH 7.4로 맞춰 중화시킨 후, 투석만 한쪽 끝을 고정시킨후 중화시킨 용액을 투석막 안에 부어준 다음, 나머지 한쪽 끝을 고정시킨 후 멸균 3차수 2 L에 넣고 4℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 투석을 마친 펩신 수용액을 동결건조할 용기에 담아 초저온 냉동고로 -70℃ 및 0 mTorr 조건에서 48 시간 동안 동결건조하여 수용성 돼지 연골 유래 파우더를 제조하였다.
실시예 2: Poly ethylene glycol 400을 이용한 돼지 연골 유래 조직의 생화학적 가교 반응
실시예 1에서 제조된 수용성 돼지 연골 유래 파우더 0.2 g을 30 mL 바이알에 첨가하고, 멸균된 3차증류수 15 mL에 분산시켜 상온에서 24 시간 교반하였다. 교반 후, 용액을 테프론몰드(75 mm × 75 mm)에 부어주고 생화학적 가교제인 PEG-400-NHS 용액을 1%, 3%, 5% 및 7%로 각각 1.5 mL씩 유리 파이펫으로 고르게 적가한 후, 37 ℃에서 100 rpm 의 속도로 12 시간 동안, 60 ℃에서 100 rpm 의 속도로 6 시간 동안, 70 ℃에서 100 rpm 의 속도로 3 시간 동안 shaker 에서 반응 및 건조시킨다. 건조된 고체 형태의 가교된 돼지 연골 유래 조직을 37 ℃에서 100 rpm으로 shaker에서 멸균된 3차 증류수와 인산완충용액으로 각각 3회씩 30 분간 번갈아 가며 세척하고 48 시간동안 동결건조하여 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 파우더를 제조하였다(도 1(a)~(c)).
실시예 3: 근적외선 형광이미징을 위한 형광물질을 포함하는 돼지 연골 유래 파우더 제조
실시예 1 또는 2에서 제조된 돼지 연골 유래 조직의 아민기(-NH2)에 형광물질을 도입하기 위해 먼저, 50 mL 둥근바닥 플라스크에 IR783(80 mg, 0.11 mmol) 및 4-mercaptobenzoic acid(51 mg, 0.33 mmol)를 DMF(3 mL)에 용해시키고, 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 후, 반응된 용액에서 미반응 물질 및 불순물을 제거하기 위하여 에탄올 및 디에틸에테르 혼합용매(v/v = 1/19) 30 mL에 침전시키고 여과하여 얻어진 초록색 고체를 진공 건조하여 IR783-COOH를 제조하였다.
다음으로, 20 mL 바이알에 IR783-COOH(1.4 mg, 1.6 μμmol) 및 DMTMM(0.66 mg, 2.4 μmol)을 멸균된 3차 증류수(5 mL)에 용해시키고, 실시예 1 또는 2에서 제조된 돼지 연골 유래 파우더(0.1 g)를 IR783-COOH 용액에 첨가 하여, 혼합 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 후, 반응 용액을 투석막(molecular weight cut-off: 2.0 kDa, Spectrum Laboratories, CA, USA)에 부어준 다음 3차 증류수 내에서 3 일간 투석하여 미반응물을 제거하고, 4 일 동안 동결 건조시켜 형광물질이 포함된 돼지 연골 유래 파우더를 제조하였다(도 2(a)~(b)).
실시예 4: 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 제조
실시예 1 또는 2에서 제조된 돼지 연골 유래 파우더를 5 mL 바이알에 각각 10, 15 또는 20 중량% 로 인산완충용액에 고르게 분산시켜 하이드로젤을 제조하였으며, 주사제형으로 사용 가능한 하이드로젤이 형성됨을 확인하였다(도 3).
실험예 1: 생화학적 가교제의 종류에 따른 돼지 연골 유래 조직 필름의 접촉각 및 팽윤도 조절 평가 및 분석
(1) 생화학적 가교제 종류에 따른 필름의 접촉각 평가
실시예 2에서 제조된 돼지 연골 유래 조직 필름의 접촉각 평가를 위해 0.01 mL의 3차 증류수를 필름에 떨어뜨려 contact angle goniometer (Phoenix 150, Suwon, Korea)를 이용하여 측정 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, 생화학적 가교제로서, PEG계 가교제를 사용한 경우(CAM-PEG-400, CAM-PEG-2000 및 CAM-PEG-4000), 글루타르알데히드를 사용한 경우(CAM-GA)에 비해, 물에 대한 접촉각이 크게 감소하는 것으로 확인된다. 또한, PEG계 가교제를 사용한 경우 중에서, 그 길이가 감소함에 따라 물에 대한 접촉각 역시 감소하는 경향을 가지는 것으로 확인된다.
(2) 생화학적 가교제 종류에 따른 필름의 팽윤도 평가
실시예 2에서 제조된 돼지 연골 유래 조직 필름의 팽윤도를 평가하기 위해 15 mm X 15 mm의 크기로 자른 돼지 연골 유래 조직을 초저온 냉동고로 -70℃ 및 0 mTorr 조건에서 48 시간동안 동결건조 하여 수분을 완전히 제거한 후 필름의 무게를 측정한 후 3차 증류수에 담지하여 3h, 6h, 12h 이후에 수분을 함유한 필름의 무게를 측정하여 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 생화학적 가교제로서, PEG계 가교제를 사용한 경우(CAM-PEG-400, CAM-PEG-2000 및 CAM-PEG-4000), 글루타르알데히드를 사용한 경우(CAM-GA)에 비해, 팽윤도가 크게 증가하는 것으로 확인된다. 또한, PEG계 가교제를 사용한 경우 중에서, 그 길이가 길어짐에 따라 팽윤도가 너무 증가하여 분해거동에 따른 문제점을 가지는 것으로 확인된다. 구체적으로, CAM-PEG-400은 6시간 이후에 수분을 함유한 무게가 일정하게 유지되지만, CAM-PEG-4000은 동일시간내에 가교반응의 효율이 낮아 6시간 이후에 구조의 파괴에 의한 무게가 감소하는 것으로 확인된다. 또한, 후술하는 도 8에서 가교제의 함량에 따른 분해거동이 나타나 있는데, 이를 통하여 가교제의 길이에 따른 분해거동을 유추할 수 있다. 즉, 가교제의 농도가 증가하면 하이드로젤의 수분 함유량이 증가하게 되고, 마찬가지로 가교제의 길이가 증가하게 되면 하이드로젤의 수분 함유량이 증가하게 되고, 도 8 에서 나타난 결과와 같이 분해기간은 짧아질 것으로 판단된다.
실험예 2: 생화학적 가교 정도에 따른 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 기계적 물성 조절 평가 및 분석
(1) 생화학적 가교 정도에 따른 하이드로젤의 유변학적 특성 평가
실시예 4에서 제조된 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 중량비 및 가교 정도에 따른 유변학적인 특성을 측정하기 위해 rheometer(MCR 102, Anton Paar, Ostfildern, Germany)를 이용하여 37 ℃에서의 탄성률 및 복합점도 값을 측정하였으며, 측정 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 돼지 연골 유래 조직의 가교정도가 증가함에 따라 하이드로젤의 복합점도가 감소하는 경향을 확인하였고, 돼지 연골 유래 조직의 가교 정도를 조절하여 하이드로젤의 기계적 물성을 조절의 가능성을 확인하였다.
(2) 생화학적 가교 정도에 따른 하이드로젤의 압축강도 및 주사가능성 평가
실시예 4에서 제조된 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 가교 정도에 따른 압축강도를 측정하여 주입가능성을 정량적으로 판단하기 위해, 도 7(a)에 도시한 방법을 사용하였다. 2 mL 주사기에 하이드로젤을 담지시켜 UTM(H5KT)를 이용하여 10 mm/min 의 속도로 압축하여 하였으며, 주사기 바늘의 내부 직경을 30, 26G 을 사용하여 측정 결과를 도 7(b)에 나타내었고, 압축시 측정된 최대 힘 값을 도 7(c)에 나타내었다.
도 7(b)에 나타난 바와 같이, 압축 거리당 받는 힘이 일정하게 유지되는 곡선은 주사가능정도가 수월하게 관찰되었으며, 압축거리당 받는 힘이 지속적으로 증가하는 곡선의 경우 주사 불가능하게 나타남을 확인하였으며, 결과에 대한 주사가능 여부를 도 7(d)에 나타내었다.
도 7(d)의 결과를 통해, 돼지 연골 유래 조직의 가교정도가 증가함에 따라 주사가능 정도는 증가하는 경향을 보이며, 주사기 바늘 내부 직경의 길이가 감소할수록 주사기 바늘 내부에 가해지는 압력이 증가하여 주사가능 정도가 감소하는 경향을 확인하였다.
실험예 3: 근적외선 형광이미징을 통한 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤의 생분해 기간 관찰 및 평가
실시예 3에서 제조된 IR783 형광물질이 도입된 돼지 연골 유래 조직 파우더를 UV 및 70% 에탄올을 사용하여 멸균 후 pH가 7.4인 인산완충용액에 20 중량%의 하이드로젤을 제조하여, nude mouse(male, 8주령)의 피하에 1 mL 주사기(26 G)로 0.15 mL 주입하여, 각 시간에 따른 형광이미징 관찰 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, 전체적으로 시간이 지나면서 형광발현의 정도는 감소하며, 돼지 연골 유래 조직의 가교정도가 증가함에 따라 형광유지기간이 감소하는 경향을 확인하여, 가교정도에 따라 생체 내 분해속도 조절의 가능성을 확인하였다. 즉, 가교정도가 증가함에 따라 수분을 많이 함유하게 되고, 이에 따라 동물 연골 유래 조직의 분해에 이용되는 물질들을 하이드로젤 내부에 더 많이 함유시키는바, 생체 내 분해속도를 증가시킨 것으로 볼 수 있다.
실험예 4: 생체 내 면역학적 혈관신생 억제 평가
실험예 2에서 적출한 조직을 10% 포르말린에 고정하였고, 고정한 조직을 파라핀 블록으로 만들어 4 μm의 두께로 자른 후 슬라이드에 고정하고 면역학적 혈관신생 억제 평가를 하기 위하여 CD31(anti-CD31 antibody ab28364: abcam, UK) 염색을 실시하여 이를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 가교된 돼지 연골 유래 조직의 하이드로젤에서는 혈관 거의 나타나지 않으므로 혈관신생을 억제할 수 있음을 확인하였다.

Claims (10)

  1. 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 통해 동물 연골 유래 조직을 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직을 5 중량% 내지 30 중량%로 포함하며, 직경이 10-28G 인 주사기로 주입가능하고, 혈관신생을 억제하는 생분해 기간이 조절 가능한 하이드로젤로서,
    상기 생화학적으로 가교시킨 동물 연골 유래 조직이 필름 형태인 경우, 물에 대한 접촉각이 40.0 ° 내지 65.0 ° 이며,
    상기 하이드로젤의 37℃에서 복합 점도는 1.5 Х 100 Pa·s 내지 1.0 Х 101 Pa·s 이고,
    상기 PEG계 가교제는 평균 몰질량이 400 g/mol 내지 2,000 g/mol 이고, 1 중량% 내지 10 중량% 으로 포함되며, 말단 작용기로서, N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)가 도입되고, 상기 NHS는 상기 동물 연골 유래 조직의 아민기와 반응하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤.
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  7. (a) 동물 연골 유래 조직을 분말화하여 동물 연골 유래 조직 분말을 제조하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 동물 연골 유래 조직 분말 함유 수용액을 폴리에틸렌글리콜(polyethylene glycol; PEG)계 가교제를 1 중량% 내지 10 중량%로 함유하는 용액과 혼합 및 가교하여, 가교된 동물 연골 유래 조직을 제조하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계에서 제조한 가교된 동물 연골 유래 조직을 건조시켜 다시 분말화한 다음, 완충용액에 분산시켜 5 중량% 내지 30 중량%로 포함하는 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는
    직경이 10-28G 인 주사기로 주입가능하고, 혈관신생을 억제하는 생분해 기간이 조절 가능한 하이드로젤의 제조방법으로서,
    상기 가교된 동물 연골 유래 조직이 필름 형태인 경우, 물에 대한 접촉각이 40.0 ° 내지 65.0 ° 이며,
    상기 하이드로젤의 37℃에서 복합 점도는 1.5 Х 100 Pa·s 내지 1.0 Х 101 Pa·s 이고,
    상기 PEG계 가교제는 평균 몰질량이 400 g/mol 내지 2,000 g/mol 이고, 말단 작용기로서, N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS)가 도입되고, 상기 NHS는 상기 동물 연골 유래 조직의 아민기와 반응하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤의 제조방법.
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