KR102250064B1

KR102250064B1 - 생분해 기간 및 물성 조절 가능한 동물 연골 유래 조직 하이드로젤의 제조 방법

Info

Publication number: KR102250064B1
Application number: KR1020180138022A
Authority: KR
Inventors: 김문석; 민병현; 강태웅; 박준영; 박승훈
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2018-11-12
Filing date: 2018-11-12
Publication date: 2021-05-07
Also published as: KR20200054578A

Abstract

본 발명은 동물 연골유래 조직을 가교화하여 제조된 하이드로젤 및 이의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 생체적합성 동물 연골 유래 조직 하이드로젤은 가교제의 함량 등에 따라 생화학적 가교에 의해 생분해 기간을 지연시킬 수 있고, 기계적인 물성을 증가시킬 수 있으며, 가교 결합의 형성 정도에 따라 생분해 기간 및 기계적인 물성을 조절할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 본 발명에 따른 동물 연골 유래 조직 하이드로젤은 주사형 제제로 이용되어, 조직수복, 약물전달 또는 세포전달 등을 위해 사용될 수 있는 특징이 있다.

Description

생분해 기간 및 물성 조절 가능한 동물 연골 유래 조직 하이드로젤의 제조 방법{Preparation of cartilage acellular matrix hydrogel with controllable biodegradation and properties}

본 발명은 동물 연골 유래 조직을 가교화하여 제조된 하이드로젤 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.

연골은 다른 결합조직과 같이 결합조직세포와 무세포기질로 구성되어 있지만, 고유 결합 조직과는 달리 단단하면서도 어느 정도 유연성이 있는 기질을 함유한 특수한 결합조직이다. 연골의 결합 조직 세포는 대부분 연골세포 한가지로 구성되어 있으며, 이러한 연골세포들은 연골 기질 안의 연골소강에 위치해 있다.

무세포기질은 섬유와 무형질로 나누어진다. 섬유성분은 대부분 Ⅱ형 아교질(콜라겐)로 구성되어 있으나, 일부 연골에는 탄력섬유가 풍부하게 있다. 무형질은 주로 황산화 글리코스아미노글리칸으로 구성되어 있는 단백당이 주성분을 이루고 있다. 연골기질에서는 많은 수의 단백당 분자가 글리코스아미노글리칸의 하나인 히알루론산에 의해 연결 단백질에 의해 연결되어 거대분자를 이룬다. 이러한 거대분자는 아교섬유와도 결합되어 있다. 단백당 분자는 무형질의 당단백질인 콘드로넥틴에 의해 아교섬유에 부착되어 있다.

기타 기질로는 비-콜라겐 단백질과 당단백질 등이 연골의 건조 중량의 10~15%를 차지하고 있으며, 이들은 주로 기질 거대분자의 구조를 안정화시키고 유기 조직을 형성하는 것을 도와준다.

이러한 동물 연골 조직에서 유래한 천연 소재는 세포외기질(Extracellular matrix; ECM)로 구성되어 있다. 세포외기질은 세포가 성장하고 분화하는데 필요한 화학적 인자들을 공급해주면서 세포가 지낼 수 있는 환경을 제공하고, 높은 생체적합성과 면역반응이 거의 일어나지 않는 특징을 가진다. 하지만 생분해 기간이 짧고 물성이 낮아 실제 적용에 한계를 가진다. 따라서, 이러한 한계를 해결하기 위하여 연골유래 조직을 물리적 또는 화학적 처리를 통하여 물성을 증진시킬 필요가 있다.

최근에 주입형 하이드로젤은 의료 분야에서 많은 관심을 받고 있는데, 의료용 충진제로부터 생리활성 물질의 방출시스템, 삼차원 구조를 이용한 기관 또는 조직재생 등 폭넓게 이용될 수 있을 것으로 전망된다. 이러한 주입형 하이드로젤은 외과적인 수술과정 없이 주사기 등을 사용하여 간단하게 생체 내에 주입될 수 있다는 장점을 가지고있다. 일반적으로 주입형 하이드로젤의 경우 체외에서는 유체와 같은 특성을 가지고 있어 주사기를 사용하여 이식이 가능하고, 체내에 주입 후에는 젤화가 일어난다. 그러므로 이식 후에는 약물이나 생리활성 물질의 지속적인 방출을 위한 약물 전달 시스템 또는 세포의 성장을 유지할 수 있는 지지체로서의 역할을 할 수 있다. 또한 다양한 가교 방법을 도입하여 하이드로젤의 젤화 시간, 팽윤 정도, 분해 및 기계적 물성과 같은 물리화학적 특성을 조절할 수 있어, 원하는 목적에 따른 하이드로젤을 제조하여 약물전달 시스템이나 조직공학에 이용하는 데 큰 장점이 된다.

이에, 본 발명자들은 물성을 조절할 수 있는 하이드로젤 및 이의 제조 방법을 제공하기 위해 노력한 결과, 천연소재인 동물 연골 유래 조직을 가교화하여 하이드로젤을 제조하였으며, 이는 가교제의 함량 등에 따라 생분해 기간 및 기계적 물성 조절이 가능하므로, 생체적합성을 가지는 조직수복, 약물전달 또는 세포전달 등을 위한 주사형 제제로 이용할 수 있을 것으로 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

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국내공개특허공보 제10-2018-0003438호 (2018.01.09.자 공개)

천연소재의 경우 생체적합성이 우수한 반면 생분해 속도 및 기계적 물성의 조절이 어렵기 때문에, 천연소재로서의 응용에는 한계가 있고 기계적 물성의 증가 및 화학적 처리에 의하여 물성을 증진시켜야만 한다.

이에, 본 발명자들은 천연소재인 동물 연골 유래 조직을 이용하여 가교제로화학적인 반응을 통하여 쉽게 분해되지 않는 젤 형성이 가능하고, 가교제의 함량 등에 따라 생분해 기간 및 기계적 물성 조절이 가능한 생체적합성 연골 유래 조직 하이드로젤을 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명은 (a) 동물 연골 유래 조직을 분말화하여 연골 유래 조직 분말을 제조하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 제조한 연골 유래 조직 분말 함유 수용액을 가교제 함유 용액과 혼합 및 가교하여, 가교된 연골 유래 조직을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 제조한 가교된 연골 유래 조직을 건조시켜 다시 분말화한 다음, 완충용액에 분산시켜 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하는 하이드로젤의 제조 방법을 제공한다.

상기 (a) 단계에서 동물은 인간, 돼지, 소, 양, 말 및 고양이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 (b) 단계에서 가교제는 알데하이드기, 에폭시기, 이미드기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 가질 수 있다.

상기 (b) 단계에서 연골 유래 조직 분말 및 가교제의 총 함량에 대하여, 상기 가교제의 함량은 0.05 중량% 내지 10 중량%일 수 있다.

상기 (c) 단계에서 분산은 가교된 연골 유래 조직 분말을 완충용액에 5 중량% 내지 30 중량%로 분산될 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 방법으로 제조된 하이드로젤을 제공한다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 하이드로젤을 포함하는 주사형 제제를 제공한다.

상기 주사형 제제는 조직수복용, 약물전달용 또는 세포전달용일 수 있다.

본 발명에 따른 생체적합성 동물 연골 유래 조직 하이드로젤은 가교제의 함량 등에 따라 생화학적 가교에 의해 생분해 시간을 지연시킬 수 있으며, 기계적인 물성을 증가 시킬 수 있으며, 가교 결합의 형성 정도에 따라 생분해 기간 및 기계적인 물성을 조절할 수 있다는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 따른 동물 연골 유래 조직 하이드로젤은 주사형 제제로 이용되어, 조직수복, 약물전달 또는 세포전달 등을 위해 사용될 수 있는 특징이 있다.

도 1a 및 b는 실시예 1에 따라 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말의 제조 방법을 나타낸 것이다.
도 2a는 실시예 4~6에 따른 IR783-COOH의 제조 방법을 나타낸 것이고, 도 2b는 실시예 4~6에 따라 형광물질이 도입되고, 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말의 제조 방법을 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 7에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤을 보여주는 사진이다.
도 4a 내지 c는 실시예 7~9에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 유변학적 특성(저장탄성률, 손실탄성률 및 복합 점도)을 측정한 결과를 비교한 그래프이다.
도 5a 내지 d는 실시예 7에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 압축강도 및 주사가능성을 평가한 것이다.
도 6은 실시예 4에 따라 형광물질이 도입되고, 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 이용한 하이드로젤에 대한 동물실험을 수행한 결과, 생분해 거동을 을 관찰 및 평가한 사진이다.
도 7a 및 b는 실시예 4에 따라 형광물질이 도입되고, 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 이용한 하이드로젤에 대한 동물실험을 수행한 결과, 적출한 조직의 hematoxylin and eosin (H&E) 염색 및 ED1(mouse anti rat CD68: Serotec, UK) 염색 사진이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 명세서 내“하이드로젤”은, 물을 분산매로 하는 겔을 지칭하는 것으로, 하이드로졸이 냉각으로 인하여 유동성을 상실하거나 3차원 망목구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창한 상태를 말한다.

상기 하이드로젤은 다공성 구조를 가짐으로써, 약물을 담지한 약물 전달체로 사용하는 경우, 약물의 분산을 최소화하면서 효과적으로 표적 세포까지 약물을 전달할 수 있다. 또한, 줄기세포를 포함하여 지지체로 사용하는 경우, 세포에 충분한 산소 및 양분의 공급을 원활하게 하여 세포의 생존율을 높일 수 있는 이점을 가질 수 있다.

먼저, 본 발명에 따른 하이드로젤의 제조 방법은 동물 연골 유래 조직을 분말화하여 연골 유래 조직 분말을 제조하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.

본 명세서 내 “연골 유래 조직”은 동물 유래 연골 조직, 바람직하게 동물 유래 연골 무세포기질(Cartilage acellular matrix; CAM)을 지칭하며, 대부분 콜라겐으로 구성되는 섬유 성분을 포함한다. 상기 연골 조직이 유래되는 “동물”은 포유류인 것이 바람직하며, 구체적으로 인간, 돼지, 소, 양, 말 및 고양이로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 보다 바람직하고, 더욱 구체적으로 인간 또는 돼지에서 유래된 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 동물 연골 유래 조직의 분말화는 a) 동물 연골 유래 조직을 동결건조하여 분쇄하는 단계; b) 상기 단계 a)에서 분쇄한 연골 유래 조직 분말을 탈세포화하는 단계; 및 c) 상기 단계 b)에서 탈세포화한 연골 유래 조직 분말을 산성 용액 및 펩신(pepsin)을 처리한 후, 염기성 용액으로 중화시켜 연골 유래 조직 분말 수용액을 수득하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

구체적으로, 상기 동물 연골 유래 조직의 분말화는 동물 연골 유래 조직을 동결건조 및 동결분쇄하는 것을 의미할 수 있다. 상기 동결건조 및 동결분쇄는 전처리된 동물 연골 유래 조직을 이용하여 초저온 조건에서 수행될 수 있고, 이때, 초저온 조건이라 함은, -100 내지 -50℃ 및 0.01 mTorr ~ 10 mTorr 조건을 말한다. 또한, 동결분쇄는 공지의 분쇄기를 사용하여 수행될 수 있고, 상기 제조한 연골 유래 조직 분말은 10μm 내지 100μm 크기를 가질 수 있다.

이후, 상기 제조한 연골 유래 조직 분말을 단백질 분해 효소를 포함하는 수용액에 용해시킨 후, 중화시킨 다음, 단백질 분해 효소를 투석 등의 방법에 의해 제거함으로써 수용성 연골 유래 조직 분말을 제조할 수 있다. 이후, 초저온에서 동결건조를 추가할 수 있다. 이때, 단백질 분해 효소로는 연골 유래 조직 분말을 구성하고 있는 콜라겐을 분해할 수 있는 효소가 사용될 수 있고, 펩신인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

다음으로, 본 발명에 따른 하이드로젤의 제조방법은 상기 (a) 단계에서 제조한 연골 유래 조직 분말 함유 수용액을 가교제 함유 용액과 혼합 및 가교하여, 가교된 연골 유래 조직을 제조하는 단계[(b) 단계]를 포함한다.

본 명세서 내 “가교제”로는 화학적 가교제를 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 화학적 가교제는 고분자 사슬 간의 가교결합을 형성시켜 체액에 의해 분해되는 것을 억제시켜, 이로 인해 인체 내에서 본 발명에 따른 하이드로젤이 분해되는 기간의 조절을 가능하게 한다. 즉, 천연소재를 사용한 지지체는 가교제의 처리를 통해 기계적 물성을 향상시킬 수 있다.

상기 가교제는 알데하이드기, 에폭시기, 이미드기, 아민기 및 카르복실기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 작용기를 가지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

구체적으로, 알데하이드기를 작용기로 가지는 가교제로는 포름알데하이드, 글루타르알데하이드 또는 덱스트린 알데하이드 등을 사용할 수 있다. 또한, 에폭시기를 작용기로 가지는 가교제로는 부탄디올디글리시딜에테르(1,4-butandiol diglycidyl ether: BDDE), 에틸렌글리콜디글리시딜에테르(ethylene glycol diglycidyl ether: EGDGE), 헥산디올디글리시딜에테르(1,6-hexanediol diglycidyl ether), 프로필렌글리콜디글리시딜에테르(propylene glycol diglycidyl ether), 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르(polypropylene glycol diglycidyl ether), 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르(polytetramethylene glycol) 등을 사용할 수 있다. 또한, 이미드기를 가지는 가교제로는 1-에틸-3-(3-디메틸 아미노프로필카보이미드), 1-에틸-3-(2-몰포리닐-4-에틸) 카보이미드 또는 디시클로헥실카보이미드 등을 사용할 수 있다. 또한, 아민기 또는 카르복실기를 작용기로 가지는 가교제로는 측쇄 또는 말단에 아민기 또는 카르복시기를 갖는 생체적합성 고분자를 사용할 수 있다. 상기 생체적합성 고분자는 폴리에틸렌글리콜 기반으로 폴리카프로락톤을 포함할 수 있고, 글리콜라이드, 락타이드 등의 단량체의 공중합들로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 가교제의 알데하이드기, 에폭시기 또는 카르복실기는 콜라겐의 아민기와 화학 반응할 수 있고, 가교제의 이미드기 또는 아민기는 콜라겐의 카르복실기와 화학 반응함으로써 가교될 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 가교제의 가장 바람직한 예로서, 글루타르알데하이드(glutaraldehyde) 수용액을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 상기 연골 유래 조직 분말 및 가교제의 총 함량에 대하여, 상기 가교제의 함량은 0.05 중량% 내지 10 중량%인 것이 바람직하고, 0.05 중량% 내지 1 중량% 미만인 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 가교제의 함량이 증가함에 따라, 저장탄성률 및 복합점도가 증가하는 경향을 보인다. 이때, 연골 유래 조직 분말에 비해 가교제가 과도하게 혼합되는 경우, 연골 유래 조직 분말 간 가교 결합이 과도하게 형성되어 제조된 하이드로젤을 적용할 시에 주사가능 정도의 한계가 있을 수 있으며, 내부의 공간이 감소하고, 체내에서 분해되는 속도가 지연될 수 있어, 이를 주사형 제제로 이용할 때 제한이 따를 수 있다. 반대로, 연골 유래 조직 분말에 비해 가교제가 너무 적게 혼합되는 경우, 유의적인 가교 결합이 형성되지 않으므로 탄성률, 압축 강도 및/또는 유변학적 특성 등의 기계적 특징이 유의적으로 나타나지 않을 수 있다.

상기 혼합 및 가교는 20℃ 내지 50℃에서 10 rpm 내지 500 rpm의 속도로, 1 시간 내지 20 시간 동안 수행될 수 있고, 30℃ 내지 40℃에서 50 rpm 내지 200 rpm의 속도로, 5 시간 내지 20 시간 동안 수행되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

다음으로, 본 발명에 따른 하이드로젤의 제조 방법은 상기 (b) 단계에서 제조한 가교된 연골 유래 조직을 건조시켜 다시 분말화한 다음, 완충용액에 분산시켜 하이드로젤을 제조하는 단계[(c) 단계]를 포함한다.

상기 분산 전에, 카르복실기를 가지는 형광물질 함유 용액과 추가로 혼합 및 가교할 수 있다. 상기 형광물질은 작용기로 카르복실기를 가짐으로써, 콜라겐의 아민기와 화학 반응할 수 있는 이점을 가진다. 이때, 작용기 도입되기 전 형광물질로는 IR 783, IR 780, FITC(Fluorescein isothiocyanate), rhodamine 및 PI(Propidium iodide) 등을 사용할 수 있다.

상기 분산은 가교된 연골 유래 조직 분말을 완충용액에 5 중량% 내지 30 중량%로 분산될 수 있고, 15 중량% 내지 30 중량%로 분산되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 완충용액 내 가교된 연골 유래 조직 분말의 함량이 증가함에 따라, 저장탄성률, 손실탄성률 및 복합점도가 증가하는 경향을 보인다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 하이드로젤을 제공한다.

일 예로, 상기 하이드로젤의 0.1 Hz 내지 10 Hz의 주파수 범위에서, 레오미터를 이용하여 측정된 저장탄성률(G') 및 손실탄성률(G”)은 각각 5.0 × 10² Pa 내지 1.0 × 10⁴ Pa 및 1.0 Х 10¹ Pa 내지 5.0 Х 10² Pa 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 하이드로젤의 37℃에서 복합 점도는 5.0 Х 10¹ Pa·s 내지 1.0 Х 10³Pa·s 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 유변학적 특성은 가교제의 함량, 완충용액 내 가교된 연골 유래 조직 분말의 함량의 특정에 따른 것으로 볼 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 하이드로젤을 포함하는 주사형 제제를 제공한다.

상기 하이드로젤에 대해서는, 하이드로젤의 제조 방법을 통해 전술한 바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.

상기 주사형 제제는 주사기에 주입가능한 형태를 의미하는 것으로, 일 예로, 바상기 주사형 제제는 바늘 내부 직경이 10G 내지 32G인 주사기에 주입가능하는 것이 바람직하고, 직경이 20G 내지 30G인 주사기에 주입가능한 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 주사기의 바늘 내부 직경이 너무 작아지게 되면, 압축거리 당 압축강도가 지속적으로 증가하게 되어 주사불가능한 문제점이 있다.

구체적으로, 상기 하이드로젤은 내부에 약물 또는 생체활성인자를 담지하여 체내에 주사되는 것을 통해, 약물 또는 생체활성인자의 서방출을 위한 전달체로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 하이드로젤은 내부에 줄기세포를 담지하여 체내에 주사되었을 때, 골분화를 위한 지지체로서 사용될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다

제조예 1: 돼지에서의 연골 유래 조직 분리 및 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말의 제조

무균 조건에서 6개월 된 100kg 정도의 돼지의 앞다리 및 뒷다리로부터 관절 연골을 분리하였다. 분리 시에는 연골 하골 부분을 포함하지 않고 연골 부분만 분리회도록 블레이드로 잘라낸 후, 인산 완충 수용액으로 세척하였다. 분리한 관절 연골 조직을 pH 8.0의 10 mM Tris-HCl의 저장 완충액으로 12시간 처리 한 후, 원심분리기를 이용하여 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 침전된 돼지 연골 유래 조직 분말을 비커에 옮긴 후 SDS 완충액을 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 교반시켰다. 이후 멸균 3차수를 넣고 원심분리기를 이용해 2,000 rpm에서 10 분간 원심 분리 하여 상층액을 제거한 후 침전된 돼지 연골 관절을 비커에 옮기고, DNase 용액을 첨가해 100 rpm으로 12시간 동안 교반하였다. 이후 2,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 제거한 후 액체질소 내에서 pre-cooling 50 초/grinding(60 Hz) 240 초/cooling 50초로 3 cycle 조건으로 동결 분쇄하여 돼지 연골 유래 조직 분말을 수득하였다. 수득한 분말을 비커에 담아 DNase 용액을 첨가해 100 rpm으로 12시간 동안 교반하였다. 이후, 용액을 원심분리기를 이용하여 2,000 rpm으로 10 분동안 원심분리하고, 상층액을 제거 후 소량의 멸균 3차수를 첨가해 돼지 연골 유래 조직 분말을 현탁하여 초저온 냉동고에서 -70℃ 및 5 mTorr 조건에서 48 시간동안 동결건조하였다. 동결 건조된 돼지 연골 유래 조직 분말을 1 g 당 25 ㎖의 800 unit/㎖ 펩신 수용액을 첨가하여 교반하여 용액을 준비하였다. 준비된 용액에 NaOH 용액을 첨가하여 pH 7.4로 맞춰 중화시킨 후, 투석만 한쪽 끝을 고정시킨후 중화시킨 용액을 투석막 안에 부어준 다음, 나머지 한쪽 끝을 고정시킨 후 멸균 3차수 2 L에 넣고 4℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 투석을 마친 펩신 수용액을 동결건조할 용기에 담아 초저온 냉동고로 -70℃ 및 0 mTorr 조건에서 48 시간동안 동결건조하여 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말을 제조하였다.

실시예 1: 글루타르알데하이드를 이용한 생화학적 가교 반응 및 분말의 제조

제조예 1에서 제조된 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말 0.2 g을 30 mL 바이알에 첨가하고, 멸균된 3차증류수 15 mL에 분산시켜 상온에서 24 시간 교반하였다. 교반 후, 용액을 테프론몰드(75 mm × 75 mm)에 부어주고 가교제인 글루타르알데하이드 용액 1.5 mL를 유리 파이펫으로 고르게 적가한 후, 37 ℃에서 100 rpm 의 속도로 12 시간 동안 shaker 에서 반응 및 건조시켰다. 이때, 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말 및 글루타르알데하이드의 총 함량 대비, 글루타르알데하이드의 함량은 0.1 중량%, 0.15 중량%, 0.2 중량%, 0.3 중량%, 0.5 중량%, 1 중량%, 3 중량% 및 5 중량% 로 다양하게 조절하였다. 건조된 고체 형태의 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 37 ℃에서 100 rpm으로 shaker에서 멸균된 3차 증류수와 인산완충용액으로 각각 3회씩 30 분간 번갈아 가며 세척하고 48 시간 동안 동결 건조하여 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 제조하였다(도 1a 및 b).

실시예 2: 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE)를 이용한 생화학적 가교 반응 및 분말 의 제조

제조예 1에서 제조된 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말 0.2 g을 30 mL 바이알에 첨가하고, 1% NaOH 수용액에 녹여 24 시간 교반하였다. 교반 후, 용액을 테프론몰드(75 mm × 75 mm)에 부어주고 가교제인 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE) 용액 1.5 mL을 유리 파이펫으로 고르게 적가한 후, 37 ℃에서 100 rpm 의 속도로 12 시간 동안 shaker 에서 반응 및 건조시켰다. 이때, 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말 및 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE)의 총 함량 대비, 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE)의 함량은 0.3 중량%로 조절하였다. 건조된 고체 형태의 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 37 ℃에서 100 rpm으로 shaker에서 멸균된 3차 증류수와 인산완충용액으로 각각 3회씩 30 분간 번갈아 가며 세척하고 48 시간 동안 동결 건조하여 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 제조하였다.

실시예 3: 폴리 ( 카프로락톤 -co- 락타이드 -co- 글리콜라이드 )- NHS / 폴리에틸렌글리콜 /폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS 를 이용한 생화학적 가교 반응 및 분말의 제조

먼저, 폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS/폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS 가교제를 제조하기 위해, 폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)/폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드) 1 g에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필카보이미드)(EDC)를 0.01 g 과 N-하이드록시석신이미드(NHS)를 0.01 g을 메틸렌클로라이드 용액에 녹인후 12시간 교반한 후 필터로 고체를 제거하고 남은 용액을 60℃에서 24시간 건조하여 제조하였다.

제조예 1에서 제조된 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말 0.2 g을 30 mL 바이알에 첨가하고, 멸균된 3차증류수 15 mL에 분산시켜 상온에서 24 시간 교반하였다. 교반 후, 용액을 테프론몰드(75 mm × 75 mm)에 부어주고 가교제인 폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS/폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS 용액 1.5 mL을 유리 파이펫으로 고르게 적가한 후, 37 ℃에서 100 rpm 의 속도로 12 시간 동안 shaker 에서 반응 및 건조시켰다. 이때, 수용성 돼지 연골 유래 조직 분말 및 폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS/폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS의 총 함량 대비, 폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS/폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS의 함량은 0.3 중량%로 조절하였다. 건조된 고체 형태의 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 37 ℃에서 100 rpm으로 shaker에서 멸균된 3차 증류수와 인산완충용액으로 각각 3회씩 30 분간 번갈아 가며 세척하고 48 시간 동안 동결 건조하여 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 제조하였다

실시예 4~6: 근적외선 형광이미징을 위한 형광물질을 포함하는 분말의 제조

실시예 1~3에서 제조된 돼지 연골 유래 조직 분말의 아민기(-NH₂)에 형광물질을 도입하기 위해 먼저, 50 mL 둥근바닥 플라스크에 IR783(80 mg, 0.11 mmol) 및 4-mercaptobenzoic acid(51 mg, 0.33 mmol)를 DMF(3 mL)에 용해시키고, 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 후, 반응된 용액에서 미반응 물질 및 불순물을 제거하기 위하여 에탄올 및 디에틸에테르 혼합용매(v/v = 1/19) 30 mL에 침전시키고 여과하여 얻어진 초록색 고체를 진공 건조하여 IR783-COOH를 제조하였다(도 2a).

다음으로, 20 mL 바이알에 IR783-COOH(1.4 mg, 1.6 μμmol) 및 DMTMM(0.66 mg, 2.4 μmol)을 멸균된 3차 증류수(5 mL)에 용해시키고, 실시예 1에서 제조된 돼지 연골 유래 조직 분말 0.1 g를 IR783-COOH 용액에 첨가하여, 혼합 용액을 실온에서 24 시간 동안 교반하였다. 반응 후, 반응 용액을 투석막(molecular weight cut-off: 2.0 kDa, Spectrum Laboratories, CA, USA)에 부어준 다음 3차 증류수 내에서 3 일간 투석하여 미 반응물을 제거하고, 4 일 동안 동결 건조시켜 형광물질이 도입되고, 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 제조하였다(도 2b).

실시예 7~9: 하이드로젤의 제조

실시예 1~3에서 제조한 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 5 mL 바이알에 각각 10 중량%, 15 중량% 및 20 중량%로 인산 완충용액에 고르게 분산시켜 하이드로젤을 제조하였으며, 주사제형으로 사용 가능한 하이드로젤이 형성됨을 확인하였다(도 3).

실험예 1: 동물 연골 유래 조직 하이드로젤의 기계적 물성 측정 및 평가

(1) 하이드로젤의 유변학적 특성 평가

실시예 7에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 유변학적 특성을 측정하기 위해, 레오미터(MCR 102, Anton Paar, Ostfildern, Germany)를 이용하여 저장탄성률(storage modulus) 및 손실탄성률(storage modulus)을 측정하였고, 37 ℃에서 복합 점도(complex viscosity)를 측정하였으며, 그 결과는 도 4a 내지 c에 나타내었다.

도 4a 및 b는 실시예 7에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 유변학적 특성(저장탄성률, 손실탄성률 및 복합 점도)을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 인산 완충용액 내 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말의 함량이 20 중량%인 경우, 가교제의 함량(0.1 중량%, 0.2 중량%, 0.3 중량%, 0.5 중량%, 1 중량%, 3 중량% 및 5 중량%)이 증가함에 따라, 저장탄성률 및 복합점도가 증가하는 경향을 보이는 것으로 확인되는바, 가교제의 함량에 따라 하이드로젤의 기계적 물성을 조절할 수 있는 것으로 볼 수 있다.

도 4b에 나타난 바와 같이, 가교제의 함량이 0.5 중량%인 경우, 인산 완충용액 내 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말의 함량(10 중량%, 15 중량% 및 20 중량%)이 증가함에 따라, 저장탄성률, 손실탄성률 및 복합점도가 모두 증가하는 경향을 보이는 것으로 확인되는바, 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말의 함량에 따라 하이드로젤의 기계적 물성을 조절할 수 있는 것으로 볼 수 있다.

도 4c는 실시예 7~9에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 유변학적 특성(저장탄성률, 손실탄성률 및 복합 점도)을 측정한 결과를 비교한 그래프이다.

도 4c에 나타난 바와 같이, 가교제의 함량이 0.5 중량%이고, 인산 완충용액 내 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말의 함량이 20 중량%인 경우, 가교제로 글루타르알데하이드(GA)를 사용한 경우뿐만 아니라, 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE) 또는 폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS/폴리에틸렌글리콜/폴리(카프로락톤-co-락타이드-co-글리콜라이드)-NHS(NHS-PEG-NHS)를 사용한 경우에도, 저장탄성률 및 복합점도를 증가시킬 수 있는 것으로 확인되는바, 다양한 가교제를 사용하여 하이드로젤의 기계적 물성을 조절할 수 있는 것으로 볼 수 있다.

(2) 하이드로젤의 압축강도 및 주사가능성 평가

실시예 7에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 압축강도 및 주사가능성을 평가하기 위해, 2 mL 주사기에 담지시킨 후, UTM(H5KT)를 이용하여 10 mm/min 의 속도로 압축하였고, 바늘 내부 직경이 30G, 26G, 23G 및 21G인 주사기를 사용하여 압축강도를 측정하고, 주사가능성을 평가하였다(도 5a).

도 5b는 실시예 7에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 압축거리 당 압축강도를 나타낸 그래프이고, 도 5c는 실시예 7에서 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 압축거리당 최대 압축강도를 나타낸 표이며, 도 5d는 도 5b 및 도 5c의 결과에 따른 주사가능성을 평가한 표이다.

도 5b 내지 d에 나타난 바와 같이, 압축거리 당 압축강도가 일정하게 유지되는 곡선은 수월하게 주사가능한 것으로 볼 수 있고, 압축거리당 압축강도가 지속적으로 증가하는 곡선은 주사불가능한 것으로 볼 수 있다. 따라서, 가교제의 함량(0.1 중량%, 0.15 중량%, 0.3 중량%, 0.5 중량% 및 1 중량%)이 증가함에 따라, 주사가능성은 감소하는 경향을 보였으며, 주사기의 바늘 내부 직경이 감소함에 따라, 주사가능성은 역시 감소하는 경향을 보였다. 특히, 가교제의 함량이 1 중량%이상인 경우, 주사 주입이 매우 어려워진 것으로 확인된다.

실험예 2: 근적외선 형광 이미징을 통한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤의 생분해 거동 관찰 및 평가

실시예 4에서 제조한 형광물질이 도입되고, 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 대상으로, UV 및 70% 에탄올을 사용하여 멸균 후 pH가 7.4인 인산완충용액에 15 중량%의 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤을 제조하였다. 제조한 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤을 nude mouse(male, 8주령)의 피하에 1 mL 주사기(바늘 내부 직경 = 21G)로 0.15 mL 주입하여, 각 시간에 따른 근적외선 형광 이미징 관찰 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 시간이 경과함에 따라 전체적인 형광 발현의 정도는 감소하지만, 가교제의 함량(0.15 중량%, 0.5 중량% 및 1 중량%)이 증가함에 따라 형광 유지 기간이 증가하는 경향을 보이는 것으로 확인되는바, 가교제의 함량에 따라 생체 내 분해 속도를 조절할 수 있는 것으로 볼 수 있다.

실험예 3: 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤 및 세포의 생체주입 관찰 및 평가

실시예 7에서 제조한 생화학적으로 가교된 돼지 연골 유래 조직 분말을 대상으로, UV 및 70% 에탄올을 사용하여 멸균 후 pH가 7.4인 인산완충용액에 15 중량%의 돼지 연골 유래 조직 하이드로젤을 제조하였다. 돼지 연골 유래 하이드로젤이 연골 유래 태아줄기세포의 전달체로 작용하는지 관찰 및 평가하기 위해, [가교된 돼지 연골 유래 하이드로젤 + 연골 유래 태아줄기세포(5 x 10⁶ cells)], [가교된 돼지 연골 유래 하이드로젤 + 연골 유래 태아줄기세포(5 x 10⁶ cells) + TGF-

(200 ng/mL)] 및 [가교된 돼지 연골 유래 하이드로젤 + 연골 유래 태아줄기세포(5 x 10⁶ cells) + BMP2 (10 μg/mL)]의 하이드로젤 3군을 상온에서 15 중량% 로 PBS에 현탁시켰다. 이를 마취시킨 SD rat(280-300 g, male, 6주령) 피하에 1 mL 주사기(바늘 내부 직경 = 21G)로 0.5 mL 주입한 다음, 조직을 적출하였다.

적출한 조직을 10% 포르말린에 고정하였고, 고정시킨 조직을 파라핀 블록으로 만들어 4 μm의 두께로 자른 후 슬라이드에 고정하고 면역학적 염증반응 평가를 하기 위하여 hematoxylin and eosin (H&E) 염색 및 ED1(mouse anti rat CD68: Serotec, UK) 염색을 실시하였고, 그 결과를 도 7a 및 b에 각각 나타내었다.

도 7a에서 나타낸 바와 같이, 돼지 연골 유래 하이드로젤에 연골 유래 태아줄기세포가 잘 살아있는 것으로 확인된다. 도 7b에서 나타낸 바와 같이, 돼지 연골 유래 하이드로젤은 면역 반응이 나타나지 않으므로, 안정성 있는 것으로 검증된다.

Claims

(a) 동물 연골 유래 조직을 분말화하여 연골 유래 조직 분말을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 제조한 연골 유래 조직 분말 함유 수용액을 글루타르알데하이드 함유 용액과 혼합 및 가교하여, 가교된 연골 유래 조직을 제조하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계에서 제조한 가교된 연골 유래 조직을 건조시켜 다시 분말화한 다음, 완충용액에 15 중량% 내지 30 중량% 로 분산시켜 주사가능한 하이드로젤을 제조하는 단계를 포함하고,
상기 (b) 단계에서 연골 유래 조직 분말 및 글루타르알데하이드의 총 함량에 대하여, 상기 글루타르알데하이드의 함량은 0.05 중량% 이상이면서 1 중량% 미만인 것을 특징으로 하는
주사형 제제의 제조 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 동물은 인간, 돼지, 소, 양, 말 및 고양이로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 주사형 제제의 제조 방법.
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