TWI835690B - 用於治療節段性骨缺損的可注射型水膠 - Google Patents
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Abstract
本發明關於一種可注射型水膠組成物，其含有10重量%明膠、0.5-2重量%透明質酸、0.5-1.0重量%京尼平，以及一水性媒質。該組成物在骨缺損部位展現出高度的生物相容性、可注射性和原位膠化能力。該組成物適合作為一種供細胞貼附的骨生成支架，以及作為一種用於傳送能夠促進骨質再生之有益物質的骨生成載體。本發明亦關於一種包含該可注射型水膠組成物與一成骨性物質的醫藥調配物，以及其在治療節段性骨缺損上的醫藥用途。
Description
本發明關於一種可注射型水膠組成物，它源自於天然來源，並且在骨缺損部位展現出高度的生物相容性、可注射性和原位膠化能力。本發明也關於一種包含該可注射型水膠組成物與一成骨性物質的醫藥調配物，以及其在治療節段性骨缺損上的醫學用途。
節段性骨缺損是指在缺損部位有局部性或全周性的骨組織喪失，其經常導因於高能量創傷、腫瘤切除、骨骼重建、感染、發育畸形或骨髓炎。在所謂的「臨界型」節段性骨缺損的情況下，骨質喪失的區域是如此之大，以至於該缺損可能導致明顯的患者併發症，並且在沒有醫學幹預的情況下將無法癒合，導致骨組織的延遲癒合或不癒合。儘管骨移植和骨骼內/外固定術已被廣泛地使用作為填補缺損的主要治療策略，但節段性骨缺損的癒合仍然是臨床骨科的一個巨大挑戰。已經提出了多種組織工程方法來促進節段性骨骼的癒合，包括植入骨傳導性支架以及傳送骨誘導性生長因子和成骨細胞。常用的作法是使用以聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）為主的骨水泥作為支架。儘管PMMA骨水泥具有高抗壓強度和能夠與骨組織良好結合的優點，但它不具生物可降解性，通常需要通過二次手術從缺損部位取出，這可能對患者帶來附加的風險。此外，PMMA骨水泥的不可生物降解性也可能導致長期併發症，如應力遮蔽現象（stress shielding），使周圍骨骼可能因缺乏機械負載而變弱，而且水泥也可能引起慢性發炎。水膠可作為一種替代方案，因其作為用於促進細胞貼附之三維骨生成支架以及作為用於傳遞細胞、刺激因子或藥物之骨生成載體的潛力候選者而愈來愈受到關注（相關綜論性文獻，請參見，例如，Bai, X.
et al.,
Bioactive Materials, (2018), 3: 401-417；Zhang Y.-F.
et al.,
Front Pharmacol.,(2020) 11:622）。
水膠是一種黏彈性聚合物材料，其具有高度水合化的三維交聯網絡，可以模擬骨外細胞基質（ECM），並且提供適合骨質再生的微環境。水膠可以源自於例如明膠、膠原蛋白、殼聚糖和透明質酸等以蛋白質或多醣為主的天然生物材料、例如聚乙二醇、聚丙烯醯胺、聚乙烯醇等人造高分子，以及它們的混成組合。由於其出色的生物相容性、非細胞毒性和生物可降解性，天然水膠在組織工程應用上通常優於合成水膠。以明膠為主的水膠是最常用於骨組織工程的天然水膠之一。明膠是膠原蛋白的水解產物，是骨組織ECM中的主要結構蛋白，而且可以通過其反應性胺基基團進行官能化。然而，由於其在生理溫度下往往會自發性地溶解，因而展現出機械性能不足以支持骨質再生，所以明膠不適合被單獨使用於治療需要高度機械穩定性的節段性骨缺損。明膠水膠的膠化時間也必須進行調整，以配合治療節段性骨缺損的特定需求。換言之，明膠水膠需要被調製成具有適當的膠化時間，以允許在手術過程中容易地被注入到骨缺損部位，同時確保它在適當的時間範圍內，通常約30分鐘，能夠在缺損部位轉化成為膠化狀態，以便骨科醫生完成手術。理論上，可以通過多種手段來調整明膠水膠的機械性能和膠化時間，例如透過改變水膠的化學組成、調整交聯程度和添加額外材料。然而，實際上尚未成功地建構出符合上述所有要求的水膠調配物。
儘管以明膠為主的水膠在本項技術領域中顯示出了潛力，但仍然需要開發出經過改良的生物材料和方法，以治療節段性骨缺損。
為了滿足上述需求，本案發明人已經開發出一種以明膠為主的水膠組成物，其中所有的水膠前驅物基本上皆來自於天然來源，因而對於患者表現出卓越的生物相容性。就化學組成而言，本案水膠組成物包括明膠和透明質酸的混合物，組合以特定濃度的京尼平作為交聯劑，從而構成一種可注射型調配物。在注射到骨缺損部位之前，該前驅物組成物在室溫下大致保持液態，但在生理條件下，例如在約37°C和pH 7.0下，適於在10-40分鐘內，例如在20-30分鐘之間，轉變成為膠態。這種可注射性和原位膠化能力對於治療節段性骨缺損而言是至關重要的性質，因為它們使得本案水膠可以通過微創手術而直接被傳送到缺損部位，並且使感染和其他併發症的風險最小化。該水膠的機械性能和原位膠化時間是藉由添加特定用量的京尼平來調節，以為節段性骨缺損中的骨質生長和再生提供結構性支持，同時也充當用於傳送成骨性物質的載體。
因此，本發明的第一態樣係提供一種可注射型水膠前驅物組成物，其包含下列成份，較佳為基本上由下列成份所組成，且更佳為由下列成份所組成：
依該組成物總重量為準約10重量%的明膠；
依該組成物總重量為準約0.5-2重量%的透明質酸；
依該組成物總重量為準約0.5-1.0重量%的京尼平；以及
一水性媒質，具有位於6-8的pH值範圍；
其中該可注射型水膠前驅物組成物適於在37°C下轉變成為一水膠，並且具有位於10分鐘至40分鐘之範圍內的膠化時間，而於室溫下保持可注射狀態至少60分鐘，而該水膠具有位於300 kPa至500 kPa之範圍內的抗壓強度。
本發明的第二態樣係提供一種醫藥調配物，其包含前述可注射型水膠前驅物組成物，與一成骨性物質相組合，該成骨性物質選自於由間質幹細胞、幹細胞分泌蛋白組（stem cell secretome）、富含血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin）、富含血小板血漿（platelet-rich plasma）、化療藥物、生長因子、細胞激素、抗生素，以及彼等之組合。
本發明的第三態樣係提供前述醫藥調配物在製備供治療節段性骨缺損的藥物上之用途，而該節段性骨缺損具有一缺損部位位於第一骨端以及與該第一骨端斷開連接的第二骨端之間。
本發明的第四態樣係提供一種用於治療節段性骨缺損的方法，該節段性骨缺損具有一缺損部位位於第一骨端以及與該第一骨端斷開連接的第二骨端之間，該方法包含將前述醫藥調配物注射到該缺損部位，並容許該醫藥調配物於原位轉化成為一水膠。
在較佳的具體例中，透明質酸的含量依該組成物之總重量為準約占1重量%，而京尼平的含量依該組成物之總重量為準約占0.5重量%。在更佳的具體例中，透明質酸的分子量在約8,000 kDa至約10,000 kDa之間。
在較佳的具體例中，明膠選自於由A型明膠、B型明膠和彼等之組合所組成的群組。在更佳的具體例中，該明膠包含B型明膠。
在較佳的具體例中，該水性媒質選自於由水、水基溶液和水基緩衝液所組成的群組。
除非另外說明，否則本申請說明書和申請專利範圍中所使用的下列用語具有下文給予的定義。請注意，本申請說明書和申請專利範圍中所使用的單數形用語「一」意欲涵蓋在一個以及一個以上的所載事項，例如至少一個、至少二個或至少三個，而非意味著僅僅具有單一個所載事項。此外，申請專利範圍中使用的「包含」、「具有」等開放式連接詞是表示請求項中所記載的元件或成分的組合中，不排除請求項未載明的其他組件或成分。亦應注意到用語「或」在意義上一般也包括「及/或」，除非內容另有清楚表明。本申請說明書和申請專利範圍中所使用的用語「約」，是用以修飾任何可些微變化的誤差，但這種些微變化並不會改變其本質。
本案所使用的術語「水膠」是指由明膠和透明質酸構成的三維聚合物網絡，其透過京尼平的共價交聯和一水性媒質的水合而成。本案所使用的術語「水膠前驅物組成物」可以指涉配於該水性媒質中由約10重量%明膠、約0.5-2重量%透明質酸和約0.5-1.0重量%京尼平構成的混合物，其呈現可注射流體的形式，並且適合於生理條件下，亦即在約37°C和pH 7的條件下，經由交聯而轉變為一水膠。或者，該組成物可以兩個或更多個分開的部分之形式存在，供使用前混合，以避免過早膠化。術語「可注射」意指本案組成物具有足夠的流動性，可以經由一注射裝置，例如注射器和裝藥筒，輸送給患者。在較佳的具體例中，該組成物適於經由注射而給藥至節段性骨缺損部位。
本案所使用的術語「明膠」，或縮寫為「GLT」，意欲涵蓋從動物的皮膚、骨骼和結締組織中提取的膠原蛋白，經過酸、鹼或酵素的水解所得到的所有蛋白物質。與膠原蛋白相比，GLT表現出更高的生物相容性、生物可降解性、經濟性、低免疫原性和易於獲得性。GLT在一級結構上富含甘胺酸、脯胺酸和羥基脯胺酸，因而適合供細胞貼附、生長和維持細胞的生理功能。適用於本發明的GLT可以包括但不限於，來自豬、家禽或魚類來源且等電點為7.0-9.0的A型GLT、來自牛皮且等電點約為5.0的B型GLT，以及彼等之組合。在較佳的具體例中，水膠前驅物組成物中僅包含B型GLT。在本發明中，本案組成物中的GLT含量，以組成物的總重量為準，為約5重量%至20重量%，更佳為約10重量%。
本案所使用的術語「透明質酸」或「玻尿酸」，或縮寫為「HA」，涵蓋由N-乙醯基-D-葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸的重複單元組成的直鏈狀醣胺聚醣聚合物，其中單醣單元經由交替的-1,3和-1,4糖苷鍵連接在一起，以及它們的鹼金族金屬鹽類，包括其鈉、鉀和鋰鹽。較佳為本案所使用的HA具有至少約1,000 kDa的分子量，更佳為具有介於約5,000 kDa至約50,000 kDa之間的分子量，例如具有介於約8,000 kDa至約10,000 kDa之間的分子量。在水膠前驅物組成物中的HA含量，依組成物的總重量為準，為約0.5重量%至約5重量%，更佳為約0.5重量%至約2.0重量%。由於組成物中有某部分GLT可能在室溫下開始膠化而減少組成物的流動性，所以組成物中存在有特定含量的HA，對於維持組成物的可注射性至關重要。雖然不希望侷限於特定理論，咸信具有高度親水性的HA可以增加水膠前驅物在水性媒質中的整體溶解度，且HA可以無規地分佈在和交織在GLT分子之間，使得GLT分子不再以規則方式排列，從而增加了組成物的流動性。
本案所使用的術語「京尼平」，或縮寫為「GP」，意指一種在都桷子（
Genipa americana）果實萃出物中發現的化合物，其具有下列化學結構：
。
已知GP為蛋白質和殼聚糖的天然交聯劑。它對哺乳動物展現出低毒性，小鼠靜脈注射的LD
50為382毫克/公斤，因而在毒性上相較於戊二醛和許多其他常用的合成交聯劑要小得多。在本案水膠前驅物組成物中的GP含量，依組成物的總重量為準，為約0.1重量%至約1.0重量%，更佳為約0.5重量%至約1.0重量%，尤以約0.5重量%為佳。
本案所使用的術語「水性媒質」意欲涵蓋水，如蒸餾水，以及水基溶液或緩衝液，如生理鹽水和磷酸鹽緩衝化生理鹽水（PBS）。在一具體例中，該水性媒質的pH值為6-8，例如約7。
當使用於申請專利範圍時，用語「包含」意指所記載的元件或成分的組合中，不排除未載明的其他組件或成分。連接詞「由…組成」是封閉式用語，其排除所有額外的元件或成分。至於申請專利範圍中所界定之組成物的構成元件，連接詞「基本上由…組成」意指該組成物含有所記載的元件或成分，而且可以含有額外的元件或成分，只要這些額外的元件或成分不會本質地改變本發明作為用於治療節段性骨缺損之組成物的基本和新穎特性即可。較佳為這些添加物完全不存在或僅微量存在。舉例來說，所請求的組成物基本上由來自GLT、HA、GP和一水性媒質所組成，這種界定方式不會排除物質製備步驟所殘留下來的微量污染物，例如防腐劑和鹽類等，它們不會本質地影響前驅物組成物的可注射性和原位膠化能力，也不會本質地影響由該組成物固化而成的水膠賴以治療節段性骨缺損的骨傳導以及骨誘導性質。
可以藉由將GLT、HA和GP與水性媒質充分混合，而製備出可注射型水膠前驅物組成物。在一具體例中，GLT、HA和GP可以在室溫下並且於施加振盪下，例如於持續攪拌下，一起添加到水性媒質中。在另一具體例中，可以先在較高溫度下使GLT和HA溶解於水性媒質中，直到獲得清澈的溶液為止，然後於使用前在室溫下將GP懸浮在該溶液中。根據本發明，即使將所有的組成成分都組合在一起，本案組成物於室溫下仍能保持高度的流動性，以確保高可注射性，並適於在將溫度提高到37°C時轉化成為水膠。更重要的是，在37°C下，本案組成物的溶液-凝膠轉化是在10至40分鐘的時間間隔內發生並且完成，這指出該組成物在生理溫度下具有介於10至40分鐘之間的膠化時間，例如介於20至30分鐘之間的膠化時間。在此，術語「膠化時間」被定義為從添加GP至組成物以啟動交聯反應的時間點起算，到達組成物的膠凝點所需要的時間。在一具體例中，膠化時間是指添加GP後，藉由流變儀測出的組成物的貯存模數（G'）穿越其損失模數（G''）所需要的時間，如後文實例4所示。在使用瓶子倒置法的另一具體例中，膠化時間是指在倒置狀態下，組成物不會顯示出明顯的流動性所需要的時間。如後文實例5所示，即使是將組成成分全部混合在一起，本案組成物在室溫下仍可保持可注射性至少一小時，使得骨科醫生有足夠的時間來完成手術，且本案組成物將會在生理溫度下迅速發生相變化而成凝膠形式。這種膠化動力學對於治療節段性骨缺損特別有利，因為它提供了一個可以實行的時間空窗，容許通過一注射裝置將組成物施加到缺損部位，並進一步使組成物可以在手術期間用於原位形成凝膠。
由本案組成物形成的水膠具有足夠的機械強度和硬度，以保持其結構穩定性，俾作為支架材料，並且對於骨質再生提供支持，以避免應力遮蔽、後續骨質流失和再次骨折，還能夠承受骨缺損部位機械性動態環境中所發生的重覆形變。如後文實例6所示，藉由一具質地分析儀進行測量，由此形成的水膠可以具有從300 kPa到500 kPa的抗壓強度，例如具有約400 kPa的抗壓強度。如本領域中所習用公知，術語「抗壓強度」是指從拉伸測試中得出的負荷-形變曲線計算出來的數值，在該測試中，以1.0毫米/秒的速度將5公斤的壓縮力施加在經固化的水膠上。
本案水膠也適用作為傳送成骨性物質的載體。因此，本發明進一步思及一種醫藥調配物，其包含本案可注射型水膠前驅物組成物，與一成骨性物質相組合。本案所使用的術語「成骨性物質」是指能夠主動地促進骨質生成或是改善被認為不利於骨質生成之條件的物質。成骨性物質的實例可以包括但不限於，間質幹細胞、幹細胞分泌蛋白組（stem cell secretome）、富含血小板纖維蛋白（platelet-rich fibrin）、富含血小板血漿（platelet-rich plasma）、化療藥物、生長因子、細胞激素、抗生素，以及彼等之組合。如果適當且有需要，可以將成骨性物質加以冷凍乾燥，並且儲存於無菌安瓿中。使用前，再添加例如去離子水等水性媒質進行復水。在一較佳具體例中，成骨性物質包含富含血小板纖維蛋白（PRF），它是一種源自於自體或他體血液的血小板濃縮物，通過離心去除紅血球後即可獲得，並且富含生長因子，包括轉化生長因子-β（TGF-β）、骨形態發生蛋白（BMP）、胰島素樣生長因子-1（IGF-1）、成纖維細胞生長因子（FGF）、血管內皮生長因子（VEGF）和血小板源性生長因子（PDGFs）。在另一具體例中，成骨性物質包含一用於治療患有細菌感染或是具有細菌感染風險之患者的抗生素，如萬古黴素。適用於將本案可注射型水膠與成骨性物質加以組合的方法大致上為本項領域所熟知，其涉及依據前文製備出可注射型水凝膠前驅物組成物，然後將成骨性物質添加到組成物中並充分混合，直到成骨性物質均勻分佈在組成物中。獲得的醫藥調配物即可供注射至，例如，一個節段性骨缺損部位，在該處它會轉化成凝膠形式。如後文實例6所述，本案水膠的機械強度不會因為將成骨性物質裝載到水膠中而顯著降低。
正如後文實例7、8和9所證明，本案所揭露的水膠，無論是否攜載有成骨性物質，於試管內和活體內均展現出低細胞毒性和高生物相容性。從實例8和9中顯示的實驗結果可以明瞭，本案水膠，無論是否攜載有成骨性物質，於試管內和活體內均展現出適合作為骨科植入物的生物降解動力學。如後文實例10進一步證明，這種生物降解動力學有利於從水膠中適時釋放出成骨性物質，以促進骨質生成。
本發明進一步思及所揭調製物在治療節段性骨缺損上的醫療用途，以及用於治療一患者體內的節段性骨缺損的治療方法，其包含將本案所揭醫藥調配物給予該患者。本案所使用的術語「節段性骨缺損」可指局部性或全周性的骨組織喪失，造成位於第一骨端和與該第一骨端斷開連接的第二骨端之間的缺損部位，且缺損部位處的骨髓腔完全暴露出來。節段性骨缺損可以發生在各種骨骼中，其包括但不限於股骨、脛骨、肱骨、橈骨、尺骨、鎖骨和下頜骨。在某些具體例中，節段性骨缺損是臨界性節段性骨缺損，其在此處被定義為患者終其一生不會經由骨質生成而自發性癒合的最小骨質喪失量。通常，成年人患者中的臨界性節段性骨缺損具有大於50%的全周性喪失或是大於2公分的長度。
術語「治療」包括在骨缺損部位提供結構性支持和/或促進骨質生成、減輕節段性骨缺損的嚴重程度、改善由節段性骨缺損造成的一或多個症狀，抑或是減緩或抑制節段性骨缺損的惡化。
適於接受治療的患者涵蓋人類或非人類脊椎動物，例如非人類哺乳動物。非人類哺乳動物包括家畜動物、伴侶動物、實驗動物和非人類靈長動物。非人類患者還包括但不限於馬、牛、豬、山羊、狗、貓、小鼠、大鼠、天竺鼠、沙鼠、倉鼠、貂和兔。應理解，首選患者是人類患者，特別是患有節段性骨缺損的人類患者。
以下實施例僅出於說明目的，並不意圖限制本發明的範圍。各個實驗結果均以平均值 ± 標準差的形式呈現。當定量資料的
p值低於0.05時，即被認為具有統計學上的顯著性。造影、組織學和生物力學資料使用司徒登氏
t-測驗進行檢查。帶有星號（*）上標字母的實驗組，表示兩組間存在有
p值＜0.05的統計差異，而被認為具有統計學上的顯著性。
實例 1 ：製備由京尼平交聯的明膠 / 透明質酸水膠
將10重量%明膠（B型，平均莫耳質量：40,000-50,000 g/mol，Sigma-Aldrich®，美國）和1重量%透明質酸（質量平均分子量：8000-10,000 kDa，Foodchemifa Co., Ltd.，日本）懸浮在去離子水中，以獲得GLT/HA混合物。將混合物分成五等份，分別添加不同用量的京尼平（莫耳質量：226.2 g/mol，嘉年生化產品有限公司，臺灣），以達到最終濃度分別為0.025重量%、0.05重量%、0.1重量%、0.5重量%和1.0重量%。藉由在37°C下以300 rpm的速度攪拌，將所得混合物固化成由GP交聯的GLT/HA水膠，於固化期間將各個混合物加以鑑定，如以下實例所示。
實例 2 ：製備凍乾的富含血小板纖維蛋白
從兔頸靜脈抽取8毫升的靜脈血，並收集到一個不含抗凝劑補充劑的無菌管中（Vacuette 455071，Greiner Bio-one，奧地利）。藉由塗佈在管子內壁上的微化矽粒來啟動凝血級聯反應。然後，將管子在一具離心機中（DSC-200A-2桌上型，德彥醫技儀器股份有限公司，臺灣新北市），以400
×g的速率離心5分鐘。離心後，在上層細胞血漿和下層紅血球之間形成一層富含血小板纖維蛋白（PRF）。為了製備凍乾PRF（LPRF），首先將新鮮的PRF加以冷凍，並在-80°C下保存24小時，然後使用一冷凍乾燥系統（金鳴科技有限公司，臺灣新北市）在-51°C下冷凍乾燥至隔日。LPRF被磨成粉末，以備後續使用。
實例 3 ：製備攜載有 PRF 的水膠
重覆實例1，以製備出含有0.5重量%GP的GLT/HA水膠的膠態懸浮液（以下簡稱為GLT/HA-0.5%GP），其中分別添加了25毫克和50毫克在實例2中所製備出來的LPRF粉末。在37°C下，以磁力攪拌法進行連續攪拌，直到粉末完全溶解。由此獲得的含有25毫克和50毫克LPRF的水膠將在後文分別簡稱為攜載有25毫克和50毫克LPRF的GLT/HA-0.5%GP水膠。
圖1顯示由實例1中製得的組成物形成之GLT/HA-0.5%GP水膠以及由實例3中製得的兩種攜載有LPRF之水膠的掃描式電子顯微鏡圖像。攜載有LPRF的水膠具有與GLT/HA-0.5%GP水膠類似的微觀結構，這指出它們具有類似的多孔結構和相似的孔徑分佈。再者，在這些水膠中觀察到了蜂窩狀的多孔形態，具有相互連接的孔洞。該支架的開放孔隙度將有助於支持成骨細胞的細胞內生/外生和骨礦化。
實例 4 ：流變性質和膠化時間
利用一具平行板流變儀（AR2000ex，TA Instruments，美國德拉瓦州紐卡斯爾）測量實例1中製得的GLT/HA-0.5%GP水膠、實例3中製得的攜載有LPRF的水膠以及未交聯的GLT/HA水膠的流變性質。在1 Hz下針對GLT/HA、GLT/HA-0.5%GP和攜載有25或50毫克LPRF的GLT/HA-0.5%GP水膠進行了時間掃描，將測試樣品放置在平板之間，並連續記錄在37°C下的儲存模數（G'）和損失模數（G”）。
如圖2所示，GLT/HA-0.5%GP的儲存模數（G'）和損失模數（G”）始終高於GLT/HA，且它的G'和G”穿越點為約23分鐘，這指出GLT/HA-0.5%GP在GP存在下穩定地交聯，並具有約23分鐘的膠化時間。與此同時，攜載有25或50毫克LPRF的GLT/HA-0.5%GP水膠的G'和G”穿越點分別為約12和15分鐘，攜載有LPRF之水膠的G'和G”的平均值高於GLT/HA-0.5%GP，這指出機械強度會隨著PRF的加入而增加。
實例 5 ：水膠的通針性
為了模擬治療節段性骨缺損手術的工作條件和時間範圍，其要求水膠前驅物組成物在通過注射裝置施用到骨缺損部位之前，在室溫下具有足夠的流動性，在實例1中製備的水膠在25°C下就其通針性（syringeability）進行測試。在測試中，將各個水膠裝入一個3毫升注射器，配有21G針頭（直徑30×0.8毫米），並在裝入後0分鐘、15分鐘和60分鐘的時候，藉由手來施力5秒鐘，再測量殘留在注射器中的水膠餘量。
進一步使用瓶子倒置測試來測量實例1中製備的水膠在生理溫度下的溶液-凝膠轉化時間。該測試開始於T0，在T0時，實例1中製備的水膠分別被放入蓋上瓶蓋的瓶子中，並且靜置1分鐘。於37℃下，在T10（由T0起算10分鐘），T20（由T0起算20分鐘）和T30（由T0起算30分鐘）時，藉由將個別瓶子加以倒置來測定個別混合物的流動性，當混合物停止流動時即判定為膠化時間。
如圖3A和3B所示，實例1中製備的水膠的熱反應行為與GP交聯的程度有關。詳言之，於室溫下，GLT/HA-0.025%GP 和 -0.05%GP 水膠即使在配製後24小時仍然可注射。在37°C下，這兩種水膠在40分鐘後逐漸膠化並形成穩定的結構，如瓶子倒置測試所示。相比之下，GLT/HA-0.5%GP 和 -1%GP 水膠在37°C下展現出相對較快的膠化時間，約20至25分鐘，這與前文實例4中使用流變儀所獲得的數值相符，同時在室溫下保持至少60分鐘的可注射性。整體來說，隨著GP濃度逐漸從0.025%增加到0.05%，0.1%，0.5%和1%，水膠在37°C下的膠化時間從37.5分鐘分別減少到29、26.5、25和20.5分鐘。
實例 6 ：水膠的機械性能 [0055
]在過渡到凝膠狀態之後，針對實例1中製備的水膠，實例3中製備的攜載有LPRF的水膠以及未交聯的GLT/HA水膠，在室溫下使用一具質地分析儀（型號TA.XT Plus，Texture Technologies Corp.，美國紐約州斯卡德爾市）就機械性能進行測試，該質地分析儀設有SMS P/25圓柱探頭用於壓縮樣品。將平板樣品（尺寸1立方公分）在5公斤荷重元和1.0毫米/秒的測試速率下進行拉伸試驗。由應力-應變曲線來獲得個別拉伸模數和斷裂強度，其中Δσ是應力（N/mm
2），Δε是拉伸測量下的應變（mm/mm）。每組水膠都進行了三次測試。
[0056
]如圖4A所示，未交聯的GLT/HA水膠展現出低於50千帕的不良機械強度，使其不適用於骨組織工程應用。相比之下，實例1中製備的GLT/HA水膠的機械強度隨著GP濃度的增加而提高，這指出本案水膠的機械性能可以藉由調整GP的交聯程度來調節。當GP的添加量在0.5重量%到1.0重量%之間時，水膠的抗壓強度約為400千帕。圖4B進一步顯示，經GP交聯的水膠，包括GLT/HA-0.5%GP水膠和攜載有LPRF的水膠，能夠承受數百千帕的壓縮應力而不致崩潰或坍塌。具體而言，攜載有LPRF的水膠的抗壓強度為約275千帕，這指出攜載LPRF並不會明顯地干擾複合水膠的結構完整性或減損機械強度。
實例 7 ：細胞毒性和生物相容性
根據ISO 10993-5:2009標準，評估了實例1中製備之組成物所形成的水膠、實例3中製備之組成物所形成的攜載有LPRF的水膠，以及未交聯的GLT/HA水膠的試管內生物相容性。分別從各個水膠切割出1立方公分的立方體樣品，浸入Dulbecco氏改良之伊格氏培養基（DMEM）（Gibco，Invitrogen Taiwan Ltd.，MD）24小時，然後收集上清液。L929成纖維細胞（購自於台灣國立衛生研究院）以每孔1×10
3細胞的密度接種在96孔微孔培養皿中，培養在補充有10%胎牛血清（FBS）（Gibco®，Grand Island，美國紐約州）的DMEM中，並容許其貼附至隔日。去除DMEM，將上清液加入細胞培養中。經過24小時的培育後，使用噻唑藍四氮唑溴化物（MTT；Sigma-Aldrich，美國密蘇里州聖路易市）計算出各個孔中的活細胞數量。在595 nm的波長下，使用微孔培養皿分析儀（Bio-Rad）測量一式四份之各個溶液的吸光度。
為了測量由各個水膠產生的活性氧物種（ROS）數量，分別以來自於水膠的上清液來處理L929細胞，歷時24、48和72小時，然後加以洗滌並且以羥基乙啶（HE）染色。隨後收集細胞並且以流式細胞儀進行分析。
如圖5所示，水膠的細胞毒性與GP濃度增加成正比，但是所有在實例1中製得的水膠，包括GP濃度從0.5重量%到1.0重量%的水膠，都沒有對細胞展現出顯著的細胞毒性。儘管圖6的MTT試驗結果顯示，GLT/HA-0.5%GP水膠中的細胞存活率從接種後的第24小時到第48小時持續下降，並且在第72小時進一步下降，但可以藉由在水膠中載入LPRF而以劑量相依方式來對抗此一負面結果，如圖6和圖7所示。
實例 8 ：試管內生物可降解性
在評估實例1中製備的GLT/HA-0.5%GP水膠、實例3中製備的攜載有LPRF的水膠以及未交聯的GLT/HA水膠的試管內生物可降解特性時，首先測量各組中1立方公分立方體水膠的初始重量。隨後，於37°C下將水膠培育在3毫升PBS緩衝液中，並在迴轉式振盪機中施以溫和振盪。在各個時間點（0小時、第12小時、第24小時、第48小時、第72小時、第6天、第9天、第12天），由培養基中取出水膠，用濾紙吸乾，最後加以稱重。然後，以新鮮的PBS來替換培養基。將重量損失百分比繪製成相對於降解時間的曲線。
如圖8所示，受測水膠的生物降解速率隨著添加GP或GP和LPRF而降低，這指出添加GP和LPRF減緩了水膠的生物降解速率。數據顯示，本案攜載有LPRF的水膠展現出理想的生物降解性能，可供進一步應用於活體內作為骨科植入物。
實例 9 ：活體內水膠皮下移植
所有動物實驗均經機構動物照護和使用委員會批准。食物和水的供應不限量。在1.5-2公升/分鐘的氧氣下使用2-2.5%異氟醚來麻醉10隻雄性ICR小鼠（20至25克重）。藉由將水膠植入小鼠背部皮下來分析活體內生物相容性和生物可降解性。簡言之，製造兩個皮下囊袋，分別在這些皮下囊袋中植入水膠樣品（GLT/HA、GLT/HA-0.5%GP、或是GLT/HA/0.5%GP-50mg LPRF），使之在28天的期間內進行降解。於第0、7、14、21、24和28天拍攝磁共振影像。
圖9所示的剩餘體積分析顯示，GLT/HA-GP和GLT/HA-GP-LPRF水膠的尺寸在前14天逐漸減小。植入有水膠的皮下組織的組織學分析顯示，這些水膠被薄薄的纖維組織包圍，但沒有明顯的炎症細胞聚集（圖10）。也沒有檢測到被植入的水膠對於包括心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟在內的重要臟器產生系統毒性（例如充血、水腫、壞死）（圖11）。為了進一步探究水膠植入後的全身反應，測量了植入有不同水膠的所有三組小鼠的腎（BUN）、肝（ALT）和促炎性標記（LDH）的血清中位準。採用植入有未交聯GLT/HA之動物的血清作為對照組。結果顯示，所有三組的動物都顯示正常的腎臟和肝臟功能。植入有這些水膠的小鼠之間的血清LDH位準沒有顯著差異（圖12）。
實例 10 ：兔節段性骨缺損模型
本實例使用了18隻骨骼成熟的紐西蘭白兔（雄性，平均體重為2-2.5公斤），分為三組。所有動物均使用異氟醚麻醉，並保持仰臥位，左肢以聚维酮碘加以消毒。然後，在左肢外側製造一個切口（6公分），以暴露出脛骨。接著，使用震動骨鋸在脛骨的外側製造出一個10×5毫米的缺損。在A組中，活體內的缺損未經治療，作為對照組（假手術組）；在B組中，活體內的缺損植入了GLT/HA-0.5%GP水膠；以及在C組中，活體內的缺損植入了GLT/HA-0.5%GP-LPRF水膠。然後在外側使用8孔迷你板（VariAx Hand，Stryker）進行固定。
最後，使用可吸收性縫合線來縫合處理過的傷口。手術後，對於接受處理的動物給予青黴素（每公斤2.2毫克，連續3天）和酮洛芬（每公斤40,000國際單位，連續3天），以防止傷口感染和控制疼痛。容許動物不受限制地在動物籠中移動。
為了評估實驗組之間的骨癒合情況，於手術後8週拍攝了兔左脛骨的前後位和側位放射線攝影數據。為了進行定量評估，根據Lane-Sandhu評分系統針對數位放射線圖像進行評分。如圖13所示，對照組的放射線攝影分析顯示，在未有植入物的脛骨缺損處完全或幾乎沒有骨質生成，這指出節段性骨缺損的不癒合。在GLT/HA-GP組中，可見到缺損部位的間隙有局部接合，且於缺損部位生成了少量的骨痂。在所有植入了GLT/HA-GP-LPRF水膠的缺損中，皆檢測到明顯的骨痂生成，並於治療後脛骨缺損發生了幾近完全的骨質接合。就定量而言，GLT/HA-GP和GLT/HA-GP-LPRF組的Lane-Sandhu評分皆明顯高於對照組，如圖14所示。
術後8週，動物經由肌肉給予鹽酸甲苯噻嗪（10毫克/公斤，拜耳公司，德國勒沃庫森市）再給予二氧化碳（吸入處理）而於麻醉後被犧牲。隨後收集動物的完整脛骨。
在取出固定植入物後，經由目視觀察第三和第四螺孔之間的相對位置，鑑定出各個脛骨的脛骨缺損區域。圖15顯示所收集到的脛骨的巨觀評估。相較於植入有GLT/HA-0.5%GP和對照組水膠的兔組，在植入有GLT/HA-0.5%GP-LPRF水膠的兔組中，目視可見更多的新骨質再生和更好的骨缺損修復。在植入有GLT/HA-0.5%GP-LPRF水膠的兔組中，缺損部位被修復組織填滿，骨皮質表面大部分是連續的。相比之下，未接受治療的對照組在缺損區域的修復極為有限，骨表面留下明顯的中央凹陷。在GLT/HA-0.5%GP組中，可見骨缺損部分癒合。
使用微型CT（Skyscan 1176；Bruker，美國馬里蘭州Billerica市）來掃描兔脛骨。股骨的微型CT掃描在90 kV、每層8000×8000個像素和35微米的解析度下完成。一旦掃描完成，使用重建軟體（NRecon Reconstruction；Bruker）重建微型CT影像，以產生三維體積成像。脛骨缺損區域是藉由鑑定出第三和第四螺孔之間的相對位置來選定，並被標示為相關區域（ROI）。拍攝並分析ROI中的新骨生成圖像。微結構測量包括骨體積（BV，mm
3）、骨體積占組織總體積的百分比（BV/TV，%）、骨厚度（mm）、骨分離（mm）、骨表面積（mm）和骨表面積/組織總體積的比值（1/mm）。
經由微型CT造影技術，以不同的維度，包括軸向、矢狀切面和三維重建視圖，展示出脛骨節段性缺損部位的新骨再生。結果顯示，在假手術對照組的缺損間隙僅觀察到微量的新骨生成，顯示手術後骨骼無法癒合。此外，如三維重建圖像所示，在對照組的脛骨上可以清楚地看到中央凹陷區域。在GLT/HA-GP組中，雖然脛骨缺損部分地填充有新再生組織，但在軸向和矢狀切面視圖上，皮質不連續的情形仍然存在（圖16）。
相反地，GLT/HA-GP-LPRF治療組中，脛骨缺損部位可見到明顯的新骨生成。在所有三個視圖中，新生成的骨組織與骨缺損處的相鄰骨緣良好接合，如圖17所示。定量CT分析進一步顯示，GLT/HA-GP-LPRF組在骨體積、小樑骨體積分數（BV/TV）、骨厚度、骨表面、BS/TV和骨分離等參數方面達成了明顯更高程度的新骨生成（圖18）。
這些活體內數據一致性地指出，經過GP交聯的GLT/HA水膠可供用於將PRF傳送到骨缺損部位，於該處，隨著水膠的生物降解而釋放出有益的生長因子，從而促進成骨細胞的成骨分化和礦化。GP交聯有助於維持水膠的穩定性，以確保對於間質幹細胞的持續刺激和生長因子的漸次釋放。
接著，將樣品進行脫鈣處理。為了進行組織學評估，將樣品包埋在石蠟中，並且切製成一系列厚切片（各個切片大約5微米厚）。然後，組織切片藉由蘇木精和伊紅（H&E）、茜素紅S（Alizarin red S；ARS），以及使用I型膠原蛋白（Col 1）抗體的免疫組織化學染色法進行染色。樣品切片也在光學顯微鏡（Leica）下觀察，以評估新骨生成。
術後8週，假手術對照組的缺損仍然清晰可見，沒有組織癒合的證據（圖19A，圖上）。這結果進一步確認了由手術創建的兔脛骨節段性骨缺損無法自然修復。在GLT/HA-0.5%GP組中，檢測到沿著脛骨缺損邊緣生成的微量新骨骼（圖19A，圖中）。在較高的放大倍率下可見，缺損中心被纖維化和未成熟的骨組織所占據，細胞密度較高，且基質形式較無條理。相對而言，組織學分析顯示，在GLT/HA-0.5%GP-LPRF組中，脛骨缺損的骨緣處可見缺損接合和密集的新骨生成。這些新生骨組織展現出更成熟的骨小樑，而位於其中的細胞，相較於比GLT/HA-0.5%GP組中的細胞，具有更為扁平的骨窩（lacunae）和呈現層狀的外觀（圖19A，圖下）。如圖19B和19C所示，茜素紅S（ARS）染色和使用I型膠原蛋白（Col 1）的免疫組織化學染色顯示，GLT/HA-0.5%GP-LPRF組的新骨組織合成出比GLT/HA-0.5%GP組明顯更多的礦化基質。綜合ARS和Col 1染色的組織學分析結果，可以見到更為成熟的交織骨生成情形，特別是在GLT/HA-0.5%GP-LPRF骨組織樣品中。
本實例中揭露的所有數據都顯示，GLT/HA-0.5%GP-LPRF水膠可供用作為一種骨傳導性生物材料，容許來自於骨髓和鄰近骨床的骨原細胞（osteoprogenitor cells）向內生長而進入多孔支架的三維結構。
儘管本發明已參照以上較佳具體例說明，應認知到較佳具體例僅為例示目的給予而非意圖限制本發明之範圍，可進行對熟習相關技藝者而言極為明顯的各種更動與改變，而不會逸離本發明精神與範圍。
無
本發明的上述與其他目的、特徵與功效在參照下列較佳具體例的說明連同隨附圖式將變得顯明，其中：
圖1顯示依據本發明之水膠的掃描式電子顯微鏡影像；
圖2顯示依據本發明之水膠的流變性質；
圖3A顯示依據本發明之水膠在室溫下的可注射性；
圖3B為一直方圖，顯示依據本發明之水膠在生理溫度下的平均膠化時間；
[0016
]圖4A顯示依據本發明之水膠的機械性能；
[0017
]圖4B顯示攜載有或未攜載有富含血小板纖維蛋白之水膠的機械性能；
圖5顯示依據本發明被京尼平所交聯之水膠的細胞毒性；
圖6為一直方圖，顯示水膠隨著時間顯現出的細胞毒性；
圖7為一直方圖，顯示水膠隨著時間顯現出的ROS倍數變化；
圖8顯示攜載有或未攜載有富含血小板纖維蛋白之水膠的試管內生物降解速率；
圖9顯示攜載有或未攜載有富含血小板纖維蛋白之水膠的活體內生物降解速率；
圖10為組織學影像，顯示植入有依據本發明之水膠的小鼠皮下組織；
圖11為組織學影像，顯示被植入的水膠對於重要臟器的系統毒性；
圖12為一直方圖，顯示植入有本發明水膠之小鼠的腎（BUN）、肝（ALT）和促炎性標記（LDH）的血清中位準；
圖13顯示植入有本發明水膠之兔脛骨的放射線攝影圖像；
圖14為一直方圖，顯示植入有本發明水膠之兔脛骨的Lane-Sandhu評分；
圖15顯示植入有本發明水膠之兔脛骨的巨觀影像；
圖16顯示植入有本發明水膠之兔脛骨的微型電腦斷層掃描圖像；
圖17顯示植入有本發明水膠之兔脛骨的另一些微型電腦斷層掃描圖像；
圖18顯示植入有本發明水膠之兔脛骨的定量電腦斷層掃描分析；以及
圖19A至19C是顯示術後8周兔模型脛骨缺損癒合的組織學圖像，其中骨組織樣品分別經過蘇木精和伊紅（H&E）、茜素紅S（Alizarin red S；ARS）和免疫組織化學染色法（Col 1）進行染色，黑色虛線方框指出缺損區域，黑色箭頭指出缺損部位的新骨生成（40倍-比例尺-200 μm；200倍-50 μm）。
無
Claims (10)
- 一種可注射型水膠前驅物組成物，其包含：依該組成物總重量為準約10重量%的明膠；依該組成物總重量為準約0.5-2重量%的透明質酸；依該組成物總重量為準約0.5-1.0重量%的京尼平；以及一水性媒質，具有位於6-8的pH值範圍；其中該可注射型水膠前驅物組成物充分混合成一清澈溶液，其適於在37℃下轉變成為一水膠，並且具有位於10分鐘至40分鐘之範圍內的膠化時間，而於室溫下保持可注射狀態至少60分鐘，而該水膠具有位於300kPa至500kPa之範圍內的抗壓強度。
- 如請求項1所述的可注射型水膠前驅物組成物，其基本上由下列成份所組成：依該組成物總重量為準約10重量%的明膠；依該組成物總重量為準約0.5-2重量%的透明質酸；依該組成物總重量為準約0.5-1.0重量%的京尼平；以及一水性媒質，具有位於6-8的pH值範圍。
- 如請求項1所述的可注射型水膠前驅物組成物，其中透明質酸的含量依該組成物之總重量為準約占1重量%，而京尼平的含量依該組成物之總重量為準約占0.5重量%。
- 如請求項3項所述的可注射型水膠前驅物組成物，其中透明質酸具有介於約8,000kDa至約10,000kDa之間的分子量。
- 如請求項4所述的可注射型水膠前驅物組成物，其中明膠選自於由A型明膠、B型明膠和彼等之組合所組成的群組。
- 如請求項5所述的可注射型水膠前驅物組成物，其中該明膠包含B型明膠。
- 如請求項1所述的可注射型水膠前驅物組成物，其中該水性媒質選自於由水、水基溶液和水基緩衝液所組成的群組。
- 一種醫藥調配物，其包含如請求項1至7中任一項所述可注射型水膠前驅物組成物，與一成骨性物質相組合，該成骨性物質選自於由間質幹細胞、幹細胞分泌蛋白組(stem cell secretome)、富含血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin)、富含血小板血漿(platelet-rich plasma)、化療藥物、生長因子、細胞激素、抗生素，以及彼等之組合。
- 一種如請求項8所述醫藥調配物在製備供治療節段性骨缺損的藥物上之用途，而該節段性骨缺損具有一缺損部位位於第一骨端以及與該第一骨端斷開連接的第二骨端之間。
- 如請求項9所述的用途，其中該節段性骨缺損是臨界性節段性骨缺損。
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| TW112127852A TWI835690B (zh) | 2023-07-26 | 2023-07-26 | 用於治療節段性骨缺損的可注射型水膠 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103007345A (zh) * | 2012-12-20 | 2013-04-03 | 深圳清华大学研究院 | 抗菌生物活性支架及其制备方法 |
| CN104582747A (zh) * | 2012-08-08 | 2015-04-29 | 南洋理工大学 | 用于制造具有活细胞的水凝胶微粒的方法和用于制造组织工程支架的组合物 |
-
2023
- 2023-07-26 TW TW112127852A patent/TWI835690B/zh active
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