KR20120092632A - 경조직 재생 유도용 재료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다혈소판 혈장과 젤라틴 β-TCP 스폰지를 포함하고, 혈관 신생, 골 신생, 연골 신생 등을 촉진하는 것을 특징으로 하는, 경조직 재생 유도용 재료에 관한 것이다.

Description

경조직 재생 유도용 재료{MATERIAL FOR INDUCTION OF HARD TISSUE REGENERATION}

본 발명은 다혈소판 혈장과 젤라틴 β-TCP 스폰지를 포함하는, 골?연골 등의 경조직 재생 유도용 재료에 관한 것이다.

종래, 골절부의 골 유합이나 양성 골 종양 절제 후 등의 골 결손부의 재건에는, 자기의 건강한 부분으로부터 골을 채취하여 골 결손 부위에 이식하는, 자가 골 이식이 행해지고 있다. 그러나, 건강한 부분에 침습을 가하기 때문에, 골 채취 부위의 감염이나 동통의 지속, 골 채취부 주변의 신경 손상 등, 합병증이 약 3할의 높은 비율로 발생한다. 또한, 골 유합 범위나 골 결손이 큰 증례에서는, 대량의 자가 골이 필요로 되기 때문에, 자가골 채취부의 결손이 임상상 문제가 되는 경우도 있다.

이러한 자가골 이식의 회피 또는 자가 골량의 부족을 보충하기 위해, 인산칼슘이나 β-인산삼칼슘(tricalcium phosphate)(β-TCP)를 이용한 인공골이 사용되어 왔다. 그러나, 인공골 자체에는 골유도능이 없기 때문에, 사용할 수 있는 부위가, 골 재생 환경이 양호한, 비교적 작은 골결손에 한정되는 것이나, 자가골에 비해서 골 형성능이 뒤떨어지기 때문에, 역학적인 강도를 얻을 수 있을 때까지 시간을 요하며, 수술 후 장기에 걸쳐 하중 제한이나 안정이 필요한 것이 큰 문제였다. 이러한 배경으로부터, 광범위에 걸친 골유합이나 골결손에 대해서도 응용 가능한 골유도능을 수반한 골 재생 기술이 널리 연구되고 있다.

최근, 자기의 골수 간엽계 줄기 세포를 배양하고, 인공골과 조합하여 골결손 부위에 이식하는 방법이 개발되어, 임상 응용예가 보고되어 있다(비특허문헌 1). 그러나, 세포 배양을 할 수 있는 클린 룸(셀 프로세싱 센터)이라고 하는 전문 시설이 필요하기 때문에, 시중 병원에서의 실시가 사실상 곤란한 것, 또한, 다분화능을 갖는 간엽계 세포의 암화의 리스크가 있는 것, 분화 유도가 반드시 완벽하지 않은 것 등, 여러가지 문제가 산적하고 있어, 범용성은 낮다.

또한, 성장 인자를 이용한 골 재생 치료로서, 유전자 조직 전환에 의해 생산된 골형성단백질(bone morphogenetic protein)-2(BMP-2)가, 1997년에 구미의 Food and Drug Administration에서 추체간 고정술에서의 사용이 인가되어, 미국에서는 임상 응용이 행해지고 있다. 그러나, 최근, 그 유효성과 안전성이 의문시되고 있다. 예컨대, BMP-2를 이용한 요추 추체간 고정에서는, 고정 추체나 이식 골의 골 흡수가 고빈도로 생겨, 골 유합률이 대폭으로 감소하였다고 하는 보고가 있다. 또한, 연부 조직의 평가에 유용한 MRI에서, 요추 주위 조직에 염증 반응이 보였다고 하는 보고나, 경추의 고정술을 행한 증례에서, 후두 부종에 의한 호흡 곤란, 연하 장해 및 경부 자체의 비정상 종창이라고 하는 위독한 합병증이 보였다고 하는 보고가 있다(비특허문헌 2 및 3). 이들의 원인으로서, 인공적으로 생산된 성장 인자를 대량으로 투여함으로써, 성장 인자가 투여 부위로부터 주위 조직으로 확산되어, 항원 항체 반응을 유발한 결과, 연부 조직 및 중요 장기에서의 부종성 변화가 생긴 것이 생각된다. 또한, BMP-2는 고가이며, 수술 비용에 더하여, 1인당 수십만엔의 비용이 더해지기 때문에, 환자에게 있어서 금전적 부담이 크다.

다혈소판 혈장(PRP(Platelet Rich Plasma)라고도 칭해짐)은, 말초혈을 저속으로 원심 분리하여 적혈구를 제거함으로써 얻어지는 농후 혈소판 혈장이다. PRP에는, 혈소판 중에 포함되는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 트랜스포밍 성장 인자 β(TGF-β), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 등의 성장 인자가 많이 포함되어 있고, 이들의 상승적 작용에 의해 혈관 신생, 골 신생, 상처 치유의 촉진 등의 효과를 갖는 것이 알려져 있다. PRP를, 젤라틴하이드로겔 등의 적절한 드러그 딜리버리 시스템 재료와 병용함으로써, 장관골이나 두개골 결손 모델에 있어서 골 신생 작용을 발휘하는 것도 확인되어 있다(특허문헌 1, 비특허문헌 4 및 5).

그러나, 광범위에 걸친 골결손이나, 해부학적으로 유합하고 있지 않은 골절, 및 척추골을 유합시키는 척추 고정술에 있어서, 충분한 골 형성을 얻기 위해서는, PRP의 효과만으로는 불충분하며, 골아세포의 분화?유도를 촉진시키기 위한 3차원 구조를 갖는 비계가 필요 불가결하다.

특허문헌 1: 일본 특허 공개 제2005-211477호 특허문헌 2: 일본 특허 공개 제2004-123576호

비특허문헌 1: Morishita T, et, Artif. Organs, 2006 비특허문헌 2: Lohn McClellan, et al., J. Spinal Disord. Tech., 2006 비특허문헌 3: Ben B, et al., Spine, 2006 비특허문헌 4: Hokugo A, et al., Tissue Eng., 2005 비특허문헌 5: Hokugo A, et al., Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod., 2007

본 발명의 과제는, 다혈소판 혈장 유래 성장 인자의 서방 효과와, 조직 재생의 양호한 비계 기능을 구비하는, 안전성 및 실용성이 우수한, 골?연골 등의 경조직 재생을 위한 신규인 재료를 제공하는데 있다.

발명자들은 상기 과제를 달성하기 위해, 성장 인자의 드러그 딜리버리 시스템을 위한 재료로서 우수한 젤라틴과 생체 흡수 분해성을 갖는 세라믹스인 β-TCP 과립을 스폰지형으로 가공한, 젤라틴 β-TCP 스폰지에, 환자의 자기 혈액으로부터 정제한 다혈소판 혈장(Platelet Rich Plasma: PRP)을 포함하여 이루어지는 경조직 재생 유도용 재료를 제작하였다. 그리고, 이 재료가 골 형성을 비약적으로 촉진시키는 것을, 랫트 척추 고정 모델을 이용하여 검증하였다.

본 발명은 상기 지견에 기초하여 이루어진 것으로, 다혈소판 혈장 및 젤라틴 β-TCP 스폰지를 포함하는, 경조직 재생 유도용 재료를 제공한다.

본 발명의 재료의 대상이 되는 경조직은, 재생에 비계를 필요로 하는 골?연골 조직 등이며, 치조골 등의 치과 영역도 포함한다.

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 골 신생 및 연골 신생을 촉진한다. 또한, 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 혈관 신생도 촉진한다.

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 젤라틴 β-TCP 스폰지가 조직 재생을 위한 양호한 세포 비계로서 기능하기 때문에, 비계를 필요로 하는 골?연골 등의 경조직의 재생에 적합하게 이용된다. 그러나, 그 적용 부위는 경조직에 한정되지 않고, 골?연골 등의 경조직에 접한 연조직이어도 좋다. 구체적으로는, 골?연골에 접한 힘줄이나 인대 등 연조직의 이식 수술에 있어서도, 그 혈관 신생 촉진 작용에 의해, 힘줄이나 인대 재생을 유도한다. 따라서, 그와 같은 경조직에 접한 연조직의 재생을 유도하기 위한 사용도 또한, 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 이용되는 다혈소판 혈장은, 경조직 재생 유도용 재료의 적용을 받는 대상 유래의 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료의 적용을 받는 대상은 인간에 한정되지 않고, 포유 동물 전반이 포함된다.

본 발명에서 이용되는 젤라틴 β-TCP 스폰지의 구멍 직경은, 10 ㎛?500 ㎛ 정도인 것이 바람직하고, 젤라틴 β-TCP 스폰지 중의 젤라틴은 가교된 것이 바람직하다. 상기 가교는, β-TCP와 젤라틴을 포함하는 조성물에, 가교와 동결 건조를 실시하여 제작되지만, 가교와 동결 건조는 어느 것이 먼저여도 좋고, 가교를 실시한 조성물을 동결 건조하여도 좋으며, 동결 건조한 조성물에 가교를 실시하여도 좋다.

본 발명에서 이용되는 PRP는 경조직 재생 유도용 재료의 적용을 받는 대상 자신의 혈액으로부터 간단하게 채취할 수 있기 때문에, 치료상의 윤리적 문제도 전혀 없고, 혈액 제제의 사용에 수반되는 바이러스 감염이나 면역 부적합 등의 리스크를 회피할 수 있다고 하는 장점을 갖는다. 또한, 본 발명에서 이용되는 젤라틴 β-TCP 스폰지는, PRP에 포함되는 성장 인자 등의 성분을 서서히 방출시켜, 골 신생, 연골 신생, 혈관 신생을 촉진하며, 조직 재생을 위한 양호한 세포 비계로서 기능함으로써, 현저한 골 재생을 가능하게 한다.

도 1은 랫트 척추 후측방 고정 모델에 있어서의 4?5 횡돌기 사이에의 이식을 모식적으로 나타낸 도면이다.
도 2는 좌우 4?5 횡돌기의 사상단면 재구성 화상이다.
도 3은 횡돌기 사이의 골량을 나타내는 그래프이다.
도 4는 3점 굽힘 시험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 PRP 스폰지 모델의 4?5 횡돌기 사이의 조직상을 나타낸다. 횡돌기 사이에 연골내 골화 유사의 변화를 보인다. 한편, 〔비교〕에 있어서는, 무설치군(수술 후 8주간)-횡돌기 사이에는 인대 성분이 보이지만, 골?연골 성분은 보이지 않는다. 화살표는, 모두 좌: 제4 횡돌기, 우: 제5 횡돌기. 상측 도면 우측의 화상은 사프라닌 O 염색상.
본 명세서는 본원 우선권의 기초인 일본 특허 출원 제2009-241041호 명세서에 기재된 내용을 포함한다.

본 발명은 다혈소판 혈장(PRP)과 젤라틴 β-TCP 스폰지를 포함하는, 경조직 재생 유도용 재료에 관한 것이다.

1. 다혈소판 혈장(PRP)

본 발명에 따른 「다혈소판 혈장(Platelet Rich Plasma: PRP)」이란, 말초혈을 저속으로 원심 분리하여 적혈구를 제거함으로써 얻어지는 농후 혈소판 혈장이다. PRP에는, 혈소판 중에 포함되는 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 트랜스포밍 성장 인자 β(TGF-β), 줄기 세포 유래 인자(SDF)-1, 인슐린 유사 성장 인자(IGF) 등의 성장 인자가 많이 포함되어 있고, 이들의 상승적 작용에 의해 혈관 신생, 골 신생, 연골 신생, 상처 치유의 촉진 등의 효과를 갖는 것이 알려져 있다.

PRP 조제에 있어서의 원심 조건에 대해서는, 이용하는 원심 분리기의 종류에 따라, 혈구 성분을 효율적으로 제거하는 회전수 및 시간을 적절하게 선택할 수 있다. 필요하다면, 혈구 성분을 제거한 후, 재차 원심 분리함으로써 혈소판을 농축하여도 좋다. 혹은, PRP는 막을 이용한 혈액 분리 장치에 의해 조제할 수도 있다.

본 발명에서 이용되는 PRP는, 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료의 투여를 필요로 하는 대상 자신의 자기혈 유래인 것이 바람직하다. 단, 중도의 빈혈이나 채혈이 곤란한 기초 질환을 갖는 대상에게 있어서는, 타인혈로부터 정제한 다혈소판 혈장을 사용하여도 좋다.

2. 젤라틴 β-TCP 스폰지

본 발명에서 사용되는 젤라틴 β-TCP 스폰지란, 젤라틴과 β-TCP 과립으로 이루어지는 다공질의 스폰지형 구조물이다.

2. 1 젤라틴

본 발명에서 사용되는 젤라틴은, 소, 돼지, 어류 등을 비롯한 각종 동물종의 피부, 골, 힘줄 등의 신체의 모든 부위로부터 채취할 수 있는 콜라겐, 혹은 콜라겐으로서 이용되고 있는 물질로부터, 알칼리 가수 분해, 산 가수 분해, 및 효소 분해 등의 여러가지 처리에 의해 변성시켜 얻을 수 있다. 젤라틴의 성질은, 이용하는 재료 및 처리 방법에 따라 여러가지이지만, 그 어떠한 성질을 갖는 젤라틴도 본 발명의 젤라틴 β-TCP 스폰지 재료로서 이용할 수 있다.

젤라틴의 성질을 나타내는 척도로서는, 예컨대, 등전점, 분자량, 제타 전위 등이 있다. 예컨대, 시판의 젤라틴으로서는, 시그마사 제조 타입 A 젤라틴, 와코사 제조 젤라틴이 있고, 수용액 중의 제타 전위가 이하와 같다:

시그마사 제조 타입 A 젤라틴: 약 0 ㎷?약 5 ㎷

와코사 제조 젤라틴: 약 -5 ㎷?약 -2 ㎷

제타 전위는, 물질(젤라틴)의 정전적인 하전의 정도를 나타내는 척도이다.

본 발명에서 이용되는 특히 바람직한 젤라틴은, 이하의 물성:

콜라겐으로부터의 알칼리 가수 분해 처리에 의해 얻어지는 산성 젤라틴임,

분자량이, SDS-PAGE의 비환원 조건 하에서 약 10 돌턴?약 20만 돌턴임,

수용액 중의 제타 전위가, 약 -15 ㎷?약 -20 ㎷임

을 갖는 젤라틴이다.

또한 바람직하게는, 소의 골유래의 I형 콜라겐을 알칼리 처리하여 조제한 산성 젤라틴을 이용할 수 있고, 닛타 젤라틴사의 시료 등전점(IEP) 5.0으로서 입수할 수도 있다. 또한, 산 처리하여 조제한 염기성 젤라틴은 마찬가지로 닛타 젤라틴사의 시료 IEP 9.0으로서 입수할 수 있지만, 제타 전위는 이하와 같이 크게 상이하다.

산성 젤라틴(닛타 젤라틴사 시료 IEP 5.0): 약 -15 ㎷?약 -20 ㎷

염기성 젤라틴(닛타 젤라틴사 시료 IEP 9.0): 약 +12 ㎷?약 +15 ㎷

2. 2 β-TCP(β-tricalcium phosphate)

본 발명에서 이용되는 β-TCP(인산삼칼슘)는, 종래부터 인공 골 재료로서 범용되고 있는 생분해성 세라믹스이다. 다공성 β-TCP의 압축 강도는 3M 파스칼 정도이며, 생체골(해면골로 7M 파스칼 정도)보다는 약하지만, 임상 사용에는 충분한 강도라고 말할 수 있다. 또한, β-TCP는 생체 내에서 서서히 분해되어 칼슘 이온과 인산 이온을 방출하여, 골아세포에 의한, 골의 구성 성분인 하이드록시아파타이트 합성이 용이한 환경을 실현한다. 즉, β-TCP는 드러그 딜리버리 시스템의 담체나 골 형성의 비계로서 뿐만 아니라, 그 자체가 골 신생, 연골 신생, 혈관 신생 등을 적극적으로 촉진시키는 기능을 갖는다. 이렇게 하여, β-TCP는, 젤라틴과 혼합됨으로써 얻어지는 젤라틴 스폰지의 역학 강도를 높이며, 그 자체도 골 신생, 연골 신생, 혈관 신생 등을 적극적으로 촉진시킴으로써, 양호한 비계 재료가 된다. 본 발명에서 이용되는 β-TCP는, 그 사이즈, 기공률, 구멍 사이즈 등은 어떠한 것이어도 좋고, 모든 종류의 β-TCP 과립을 이용할 수 있다. 예컨대, 시판의 β-TCP-100(분쇄품): 다이헤이카가쿠산교가부시키가이샤 제조, 오스페린(등록 상표): 올림푸스 제조 등을 이용할 수 있다.

2. 3 젤라틴 β-TCP 스폰지의 구조

본 발명의 젤라틴 β-TCP 스폰지에 있어서의 젤라틴과 β-TCP의 비율은, 건조 중량으로 10:1?1:10, 바람직하게는 5:1?1:5이다.

본 발명에 따른 젤라틴 β-TCP 스폰지는, 평균 구멍 직경이 10 ㎛?500 ㎛인 다수의 미세 소구멍을 갖는 스폰지형의 것이다. 이와 같이 다수의 미세 소구멍을 갖는 구조이기 때문에, 이식한 경우에, 주변의 세포가 스폰지 내에 용이하게 침입할 수 있어, 조직 재생의 비계 재료로서의 역할을 달성하는 것이 가능해진다. 또한, 접착한 세포에 충분한 영양과 산소를 공급하는 것이 가능해져, 세포를 정상적으로 증식, 분화시킬 수 있다.

본 발명에 따른 젤라틴 β-TCP 스폰지의 미세 소구멍의 평균 구멍 직경의 하한은 10 ㎛, 상한은 500 ㎛이다. 10 ㎛ 미만이면, 재생 의료용 지지체의 내부에 세포가 침입할 수 없어 세포 접착성이 극단적으로 뒤떨어지거나, 접착한 세포가 3차원적으로 신장할 수 없거나 하고, 500 ㎛를 넘으면, 세포의 밀도가 낮아져 조직 또는 기관을 재생할 수 없다. 바람직한 하한은 50 ㎛, 바람직한 상한은 200 ㎛이다.

본 발명의 젤라틴 β-TCP 스폰지에 있어서, 젤라틴에는 가교가 실시되어 있다. 가교의 정도(가교도)를 평가하는 지표로서 함수율이 있다. 함수율은, 팽윤 젤라틴 β-TCP 스폰지의 중량에 대한 스폰지 중의 물의 중량 퍼센트이다. 함수율이 크면 젤라틴 β-TCP 스폰지의 가교도는 낮아져, 분해되기 쉬워진다. 즉, 젤라틴 β-TCP 스폰지의 생체 내에서의 효소 분해성은, 이 함수율에 따라 변화하며, 함수율의 값이 PRP의 서방성(서서히 방출)을 좌우한다.

본 발명의 젤라틴 β-TCP 스폰지는, 함수율 90％?99.8％인 것이 바람직하다. 함수율이 90％ 미만이면, 이식에 알맞은 유연성이 손상되는 것 외에, 생체 내에 이식하여도 생분해에 장시간을 요하며, 생리 활성 물질이 서서히 방출되지 않아 지지체 내에 머물러 버리는 경우가 있다. 99.8％를 넘으면, 지지체가 배양액이나 버퍼 중에서 강도를 유지할 수 없거나, 1일?3일간이라고 하는 짧은 기간밖에 생리 활성 물질이 서서히 방출되지 않거나 하는 경우가 있다. 보다 바람직한 하한은 95％, 보다 바람직한 상한은 98％이다.

2. 4 젤라틴 β-TCP 스폰지의 제작 방법

본 발명에서 사용되는 젤라틴 β-TCP 스폰지는, 젤라틴과 β-TCP를 포함하는 조성물에, 가교와 동결 건조를 실시하여 얻어진다.

구체적으로는, 우선, 젤라틴에 β-TCP를 배합한다. 계속해서, 젤라틴에 가교를 도입한다. 가교 방법은 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 진공 열 탈수법, 건열법, γ선 조사법, 자외선 조사법, 전자선 조사법, X선 조사법, 가교제를 이용하는 방법 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 후술하는 바와 같이 일단 스폰지형으로 성형한 상태의 젤라틴을 가교하는 경우라도 내부까지 균일한 가교도가 되도록 가교할 수 있기 때문에 가교제를 이용하는 방법이 적합하다.

이용되는 가교제는 특별히 한정되지 않고, 예컨대 글루타르알데히드, 예컨대 EDC 등의 수용성 카르보디이미드, 예컨대 프로필렌옥사이드, 디에폭시 화합물, 수산기, 카르복실기, 아미노기, 티올기, 이미다졸기 등의 사이에 화학 결합을 만드는 축합제(에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 글리세롤폴리글리시딜에테르, 헥사메틸렌디이소시아네이트 등)를 이용할 수 있다. 바람직한 것은, 글루타르알데히드이다.

가교는, 동결 건조 전에 행하여도, 동결 건조 후에 행하여도 좋다. 구체적으로는, 예컨대, β-TCP를 배합한 젤라틴 수용액을, 호모게나이저 등에 의해 격하게 교반하여 발포시킨 후, 가교 반응을 행한 후, 형틀에서 유연(流延)하여, 동결 후 추가로 동결 건조하여 스폰지형의 성형체를 얻거나, 혹은 β-TCP를 배합한 젤라틴 수용액을, 호모게나이저 등에 의해 격하게 교반하여 발포시킨 후, 형틀에 유연하여, 동결 후 추가로 동결 건조하여 스폰지형의 성형체를 얻고, 이 스폰지형 성형체를 적당한 농도의 글루타르알데히드 용액에 일정 시간 침지함으로써 가교를 실시한다(일본 특허 공개 제2005-211477호 참조).

아미노기와 반응하는 것과 같은, 예컨대, 글루타르알데히드에 의한 가교 반응을 정지시키기 위해서는, 에탄올아민, 글리신 등의 아미노기를 갖는 저분자 물질에 접촉시키거나, 혹은, pH 2.5 이하의 수용액을 첨가하면 좋다. 반응에 이용된 가교제 및 저분자 물질을 완전하게 제거할 목적으로, 얻어진 젤라틴 β-TCP 스폰지는, 증류수, 에탄올, 2-프로판올, 아세톤 등에 의해 세정하고, 재차 동결 건조하여도 좋다.

비계 재료로서 중요한 스폰지 구조는, 교반에 의한 발포와, 동결 건조 공정에 의해 형성된다. 즉, 동결 공정에 의해 성장한 무수한 물의 결정이, 동결 건조에 의해 기공이 되어, 원하는 기공률과 기공 직경을 갖는 다공질 스폰지 구조를 부여한다.

또한, 글루타르알데히드 등의 가교제 처리에 있어서, 처리의 초기에 스폰지형 구조체가 팽윤하여 버리는 것을 피할 목적으로, 처리 전에 열가교 처리 등을 실시하여 두어도 좋다. 또한, 가교제에 의한 가교를 행한 경우에는, 반응 말단을 처리하여 독성을 제거하는 것이 바람직하다. 예컨대, 글루타르알데히드 처리 후에는, 글리신 수용액 등을 이용하여 세정함으로써, 반응 말단을 실활시켜 독성을 제거할 수 있다.

젤라틴 β-TCP 스폰지는 어떠한 형상으로 성형하여도 좋고, 예컨대, 원주형, 각주형, 시트형, 디스크형, 구형, 입자형 등으로 성형할 수 있다. 원주형, 각주형, 시트형, 디스크형의 것은, 통상 매립편으로서 이용되는 경우가 많고, 혹은 미세하게 부수어 입자형으로 하여 이용하는 것도 가능하다. 또한, 구형, 입자형의 것은 주사 투여도 가능하다.

또한, 젤라틴 β-TCP 스폰지는 시판품(예컨대, β-TCP 강화형 젤라틴 스폰지 MedGel(등록 상표) Scaffold 혹은 MedGel(등록 상표) SP(메드젤))을 이용하여도 좋다.

3. 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료

본 발명에 따른 「경조직」이란, 골, 연골, 이를 포함하는 단단한 세포간 물질을 갖는 조직을 의미한다. 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 골 신생이나 연골 신생, 혈관 신생 등의 재생 촉진 효과를 갖는 PRP와, 조직 재생의 비계로서 우수한 젤라틴 β-TCP 스폰지를 포함함으로써, 경조직 재생 유도용 재료로서 이용된다. 특히, 골?연골 조직 결손부의 재생 유도용 재료로서 적합하게 이용된다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 세포 비계를 필요로 하는 골?연골 결손부의 재생 유도용 재료에 적합하게 이용되지만, 그 적용 부위는 경조직에 한정되지 않고, 골?연골 등의 경조직에 접한 연조직이어도 좋다. 구체적으로는, 골?연골에 접한 힘줄이나 인대 등 연조직의 이식 수술에 있어서도, PRP의 혈관 신생 촉진 작용에 의해, 힘줄이나 인대의 재생을 유도한다. 따라서, 그와 같은 경조직에 접한 연조직의 재생을 유도하기 위한 사용도 또한, 본 발명에 포함된다.

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 정형 외과, 치과 영역을 포함하는 의학?수의학 분야에 있어서 널리 사용 가능하며, 그 적용을 받는 대상은 인간에 한정되지 않고, 포유 동물 전반이 포함된다.

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 상기한 젤라틴 β-TCP 스폰지에 PRP를 배합하여 조제된다. PRP 함유 젤라틴 β-TCP 스폰지는, 예컨대, 상기 동결 건조한 젤라틴 β-TCP 스폰지에 PRP를 적하하거나, 혹은 젤라틴 β-TCP 스폰지를 PRP 중에 침지시켜, 스폰지 내에 PRP를 함침시킴으로써 얻을 수 있다. 이 함침 조작은, 통상, 4℃?37℃에서 15분간?1시간, 바람직하게는 4℃?25℃에서 15분?30분간으로 종료하며, 그 사이에 스폰지는 PRP로 팽윤하고, PRP 중에 포함되는 성장 인자 등이 스폰지 내의 젤라틴 분자와 상호 작용함으로써, 성장 인자 등이 젤라틴 분자와 복합체를 형성함으로써, PRP가 젤라틴 β-TCP 스폰지 내에 물리적 상호 작용에 의해 고정된다. PRP와 젤라틴 분자 사이의 복합체의 형성에는, 양자간의 정전적 상호 작용뿐만 아니라, 소수 결합, 수소 결합 등의 다른 상호 작용도 크게 기여하고 있다고 생각된다.

젤라틴 β-TCP 스폰지(건조 중량)에 대한 PRP의 중량비는 약 1배?약 10000배의 범위 내인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 젤라틴 β-TCP 스폰지에 대하여 PRP는 약 2배?약 5000배의 중량비이며, 더욱 바람직하게는 약 10배?약 1000배의 중량비이다.

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 환부에 직접 포매(적용)되고, 각각의 용도에 따라 적절하게 제형을 고안할 수 있다. 즉, 젤라틴 β-TCP 스폰지를, 그 적용 부위에 맞추고, 원주형, 각주형, 시트형, 디스크형, 구형, 입자형 등, 원하는 형태로 성형하면 좋다.

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료 중의 PRP의 용량은, 질환의 위중도, 대상의 연령, 체중 등에 따라 적절하게 조제할 수 있지만, 통상 인간의 경우이면, 성인 환자당 약 0.1 ㎖?약 500 ㎖의 범위, 바람직하게는, 약 1 ㎖?약 50 ㎖의 범위에서 투여량이 선택되고, 이것을 환부 또는 그 주변 부위에 주입할 수 있다. 또한 1회의 투여로 효과가 불충분한 경우는, 그 투여를 복수회 행하는 것도 가능하다.

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 필요에 따라, 적절하게 다른 약제나 약리학적으로 허용할 수 있는 담체를 함유하고 있어도 좋다. 그와 같은 약제나 담체로서는, 혈관 신생이나 골 재생을 촉진하는 약제, 골아세포의 활성화 또는 파골 세포의 억제제, 세포의 증식 분화를 재촉하는 비계 담체, 혹은 이들의 조합 등을 들 수 있다.

4. 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료의 효과

4. 1 PRP 서방성 효과

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, PRP의 서방성 효과와 안정화 효과를 더불어 갖기 때문에, PRP에 포함되는 각종 성장 인자 등의 기능을 소량으로 장시간에 걸쳐 발휘할 수 있다. 그 때문에, 국소 투여한 부위에 있어서, 이들의 성장 인자 등의 혈관 신생 촉진 기능 및 골 신생?연골 신생 기능이 효과적으로 발휘된다.

이 서방성의 메커니즘은, PRP에 포함되는 각종 성장 인자 등이, 스폰지 내의 젤라틴 β-TCP에 물리적으로 고정화되어 있는 것에 기초한다. 본 발명자들은 지금까지, 성장 인자, 사이토카인, 모노카인, 림포카인, 그 외의 생리 활성 물질 등의 생체 흡수성 고분자 하이드로겔을 이용한 서방화를 시도하여, 이에 의해 다른 재료로는 달성할 수 없는 생리 활성을 갖는 성장 인자 등의 서방화와 그 서방 기간의 컨트롤에 성공하여 왔다. 본 발명에 있어서는, PRP에 포함되는 성장 인자 등이 동일한 메커니즘에 의해 젤라틴 β-TCP로부터 서서히 방출된다고 생각된다. 젤라틴 β-TCP에 고정화된 상태에서는, 성장 인자 등은 스폰지로부터 방출되지 않는다. 생체 내에서 젤라틴 β-TCP 스폰지가 분해됨에 따라, 젤라틴 β-TCP 분자가 수가용성이 되고, 그에 따라, 젤라틴 β-TCP 분자에 고정화되어 있는 성장 인자 등이 방출되게 된다. 즉, 젤라틴 β-TCP 스폰지의 분해에 의해, 성장 인자 등의 서방성을 제어할 수 있다. 젤라틴 β-TCP 스폰지의 분해성은, 젤라틴 β-TCP 스폰지 제작 시에 있어서의 가교 정도를 조절함으로써 바꿀 수 있다. 또한, PRP에 포함되는 각종 성장 인자 등이 젤라틴 β-TCP와 상호 작용함으로써, 이들의 생체 내에서의 안정성, 예컨대 효소 분해 저항성 등이 향상된다. 또한, 성장 인자 등의 서방화에 따라, 젤라틴 β-TCP 스폰지는 소실되기 때문에, 세포의 증식 분화에 의한 골 재생 과정을 물리적으로 저해하지 않는다고 하는 특징을 갖는다.

4. 2 혈관 신생 촉진 및 골 신생?연골 신생 촉진 효과

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료에 배합되는 PRP는, 각종 성장 인자 등을 포함하며, 혈관 신생 촉진 효과, 골 신생 촉진 효과, 연골 신생 촉진 효과, 상처 치유 촉진 효과, 피부 궤양 치료 효과 등의 여러가지 효과를 갖는다(전술).

후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 발명자들은 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료가 현저한 골 재생 작용을 갖는 것을 확인하였다. 골 형성에는, 혈관 신생의 관여도 보고되어 있고, 골 신생?연골 신생 촉진 효과뿐만 아니라, 혈관 신생 촉진 효과 등, PRP가 갖는 여러가지 효과가 기여함으로써, 결손부에 있어서의 조직 재생이 촉진되어, 양호한 골 재생이 달성된다.

4. 3 비계 재료로서의 효과

본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 가교된 젤라틴 β-TCP 스폰지를 주체로 하며, 일정한 구멍 직경의 다수의 미세 소구멍을 갖는 기재로 이루어짐으로써 세포가 용이하게 침입할 수 있어, 재생의 비계 재료로서의 역할을 달성할 수 있다. 또한, 기재의 표면에는 PRP 성분이 정전 결합하고 있어 기재의 분해에 맞추어 서서히 방출되기 때문에, 장기간에 걸쳐 세포에 해당 PRP 성분을 계속 작용시킬 수 있어, 골 형성 효과를 비약적으로 증대시킬 수 있다. 이 서방 속도는, 젤라틴의 가교도를 조정함으로써 조절하는 것이 가능하다. 즉, 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는, 재생을 위한 비계 재료와 재생 촉진제의 2가지의 역할을 동시에 달성할 수 있는 것이다.

실시예

이하에 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

실시예

1. 다혈소판 혈장(PRP) 조제

SD 랫트(웅성, 8주령, 240 g?290 g, 시미즈 실험 재료, 쿄토), 250 μL의 펜토바르비탈을 복강내 주사하여 전신 마취를 행하였다. 개흉하여, 21G 바늘을 이용하여 심장으로부터 5 CC의 채혈을 행하였다. 미리 ACD-A액(W/V％: 시트르산 0.85, 시트르산삼나트륨 2.32, 글루코오스 2.59)을 2 CC 넣어 둔 15 ㏄ 원심 튜브에, 혈액을 옮겼다. 원심 튜브를, 원심 분리기(KN-70, 구보타세이사쿠쇼 제조)를 이용하여 1500회전으로 10분간 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상층에 있는 투명한 혈청 부분을, 14G 사프로 바늘을 이용하여 흡인하여, 별도의 원심 튜브에 옮겼다. 추가로, 3000회전으로 10분간 원심 분리하였다. 상층의 혈청 부분을, 14G 사프로 바늘을 이용하여, 200 μL 남기고 흡인하고, 남은 용액을 교반하여, 다혈소판 혈장(PRP) 200 μL를 얻었다. 얻어진 200 μL의 PRP를, 한쪽 편 2 ㎜의 정육면체로 절단한 젤라틴 β-TCP 스폰지(β-TCP 강화형 젤라틴 스폰지 MedDel(등록 상표) Scaffold(메드젤)) 합계 20 ㎎에 함침시켜, 4℃에서 하룻밤 방치하였다. 대조로서, 인산염 완충 염수(Phosphate buffer saline)(이하, PBS) 200 μL를 동형 동량의 젤라틴 β-TCP 스폰지에 함침시켜, 4℃에서 하룻밤 방치하였다.

2. 랫트 척추 후측방 고정 모델

SD 랫트(웅성, 8주령, 240 g?290 g, 시미즈 실험 재료, 쿄토)에, 250 μL의 펜토바르비탈을 복강내 주사하여 전신 마취를 행하였다. 등부 정중앙의 피부에 40 ㎜의 세로 절개를 가하였다. 정중앙으로부터 좌우 5 ㎜의 위치에서, 방척주근에 25 ㎜의 세로 절개를 가하여, 제4 및 제5 요추의 횡돌기(이하, 4?5 횡돌기)를 양측 노출시켰다. 선단이 직경 0.5 ㎜인 스틸 바(오사다석세스-40M, OS-40MV, 나가타덴키코교사 제조)를 이용하여, 횡돌기의 등측 피질골을, 골수로부터의 출혈을 확인할 수 있을 때까지 굴착하였다. 좌우의 4?5 횡돌기 사이에 이하에 나타내는 재료를 이식하고, 절개한 방척주근과 피부를 3-0 나일론실(회사 제조)로 봉합하였다. 이식하는 재료는, 1:「PRP 함침 젤라틴 β-TCP 스폰지(이하 PRP 스폰지), 2: PBS(phosphate buffer saline) 함침 젤라틴 β-TCP 스폰지(MedGel(등록 상표) Scaffold(메드젤): 이하, PBS 스폰지), 3: PRP 단독, 4: 자가 장골로 하고, 아무것도 이식하지 않은 군과 합쳐, 합계 5군으로 검토를 행하였다. 3의 PRP 단독 모델에서는, 200 μL의 PRP만을 횡돌기 사이에 살포하였다. 4의 자가 장골은 이식 예정부와 동측의 장골 선단을 5 ㎜×2 ㎜×2 ㎜의 크기로 채취하였다. 도 1에, 랫트 척추 후측방 고정 모델에 있어서의 4?5 횡돌기 사이에의 이식을 모식적으로 나타낸다.

3. 골 형성의 평가 및 역학적 강도의 평가

수술 후 8주간에서 펜토바르비탈의 대량 투여로 안락사시켜, 요추를 적출하였다. μCT(마이크로포커스 2D/3D X선 CT 장치, ScanXmate-E090S40, 컴스캔테크노사 제조)를 이용하여 4?5 횡돌기의 시상 단면 재구성 화상을 작성하고, 횡돌기 사이의 유합의 유무를 평가하였다. 또한, 얻어진 화상을 기초로, 화상 해석 소프트(FanCT ver 1.3 컴스캔테크노사 제조)를 이용하여 횡돌기 사이만을 추출하여, 골량을 계측하였다. 그 후, 3점 굽힘 시험기(토쿄시켄키, LSC-200/30-2)를 이용하여 요추의 3점 굽힘 시험을 행하였다. 폭 40 ㎜의 간격을 두고 지그 위에, 요추를 전방이 위를 향하도록 설치하고, 직경 5 ㎜의 원주 지그를 이용하여, 10 ㎜/min의 속도로 제4/제5 요추 추간판 전방으로 압박력을 가하였다. 변위 거리가 10 ㎜인 시점에서의 하중을 각 군에서 비교하였다. 다음에, 4％ 파라포름알데히드로, 1주간, 4℃에서 조직 고정을 행하였다. 0.5 MEDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)액으로, 2주간, 탈회를 행한 후, 20％ 슈크로스에 2일간 침지시켰다. 4?5 횡돌기 사이 단면의 동결 조직 절편(두께 12 ㎛)을 제작하여, 헤마톡실린?에오신 염색 및 사프라닌 O 염색(연골 기질을 적염)을 행하였다.

4. 결과

도 2에, 좌우 4?5 횡돌기의 시상 단면 재구성 화상의 결과를 나타낸다. PRP 스폰지 모델 및 자가 장골 모델에서는 좌우 횡돌기 사이의 유합 경향이 보였다. 또한, PRP 스폰지 모델에서는, 자가 장골 모델에 비해서, 현저한 횡돌기 전후 직경의 증대가 보였다. PBS 스폰지, PRP 단독 및 무설치 모델에서는 횡돌기 사이의 증대는 없고, 골유합 경향은 보이지 않았다.

도 3에, 좌우 4?5 횡돌기 사이의 골량을 나타낸다. PRP 스폰지 모델에서는, 다른 모델에 비해서 현저한 골량의 증대가 보였다.

도 4에, 3점 굽힘 시험의 결과를 나타낸다. PRP 스폰지 모델에서는, 다른 군에 비해서 평균 59.6배의 강도가 보였다.

도 5에, PRP 스폰지 모델의 4?5 횡돌기 사이의 조직상을 나타낸다. 횡돌기 사이에서는, 골기질 및 초자 연골 성분이 혼재한 상을 나타내고 있고, 연골내 골화와 유사한 현상이 생기고 있었다. 사프라닌 O 염색에서는, 초자 연골 주변의 일부가 적염색상을 나타내고 있고, 연골 기질인 것이 증명되었다. 비교로서, 무설치군의 4?5 횡돌기 사이의 조직상(수술 후 8주간)을 나타낸다. 도 5에 나타내는 바와 같이, 횡돌기 사이에는 인대 성분이 보이지만, 골?연골 성분은 보이지 않는다.

5. 결론

이상의 결과로부터, PRP와 젤라틴 β-TCP 스폰지를 조합함으로써, 자가 골이식을 상회하는, 매우 높은 골?연골 형성능이 달성되어, 유합 부위에 있어서의 역학적 강도가 저명하게 증강하는 것이 증명되었다.

참고예. 젤라틴 β-TCP 스폰지의 제작

젤라틴으로서는, 닛타 젤라틴사 제조의 산 처리품(산처리 젤라틴)을 이용하였다. 또한, β-TCP로서는, β-TCP-100(분쇄품)(다이헤이카가쿠산교가부시키가이샤)을 이용하였지만, 오스페린을 이용하여도 좋다.

산처리 젤라틴을 증류수에 용해하여 3 중량％의 젤라틴 수용액을 조제하였다. 얻어진 젤라틴 수용액 60 mL에 β-TCP 1.8 g을 배합하고, 0.16 중량％ 글루타르알데히드 수용액 0.4 mL를 부가하여, 호모게나이저로, 5000 rpm, 3분간 교반함으로써 발포시켰다. 발포한 젤라틴 β-TCP 수용액을 12 ㎝×12 ㎝의 형틀에 유연하여, 4℃, 12시간 정치하여 가교 반응을 행한 후, -40℃에서 동결한 후, 동결 건조를 행하여 스폰지체를 얻었다.

얻어진 스폰지체를, 0.1 N 글리신 수용액을 이용하여 1시간 세정을 3회 행한 후, 더욱 수세하고, 재차 동결 건조하여 젤라틴 β-TCP 스폰지를 얻었다.

본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로서 본 명세서 중에 포함되는 것으로 한다.

본 발명에서 이용되는 다혈소판 혈장은 경조직 재생 유도용 재료의 적용을 받는 대상 자신의 혈액을 원심 조작하는 것만으로 정제할 수 있기 때문에, 특별한 시설이나 기기를 필요로 하지 않고, 다시설에서의 실시가 가능하다. 또한, 자기혈 유래의 다혈소판 혈장을 이용하기 때문에, 유전자 재조합 성장 인자에 비해서, 부작용이 생길 가능성은 매우 낮다. 또한 젤라틴 β-TCP 스폰지는 임상에서 사용되고 있는 재료만을 사용하고 있어 인체에의 안전성이 높기 때문에, 본 발명의 경조직 재생 유도용 재료는 매우 신속한 임상 응용을 기대할 수 있다. 본 발명의 보급에 의해, 종래부터 일반적으로 행해져 온 자가골 채취의 필요성이 극적으로 감소할 뿐만 아니라, 골 형성능 촉진 작용에 의해 조기 하중이나 조기 리허빌리테이션이 가능해지기 때문에, 그 은혜는 헤아릴 수 없다.

Claims (9)

1. 다혈소판 혈장 및 젤라틴 β-TCP 스폰지를 포함하는, 경조직 재생 유도용 재료.
2. 제1항에 있어서, 젤라틴 β-TCP 스폰지를 구성하는 젤라틴이 산성 젤라틴인 재료.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 경조직이 골?연골 조직인 재료.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 골 신생 또는 연골 신생을 촉진하기 위한 것인 재료.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혈관 신생을 촉진하기 위한 것인 재료.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 다혈소판 혈장이 경조직 재생 유도용 재료의 적용을 받는 대상 유래의 것인 재료.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 젤라틴 β-TCP 스폰지의 구멍 직경이 10 ㎛?500 ㎛인 재료.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 젤라틴 β-TCP 스폰지 중의 젤라틴이 가교된 것인 재료.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 젤라틴 β-TCP 스폰지가, β-TCP와 젤라틴을 포함하는 조성물에, 가교와 동결 건조를 실시하여 제작된 것인 재료.

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