CN104784756B - 一种粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架。本发明的粘附血小板的复合多孔金属支架的制备方法如下：首先，利用3D打印技术制备多孔金属支架；然后，采用热交联法在上述多孔金属支架内部制备出三维微支架；最后，将富血小板血浆冻干粘附在三维微支架上。本发明的粘附血小板的复合多孔金属支架为骨细胞的生长提供了最好的生长微环境，经冻干处理后的血小板遇水化后可缓慢激活释放细胞因子，诱导骨组织、纤维组织及新生血管的形成，为临床上骨组织修复提供了良好的具有生物活性的支架材料。
Description
技术领域
本实用新型属于生物医学材料技术领域，涉及一种具有仿生三维微支架的3D打印医用多孔金属支架，具体涉及一种在三维微支架表面附着血小板层使其具有生物活性的多孔金属支架。
背景技术
钛合金作为生物医用金属功能材料之一，在人体外科植入物中得到广泛应用，如口腔种植体、骨缺损修补材料、假关节植入体等。其具有无毒、质轻、良好生物相容性和耐腐蚀性以及具有与人体皮质骨更为匹配的弹性模量。而由于钛合金表面的生物惰性，不利于成骨细胞生长，因此多孔及表面涂层修饰钛合金支架受到越来越多的关注。但现有的机械加工技术很难制备出均匀大小一致的微米级别联通孔隙。
3D打印的出现让人们重新认识了钛合金，通过CT等扫描数据的处理，由计算机设计构建，可以将钛合金打印成符合需求的个性化多孔连通复杂结构，不仅给骨长入提供了空间，也因为多孔结构降低了钛合金的弹性模量，实现了与正常骨组织弹性模量的匹配，且不必担心降解时间与机体需求的不匹配，成为了3D打印在骨科发展的重要方向。
然而，现有3D打印技术制作出的多孔钛合金材料，孔隙直径约300-2000μm，对于平均直径10-20μm的细胞来说，显得过于空旷。且细胞只能延附孔壁攀附生长，不能实现在整个孔洞内三维层次生长，未能充分有效利用多孔钛内部的空间。既往很多研究侧重点在于利用酸碱腐蚀、电镀等方法表面修饰多孔钛金属或表面负载生物活性因子，很少有研究重点将多孔支架内部二维空间改造为三维空间。而我们猜想若能在多孔钛的每一个孔洞中，搭建一个仿生三维微支架，将给细胞的增殖、分化提供一个良好的环境。
人体来源的血小板含有丰富的细胞因子，如血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子(TGF-β)、血管内皮生长因子(VEGF)等。多项体外研究证实,血小板的浓度与骨髓基质干细胞、成纤维细胞增殖和I型胶原蛋白的产生成正相关。富血小板血浆(PRP)是血小板浓缩物，其可以释放多种细胞因子，在促进骨修复、血管生成、软组织生成等方面发挥重要作用。而现在临床上，富血小板血浆在口腔科种植体及心脏瓣膜移植术等方面已成熟应用。另一方面，血小板冻干保存技术已在市场及临床中应用，其可以做到常温长期有效保存，对血小板活性并无太大影响，而将血小板再次水化后可缓慢激活释放内部生长因子。将血小板融合入3D打印多孔钛合金支架则可使钛合金具有多种生物活性，其血小板来源的生物因子更接近人体需要量，有研究表明血小板纤维化可在一定程度上达到缓释效果。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架，所述粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架包括多孔金属支架、位于所述多孔金属支架内部的三维微支架、以及粘附在所述三维微支架上的血小板。本发明的粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架既克服了多孔金属支架缺乏生物活性的缺陷，同时克服了生物可降解材料机械强度不够导致应用范围小的缺陷。另外，本发明的目的还在于提供了粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架的制备方法。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了一种粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架，所述粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架包括多孔金属支架、位于所述多孔金属支架内部的三维微支架、以及粘附在所述三维微支架上的血小板。所述三维微支架的孔径为80-200μm。
进一步，本发明的多孔金属支架可以是多孔钛合金支架、多孔纯钛支架、多孔不锈钢支架、多孔钴合金支架。在本发明的具体实施方案中，所述多孔金属支架是多孔钛合金支架。
进一步，本发明的所述三维微支架可以由高分子材料和/或生物陶瓷制备而成。
高分子材料可以是胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠、硫酸葡聚糖、肝素钠、硫酸软骨素或硫酸角质素中的一种或几种。生物陶瓷可以是纳米羟基磷灰石、磷酸三钙或者磷酸钙中的一种或几种。
在本发明的具体的实施方案中，所述三维微支架是由明胶制备而成。
进一步，本发明使用的血小板是由富血小板血浆冻干而成。
本发明还提供了上述粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架的制备方法，所述制备方法包括：
(1)制备多孔金属支架；
(2)利用高分子材料和/生物陶瓷在步骤(1)制备的所述多孔金属支架内部制备三维微支架形成三维微支架复合多孔金属支架；
(3)将富血小板血浆粘附到步骤(2)制备的所述三维微支架中。
进一步，步骤(1)中所述多孔金属支架利用3D打印技术制备而成，3D打印技术包括选择性激光烧结技术(SLS)、选择性激光熔融技术(SLM)、电子束熔融技术(EBM)，上述技术制备的多孔金属支架孔径为100μm-2000μm，弹性模量小于10GPa。
在本发明的具体实施方案中，步骤(1)的具体操作为：
a、将CT图像导入Mimics或CAD等三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，平均孔柱为100-1000μm、孔径为300-3000μm，以正六面体、正十二面体结构单位充填、扩展该图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型；
b、采用EOS M280金属材料3D打印机，依据设计模型打印多孔金属支架。
优选地，目标骨组织的三维图像的平均孔柱为300μm、孔径为1000μm。
优选地，以正十二面体结构单位充填、扩展三维图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型。
优选地，上述多孔金属支架以钛合金(Ti-6Al-4V)为原料制备。
步骤(2)制备三维微支架可以使用高分子材料，包括但不限于，胶原、明胶、丝素蛋白、玉米蛋白、藻酸盐、壳聚糖、透明质酸钠、海藻酸钠、硫酸葡聚糖、肝素钠、硫酸软骨素或硫酸角质素。
步骤(2)制备三维微支架可以使用生物陶瓷，包括但不限于，纳米羟基磷灰石、磷酸三钙或者磷酸钙。
步骤(2)制备三维微支架可以使用上述高分子和生物陶瓷的组合。
在本发明的具体实施方案中，步骤(2)制备三维微支架使用的是明胶。
骨组织工程中使用的三维多孔支架根据采用的材料不同，制备方法也有所不同，制备方法包括：高温烧结法、相分离法/冷冻干燥法、颗粒/微球/纤维-堆积粘结法及模板层压法、交联凝胶化法、自固化/聚合-溶出法、静电纺丝技术、气体发泡技术/超临界流体法、溶液浇注-粒子沥滤法、溶液涂覆-致孔剂分解技术、快速成型技术等。其中，交联凝胶化法主要是通过各种物理化学交联的方法使高聚物发生凝胶化，然后再利用如冷冻干燥法或者真空干燥法等技术除去溶剂制备多孔支架。常见的化学交联法包括戊二醛交联法、碳化二亚胺交联、酰叠氮法、赖氨酸交联法。常见的物理交联法包括脱水加热、高能辐射、光氧化。
优选地，本发明的三维微支架的制备采用的是物理交联法；更优选地，本发明的三维微支架的制备采用的是热交联法。
在本发明的具体实施方案中，步骤(2)的具体操作为：将明胶颗粒加入去离子水中充分溶解，使其终浓度为1.5-20％；取上述明胶溶液，加入适量氯化钠固体，混合后灌注到步骤(1)制备的多孔金属支架中并冷冻干燥；采用热交联方式处理后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥，获得三维微支架复合多孔金属支架。
优选地，步骤(2)的具体操作为：将明胶颗粒加入去离子水，在37℃，300r/min的磁力搅拌器中2h至彻底溶解，终浓度为1.5-20％；取上述明胶溶液5ml，加入1g氯化钠固体，混合后灌注到步骤(1)制备的多孔金属支架中并冷冻干燥；在180℃下热交联24h后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥，获得三维微支架复合多孔金属支架。
优选地，明胶溶液的终浓度为3-5％。
进一步，所述步骤(3)的具体操作为：将步骤(2)制备的所述复合多孔金属支架经EOG灭菌后，在超净台内滴加富血小板血浆，使血浆完全浸润所述复合多孔金属支架，并封入灭菌袋中，再次冻干。
目前，国际上尚无统一的标准化的富血小板血浆的提取方法。按其制备程序，可以分为一次离心法、二次离心法、三次离心法。大量的实验证明，二次离心法的提取率最高，在临床上也应用最广。在本发明的具体实施方案中，富血小板血浆的提取方法为：
(1)用装有抗凝剂的真空采血针采静脉血10ml，用2000r/min离心10min，分两层，上层为富含血小板溶液，移出全部上清液及下层悬浮物1mm至空离心管中。
(2)再次离心2000r/min，10min，移除3/4上清液，得到沉淀物及1/4上清液，吹打后得到混匀的富血小板血浆。
本发明还提供了上述粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架在制备骨组织工程材料中的应用。
本发明的优点和有益效果：
1、本发明的复合多孔金属支架可提供细胞最佳生长环境，抛弃了传统观念中金属支架的设计必须满足最适合细胞生长孔径的限制，尽可能将其制备成大孔洞和高孔隙率结构，从而实现了金属的最少化和骨长入量的最大化；而内部三维微支架则不再受首先满足力学强度的限制，尽可能采用最利于骨生长的材料，营造出结构疏松、具有细胞识别位点、适合细胞攀附生长的三维微支架，为细胞提供最好的生长微环境，从而实现两者的优势互补。
2、本发明的三维微支架的制备采用热交联方法，较以往使用EDC、戊二醛交联剂的化学交联方法相比，没有化学毒性，与此同时形成相差无几的级联孔洞。
3、本发明的复合多孔金属支架中的三维微支架中粘附的血小板是经富血小板血浆冻干处理后获得的，可在常温下长久保存，遇水水化后可缓慢激活释放细胞因子，使其具备一定的生物活性。
4、本发明使用的血小板来源方便，可采用自身或同种同型血小板，较同种异体骨来说没有免疫排斥性。
附图说明
图1显示使用3D打印技术制备的多孔钛合金支架；
图2显示明胶三维微支架的电镜扫描图；
图3显示多孔钛合金支架孔洞中的明胶三维微支架；
图4显示粘附血小板的明胶三维微支架的电镜扫描图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
下列实施例中未注明来源的试剂，均可从商用途径获取。
实施例1粘附血小板的三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
1、多孔钛合金支架的制备
(1)将CT图像导入Mimics或CAD等三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，平均孔柱为100μm、孔径为300μm，以正六面体单位充填、扩展该图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型。
(2)采用EOS M280金属材料3D打印机，以钛合金(Ti-6Al-4V)为原料，依据设计模型打印多孔钛合金支架。
2、明胶三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
(1)将明胶颗粒加入去离子水中浸泡2h，同时在37℃，300r/min的磁力搅拌器作用下搅拌至彻底溶解，终浓度为1.5％。
(2)取步骤(1)制备的明胶溶液5ml，加入1g氯化钠固体，混合后灌注到3D金属支架内并冷冻干燥。
(3)在180℃下热交联24h后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥。
3、明胶三维微支架上粘附血小板
(1)制备富血小板血浆：首先，用装有抗凝剂的真空采血针采静脉血10ml，用2000r/min离心10min，分两层，上层为复含血小板溶液，移出全部上清液及下层悬浮物1mm至空离心管中；然后，再次离心2000r/min，10min，移除3/4上清液，得到沉淀物及1/4上清液，吹打后得到混匀的富血小板血浆。
(2)将上述步骤2制备的明胶三维微支架复合多孔钛合金支架经EOG灭菌后，在超净台内向其滴加富血小板血浆，使血浆完全浸润复合多孔钛合金支架，并封入灭菌袋中，再次冻干后备用。
实施例2粘附血小板的三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
1、多孔钛合金支架的制备
(1)将CT图像导入Mimics或CAD等三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，平均孔柱为300μm、孔径为1000μm，以正十二面体单位充填、扩展该图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型。
(2)采用EOS M280金属材料3D打印机，以钛合金(Ti-6Al-4V)为原料，依据设计模型打印多孔钛合金支架。
2、明胶三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
(1)将明胶颗粒加入去离子水中浸泡2h，同时在37℃，300r/min的磁力搅拌器作用下搅拌至彻底溶解，终浓度为5％。
(2)取步骤(1)制备的明胶溶液5ml，加入1g氯化钠固体，混合后灌注到3D金属支架内并冷冻干燥。
(3)在180℃下热交联24h后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥。
3、明胶三维微支架上粘附血小板
(1)制备富血小板血浆：首先，用装有抗凝剂的真空采血针采静脉血10ml，用2000r/min离心10min，分两层，上层为复含血小板溶液，移出全部上清液及下层悬浮物1mm至空离心管中；然后，再次离心2000r/min，10min，移除3/4上清液，得到沉淀物及1/4上清液，吹打后得到混匀的富血小板血浆。
(2)将上述步骤2制备的明胶三维微支架复合多孔钛合金支架经EOG灭菌后，在超净台内向其滴加富血小板血浆，使血浆完全浸润复合多孔钛合金支架，并封入灭菌袋中，再次冻干后备用。
实施例3粘附血小板的三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
1、多孔钛合金支架的制备
(1)将CT图像导入Mimics或CAD等三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，平均孔柱为300μm、孔径为1000μm，以正十二面体单位充填、扩展该图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型。
(2)采用EOS M280金属材料3D打印机，以钛合金(Ti-6Al-4V)为原料，依据设计模型打印多孔钛合金支架。
2、明胶三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
(1)将明胶颗粒加入去离子水中浸泡2h，同时在37℃，300r/min的磁力搅拌器作用下搅拌至彻底溶解，终浓度为3％。
(2)取步骤(1)制备的明胶溶液5ml，加入1g氯化钠固体，混合后灌注到3D金属支架内并冷冻干燥。
(3)在180℃下热交联24h后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥。
3、明胶三维微支架上粘附血小板
(1)制备富血小板血浆：首先，用装有抗凝剂的真空采血针采静脉血10ml，用2000r/min离心10min，分两层，上层为复含血小板溶液，移出全部上清液及下层悬浮物1mm至空离心管中；然后，再次离心2000r/min，10min，移除3/4上清液，得到沉淀物及1/4上清液，吹打后得到混匀的富血小板血浆。
(2)将上述步骤2制备的明胶三维微支架复合多孔钛合金支架经EOG灭菌后，在超净台内向其滴加富血小板血浆，使血浆完全浸润复合多孔钛合金支架，并封入灭菌袋中，再次冻干后备用。
实施例4粘附血小板的三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
1、多孔钛合金支架的制备
(1)将CT图像导入Mimics或CAD等三维图像软件，得到目标骨组织的三维图像，平均孔柱为1000μm、孔径为3000μm，以正六面体单位充填、扩展该图像，得到个性化的多孔连通三维数字模型。
(2)采用EOS M280金属材料3D打印机，以钛合金(Ti-6Al-4V)为原料，依据设计模型打印多孔钛合金支架。
2、明胶三维微支架复合多孔钛合金支架的制备
(1)将明胶颗粒加入去离子水中浸泡2h，同时在37℃，300r/min的磁力搅拌器作用下搅拌至彻底溶解，终浓度为20％。
(2)取步骤(1)制备的明胶溶液5ml，加入1g氯化钠固体，混合后灌注到3D金属支架内并冷冻干燥。
(3)在180℃下热交联24h后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥。
3、明胶三维微支架上粘附血小板
(1)制备富血小板血浆：首先，用装有抗凝剂的真空采血针采静脉血10ml，用2000r/min离心10min，分两层，上层为复含血小板溶液，移出全部上清液及下层悬浮物1mm至空离心管中；然后，再次离心2000r/min，10min，移除3/4上清液，得到沉淀物及1/4上清液，吹打后得到混匀的富血小板血浆。
(2)将上述步骤2制备的明胶三维微支架复合多孔钛合金支架经EOG灭菌后，在超净台内向其滴加富血小板血浆，使血浆完全浸润复合多孔钛合金支架，并封入灭菌袋中，再次冻干后备用。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (4)
1.一种粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架，其特征在于，所述粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架包括多孔金属支架、位于所述多孔金属支架内部的三维微支架、以及粘附在所述三维微支架上的血小板；所述三维微支架是由明胶制备而成；所述粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架的制备方法如下：
(1)制备多孔金属支架；
(2)将明胶颗粒加入去离子水，在37℃，300r/min的磁力搅拌器中2h至彻底溶解，终浓度为1.5-20％；取上述明胶溶液5ml，加入1g氯化钠固体，混合后灌注到步骤(1)制备的多孔金属支架中并冷冻干燥；在180℃下热交联24h后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥，获得三维微支架复合多孔金属支架；
(3)将步骤(2)制备的所述三维微支架复合多孔金属支架经EOG灭菌后，在超净台内滴加富血小板血浆，使血浆完全浸润所述三维微支架复合多孔金属支架，并封入灭菌袋中，再次冻干，获得粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架。
2.根据权利要求1所述的粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架，其特征在于，所述粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架是粘附血小板的三维微支架复合多孔钛合金支架。
3.一种权利要求1所述的粘附血小板的三维微支架复合多孔金属支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)制备多孔金属支架；
(2)将明胶颗粒加入去离子水，在37℃，300r/min的磁力搅拌器中2h至彻底溶解，终浓度为1.5-20％；取上述明胶溶液5ml，加入1g氯化钠固体，混合后灌注到步骤(1)制备的多孔金属支架中并冷冻干燥；在180℃下热交联24h后，用蒸馏水洗氯化钠，并再次干燥，获得三维微支架复合多孔金属支架；
(3)将步骤(2)制备的所述三维微支架复合多孔金属支架经EOG灭菌后，在超净台内滴加富血小板血浆，使血浆完全浸润所述三维微支架复合多孔金属支架，并封入灭菌袋中，再次冻干。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述多孔金属支架利用3D打印技术制备而成。
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