WO2023140312A1 - 複合体及びその製造方法並びに骨再生用材料 - Google Patents

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tcp
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義知 本田
知成 田中
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学校法人大阪歯科大学
国立大学法人京都工芸繊維大学
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Definitions

  • the present invention relates to a composite, a manufacturing method thereof, and a bone regeneration material.
  • Non-Patent Documents 1 to 3 ⁇ -Tricalcium phosphate particles (Non-Patent Documents 1 to 3) and spongy materials combining ⁇ -TCP particles and polymers (Non-Patent Document 4) are used as bone regeneration materials.
  • Patent Document 1 discloses a functional crosslinked structure in which physiologically active substances such as catechins are bound to a crosslinked natural polymer
  • Patent Document 2 discloses the use of a composite of catechins and gelatin as a bone destruction inhibitor.
  • the purpose of the present invention is to provide a composite, a manufacturing method thereof, and a bone regeneration material.
  • a composite comprising ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) particles dispersed in a matrix comprising a functional crosslinked structure in which a natural polymer having at least one selected from the group consisting of OH groups and amino groups and a COOH group and a COOH group as repeating units and a physiologically active substance having an OH group or an amino group are bound by an ester bond, an amide bond or a hydrogen bond, and at least one selected from the group consisting of the COOH groups of the natural polymer and the OH groups and amino groups of the natural polymer are crosslinked.
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • the physiologically active substance is at least one selected from the group consisting of catechins, polyphenols, proanthocyanidins, anthocyanins, flavonoids, soybean isoflavones and polyamines.
  • the natural polymer is selected from the group consisting of hyaluronic acid, collagen, gelatin, xanthan gum, gellan gum, pectin/pectic acid, alginic acid or its sodium salt, and elastin.
  • EGCG epigallocatechin gallate
  • a natural polymer having at least one selected from the group consisting of an OH group and an amino group and a COOH group as repeating units is reacted in water with a physiologically active substance having an OH group or an amino group in the presence of a water-soluble dehydration condensing agent to bind the COOH groups of the natural polymer with an ester bond, an amide bond or a hydrogen bond, bind the physiologically active substance, and crosslink the natural polymer to obtain a functional crosslinked structure, and mix a solution of the obtained functional crosslinked structure with ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) particles.
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • a method for producing a composite of a functional crosslinked structure and ⁇ -TCP particles comprising performing freeze-drying and vacuum heat treatment.
  • a bone regeneration material comprising the composite according to any one of [1 to 5].
  • FIG. 1 Schematic diagram showing a method for producing a sponge, which is a hydrogel precursor. Characterization of sponges, precursors of hydrogels.
  • A Macroscopic appearance of sponges
  • B Microscopic appearance of sponges. Arrows indicate ⁇ -tricalcium phosphate ( ⁇ -TCP) particles
  • C Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared Spectroscopy (ATR-FTIR) spectra
  • D Powder X-ray diffraction (XRD) results of the material. Microscopic images of ⁇ -TCP leakage and hydrogels.
  • A Representative macroscopic images of hydrogels and quantitative data after immersion in water. Arrows: Leaked ⁇ -TCP particles.
  • ⁇ -TCP ⁇ -tricalcium phosphate
  • A Lateral view of bone defects after 3 and 6 weeks in ⁇ -CT analysis. Light and dark blue in the bone defect indicates residual ⁇ -TCP particles.
  • B Quantification of residual ⁇ -TCP particles using ⁇ -CT analysis
  • C Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining of osteoclasts.
  • D TRAP-stained area of the defect. ** p ⁇ 0.05. ** p ⁇ 0.01.
  • an amino group is a primary amino group (NH 2 ) or secondary amino group (NH), which is a group capable of forming an amide bond with a COOH group of a natural polymer.
  • the natural polymer is not particularly limited as long as the repeating unit contains at least one selected from the group consisting of (1) COOH group and (2) OH group and amino group.
  • Examples of repeating units containing a COOH group include sugar residues having a COOH group such as glucuronic acid, galacturonic acid and mannturonic acid, and amino acid residues having a COOH group in the side chain such as glutamic acid and aspartic acid.
  • Repeating units having an OH group or an amino group include glucose, mannose, galactose, fructose, fucose, rhamnose, glucosamine, galactosamine, mannosamine, lysine (Lys), ornithine (Orn), hydroxylysine (Hyl) and the like.
  • Natural polymers include hyaluronic acid, collagen, gelatin, xanthan gum, gellan gum, pectin/pectic acid, alginic acid or its sodium salt, and elastin.
  • collagen used as the raw material for the gelatin sponge conventionally known gelatin sponge raw materials can be widely used, and examples thereof include soluble collagen such as acid-soluble collagen, neutral salt-soluble collagen, and enzyme-solubilized collagen.
  • Table 1 below shows the number of amino acids (amino acid composition) per 1000 amino acid residues of representative gelatin.
  • Table 1 shows pigskin gelatin, and cowhide and bovine bone gelatins have almost the same amino acid composition. However, due to the problem of mad cow disease, Table 1 shows only the gelatin composition derived from pigskin.
  • the 117 side-chain COOH groups are used for intramolecular or intermolecular cross-linking via ester or amide bonds with gelatin OH groups or amino groups, covalent bonds (ester bonds, amide bonds) and hydrogen bonds with physiologically active substances containing OH groups or amino groups.
  • ester- or amide-based crosslinks and covalent bonds can be formed by adding a water-soluble dehydration condensation agent to water containing gelatin.
  • the water-soluble dehydration-condensation agent may be added to water containing gelatin and a physiologically active substance, or a portion of the water-soluble dehydration-condensation agent may be added to water containing gelatin to form gelatin crosslinks, and then the physiologically active substance and an additional water-soluble dehydration-condensation agent may be added to bind the physiologically active substance to the gelatin.
  • the gelatin cross-linking reaction and the binding reaction of the physiologically active substance may be carried out at the same time, or the gelatin cross-linking reaction may be formed to some extent first, and then the binding of the physiologically active substance (at this time, the gelatin cross-linking reaction may also occur at the same time).
  • the physiologically active substance is not particularly limited as long as it has an OH group or an amino group.
  • catechins catechins (catechin (C), gallocatechin (GC), epicatechin (EC), epigallocatechin (EGC), catechin gallate (CG), epicatechin gallate (ECG), gallocatechin gallate (GCG), epigallocatechin gallate (EGCG), etc.
  • polyphenols e.g., quercetin and derivatives thereof
  • proanthosias carrots e.g., quercetin and derivatives thereof
  • proanthosias carrots anthocyanins
  • flavonoids e.g., flavonols, flavones, isoflavones, flavanones, flavanols, etc.
  • soybean isoflavones diaidzein, genistein, glycitein and their glycosides daidzin, genistin and glycitin, and their metabolites equol
  • catechins may be a mixture containing two or more catechins, and may contain components other than catechins depending on the degree of purification.
  • Catechins preferably contain EGCG, and particularly preferably contain EGCG as a main component.
  • the physiologically active substance containing EGCG as a main component may be 100% EGCG.
  • the dehydration condensation agent used in the present invention is not particularly limited as long as it is water-soluble, capable of forming an ester bond or an amide bond between the COOH group of the natural polymer and the OH or amino group of the physiologically active substance in an aqueous solution, and capable of cross-linking the natural polymer.
  • -morpholinoethyl)carbodiimide, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (WSC), etc. can be used alone or in appropriate combination.
  • About 1 to 1,000 parts by mass, preferably 5 to 500 parts by mass, and more preferably 10 to 100 parts by mass of the water-soluble dehydration-condensing agent may be reacted with 100 parts by mass of the natural polymer.
  • the used dehydration condensation agent can be removed by washing with water.
  • Purification of the functional crosslinked structure can be carried out according to conventional methods, including purification methods such as dialysis, filtration, gel filtration chromatography, and ion exchange chromatography.
  • the functional cross-linked structure used in the present invention functions as a matrix to hold ⁇ -TCP particles, and not only suppresses the scattering, movement, and leakage of ⁇ -TCP particles to improve handling properties, but also enhances the ability of ⁇ -TCP to regenerate bone.
  • the dose of ⁇ -TCP can be reduced, and the amount of ⁇ -TCP remaining during bone regeneration can be reduced.
  • ⁇ -TCP is necessary for bone regeneration, but if it remains after bone regeneration has progressed sufficiently, it may interfere with bone regeneration or cause infection.
  • the bone regeneration material of the present invention is ideal because ⁇ -TCP particles are resorbed simultaneously with the progress of bone regeneration.
  • the solid content of the composite of the present invention preferably contains 0.0001 to 99.9999% by mass of the functional crosslinked structure and 0.0001 to 99.9999% by mass of the ⁇ -TCP particles, more preferably 5 to 60% by mass of the functional crosslinked structure and 40 to 95% by mass of the ⁇ -TCP particles.
  • the complex of the present invention may contain water or an aqueous solution in addition to these solids.
  • Aqueous solutions include, for example, buffers, cell culture media, infusions, blood (plasma, serum) and the like.
  • a bone regeneration material containing an aqueous solution may take the form of a hydrogel.
  • the water content of the bone regeneration material is preferably 0.0001-99.9999% by mass, more preferably 0.1-99% by mass.
  • the material for bone regeneration does not contain water, it can absorb water in body fluids and form a hydrogel when applied or implanted in a site requiring bone regeneration such as a bone defect site.
  • the average particle size of ⁇ -TCP particles is 5-5000 ⁇ m, more preferably 150-3000 ⁇ m.
  • the average particle size can be measured by a laser diffraction/scattering method (wet method).
  • the complex of the present invention can be obtained by mixing the functional cross-linked structure and ⁇ -TCP particles in a water-containing solvent, freeze-drying, and, if necessary, further cross-linking.
  • Crosslinking after freeze-drying is preferably formed by vacuum heat treatment.
  • the reaction temperature of the vacuum heat treatment is preferably 24 to 250° C., more preferably 80 to 175° C.
  • the reaction time is preferably 1 minute to 72 hours, more preferably 1 to 48 hours
  • the reaction pressure is preferably atmospheric pressure to absolute vacuum, more preferably ⁇ 0.01 to ⁇ 0.101 MPa.
  • the shape of the composite and bone regeneration material of the present invention is not particularly limited as long as it matches the shape of the bone defect to which it is applied. Two or more shapes of composites or osteogenic materials may be used in combination.
  • the shape of the composite or bone regeneration material of the present invention can be adjusted during freeze-drying or prior to implantation so as to fit the shape of the bone defect, and in the case of a flexible material such as hydrogel, it can be adjusted during surgery/implantation so as to fit the shape of the bone defect.
  • Example 1 Preparation of sponge (precursor of hydrogel)
  • a sponge which is a precursor of hydrogel
  • the following solutions (1) to (3) were prepared: (1) untreated gelatin solution (gray), (2) chemically crosslinked gelatin solution (blue), (3) chemically crosslinked gelatin solution modified with EGCG (red) (Fig. 1).
  • a total of 6 solutions with (3) or without (3) ⁇ -TCP particles were prepared and lyophilized to obtain sponges (Fig. 1 and Table 2).
  • a portion of the obtained sponge was thermally crosslinked by vacuum heat treatment at 150° C. and ⁇ 0.1 MPa as shown in FIG.
  • a gelatin (1%) solution was prepared by dissolving 100 mg of RM-Gelatin (manufactured by Zerais) in 10 mL of ultrapure water at 50°C.
  • a solution of chemically crosslinked gelatin and EGCG-modified chemically crosslinked gelatin was prepared according to a method known in the literature (Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 14143-14157.; Molecules 2018, 23, 876.).
  • EGCG purity 90% was provided by Dr. Yukihiko Hara (Tea Research, Hara Office Co., Ltd.).
  • a 9 mm hole was made in a PTFE sheet (Misumi Group Inc., Tokyo, Japan) and the bottom was covered with a polydimethylsiloxane sheet manufactured by SILPOT 184 (Dow Corning Toray Co., Ltd., Tokyo, Japan).
  • SILPOT 184 Low Corning Toray Co., Ltd., Tokyo, Japan.
  • 100 ⁇ L of solutions of gelatin, chemically cross-linked gelatin, and EGCG-modified chemically cross-linked gelatin were added to the prepore with or without 4 mg of ⁇ -TCP particles (500-1000 ⁇ m, Catarimedic) and placed in a MediFridge (Fukushima Galilei Co., Ltd., Kagoshima, Japan) at -20°C.
  • the frozen material was then lyophilized in DC800 (Yamato Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan) for 24 h to obtain a sponge material.
  • Vacuum heat treatment was performed at 150°C for 24 hours using AVO-250NS (AS ONE Co., Ltd., Osaka, Japan) and DA-20D (Ulvac kiko. Inc., Kanagawa, Japan) at a gauge pressure of -0.1 MPa.
  • Macrophotographs were taken using an EOS 600D digital camera (manufactured by Canon).
  • the coating process was performed using an osmium coater (Vacuum Device Co., Ltd., Ibaraki, Japan) for 3 seconds and observed with an electron microscope.
  • FE-SEM field emission scanning electron microscope
  • S-4800 Hitachi Ltd., Tokyo, Japan
  • Spectra were obtained using total reflection infrared (ATR-FTIR) spectroscopy (IRAffinity-1S; Shimadzu Co., Kyoto, Japan) at wavenumbers from 400 to 3900 cm ⁇ 1 .
  • Spectra were measured from 20° to 40° using X-ray diffraction (XRD) (XRD-6000; Shimadzu Co.).
  • the dispersed ⁇ -TCP particles were weighed using an electronic balance (GR-202; Misumi Group Inc.) and the weight percent of dispersed particles was calculated using the formula: ⁇ -TCP (mg)/4 ⁇ 100%.
  • ⁇ -TCP ⁇ -TCP (mg)/4 ⁇ 100%.
  • immunostaining of gelatin was performed using the staining solution FDV-0035 (10 ⁇ g/mL; Funakoshi Co., Ltd., Tokyo, Japan) and Qdot 655 streptavidin complex (1 ⁇ g/mL, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the time required for hydrogel was tested using a wettability evaluation device (LSE-ME2; Nick Corporation, Saitama, Japan) by adding a 70 ⁇ L water droplet to each sponge.
  • vhGS vacuum heat-treated gelatin sponge
  • vhc-GS vacuum heat-treated and chemically synthesized gelatin sponge
  • vhEc-GS vacuum heat-treated and chemically synthesized EGCG-bound gelatin sponge
  • vhGS with ⁇ -TCP particles introduced vhGS- ⁇
  • vhc-GS with ⁇ -TCP particles introduced vhc-GS- ⁇
  • vhEc-GS with ⁇ -TCP particles introduced vhEc -GS- ⁇
  • the number of viable cells in the well plate was measured after 24, 48, and 72 h of culture using Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan).
  • Monolithic hydrogels were prepared from 7 sponge pieces with 100 ⁇ L medium, specifically vhEc-GS- ⁇ (12), which is a mixture of 4 sponge pieces (vhEc-GS) and 3 sponge pieces (vhEc-GS- ⁇ (4 mg ⁇ -TCP)), and vhEc-GS- ⁇ (28), which is composed of 7 sponge pieces (vhEc-GS- ⁇ (4 mg ⁇ -TCP)).
  • vhEc-GS- ⁇ a mixture of 4 sponge pieces (vhEc-GS) and 3 sponge pieces (vhEc-GS- ⁇ (4 mg ⁇ -TCP)), and vhEc-GS- ⁇ (28), which is composed of 7 sponge pieces (vhEc-GS- ⁇ (4 mg ⁇ -TCP)).
  • Four rats were used in one group at 3 and 6 weeks respectively. Samples were collected by cardiac perfusion fixation after 3 or 6 weeks. Tissues were fixed using 10% neutral buffered formalin (Wako Chemicals USA Inc., Richmond, VA, USA
  • Microcomputed tomography ( ⁇ -CT) analysis was performed using a Skyscan 1275 (Bruker Co., Billerica, MA, USA) at 80 ⁇ A and 70 kV.
  • the samples were decalcified by immersion in decalcification solution B (Wako Chemicals USA Inc.) for 5 days.
  • the tissue was sectioned by the Kawamoto method (Arch. Histol. Cytol. 2003, 66, 123-143.). Sections were made with a Leica CM1950 (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany) at a thickness of 6 ⁇ m.
  • Hematoxylin and eosin (H&E) staining solution was purchased from Muto Pure Chemicals Co., Ltd. (Tokyo, Japan).
  • hydrogel shape and water absorption rate The formation process of hydrogels can affect their operability.
  • the water absorption rate of the material is directly related to the sample preparation time. After administration of ultrapure water, vhc-GS or vhEc-GS, as well as materials containing ⁇ -TCP particles, shrunk significantly, whereas vhGS and vhGS- ⁇ relatively retained their morphology (Fig. 4A).
  • the water absorption rates of vhEc-GS and vhEc-GS- ⁇ were significantly faster than those of vhGS and vhGS- ⁇ (Fig. 4B).
  • vhEc-GS- ⁇ containing 28 mg of ⁇ -TCP
  • 4 pieces of vhEc-GS and 3 pieces of vhEc-GS- ⁇ containing 12 mg of ⁇ -TCP
  • the hydrogel had good operability and could be grasped with tweezers (Fig. 6A).
  • the amount of ⁇ -TCP particles was standardized at 12 mg or 28 mg per defect (the numbers in parentheses are the masses of ⁇ -TCP particles).
  • ⁇ -CT results showed that the vhEc-GS- ⁇ sponge-derived hydrogel became more opaque than the ⁇ -TCP particles alone at 3 and 6 weeks after implantation (Fig. 6C). H&E staining images confirmed that the area of new bone was increased (Fig. 6D). Furthermore, ⁇ -CT morphometric analysis after removing opacities from ⁇ -TCP particles shows that vhEc-GS- ⁇ (12) and vhEc-GS- ⁇ (28) formed significantly more bone than ⁇ -TCP particles alone (Fig. 6E).

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Abstract

骨再生効率の良い材料及びその製造方法を提供する。ＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種とＣＯＯＨ基を繰り返し単位に有する天然高分子と、ＯＨ基又はアミノ基を有する生理活性物質がエステル結合、アミド結合又は水素結合で結合され、かつ、天然高分子のＣＯＯＨ基と天然高分子のＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種が架橋している機能性架橋構造体を含むマトリクスにβ－トリカルシウムホスフェート（β-TCP）粒子が分散してなる、複合体。

Description

複合体及びその製造方法並びに骨再生用材料
　本発明は、複合体及びその製造方法並びに骨再生用材料に関する。
　β－トリカルシウムホスフェート（β-TCP）粒子（非特許文献１～３）、β-TCP粒子とポリマーを組み合わせたスポンジ状材料（非特許文献４）が骨再生材料として使用されている。
　特許文献１はカテキン類などの生理活性物質を架橋天然高分子に結合した機能性架橋構造体を開示し、特許文献２は、カテキン類とゼラチンの複合体の骨破壊阻止剤用途を開示している
Mater. Today Bio 2019, 4, 100031. Biomater. Res. 2019, 23, 12. Acta Biomater. 2021, 126, 496-510. Polymers 2019, 11, 1468.
特開２０１５－２０８３６９号公報 特開２０１８－１６５２４８号公報
　本発明は、複合体及びその製造方法並びに骨再生用材料を提供することを目的とする。
　本発明は、以下の複合体及びその製造方法並びに骨再生用材料を提供するものである。
〔１〕ＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種とＣＯＯＨ基を繰り返し単位に有する天然高分子と、ＯＨ基又はアミノ基を有する生理活性物質がエステル結合、アミド結合又は水素結合で結合され、かつ、天然高分子のＣＯＯＨ基と天然高分子のＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種が架橋している機能性架橋構造体を含むマトリクスにβ－トリカルシウムホスフェート（β-TCP）粒子が分散してなる、複合体。
〔２〕生理活性物質がカテキン類、ポリフェノール類、プロアントシアニジン、アントシアニン、フラボノイド類、大豆イソフラボン類及びポリアミンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、〔１〕に記載の複合体。
〔３〕天然高分子がヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチン、キサンタンガム、ジェランガム、ペクチン／ペクチン酸、アルギン酸又はそのナトリウム塩及びエラスチンからなる群から選ばれる、〔１〕又は〔２〕に記載の複合体。
〔４〕前記マトリクスがゲルである、〔１～３〕のいずれか１項に記載の複合体。
〔５〕生理活性物質がエピガロカテキンガレート（EGCG）を主成分とするカテキン類であり、天然高分子がゼラチンである、〔１～４〕のいずれか１項に記載の複合体。
〔６〕ＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種とＣＯＯＨ基を繰り返し単位に有する天然高分子を水中で水溶性脱水縮合剤の存在下にＯＨ基又はアミノ基を有する生理活性物質と反応させて、天然高分子のＣＯＯＨ基とエステル結合、アミド結合又は水素結合で結合され、生理活性物質を結合し、かつ、前記天然高分子を架橋して機能性架橋構造体を得、得られた機能性架橋構造体の溶液とβ－トリカルシウムホスフェート（β-TCP）粒子を混合し、凍結乾燥と真空熱処理を行う、機能性架橋構造体とβ-TCP粒子の複合体の製造方法。
〔７〕さらに含水溶液を作用させてゲル状の複合体を得る、〔６〕に記載の複合体の製造方法。
〔８〕〔１～５〕のいずれか１項に記載の複合体を含む、骨再生用材料。
　本発明の複合体を構成する生理活性物質を結合した架橋天然高分子を含む機能性架橋構造体とβ-TCP粒子は物質としては公知であるが、これらを組み合わせることで骨再生能、操作性が飛躍的に高まることは、予測できない結果である。
ハイドロゲルの前駆体であるスポンジの製造方法を示す概略図。 ハイドロゲルの前駆体であるスポンジの特徴付け。(A) スポンジの肉眼的外観、(B) スポンジの顕微鏡的外観。矢印はβ-トリカルシウムホスフェート(β-TCP) 粒子、(C)減衰全反射フーリエ変換赤外分光法（ATR-FTIR）のスペクトル及び(D) 材料の粉末X線回折(XRD)結果。 β-TCP漏出及びハイドロゲルの顕微鏡画像。(A) ハイドロゲルの代表的な肉眼的画像と水に浸漬した後の定量的データ。 矢印: 漏出したβ-TCP 粒子。 (B) ゼラチン染色後のハイドロゲルの顕微鏡写真。 ハイドロゲル形態及び吸水速度。(A)スポンジに超純水を適用後のハイドロゲルの形態。(B) 吸水速度。* p < 0.05, ** p < 0.01。 n.s.: 有意でない。 ハイドロゲルの生体適合性。(A) CCK-8 アッセイで試験されたハイドロゲルの細胞毒性と24～72時間培養後の骨芽細胞株UMR106 (n = 3)。 (B) 骨芽細胞株UMR106の24時間培養後の生細胞及び死細胞の染色。緑:ハイドロゲル表面上の生細胞; 赤: 死細胞(n = 3). n.s.: 有意でない。 * p < 0.05, ** p < 0.01. 骨形成を評価するための動物実験。(A) ハイドロゲルの調製: 各ハイドロゲルについて7片のスポンジを使用。(B) 骨欠損部及び手術直後の材料で処置された骨欠損部の肉眼的画像(n = 4)。(C) 3週後及び６週後の骨欠損部のマイクロコンピューター断層撮影(μ-CT)画像。(D) 3週後及び6週後の骨欠損部のヘマトキシリン・エオジン(H&E)染色。(E) β-TCP 粒子除去後の定量的μ-CT解析。統計的有意: 粒子とハイドロゲルの間の比較を以下のように示す: ** p < 0.01. BV/TV: 骨体積対総体積(%). 骨欠損部におけるβ-トリカルシウムホスフェート(β-TCP)粒子の分解。(A) μ-CT解析における3週後と6週後の骨欠損部の側面図。骨欠損部における明暗の青色は残留するβ-TCP 粒子を示す。(B)μ-CT解析を用いた残留するβ-TCP 粒子の定量 (C) 破骨細胞の酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ (TRAP)染色。(D) 欠損部のTRAP染色面積。 * p < 0.05. ** p < 0.01.
　本明細書において、アミノ基は、第１級アミノ基（ＮＨ２）又は第２級アミノ基（ＮＨ）であり、天然高分子のＣＯＯＨ基とアミド結合を形成可能な基である。
　天然高分子は、（１）ＣＯＯＨ基と（２）ＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種を繰り返し単位に含むものであれば特に限定されない。ＣＯＯＨ基を含む繰り返し単位としては、グルクロン酸、ガラクツロン酸、マンヌツロン酸等のＣＯＯＨ基を有する糖残基、グルタミン酸、アスパラギン酸などのＣＯＯＨ基を側鎖に有するアミノ酸残基などが挙げられる。ＯＨ基もしくはアミノ基を有する繰り返し単位としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、フコース、ラムノース、グルコサミン、ガラクトサミン、マンノサミン、リジン（Ｌｙｓ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）などが挙げられる。
　天然高分子としては、ヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチン、キサンタンガム、ジェランガム、ペクチン／ペクチン酸、アルギン酸又はそのナトリウム塩、エラスチンなどが挙げられる。
　ゼラチンスポンジの原料となるコラーゲンとしては、従来公知のゼラチンスポンジの原料が広く使用でき、例えば、酸可溶性コラーゲン、中性塩可溶性コラーゲン、酵素可溶化コラーゲン等の可溶性コラーゲンが挙げられる。
　代表的なゼラチンの１０００アミノ酸残基あたりのアミノ酸数（アミノ酸組成）を以下の表１に示す。表１は豚皮のゼラチンを示し、牛皮、牛骨のゼラチンもほぼ同様なアミノ酸組成であるが、狂牛病の問題があるので、表１には豚皮由来のゼラチン組成のみを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ゼラチンは、Ｇｌｙが約１／３を占め、Ｇｌｕ＋Ａｓｐ＝１１７個の側鎖ＣＯＯＨ基、Ｌｙｓ＋Ｈｙｌ＋Ａｒｇ＋Ｈｉｓ＝８６個の側鎖アミノ基（ＮＨ２、ＮＨ）、Ｓｅｒ＋Ｔｈｒ＋Ｔｙｒ＝５６個の側鎖ＯＨ基を有している。１１７個の側鎖ＣＯＯＨ基は、ゼラチンのＯＨ基、アミノ基とのエステル結合もしくはアミド結合による分子内架橋もしくは分子間架橋、さらにＯＨ基もしくはアミノ基を含む生理活性物質との共有結合（エステル結合、アミド結合）及び水素結合に利用される。このようなエステルもしくはアミドによる架橋及び共有結合は、水溶性脱水縮合剤をゼラチンを含む水中に添加することにより形成することができる。水溶性脱水縮合剤は、ゼラチンと生理活性物質を含む水中に加えてもよいが、ゼラチンを含む水中に一部の水溶性脱水縮合剤を加えてゼラチン架橋を形成し、その後に生理活性物質と追加の水溶性脱水縮合剤を添加して生理活性物質をゼラチンに結合させてもよい。換言すると、ゼラチン架橋反応と生理活性物質の結合反応は、同時に行ってもよく、先にゼラチン架橋をある程度形成させておき、その後に生理活性物質の結合（このときゼラチン架橋反応も同時に生じ得る）を生じさせてもよい。
　上記でゼラチンのケースを例に取り説明したが、ゼラチン以外の天然高分子についても同様に生理活性物質及び水溶性脱水縮合剤を水中で反応させることで同様に機能性架橋構造体を得ることができる。
　生理活性物質としては、ＯＨ基又はアミノ基を有するものであれば特に限定されないが、例えばカテキン類（カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）、カテキンガレート（ＣＧ）、エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）など）、ポリフェノール（例えばケルセチンおよびそれらの誘導体）、プロアントシアニジン、アントシアニン、フラボノイド（例えば、フラボノール、フラボン、イソフラボン、フラバノン、フラバノール等）、大豆イソフラボン（ダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン及びそれらの配糖体であるダイジン、ゲニスチン及びグリシチン並びにそれらの代謝産物であるエクオールなど）、ポリアミン（スペルミン、スペルミジンなど）などが挙げられる。これらの生理活性物質は、単独で用いてもよく、2種以上を併用してもよい。例えば、カテキン類は、2種以上のカテキン類を含む混合物であってもよく、精製の程度によりカテキン類以外の成分が含まれていてもよい。カテキン類は、ＥＧＣＧを含むものが好ましく、特にＥＧＣＧを主成分として含むものが好ましい。ＥＧＣＧを主成分として含む生理活性物質はEGCG 100％のものであってもよい。
　生理活性物質は、天然高分子１００質量部に対し、０．０００１～１５質量部、好ましくは０．００１～１０質量部、より好ましくは０．０１～５質量部程度反応させればよい。
　本発明に用いる脱水縮合剤は、水溶性であり、水溶液中で天然高分子のＣＯＯＨ基と生理活性物質のＯＨもしくはアミノ基とのエステル結合もしくはアミド結合を形成可能であり、かつ、天然高分子の架橋が可能であるものであれば特に限定されず、例えば４－（４，６－ジメトキシ－１，３，５－トリアジン－２－イル）－４－メチルモルホリニウムクロリド（ＤＭＴ－ＭＭ）などのトリアジン系縮合剤、１－シクロヘキシル－３－（２－モルホリノエチル）カルボジイミドの水溶性塩、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＷＳＣ）などが挙げられ、これらを単独でまたは適宜組み合わせて使用可能である。
　水溶性脱水縮合剤は、天然高分子１００質量部に対し、１～１０００質量部、好ましくは５～５００質量部、より好ましくは１０～１００質量部程度反応させればよい。
　使用した脱水縮合剤は、水による洗浄によって除去できる。
　機能性架橋構造体の精製は、常法に従い行うことができ、例えば透析、ろ過、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなどの精製法が挙げられる。
　本発明で使用する機能性架橋構造体は、β-TCP粒子を保持するためのマトリクスとして機能し、β-TCP粒子の飛散、移動、漏出を抑制してハンドリング性を向上するだけでなく、β-TCPによる骨再生能を高めることができる。また、β-TCP粒子の吸収を促進することで、β-TCPの投与量を少なくすることができ、骨再生時に残存するβ-TCP量を低減することができる。β-TCPは骨再生に必要であるが、骨再生が十分進行した時点で残存していると骨再生を妨げたり、感染の原因になる可能性がある。本発明の骨再生用材料は、骨再生の進行と同時にβ-TCP粒子の吸収が進むので、理想的である。
　本発明の複合体の固形分に対し、好ましくは機能性架橋構造体を0.0001～99.9999質量％、β-TCP粒子を0.0001～99.9999質量％含有し、より好ましくは機能性架橋構造体を5～60質量％、β-TCP粒子を40～95質量％含有する。本発明の複合体は、これらの固形分の他に水、あるいは水溶液を含んでいてもよい。水溶液は、例えば、緩衝液、細胞培養用培地、輸液、血液（血漿、血清）などが挙げられる。水溶液を含む骨再生用材料はハイドロゲルの形態をとり得る。骨再生用材料の水の含有量は、好ましくは0.0001～99.9999質量％、より好ましくは0.1～99質量％である。骨再生用材料が水を含まない場合、骨欠損部などの骨再生が必要とされる部位に適用または埋入された際に体液中の水分を吸収してハイドロゲルになり得るが、予め含水溶媒を吸収させてハイドロゲルの状態で骨再生用材料として移植することも可能である。
　β-TCP粒子の平均粒径は5～5000μm、より好ましくは150～3000μmである。平均粒径は、レーザ回折・散乱法（湿式）により測定することができる。
　本発明の複合体は、機能性架橋構造体とβ-TCP粒子を含水溶媒中で混合し、凍結乾燥し、必要に応じてさらに架橋することで得ることができる。凍結乾燥後の架橋は、真空熱処理により形成することが好ましい。真空熱処理の反応温度は、好ましくは24～250℃、より好ましくは80~175℃であり、反応時間は、好ましくは1分～72時間、より好ましくは1～48時間であり、反応圧力は、好ましくは大気圧～絶対真空、より好ましくは－0.01～－0.101MPaである。
　本発明の複合体及び骨再生用材料の形状は、適用される骨欠損部の形状に合うものであればよく、特に限定されないが、例えばシート状、塊状、円板状、弾丸状、円柱状、立方体などが挙げられる。2種以上の形状の複合体又は骨形成用材料を併用してもよい。本発明の複合体又は骨再生用材料の形状は、骨欠損部の形状に合うように凍結乾燥時や移植前に整えることができ、ハイドロゲルなどの可撓性の材料の場合には、骨欠損部の形状に合うように手術時／埋入時に調整することもできる。
　以下、実施例により本発明をより詳細に説明する。
実施例１
1.1 スポンジ（ハイドロゲルの前駆体）の調製
ハイドロゲルの前駆体であるスポンジを得るために、以下の(1)～(3)の溶液を調製した：(1)未処理ゼラチン溶液(グレー)、(2)化学架橋したゼラチン溶液(ブルー), (3) EGCGで修飾された化学架橋ゼラチン溶液（レッド）(図1)。β-TCP粒子を含む（3種）又は含まない（3種）、合計で6種の溶液を調製し、凍結乾燥してスポンジを得た（図1及び表2）。得られたスポンジの一部を図１に示すように１５０℃、－０．１ＭＰａで真空熱処理で熱架橋した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　100mgのRM-Gelatin (ゼライス社製)を50℃で10mLの超純水に溶解してゼラチン(1%)溶液を調製した。文献既知の方法（Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 14143-14157.；Molecules 2018, 23, 876.）に従い化学架橋ゼラチンとEGCG修飾した化学架橋ゼラチンの溶液を調製した。EGCG（純度90％）は原征彦先生（茶研究・原事務所株式会社）より供与頂いた。9mmの孔をPTFEシート(Misumi Group Inc., Tokyo, Japan)に形成し、底をSILPOT 184 (Dow Corning Toray Co., Ltd., Tokyo, Japan)で製造したポリジメチルシロキサンシートで覆った。スポンジを製造するために、100 μLのゼラチン、化学架橋ゼラチン、EGCG修飾した化学架橋ゼラチンの溶液を4mgのβ-TCP粒子 (500-1000 μm, カタリメディック社製)とともに又はβ-TCP粒子無しで前孔に加え、-20℃でMediFridge(Fukushima Galilei Co., Ltd., Kagoshima, Japan)中に置いた。次いで、凍結した材料をDC800 (Yamato Scientific Co., Ltd., Tokyo, Japan)中で24 h凍結乾燥してスポンジ材料を得た。真空熱処理を150℃で24時間AVO-250NS (AS ONE Co., Ltd., Osaka, Japan)とDA-20D (Ulvac kiko. Inc., Kanagawa, Japan)を用いて-0.1 MPaのゲージ圧で行った。EOS 600Dデジタルカメラ(キャノン社製)を用いてマクロ写真を撮影した。コーティングプロセスはosmium coater (Vacuum Device Co., Ltd., Ibaraki, Japan)を用いて3秒間行い、電子顕微鏡で観察した。電界放出形走査電子顕微鏡(FE-SEM) (S-4800; Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)を用いて5 kVでβ-TCP粒子が含まれていることを確認した。 全反射赤外（ATR-FTIR）分光法(IRAffinity-1S; Shimadzu Co., Kyoto, Japan)を用いて400～3900 cm-1.の波数でスペクトルを得た。X線回折法(XRD) (XRD-6000; Shimadzu Co.) を用いて20°～40°でスペクトルを測定した。
1.2. ハイドロゲルからのβ-TCP粒子の漏出試験
ハイドロゲルからのβ-TCP粒子の漏出速度を1片のフレーク状スポンジと1000 μLの超純水を用いて小さい試験管を用いて行った。サンプルは冷蔵庫中に4 ℃で24時間, 48時間、72時間静置した。 所定時間インキュベートし、漏出したリン酸カルシウム(CaP)以外の材料を除いた後、残留するCaPを乾燥オーブン(DV 400; Yamato Scientific Co., Ltd.) 中 55℃で24時間乾燥した。 分散したβ-TCP粒子を電子天秤(GR-202; Misumi Group Inc.)を用いて秤量し、分散粒子の質量％を式：β-TCP (mg)/4×100%を用いて計算した。ハイドロゲルの構造安定性を確認するために、染色溶液であるFDV-0035 (10 μg/mL; Funakoshi Co., Ltd., Tokyo, Japan)とQdot 655 ストレプトアビジン複合体 (1 μg/mL, Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA)を用いて製造元の指示書に従いゼラチンの免疫染色を行った。ハイドロゲルに必要とされる時間は、濡れ性評価デバイス(LSE-ME2; Nick Corporation, Saitama, Japan)を用い、70 μLの水滴を各スポンジに加えて試験した。
1.3. ハイドロゲルの生体適合性分析
7継代のUMR106 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA) を96-ウェルプレート(AGC Techno Glass Co. Ltd., Shizuoka, Japan)で、ウェル当たり5000細胞で3日間培養した。培養培地は10%ウシ胎児血清及び1%抗生物質を補足したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM) (MilliporeSigma, Burlington, MA, USA)を用いた。次いで、真空熱処理されたゼラチンスポンジ(vhGS)ハイドロゲル、真空熱処理及び化学合成されたゼラチンスポンジ(vhc-GS), 真空熱処理及び化学合成されたEGCGを結合したゼラチンスポンジ(vhEc-GS), β-TCP粒子が導入されたvhGS (vhGS-β), β-TCP粒子が導入されたvhc-GS(vhc-GS-β)、又は、β-TCP粒子が導入されたvhEc-GS (vhEc-GS-β)とDMEMを含む1ディスクのハイドロゲルをウェルに加え、インキュベータ中に配置した。ウェルプレート中の生存細胞数をCell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan)を用いて培養の24, 48, 及び72 h後に測定した。LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells ProtocolをThermo Fisher Scientific Incから入手した。７継代のUMR106を上記のハイドロゲルに播種し(20,000 cells/mL)、24時間インキュベートし、fluorescent cell imager (Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)を用いて観察した。緑と赤で占められた領域をImageJ (Java 1.8.0_172; National Institutes of Health, Bethesda,MD, USA)を用いて計測した。下記式を用いて死細胞の割合を得た：
赤領域/(赤領域+緑領域) ×100% (n = 3)。
1.4. 動物実験
実験は、大阪歯科大学の倫理委員会に、動物実験承認番号2102017で承認された。8週齢のSDラットをShimizu Laboratory Supplies Co. (Kyoto, Japan) から購入し、直径9 mmの臨界頭蓋冠骨欠損モデルを作製した。欠損部は、コントロールのシャム外科手術群として100 μL DMEM (粒子又はハイドロゲルなし)で処理した。一方、β-TCP粒子(12又は28 mg)又は同量のβ-TCP粒子を含むハイドロゲルを実験群として移植した。一体型ハイドロゲルは、100 μLメディウムを備えた7片のスポンジからなり、具体的には4片のスポンジ（vhEc-GS）と3片のスポンジ（vhEc-GS-β (4 mg β-TCP)）の混合物であるvhEc-GS-β(12)、7片のスポンジ（vhEc-GS-β (4 mg β-TCP)）から構成されるvhEc-GS-β(28)から調製された。4匹のラットを各々3週及び6週で1群に使用した。サンプルは、3週又は6週後に心臓灌流固定により集めた。10%中性緩衝ホルマリン液(Wako Chemicals USA Inc., Richmond, VA, USA)を使用して組織を固定した。Skyscan 1275 (Bruker Co., Billerica, MA, USA)を使用して80 μAと70 kVでマイクロコンピューター断層撮影(μ-CT)解析を行った。サンプルは脱灰液B (Wako Chemicals USA Inc.)に5日間浸漬することにより脱灰した。その後、Kawamoto法により組織の切片化を行った（Arch. Histol. Cytol. 2003, 66, 123-143.）。切片はLeica CM1950 (Leica Biosystems, Wetzlar, Germany)を用いて6 μmの厚さで作製した。ヘマトキシリン・エオジン(H&E) 染色液をMuto Pure Chemicals Co., Ltd. (Tokyo, Japan)から購入した。，酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ(TRAP)染色キット(Wako Chemicals USA Inc.)を使用して指示書に記載の手順に従い破骨細胞の出現を評価した。破骨細胞量は、以下の式を用いて計算した：
各写真の紫色に染色された面積/総画像面積×100% (n = 3)
1.5. 統計解析
本研究のデータ処理と解析のためにsoftware Prism 9.0.0 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)を使用した。すべての統計解析は、1-way ANOVA (一元配置分散分析） Tukeyの多重比較法（Tukey’s multiple comparisons test）を用いて行い、平均±標準偏差で表した。p < 0.01又は0.05は有意差があることを示す。
2. 結果
2.1. スポンジの特徴付け(ハイドロゲルの前駆体)
肉眼的観察では真空熱処理の前後で有意な変化は見られなかった; FE-SEM観察は、多孔性β-TCP粒子がすべてのスポンジに十分に封入されていることを示した(図2A,B)。ATR-FTIR とXRDの結果は、ゼラチンの存在とβ-TCP粒子の結晶相の変化は無視できるレベルであることを確認した(図2C,D)。スポンジの特徴付け後、以下の実験で、純水またはメディウムを添加することでハイドロゲルを調製した。
2.2. ハイドロゲルからのβ-TCP粒子の漏出
各スポンジに純水を加えることによりハイドロゲルを調製後、該ゲルを水溶液に浸漬し、穏やかに振動させてβ-TCP粒子の漏出を評価した。熱架橋していないハイドロゲルは速やかに液体中で崩壊してβ-TCP粒子は流出したが、熱架橋したハイドロゲルは72時間後でもその形状を維持し、β-TCP粒子を保持していた(図3A)。繰り返しの洗浄を伴うゼラチン染色後でさえ、熱架橋プロセスに供された全てのサンプルはハイドロゲルとしてその形状をしっかりと保持していた(図3B)。これらの結果は、熱架橋がハイドロゲルの安定性とβ-TCP粒子の保持性を増強することを示す。
2.3. ハイドロゲル形状と吸水速度
ハイドロゲルの形成プロセスは、操作性に影響し得る。材料の吸水速度は標本の調製時間と直接関連する。超純水を投与後、vhc-GS又はvhEc-GS、これらにさらにβ-TCP 粒子を含む材料は大きく収縮するが、vhGSとvhGS-βは比較的形態を保持していた(図4A)。vhEc-GSとvhEc-GS-βの吸水速度は、vhGSとvhGS-βの吸水速度より有意に早かった (図4B)。
2.4.インビトロ生体適合性試験
スポンジは、細胞培養試験に使用する前にDMEMでハイドロゲル化された。2つの異なる方法を、ラット骨芽細胞株UMR106を用いるハイドロゲルの細胞毒性評価に使用した。ハイドロゲルと接触していない細胞に関与するCCK-8試験の結果では顕著な細胞毒性は認められなかった(図5A)。一方、ハイドロゲルと接触した細胞の生存又は死滅の染色は、vh-GSとvh-GS-β由来のハイドロゲルで観察されたが、vhEc-GSとvhEc-GS-β由来のハイドロゲルでは死滅細胞が有意に少ない結果であった。
2.5. 骨再生とβ-TCP粒子の吸収
粒子のみと比較したvhEc-GS-βの操作性と細胞適合性の優位性を考慮して、vhEc-GS-β由来のハイドロゲルとβ-TCP 粒子の骨形成能とβ-TCP 粒子の吸収をラット頭蓋冠臨界骨欠損 (9 mm)を用いて比較した(図6)。骨欠損のサイズに基づき、7片のvhEc-GS- β(β-TCP 28 mgを含む)あるいは4片のvhEc-GS と3片のvhEc-GS-β (β-TCP 12 mgを含む)を組み合わせ、DMEMと混合及び一体化して各ハイドロゲルを調製し、移植した(図6A,B)。ハイドロゲルは操作性が良好で、ピンセットでつかむことができた(図 6A)。β-TCP 粒子量は欠損部当たり12 mg又は28 mgに統一した(括弧内の数字はβ-TCP 粒子の質量である)。μ-CTの結果は、vhEc-GS-βスポンジ由来のハイドロゲルが移植の3週間後及び6週間後の時点でβ-TCP 粒子単独と比較して不透明像が増大した(図6C)。H&E 染色画像は、新生骨の領域が増大したことを保証した(図6D)。さらに、β-TCP 粒子由来の不透明像を除いた後のμ-CT 形態計測分析は、vhEc-GS-β(12)及びvhEc-GS-β(28) はβ-TCP 粒子単独よりも有意に多量の骨を形成したことを示す(図6E)。
2.6. β-TCP吸収
μ-CT画像における骨欠損部の側面図は、明暗の青色粒子 (β-TCPを示す)が6週においてvhEc-GS-β由来のハイドロゲルで処理された欠損部よりもβ-TCP 群においてより多く見出されることを示す(図7A)。vhEc-GS-β群におけるβ-TCP 粒子はβ-TCP 群よりも速やかに吸収された(図7A,B)。破骨細胞を示すTRAP染色は、破骨細胞数がβ-TCP 28 mgを投与した場合と比較してvhEc-GS-β(28)群で増加していることを示した(図7C,D)。

Claims (8)

  1. ＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種とＣＯＯＨ基を繰り返し単位に有する天然高分子と、ＯＨ基又はアミノ基を有する生理活性物質がエステル結合、アミド結合又は水素結合で結合され、かつ、天然高分子のＣＯＯＨ基と天然高分子のＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種が架橋している機能性架橋構造体を含むマトリクスにβ－トリカルシウムホスフェート（β-TCP）粒子が分散してなる、複合体。
  2. 生理活性物質がカテキン類、ポリフェノール類、プロアントシアニジン、アントシアニン、フラボノイド類、大豆イソフラボン類及びポリアミンからなる群から選ばれる少なくとも１種である、請求項１に記載の複合体。
  3. 天然高分子がヒアルロン酸、コラーゲン、ゼラチン、キサンタンガム、ジェランガム、ペクチン／ペクチン酸、アルギン酸又はそのナトリウム塩及びエラスチンからなる群から選ばれる、請求項１又は２に記載の複合体。
  4. 前記マトリクスがゲルである、請求項１～３のいずれか１項に記載の複合体。
  5. 生理活性物質がエピガロカテキンガレート（EGCG）を主成分とするカテキン類であり、天然高分子がゼラチンである、請求項１～４のいずれか１項に記載の複合体。
  6. ＯＨ基及びアミノ基からなる群から選ばれる少なくとも１種とＣＯＯＨ基を繰り返し単位に有する天然高分子を水中で水溶性脱水縮合剤の存在下にＯＨ基又はアミノ基を有する生理活性物質と反応させて、天然高分子のＣＯＯＨ基とエステル結合、アミド結合又は水素結合を介して生理活性物質を結合し、かつ、前記天然高分子を架橋して機能性架橋構造体を得、得られた機能性架橋構造体の溶液とβ－トリカルシウムホスフェート（β-TCP）粒子を混合し、凍結乾燥と真空熱処理を行う、機能性架橋構造体とβ-TCP粒子の複合体の製造方法。
  7. さらに含水溶液を作用させてゲル状の複合体を得る、請求項６に記載の複合体の製造方法。
  8. 請求項１～５のいずれか１項に記載の複合体を含む、骨再生用材料。
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