CN117917965A - 用于治疗骨损伤的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及用于治疗、改进和加速受试者的大节段骨缺损的愈合的组合物和仿生支架以及其使用方法。所述方法包括将所述组合物和仿生支架植入受试者中。

Description

用于治疗骨损伤的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2021年8月31日提交的美国临时申请号63/239,161的提交日的权益。这一在先提交的申请的内容由此以引用的方式整体并入。
背景技术
仅在美国，平均每年就有790万例骨折发生，其中大约5-10％会导致延迟愈合、不愈合、亚临界尺寸缺损或大块骨缺损，这给外科医生带来了重大的治疗挑战(Zura等人,JAMA Surg.2016年11月16日；151)。在普通人群中，骨折严重程度、解剖位置、患者合并症、吸烟和使用某些药物可对骨折愈合问题产生实质影响(Zura等人,JAMA Surg.2016年11月16日；151)。胫骨、股骨或肱骨不愈合的治疗费用介于每例$31,500与$34,400之间范围内，这对每年的医疗保健费用造成了沉重负担(Kanakaris NK,Giannoudis PV.Injury.2007；38增刊2:S77 S84；和Wu等人Orthopedic Research and Reviews.2013:5 21-33)。
此外，超过59,000名军事人员在伊拉克和阿富汗服役期间在作战相关行动中受伤，其中50％是肌肉骨骼损伤，包括大节段骨缺损(Belmont Jr.PJ,McCriskin BJ,SiegRN,Burks R,Schoenfeld AJ.Combat wounds in Iraq and Afghanistan from 2005 to2009.J Trauma Acute Care Surg.2012；73:3-12)。据估计，在这些冲突中承受的78％的肌肉骨骼损伤是严重的肢体损伤(Stansbury LG,Lalliss SJ,Branstetter JG,Bagg MR,Holcomb JB.Amputations in U.S.military personnel in the current conflicts inAfghanistan and Iraq.J Orthop Trauma.2008；22:43-46)。此类骨损伤愈合不良，特别是与高冲击爆炸损伤有关的那些，原因是骨和软组织受到污染性破坏，加上局部组织血管减少。即使没有此类并发症，超过临界尺寸的骨缺损也没有内在的愈合能力。大节段骨缺损患者的管理仍然是军事和民用外科医生面临的最具挑战性的临床问题之一(Pollak AN,Ficke JR,Extremity War Injuries III Session Moderators.Extremity warinjuries:challenges in definitive reconstruction.J Am Acad Orthop Surg.2008；16:628-34)。提高临床医生成功管理这些损伤的能力的重要性再怎么强调也不为过，因为这些毁灭性的损伤往往会导致持续医疗护理的漫长过程，这不可避免地代价高昂，并有失败和最终截肢的重大风险。仅由于在伊拉克和阿富汗的军事活动(OIF/OEF)，就有超过2000名士兵需要至少截肢一次(Fischer H.A Guide to U.S.Military Casualty Statistics:Operation Freedom’s Sentinel,Operation Inherent Resolve,Operation New Dawn,Operation Iraqi Freedom,and Operation Enduring Freedom.Congr Res Serv.2015；7)。此外，持续不愈合的骨缺损导致延迟返回工作岗位或军事任务，并相应降低个人的生活质量。因此，临床需求显然没有得到满足，这是开发更有效的治疗策略以解决这些潜在灾难性损伤的强大动力。
发明内容
本文公开了组合物，所述组合物包含：离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶(ecarin)；奥苏他林(oscutarin)和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；以及骨替代物。
本文公开了组合物，所述组合物包含：离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；以及骨替代物。
本文公开了多隔室装置，所述多隔室装置包括第一室，所述第一室包括分离的全血和/或一种或多种生长因子、一种或多种骨替代物或其组合；第二室，所述第二室包括蛇静脉酶或氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。
本文公开了仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。
本文公开了仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。
本文公开了构建植入物的方法，所述方法包括：a)以促进将储库植入物植入骨缺损中的形状和尺寸中的至少一者确定储库植入物的尺寸；和b)通过引入以下物质使储库植入物结构化为具有支架：(i)分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；(ii)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；以及(iii)骨替代物，以形成支架。
本文公开了构建仿生支架的方法，所述方法包括：a)以促进将支架植入骨缺损中的形状和尺寸中的至少一者确定支架的尺寸；和b)使a)中的支架与离体血肿组合，所述离体血肿包含：(i)分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(ii)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙，以形成仿生支架。
在以下描述、附图和权利要求书中说明了本发明组合物和方法的其他特征和优点。
附图说明
图1示出手术后8周大鼠的5mm股骨缺损的愈合结果。ACS-可吸收胶原蛋白海绵，BMP2-骨形态发生蛋白2，MicroCT-显微计算机断层摄影，WB-全血。
图2示出脱矿骨基质(DBX与离体血肿(BH)以1:3和1:6的DBX:BH比率混合时的微架构。
图3示出在3D打印的定制钛脊柱融合器内递送的离体血肿。
图4示出可如本文所公开使用的3D患者专用钛股骨植入物(融合器/支架)。
图5示出可用于递送离体血肿的组分的双室注射器的实例。一个室可递送凝血剂，并且另一个室可单独或与生长因子和/或骨替代物组合递送全血。
具体实施方式
通过参考本发明的以下详细描述、附图和其中包括的实施例可更容易地理解本公开。
在公开并描述本发明组合物和方法之前，应理解，除非另外规定，否则它们不限于特定合成方法，或者除非另外规定，否则它们不限于特定试剂，因而当然可以变化。还应理解，本文所用的术语仅用于描述特定方面的目的，而不意图进行限制。尽管与本文所述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于实践或测试本发明，但现在描述示例性方法和材料。
此外，应理解，除非另外明确说明，否则决非意图将本文所列出的任何方法解释为要求以特定顺序来进行其步骤。因此，当方法权利要求实际上并未陈述其步骤待遵循的顺序或者在权利要求或描述中并未以其他方式明确说明步骤将局限于特定顺序时，决非意图在任何方面推断顺序。这适用于供解释用的任何可能的非明示基础，包括与步骤安排或操作流程有关的逻辑问题、源自语法组织或标点符号的简明含义以及本说明书中所描述的方面的数目或类型。
本文所提及的所有出版物均以引用的方式并入本文中，以公开和描述与所引用的出版物相关的方法和/或材料。本文所讨论的出版物仅针对它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容均不应解释为承认本发明无权凭借在先发明而先于此类出版物。此外，本文所提供的公开日可能不同于实际的公开日，这可能需要单独确认。
定义
如本说明书和所附权利要求中所用，除非本文另外明确指示，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括多个提及物。
如本文所用，词语“或”意指特定列表的任何一个成员，并且还包括所述列表的成员的任何组合。
贯穿本说明书的描述和权利要求，词语“包含(comprise)”和所述词语的变化形式(诸如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”)意指“包括但不限于”并且不意图排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。特别地，在陈述为包括一个或多个步骤或操作的方法中，特别设想每个步骤包括所列内容(除非所述步骤包括诸如“由......组成”的限制术语)，意指每个步骤并不意图排除例如步骤中未列出的其他添加剂、组分、整数或步骤。
范围在本文中可表述为“约(about)”或“大约(approximately)”一个特定值和/或至“约”或“大约”另一特定值。当表述此类范围时，另一方面包括一个特定值和/或至另一特定值。同样，在通过使用先行词“约”或“大约”将值表述为近似值时，应理解所述特定值形成另一方面。还应理解，每个范围的端点既与另一端点显著相关，又独立于另一端点。还应理解，本文公开了许多值，并且本文中还将每个值公开为除了所述值本身以外的“约”那个特定值。例如，如果公开了值“10”，那么也公开了“约10”。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，那么也公开了11、12、13以及14。
如本文所用，术语“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能发生或可能不发生并且所述描述包括所述事件或情况发生的情况和所述事件或情况不发生的情况。
如本文所用，术语“受试者”是指施用的靶标，例如人类。因此，所公开的方法的受试者可以是脊椎动物，诸如哺乳动物、鱼、鸟、爬行动物或两栖动物。术语“受试者”还包括家养动物(例如，猫、狗等)、家畜(例如，牛、马、猪、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蝇等)。一方面，受试者是哺乳动物。另一方面，受试者是人类。所述术语不表示特定的年龄或性别。因此，意图涵盖成年、幼年、青少年和新生受试者，以及胎儿(无论是雄性或是雌性)。
如本文所用，术语“患者”是指患有疾病或病症或疾患的受试者。术语“患者”包括人和兽医受试者。在所公开的方法的一些方面，例如在施用步骤之前，“患者”已经被诊断出需要治疗骨损伤的愈合。
如本文所用，术语“治疗”是指部分或完全缓解、改善、缓和特定疾病、病症和/或疾患的一种或多种症状或特征，延迟其发作，抑制或减缓其进展，降低其严重程度，和/或降低其发生率。可向未表现出疾病、病症和/或疾患的迹象的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或疾患的早期迹象的受试者施用治疗，以达成降低与疾病、病症和/或疾患相关的病理学的发展风险的目的。例如，疾病、病症和/或疾患可以是骨损伤或骨折。
目前治疗大节段骨缺损的方法。许多技术已经用于治疗骨骼缺损，包括自体骨移植、各种骨移植替代物、Ilizarov方法、巨型假体关节成形术、生物制剂以及作为最后手段的截肢。然而，这些现有的治疗方案通常需要长时间的治疗，涉及多次手术，费用昂贵，并发症发生率高，而且治疗失败的风险很大。例如，自体移植仍然是大节段骨缺损愈合时的首选治疗(Khan SN,Cammisa FP,Sandhu HS,Diwan AD,Girardi FP,Lane JM.J Am AcadOrthop Surg.2005；13:77-86)。自体骨移植仍然是治疗骨缺损时的首选治疗，然而，足够的自体移植材料的供应可能有限，尤其是在平民和严重受伤的士兵遭受严重创伤性损伤或骨折不愈合的情况下，并且与供骨部位的显著发病率有关。相比之下，尽管同种异体骨可以大量获得，它的使用却会引起对疾病传播和免疫反应的担忧(Khan SN,Cammisa FP,SandhuHS,Diwan AD,Girardi FP,Lane JM.J Am Acad Orthop Surg.2005；13:77-86)，但更重要的是，它由不能充分吸收或重塑的死骨组成。它还显示出在加载时会逐渐积累微裂缝，导致5年失败率达到30％或更高(Enneking WF,Campanacci DA.J Bone Joint Surg Am.2001；83-A:971-986；和Wheeler DL,Haynie JL,Berrey H,Scarborough M,Enneking W.BiomedSci Instrum.2001；37:251-256)。此外，还开发了各种骨替代物来帮助治疗大节段骨缺损，但这些方法局限于结果的边际改进。骨形成不足、机械和操作特性差、缺乏生物相容性、不可预测的吸收以及相关的炎症反应仍然是此类材料的主要限制(McKee MD.J Am AcadOrthop Surg.2006；14:S163-7)。因此，对于超过8cm的骨缺损，牵引成骨仍然是军事外科医生的首选治疗。然而，这项技术繁琐、痛苦并且不可靠，会因针道感染而变得复杂，并且可能愈合缓慢(Pollak AN,Ficke JR,J Am Acad Orthop Surg.2008；16:628-34)。最重要的是，大节段骨缺损的现有治疗方案的主要并发症是它们无法确保快速恢复功能，以及降低再骨折率的能力。
对成骨生物学的研究导致了骨形态发生蛋白(BMP)的发现，BMP是一些最有效的成骨诱导剂(Urist MR.J Bone Miner Res.1997；12:343-6)。BMP家族的两个成员已被批准用于临床：重组人BMP-2(rhBMP-2；)和重组人BMP-7(rhBMP-7；/>)。尽管BMP已经在动物模型中显示出临床前功效，但其临床有效性令人失望。对这些蛋白质的适度临床反应与递送问题有关。此外，目前使用极高超生理剂量的BMP的实践(其中大部分会迅速从应用部位渗出)有可能增加异位/异位骨化的发生率和严重程度以及许多其他相关副作用，诸如抗体形成、植入物移位、骨吸收和甚至癌症(Carragee EJ,Hurwitz EL,WeinerBK.Spine J.2011；11:471-491)。因此，需要开发一种合适的载体，通过显著最小化所需剂量来提高BMP的有效性，从而限制其潜在的副作用和相关的治疗成本。
自体骨移植的最有前途的替代方案之一是使用可吸收胶原蛋白海绵(ACS)上递送的重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)。然而，成功的骨愈合需要超生理剂量的rhBMP-2，因为它在体内突释并且半衰期很短，一旦胶原蛋白海绵在插入骨缺损区域后被压缩，大部分rhBMP-2就会迅速渗出。这导致增加异位/异位骨化的发生率和严重程度以及许多其他相关副作用，诸如抗体形成、植入物移位、骨吸收和甚至癌症。显然需要一种更合适的载体来治疗这些复杂的骨损伤，并通过显著减少所需剂量来提高BMP的有效性，从而减轻其潜在的危险副作用。
近年来，富血小板血浆(PRP)(富含高浓度血小板的血浆)已经在一系列应用中进行了试验，包括治疗肌肉骨骼损伤。PRP被认为以超生理浓度分泌多种生长因子和细胞因子，并生成呈纤维蛋白凝块形式的细胞支撑基质。具体而言，有人认为PRP促进骨愈合的作用(Iqbal J,Pepkowitz SH,Klapper E.Curr Osteoporos Rep.2011；9:258-263；和Kurikchy MQ,Al-Rawi NH,Ayoub RS,Mohammed SS.Clin Oral Investig.2013；17:897-904)是由于诸如血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)和胰岛素样生长因子1(IGF-1)的因子浓度增加(Soffer E,Ouhayoun JP,AnagnostouF.Oral Surgery,Oral Medicine,Oral Pathology,Oral Radiology,andEndodontics.2003.第521-528页)。尽管如此，在口腔颌面骨移植手术中使用PRP的实验结果(Simman R,Hoffmann A,Bohinc RJ,Peterson WC,Russ AJ.Ann Plast Surg.2008；61:337-44)和临床研究(Marx RE,Carlson ER,Eichstaedt RM,Schimmele SR,Strauss JE,Georgeff KR.Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.1998；85:638-46)存在争议，并且迄今为止，几乎没有证据表明它实际上改进或加速骨愈合，事实上，在大多数情况下，骨形成减少(Choi B-H,Im C-J,Huh J-Y,Suh J-J,Lee S-H.Int J OralMaxillofac Surg.2004；33:56-9；和Marden LJ,Fan RSP,Pierce GF,Reddi AH,HollingerJO.J Clin Invest.1993；92:2897-2905)。这种明显的功效缺乏也延伸至长骨和脊柱。最近在绵羊身上进行的一项研究使用股骨干截骨术，接着进行牵引成骨，未能表明PRP的应用改进了新骨形成(Hernandez-Fernandez A,Vélez R,Soldado F,Saenz-Ríos JC,Barber I,Aguirre-Canyadell M.Injury.2013；44:901-7)。同样，在啮齿动物研究中，PRP对骨愈合没有有益作用(Pryor ME,Yang J,Polimeni G,Koo K,Hartman MJ,Gross H等人JPeriodontol.2005；76:1287-1292；和Ranly DM,Lohmann CH,Andreacchio D,Boyan BD,Schwartz Z.J Bone Joint Surg Am.2007；89:139-147)，或者充其量指示再生潜力较低(Sánchez AR,Sheridan PJ,Eckert SE,Weaver AL.J Periodontol.2005；76:1637-1644)。在促进脊柱融合术后骨愈合的研究中，动物(Li H,Zou X,Xue Q,Egund N,Lind M,BüngerC.Eur Spine J.2004；13:354-8)或人类受试者(Weiner BK,Walker M.Spine(Phila Pa1976).2003；28:1968-1970)也均未受益。这些研究中导致可变结果的因素尚不清楚，但有人认为血小板中存在的蛋白酶可能会降解生长因子(Thibault L,Beauséjour A,DeGrandmont MJ,Lemieux R,Leblanc JF.Transfusion.2006；46:1292-1299)，从而改变PRP的组成并降低其实验和临床有效性。此外，PRP激活需要凝血酶，从而导致生长因子突释，并降低总生长因子浓度。牛凝血酶通过刺激抗凝血酶抗体来干扰人类凝血蛋白，这被认为会影响愈合过程(Oryan A,Alidadi S,Moshiri Expert Opin Biol Ther.2016；16:213-32)。这也可能与PRP无法形成具有合适结构特性的凝块有关。
基于PRP的不良性能，法国颌面外科医生Joseph Choukroun开发了一种“第二代”浓缩血小板，称为富血小板纤维蛋白(PRF)(Choukroun J,Diss A,Simonpieri A,GirardM-O,Schoeffler C,Dohan SL等人Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndod.2006；101:299-303)。它被描述为一种更天然的纤维蛋白基质，含有有利于愈合和免疫的血液成分，与PRP相比具有特定的优势。例如，与将凝血酶添加至PRP中时产生的快速聚合相比，凝血过程是通过较慢的天然聚合发生的。最重要的是，PRF不需要抗凝剂或凝血酶添加剂(Dohan DM,Choukroun J,Diss A,Dohan SL,Dohan AJJ,Mouhyi J等人OralSurgery,Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endodontology.2006；101)。体外研究还表明，PRF能够更持续地释放生长因子，诸如PDGF、TGF-β和BMP，持续长达28天(He L,Lin Y,HuX,Zhang Y,Wu H.Oral Surgery,Oral Med Oral Pathol Oral RadiolEndodontology.2009；108:707-713)。这种释放曲线与PRP显著不同，PRP的特征是细胞因子和生长因子在一天内突释。尽管如此，当应用于口腔颌面手术时，PRF并未显示出任何显著的改进(Choukroun J,Diss A,Simonpieri A,Girard M-O,Schoeffler C,Dohan SL等人Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.2006；101:299-303；和Busenlechner D,Huber CD,Vasak C,Dobsak A,Gruber R,Watzek G.Clin Oral ImplantsRes.2009；20:1078-1083)。此外，这可能与血小板的递送量不足以及不合适的结构特性有关，类似于PRP。
血肿形成对骨折愈合的影响。骨折血肿形成发生在骨损伤后几分钟内并且包括一连串的生物事件，所述生物事件涉及血液系统中激活的凝血因子以及源自骨膜、骨髓和周围软组织的许多分子因子，诸如促炎细胞因子和生长因子，包括成骨和血管生成因子(LaiBFL,Zou Y,Brooks DE,Kizhakkedathu JN.Biomaterials.Elsevier Ltd；2010；31:5749-5758)。在骨折部位，血管收缩以防止持续失血，随后发生凝血级联，从而导致位于骨折碎片之间的血肿或血凝块形成(Schindeler A,McDonald MM,Bokko P,Little DG.Semin CellDev Biol.2008；19:459-66)。在凝血过程中，主要有两条途径：内在途径和外在途径，其中共同的途径是将凝血因子X转化为Xa。凝血酶是凝血级联中的最终蛋白酶，是胰凝乳蛋白酶家族的典型丝氨酸蛋白酶并且具有促凝血和抗凝血功能(Huntington JA.Thrombinplasticity.Biochim Biophys Acta-Proteins Proteomics.Elsevier B.V.；2012；1824:246-252)。在正常凝血过程中，凝血级联通过将酶原凝血酶原转化为丝氨酸蛋白酶凝血酶来激活所述酶原。凝血酶接着将可溶性纤维蛋白原转化为不溶性纤维蛋白纤维。最后，这些纤维蛋白纤维在凝血因子XIII的帮助下有助于形成成熟的网状纤维蛋白凝块(ChernyshIN,Nagaswami C,Purohit PK,Weisel JW.Sci Rep.2012；2:879)。因此，纤维蛋白原、凝血酶和凝血因子XIII的浓度梯度在调节纤维蛋白凝块构象中发挥重要作用(Wolberg AS,Campbell RA.Transfus Apher Sci.2008；38:15-23)。纤维蛋白凝块的结构参数可以通过纤维直径、密度、分支点的数目、分支点之间的距离和孔隙的尺寸来表征(Weisel JW,Litvinov RI.Blood.2013；121:1712-1719)。纤维蛋白纤维直径的增加与纤维蛋白纤维的密度成反比并且与孔径成正比(Eichhorn SJ,Sampson WW.J R Soc Interface.2005；2:309-318；和Kaur S,Sundarrajan S,Rana D,Matsuura T,Ramakrishna S.J MembSci.2012；392-393:101-111)。此外，纤维的直径和密度对纤维蛋白凝块的孔隙率和表面积有影响(Pham QP,Sharma U,Antonios G.Mikos.Biomacromolecules.2006；7:2796-2805)并负责干细胞的生物学功能，诸如粘附、增殖和分化(Badami AS,Kreke MR,Thompson MS,Riffle JS,Goldstein AS.Biomaterials.2006；27:596-606)。例如，低凝血酶浓度(<1nM)会生成对纤维蛋白溶解高度敏感的粗纤维蛋白纤维的多孔网络，而高浓度的凝血酶会生成细纤维，从而形成相对抵抗纤维蛋白溶解的渗透性差的纤维蛋白网络(Gabriel DA,MugaK,Boothroyd EM.J Biol Chem.1992；267:24259-63)。此外，尽管单个粗纤维具有较高的机械强度(刚度)，但由于纤维数目减少，由粗纤维构成的纤维蛋白凝块通常具有较低的机械强度(Carlisle CR,Coulais C,Guthold M.Acta Biomater.2010；6:2997-3003；和Liu W,Thomopoulos S,Xia Y.Adv Healthc Mater.2012；1:10-25)。
将支架与所公开的离体血肿组合可用于成功并且有效地增强大节段缺损的骨再生，所述大节段缺损本身不能自发愈合。在一些方面，所述组合可与比目前使用的标准剂量(11μg)少约33倍的rhBMP-2一起使用。如本文所述，使用体内5mm股骨缺损大鼠模型，通过离体血肿”递送的rhBMP2(例如，0.33μg)比在可吸收胶原蛋白海绵上递送时有效得多。与在可吸收胶原蛋白海绵上递送并且不作为离体血肿的一部分的rhBMP-2相比，在8周结束时，基于骨痂尺寸和骨形态计量学参数，大骨缺损用明显较低剂量的rhBMP-2持续愈合，并且在离体血肿组中愈合的骨的质量也优越。本文公开了仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿。本文公开了仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿，所述仿生支架可以被设计和制造为模拟正常骨折血肿，但更有效地递送极低剂量的rhBMP-2以及特定浓度的钙和凝血酶或蛇静脉酶。其他成骨蛋白也可包括于本文所述的离体血肿中。设计和使用包括支架和离体血肿的仿生支架可以被制成模拟骨折时形成的血肿，至少因为在受伤时形成的血肿充当激活一连串生物事件的支架。为了启动骨折愈合，这种级联可以参与激活来自血液系统的凝血因子，以及源自骨膜、骨髓和周围软组织的许多分子因子，诸如促炎细胞因子和生长因子，以及成骨和血管生成因子。在骨折部位的仿生支架中形成的血肿可显著影响骨折的愈合方式，而去除这种血肿会延迟骨折愈合。
本文公开了改进诱导的血凝块的结构和生物学特性以增强大节段骨缺损的愈合的方法。例如，为了显著改进和加速士兵和平民的大节段骨缺损的愈合，本文描述了仿生支架，所述仿生支架包括支架、通过构建模拟先天骨折血肿的结构特性的纤维蛋白凝块而产生的离体血肿。
促血栓形成蛇毒。许多蛇毒毒素含有蛋白水解酶，所述蛋白水解酶通过凝血剂凝血酶样酶和凝血酶原激活毒素的作用影响止血。因子X转化为(激活的)Xa是外在凝血途径与内在凝血途径之间的共同枢纽。蛇毒酶已经进化为利用凝血级联的各个阶段。这些毒液已经进化为利用血小板、内皮细胞和血浆蛋白与毒液蛋白之间存在的脆弱相互作用，所述毒液蛋白对脊椎动物止血阶段有影响(Meier J,Stocker K.Crit Rev Toxicol.1991；21:171-182)。根据蛇的类型，它们各自具有特定的促凝血因子。例如，在海岸太攀蛇(太攀蛇(Oxyuranus scutellatus))的毒液中发现的促凝血因子奥苏他林在结构和功能上与哺乳动物的凝血因子X相似。奥苏他林是一种丝氨酸蛋白酶，它属于C组凝血酶原激活剂毒液，与哺乳动物因子X不同，它不需要非酶促因子V，因为它们含有自己的因子Va样分子(St.Pierre L,Masci PP,Filippovich I,Sorokina N,Marsh N,Miller DJ等人Comparative analysis of prothrombin activators from the venom of Australianelapids.Mol Biol Evol.2005；22:1853-1864)。同样，在锯鳞蝰蛇(Saw-scaled viper/Echis carinatus)的毒液中发现的蛇静脉酶是一种金属蛋白酶，它无需诸如氯化钙(CaCl2)和磷脂的辅助因子的参与即可发挥作用。由于不需要辅因子，蛇静脉酶将羧化和脱羧凝血酶原转化为间凝血酶(Hutton R.Blood Rev.1993；7:176-189)。间凝血酶是全血凝固过程中凝血酶生成的中间产物，并且据报道在纤维蛋白原转化为纤维蛋白方面具有有限的酶活性(Bovill EG,Tracy RP,Hayes TE,Jenny RJ,Bhushan FH,Mann KG.ArteriosclerThromb Vasc Biol.1995；15:754-758；和Krishnaswamy S,Mann KG,Nesheim ME.J BiolChem.1986；261:8977-8984)。另一方面，从鲁塞尔氏蝰蛇(Russell’s viper/Dabioarusselli)毒液中分离出的丝氨酸蛋白酶RVV-V以不依赖于钙的方式特异性地激活因子V。另一种充分表征的蛋白酶RVV-X也是从鲁塞尔氏蝰蛇毒液中分离出来的，是一种有效并且特异性的因子X激活剂。与RVV-V相比，RVV-X是一种金属蛋白酶，它需要Ca2+，但不需要磷脂作为辅因子(Takeya H,Nishida S,Miyata T,Kawada SI,Saisaka Y,Morita T等人J BiolChem.1992；267:14109-14117；和Tokunaga F,Nagasawaq K,Miyataq T,Iwanagaqll S.JBiol Chem.1988；263:17471-17481)。相比之下，在正常骨折部位，因子X与血小板膜上的因子V结合，从而使凝血酶的生成加速数千倍，这种机制导致形成成熟凝块，从而稳定初级止血塞(Probst A,Spiegel H-U.J Investig Surg.1997；10:77-86)。上述内容表明，从蛇毒中分离出的促凝血因子应该适合作为一种更天然的凝血剂来改变血凝块的结构特性。事实上，蛇毒蛋白在阐明控制凝血级联和决定血小板功能的复杂生理机制方面发挥了重要作用。此外，由于它们的效力、选择性和高生物功效，它们在阐明人类凝血因子和血小板糖蛋白的结构和功能关系方面发挥了重要作用(Hong T-T,Huang J,Lucchesi BR.Am JPhysiol Heart Circ Physiol.2006；290:H959-67；Han SM,Weaver FA,Comerota AJ,Perler BA,Joing M.J Vasc Surg.2010；51:600-9；Sanchez EF,Bush LR,Swenson S,Markland FS.Thromb Res.1997；87:289-302；Swenson S,Bush LR,Markland FS.ArchBiochem Biophys.2000；384:227-37；和Shah AR,Scher L.IDrugs.2007；10:329-35)。结果，已经鉴定、分离、表征并纯化了数种活性毒液化合物，并且所述化合物目前用于诊断和医学目的(King GF.Expert Opin Biol Ther.2011；11:1469-84；和Butler MS.Nat ProdRep.2008；25:475-516)。如本文所述，组合物包含蛇毒凝固酶(SVCE)作为替代凝血剂，而不是添加凝血酶，凝血酶在临床使用时已显示出具有副作用(Oryan A,Alidadi S,MoshiriA.Expert Opin Biol Ther.2016；16:213-32)。特定SVCE已显示出比其哺乳动物对应物更具催化活性，并且由于存在额外的二硫桥，已知其具有更高的热稳定性和更强的抗蛋白水解能力(Kang TS,Georgieva D,Genov N,Murakami MT,Sinha M,Kumar RP等人FEBSJ.2011；278:4544-76)。本文公开了仿生支架和方法，使用大鼠模型证明了蛇毒酶改变血肿特性的能力，以及它们愈合大节段缺损的能力。
蛇毒中的凝血因子由于数种原因而受到青睐，例如，它们不会影响其他凝血因子，而且分子尺寸小，使其在使用时不太可能被身体的免疫系统识别，并且因此不太可能受到攻击。此外，所述分子在体内附着至其靶标时具有选择性，从而最小化产生不必要副作用的可能性。蛇静脉酶是专门选择的，因为它不需要辅因子来激活。
本公开对于开发新的和改进的治疗策略是重要的，所述策略用以增强骨损伤的愈合，提高生活质量，降低高昂的治疗成本，并降低由于严重创伤和战场损伤而导致的平民和军事人员的截肢率。本文所公开的结果可以提供对离体产生的血肿的要求，所述血肿具有通过模拟自然愈合的骨折血肿的固有结构和生物特性来增加骨愈合的有效性的特性。本公开对于离体血肿的开发也是重要的，所述离体血肿充当骨诱导性和骨传导性的生长因子储库，并且可以与支架组合形成仿生支架，以增强大节段骨缺损、亚临界尺寸缺损的愈合以及治疗不愈合骨折(延迟愈合或不愈合)。公开了将离体血肿与例如骨传导性支架组合的组合物，所述骨传导性支架可被设计成具有适合骨修复应用的机械特性。例如，这些支架可用于跨越显著距离的骨再生，并控制由此产生的骨密度、结构和支架重塑速率。在一些方面，支架可以是三维打印的支架，所述支架可用于替代当前的骨移植技术和骨移植替代物。
在民用或军用临床环境中，通过在手术室中简单地将所需体积的全血与特定浓度的蛇毒凝固酶混合，无需高度专业化的装备，即可预期快速产品转化以及按需应用。此处描述的结果也可以使生物材料研究人员受益，通过将血肿的顺应性结构特性并入生物材料支架的设计中，改进目前用于再生医学的性能不佳的支架的能力，从而帮助骨修复。此外，从蛇毒中分离出的促凝血因子可能用作合适的凝血剂以改变血凝块的结构特性，以及用于在医院环境和战场上阻止不受控制的出血。本文还公开了一种可能在数秒内止血的产品，所述产品易于携带，保质期长，可吸收或易于去除，并且价格低廉。由于这些蛇进化为通过造成瞬间、大规模的凝血病来杀死它们的猎物，它们已经开发出了将血液转化为明胶的高度特异性生物制剂。然而，当在受控条件下进行适当分离和精心制备时，相同的凝血因子(诸如蛇静脉酶)反而可以用于帮助挽救生命。通过立即控制失血，这种显著的特性可以限制平民患者或战场上受伤的士兵的进一步失血。
本文公开了用于愈合大骨缺损的生物相容性蛇毒诱导的离体血肿。本文还公开了以特定方式处理和操纵离体血肿(血凝块)的方法，所述方法修改其超微结构特征，从而改变其在各种临床情况下的行为。本文公开了用一种剂处理全血或血液制品的方法，所述剂会改变全血或血液制品的结构构象并改变它的生物活性，使得它可用于治疗数种不同的医疗条件。
本文公开了可用于改进大骨缺损、亚临界尺寸缺损的再生和修复以及用于治疗不愈合骨折(延迟愈合或不愈合)的组合物、仿生支架和方法。本文公开了有组织的血凝块(即，可以与支架组合形成仿生支架的离体血肿)，它们可以通过充当用于连续释放重要生长因子的临时储库来增强骨愈合，并且通过提供足够的空间将同时有助于细胞浸润、增殖和分化。本文公开了用于增强修复过程的仿生支架、组合物和方法，所述修复过程涉及产生模拟自然愈合的骨折血肿的血凝块(离体血肿)。概念是，可以使用源自蛇毒的凝血因子(蛇静脉酶)来改变离体产品(离体血肿)的结构特性，以模拟内在的骨折血肿，所述离体产品当与骨替代物和/或支架组合并植入骨缺损中时，将增强和加速骨愈合。源自蛇毒的凝血因子(蛇静脉酶)也可用于止血。在一些方面，所述组合物可以配制成粉末、液体或喷雾剂。
本文公开了包含全血、蛇静脉酶和BMP-2的组合物。在一些方面，蛇静脉酶可以特定浓度存在。在一些方面，低剂量或显著降低剂量的BMP-2可用于本文所公开的组合物中。在一些方面，所公开的组合物可用于增强骨缺损愈合。在一些方面，所公开的组合物可以配制成液体或凝胶。
本文所述的愈合类型优于由Medtronic销售的市售产品提供的愈合，所述市售产品使用在可吸收胶原蛋白海绵(InfuseTM)上递送的rhBMP-2。当与支架组合以启动骨愈合时，本文所述的组合物或产品需要显著较低剂量的BMP-2(例如，rhBMP-2)。在一些方面，BMP-2的剂量可以比任何市售产品或组合物低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20倍或更多倍。
如本文所公开，BMP-2属于骨形态发生蛋白(BMP)家族。这些蛋白质是骨生长因子，能够诱导软骨内骨新生。在一些方面，BMP-2可以是重组BMP-2。产生重组BMP-2的方法是本领域已知的，并且例如可见于美国专利号7,354,901中，所述专利由此以引用的方式并入本文中。
本文还公开了仿生支架，所述仿生支架可如下按需制备：将3D打印的融合器(例如，植入物)倒入/浸没至或与各种骨替代物混合至可用于制备离体血肿的组分溶液(例如，特定浓度的血液制品和凝血剂(钙和凝血酶或蛇静脉酶，并且含有或不含生长因子))中，并使其凝结15-20min，并且接着将仿生支架植入预期的治疗/损伤部位中。如本文所述的包括支架和离体血肿的仿生支架是目前唯一已知的能够以此类效率有效递送此类极低剂量的rhBMP-2，持续并且稳健地启动骨折愈合级联以成功修复大的临界尺寸骨缺损的组合物。此外，离体血肿的获取和准备可以在手术中按需完成，非常快速，并且可以名义成本重复进行。
组合物
本文公开了组合物，所述组合物包含：1)离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；以及2)骨替代物。本文还公开了组合物，所述组合物包含：一种组合物，所述组合物包含：1)离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；以及2)骨替代物。在一些方面，所述离体血肿可包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿还可包含柠檬酸钠。在一些方面，短语“含红细胞血浆”意指不含血小板的血浆。在一些方面，所述离体血肿可包含具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。在一些方面，蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙可导致形成一种或多种具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。如本文所用，术语“离体”是指可以在生物体外部(例如，在外部环境中)形成的血肿。在一些方面，所述离体血肿可包含(a)分离的全血和柠檬酸钠富血小板血浆、单独的血浆、含红细胞血浆(不含血小板)或其他血液制品；以及(b)一种或多种凝血因子。在一些方面，所述离体血肿可包含全血和一种或多种凝血因子。
如本文所用，术语“全血”和“血液”在此用于指可以直接从身体中抽取的血液，其中未去除任何组分，包括血浆或血小板。在一些方面，全血或血液可以来自将接受本文所述的任何组合物或本文所述的任何离体血肿的受试者或患者。在一些方面，全血或血液可以来自供体受试者或患者。全血由红细胞、白细胞、血小板和血浆构成。在一些方面，可以使用纤维蛋白凝胶来替代全血。
本领域普通技术人员应理解，血液是一种特殊的体液，它将重要的物质(诸如营养物和氧气)递送至细胞并将代谢废物从那些相同的细胞中运走。在脊椎动物中，血液由悬浮于血浆中的血细胞构成。血液可包含不同组分，例如血浆、红细胞(red blood cell/erythrocyte)、血小板(platelet/thrombocyte)和白细胞(white blood cell/leukocyte)。血浆是血液的主要组分，约占55％，主要由水和离子、蛋白质、营养物和废物组成。血浆可含有由身体产生的每种蛋白质的一些。例如，血浆可包含约90％的水和10％的以下物质的混合物：离子(Na+、K+、Mg+2、Ca+2、Cl-、HCO3 -、HPO4 -2、SO4 -2)(Nezafati等人,2012)；蛋白质(例如，主要是白蛋白-55％、球蛋白、生长因子、酶、激素、抗体)；凝血因子(因子I-XIII)(labtestsonline.org.au)；糖(葡萄糖)；脂质(胆固醇)；矿物质(钠、钙、镁、钾、铁、锌、铜和硒)(Harrington等人,2014)；废物；和溶解气体。红细胞(Red blood cell/erythrocyte)负责携带氧气和二氧化碳。它们的尺寸为约7-8μm，成熟时不含线粒体或细胞核，并且具有120天的平均寿命。女性具有约360-500万个红细胞/mm3，并且男性具有约420-540万个红细胞/mm3。血小板(Platelet/thrombocyte)负责血液凝固。正常血小板计数介于约150,000至450,000/mm3范围内。白细胞(WBC；White blood cell/leukocyte)是免疫系统的一部分并且在免疫反应中发挥作用。约1％的所述细胞存在于血液中。它们的尺寸比红细胞大，并含有正常的细胞核和线粒体。正常白细胞计数介于约5,000-10,000/mm3范围内。白细胞可分为5种主要类型，所述类型再分为两个不同的组：粒细胞：中性粒细胞：占WBC的60-70％或3,000-7,000/mm3，嗜酸性粒细胞：占WBC的1-3％或50-400/mm3，和嗜碱性粒细胞：占WBC的0.3-0.5％或25-200/mm3；和无粒白细胞：淋巴细胞：占WBC的20-30％或1,000-4,000/mm3，和单核细胞：占WBC的3-8％或100-600/mm3。
如本文所用，术语“富血小板血浆”(也称为自体条件血浆)是指源自全血的富血小板血浆蛋白的浓缩形式。例如，可以对全血进行离心以去除红细胞。在一些方面，术语“单独的血浆(blood plasma alone/plasma alone)”或“血浆”可指源自全血的淡黄色液体组分，所述组分通常使全血中的血细胞保持悬浮。例如，可通过对血液进行离心直至血细胞落到管的底部来使血浆与全血分离，并且接着可从管的顶部抽出血浆。在一些方面，术语“含红细胞血浆”可指添加了红细胞的“单独的血浆”。例如，可通过对全血进行离心直至红细胞落到管的底部来获得红细胞，并在从管的顶部去除血浆、白细胞和血小板后回收红细胞。
在一些方面，所述组合物可包含一种或多种骨替代物。在一些方面，所述一种或多种骨替代物可源自生物产品，可以是合成骨替代物或其组合。源自生物产品的骨替代物的实例包括但不限于脱矿骨基质(DBM)、骨形态发生蛋白(BMP)、羟基磷灰石(HA)和珊瑚、同种异体松质骨碎片或骨髓抽吸浓缩物(BMAC)，包括使用扩髓冲洗抽吸器(RIA)从长骨收获的骨移植物。在一些方面，所述一种或多种骨替代物可源自生物产品，其中所述生物产品可以是骨形态发生蛋白(BMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、脱矿骨基质(DBM)、羟基磷灰石(HA)、珊瑚、同种异体松质骨碎片或骨髓抽吸浓缩物(BMAC)，包括使用扩髓冲洗抽吸器(RIA)从长骨收获的骨移植物。在一些方面，骨替代物可以是合成骨替代物。合成骨替代物的实例可包括但不限于硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙(TCP)陶瓷、双相磷酸钙(羟基磷灰石(HA)和β-TCP陶瓷)、生物活性玻璃和基于聚合物的骨替代物。合成骨替代物的其他实例包括但不限于S硫酸钙骨空隙填充剂、/>Beads、HydroSet可注射骨替代物(磷酸钙)、Ossilix磷酸钙水泥、Syntoss合成β-磷酸三钙骨移植材料、/>磷酸三钙骨移植物、GL1894P/-20 58S生物活性玻璃、UniGraft生物活性玻璃200-600um、BonAlive(BonAlive Biomaterials Ltd,Finland)、Cerament(骨空隙填充剂)和Cerament G(Bonesupport Holding AB,Lund Sweden)。聚合物的实例包括但不限于胶原蛋白、明胶、壳聚糖和合成聚合物，诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚己内酯(PCL)-GalaFlex P4HB生物聚合物等。在一些方面，骨替代物可以多种形式提供，包括但不限于干燥的、可模制的或可注射的形式，以及糊剂、粉末、油灰、颗粒、凝胶、海绵或条带。在一些方面，骨替代物可以是市售产品。在一些方面，骨替代物可以是脱矿骨基质(DBX；MTFBiologics,Edison,NJ)、RegenaVate DBM、Puros DBM、StaGraft DBM或FiberStack DBM(Zimmer Biomet；Warsaw,IN)。在一些方面，DBM可以是同种异体移植的松质骨或皮质骨，它已经脱钙以产生胶原蛋白和非胶原蛋白的产物。DBM的实例包括但不限于Grafton DBM(Osteotech,Inc,Eatontown,New Jersey)、Allosource(Denver,Colorado)、Dynagraft II(Integra LifeSciences,Plainsboro,New Jersey)、DBX(Musculoskeletal TransplantFoundation and Synthes,Paoli,Pennsylvania)、Osteofil(Medtronic Sofamor Danek,Minneapolis,Minnesota)。珊瑚的实例包括但不限于动物界、腔肠动物、石珊瑚目(scleractenia)、滨珊瑚科(poratidae)、滨珊瑚物种和角孔珊瑚物种；其中每一者均可用于开发珊瑚羟基磷灰石(CHA)骨替代物。在一些方面，骨替代物不是BMP、rhBMP-2或BMP-2。
在一些方面，离体血肿与骨替代物的比率可以是1000:1至1:1000或其间任何比率。在一些方面，离体血肿与骨替代物的比率可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。在一些方面，骨替代物与离体血肿的比率可以是1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9或1:10。
在一些方面，所述组合物、离体血肿、骨替代物或仿生支架可包含一种或多种生长因子。在一些方面，所述一种或多种生长因子可以是一种或多种骨形态发生蛋白。BMP的实例包括但不限于BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9和BMP-14(也称为GDF5)。考虑任何BMP，包括BMP-1至BMP-18。在一些方面，所述一种或多种生长因子可以是血小板源性生长因子。在一些方面，所述一种或多种生长因子可以是血管内皮生长因子。在一些方面，所述一种或多种生长因子可以是成纤维细胞生长因子2。在一些方面，所述一种或多种生长因子可以是骨形态发生蛋白、血小板源性生长因子、血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子2或其组合中的一者或多者。在一些方面，所述组合物、离体血肿、骨替代物或仿生支架还可包含BMP-2。在一些方面，所述一种或多种生长因子可以是BMP-2。在一些方面，所述一种或多种生长因子不是BMP、rhBMP-2、BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9或BMP-14。
在一些方面，全血可包含活细胞。在一些方面，全血的约50％至70％的活细胞在离体血肿形成后保持存活。在一些方面，全血的至少50％的活细胞在血肿形成后保持存活。在一些方面，全血的至少60％的活细胞在血肿形成后保持存活。在一些方面，全血的至少70％的活细胞在离体血肿形成后保持存活。在一些方面，全血的至少80％的活细胞在离体血肿形成后保持存活。在一些方面，全血的至少90％的活细胞在离体血肿形成后保持存活。在一些方面，全血的超过90％的活细胞在离体血肿形成后保持存活。
在一些方面，全血可包含一种或多种生物因子。在一些方面，术语“生物因子”或“其他生物因素”是指全血中不包括水的血浆组分。其他生物因子的实例包括但不限于离子、蛋白质、凝血因子、糖、脂质和矿物质。
在一些方面，全血中存在的一种或多种生物因子可以是内源性生物因子。血小板存在于全血中。多种生长因子可存在于血小板中。富血小板血浆的血小板α-颗粒中的生长因子已显示出含有促有丝分裂和趋化生长因子以及非活性形式的相关愈合分子，这对伤口愈合很重要，包括但不限于血小板源性生长因子(PDGF)、转化生长因子β1、β2、β3(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、血小板源性血管生成因子(PDAF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、血小板因子4(PF-4)、表皮生长因子(EGF)、上皮细胞生长因子(ECGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和其他细胞因子。此外，血浆液还含有许多生物活性蛋白，诸如生长因子IGF-I和肝细胞生长因子(HGF)。在正常伤口愈合过程中，所捕获的血小板被激活并脱粒，导致α-颗粒内容物的释放。血小板中存在的生长因子的实例包括但不限于血小板源性生长因子、转化生长因子β1、β2、β3、血小板源性血管生成因子、胰岛素样生长因子1、血小板因子4、表皮生长因子、上皮细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和其他细胞因子；以及血小板源性内皮生长因子(PDEGF)、白细胞介素1、骨钙素和骨粘连蛋白。血浆液中存在的生长因子包括但不限于胰岛素样生长因子1和肝细胞生长因子。
在一些方面，所述离体血肿可包含全血、蛇静脉酶和柠檬酸钠。在一些方面，所述离体血肿可包含全血、氯化钙和柠檬酸钠。在一些方面，所述离体血肿可包含富血小板血浆和蛇静脉酶。在一些方面，所述离体血肿可包含富血小板血浆和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含全血；氯化钙；或奥苏他林和氯化钙；和柠檬酸钠。在一些方面，(a)分离的全血和柠檬酸钠；富血小板血浆或含红细胞血浆之一的组合可与(b)蛇静脉酶、奥苏他林和氯化钙或氯化钙之一组合。在一些方面，(a)分离的全血和柠檬酸钠；富血小板血浆或含红细胞血浆之一的组合可与(b)凝血酶或凝血酶和氯化钙之一组合。在一些方面，本文所述的任何离体血肿组合还可包含一种或多种抗生素。
在一些方面，所述离体血肿中存在的氯化钙的浓度可在1mM至20mM范围内。在一些方面，氯化钙的浓度可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20mM或其间任何数字。在一些方面，氯化钙的浓度可以是约10mM。
在一些方面，凝血酶的浓度可在0.1至1U/mL范围内。在一些方面，所述离体血肿中存在的凝血酶的浓度可以是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1U/mL或其间任何数字或更高数字。在一些方面，所述离体血肿中存在的凝血酶的浓度可以是0.5U/mL
在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度可以是至少0.05U/mL。在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度可以是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2U/mL或其间任何数字或更高数字。在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度可以是0.3U/mL。在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度可以是0.6U/mL。在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度可以是0.75U/mL。在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度可以是0与2之间的任何值(合理或不合理)。
在一些方面，本文所述的离体血肿、骨替代物、仿生支架或组合物还可包含BMP-2。在一些方面，BMP-2可以是重组BMP-2。在一些方面，重组BMP-2可包含人BMP-2。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可以是至少0.01mg。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可以是0.01至5mg。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可以是0.01、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mg或其间任何数字。在一些方面，重组BMP-2可以约0.01mg至约12mg的剂量使用。在一些方面，重组BMP-2可以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0mg或其间任何数字的剂量使用。在一些方面，重组BMP-2可以高于12.0mg的剂量使用。在一些方面，BMP-2的剂量可以是约1mg至5mg。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可以是至少0.01μg。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可以是0.01至5μg。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可以是0.01、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0μg或其间任何数字。在一些方面，重组BMP-2可以约0.01μg至约12μg的剂量使用。在一些方面，重组BMP-2可以0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0、11.5、12.0μg或其间任何数字的剂量使用。在一些方面，重组BMP-2可以高于12.0μg的剂量使用。在一些方面，BMP-2的剂量可以是约1μg至5μg。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可在0.3与0.4μg之间。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可低于标准剂量。在一些方面，所述离体血肿、骨替代物、组合物或仿生支架中存在的BMP-2的剂量可比标准剂量或BMP-2/ACS的最低有效剂量低10-50倍。
在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的量可以是至少0.05U/mL；并且所述离体血肿中存在的BMP-2的量可以是至少0.01mg。
在一些方面，所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的量可以是至少0.05U/mL；并且所述离体血肿中存在的BMP-2的量可以是至少0.01μg。
在一些方面，柠檬酸钠的浓度可以是约3.2至4mg/ml。在一些方面，溶液是约3.2至4％(重量/体积)的柠檬酸钠，接着可使这一溶液的一部分与九份全血混合。
在一些方面，本文所述的离体血肿或组合物还可包含一种或多种治疗剂。在一些方面，治疗剂可以是生长因子。在一些方面，治疗剂可以是BMP-2。在一些方面，治疗剂可以是重组BMP-2。在一些方面，治疗剂可以是干细胞或预分化干细胞，包括但不限于间充质干细胞、脂肪干细胞和诱导性多能干细胞。在一些方面，治疗剂可以是蛇静脉酶。
在一些方面，本文所公开的离体血肿、仿生支架或组合物可以配制成液体或凝胶。在一些方面，本文所公开的离体血肿、仿生支架或组合物可以配制成糊剂或油灰。在一些方面，所述离体血肿可以配制成冻干或粉末形式。所述冻干或粉末形式可以使离体血肿更稳定进行存储。在一些方面，本文所公开的离体血肿、仿生支架或组合物可以配制成液体、凝胶、粉末、颗粒、糊剂或油灰。在一些方面，所述组合物可以配制成冻干或粉末形式。所述冻干或粉末形式可以使本文所公开的离体血肿、仿生支架或组合物更稳定进行存储。在一些方面，生长因子(BMP和其他)、凝血因子(蛇静脉酶、氯化钙等)和柠檬酸钠可以冻干或粉末形式获得。在一些方面，用于制造本文所公开的离体血肿的化合物可以在与全血或其他血液制品(例如，PRP、血浆等)混合之前溶解于无菌蒸馏水中。稀释剂为无菌蒸馏水。制备或存储不需要额外组分。全血(或其他血液制品)可以在手术之前(例如，就在手术之前)从患者抽取，并进行柠檬酸化以防止凝血。在一些方面，供体血液可用于例如患有血液病症或疾病的患者，所述血液病症或疾病包括但不限于贫血、血友病、白血病、HIV等。所述离体血肿的剩余组分不需要任何用于存储的额外稳定剂。例如，BMP-2可在市场上瓶装购得，即开即用；并且CaCl2可以粉末形式获得，并且在一些情况下可能已经溶解于无菌蒸馏水中(它在溶解后非常稳定)。BMP-2和CaCl2均可在室温下存储。蛇静脉酶可以冻干形式(冷冻干燥)获得，存储于-20℃，并且可以在使用前溶解于无菌蒸馏水中。离体血肿可以使用本文所述的组分相对简单地制备，所述组分的量基于待填充的缺损的体积。为此，在准备好各组分后，可以在管/模具中将它们混合在一起。一般来说，离体血肿将在约30至45分钟内形成，并且接着可以插入(或植入)骨缺损中。在一些方面，本文所述的离体血肿可以例如使用“智能存储系统”进行存储，所述“智能存储系统”使用基于射频识别的系统(例如，SmartstorageTM)，所述系统涉及近实时组织跟踪系统，它可以简化库存管理，包括保持准确的使用历史和温度日志。
支架
本文公开了仿生支架。所述仿生支架可包含本文所述的任何支架和本文所述的任何离体血肿。
本文公开了仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。本文公开了仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。在一些方面，所述仿生支架还包括一种或多种骨替代物。在一些方面，所述仿生支架的离体血肿包含一种或多种骨替代物。
在一些方面，本文所述的离体血肿还可与载体(诸如支架)组合。例如，载体可以是生物可降解的生物材料支架(例如，丝素蛋白支架、聚(丙交酯-共-乙交酯(PLGA)或其他类似的可吸收产品或材料)。此类载体可用于为离体血肿提供额外的机械支撑。用于所公开的仿生支架的支架的实例包括但不限于生物相容性支架、骨传导性支架、三维打印的支架、胶原蛋白、可吸收胶原蛋白支架(1型牛或猪胶原蛋白)、胶原蛋白牛膜或源自其他哺乳动物或非哺乳动物(诸如海洋)来源的胶原蛋白、几丁质、生物可吸收聚合物(诸如PLA)或不可吸收聚合物(诸如PEEK)或者钛或其他生物相容性金属合金(诸如可吸收镁(诸如镁钙合金))或三维打印的支架。
在一些方面，可与本文所述的离体血肿组合的支架可以是生物相容性的和生物可降解的。例如，支架应引起可忽略不计的免疫反应，以便防止它引起严重的炎症反应，以致可能减少愈合或引起身体排斥。在一些方面，支架可顺应粘附于其上的细胞，并且使得细胞可以正常发挥作用并迁移至表面，并最终穿过支架进行增殖。本文所公开的支架也可以是生物可降解的，使得细胞可以产生它们自己的细胞外基质。这种降解的副产物也可以是无毒的，并且能够在不受其他器官干扰的情况下离开身体。
在一些方面，支架可具有与它将植入的解剖部位一致的机械特性并且足够坚固以允许在植入期间进行手术操作。此外，支架可足以允许细胞浸润和血管形成。在设计适当支架时，考虑支架的架构非常重要。例如，支架可具有互连的孔隙结构和高孔隙率，以确保细胞渗透和营养物向细胞的充分扩散。多孔互连结构对于允许废物扩散出支架非常重要，并且支架降解的产物应该能够在不干扰其他器官和周围组织的情况下离开身体。
在一些方面，支架可以是三维打印的支架。在一些方面，三维打印的支架可以定制生产。
三维支架可使用被称为机器人沉积或直写(DW)技术的3-D打印技术来生产。这项技术使用计算机控制的打印过程和胶体油墨来形成三维结构。这些结构可以在自身组件上形成，或者可以根据断层摄影数据(X射线、超声检查或MRI)定制形成以填充单个骨缺损。
油墨制造和打印系统本身使用水基流变控制油墨，所述油墨在离开打印喷嘴时会变成固体。这些油墨由水基浆料中的精细控制的陶瓷颗粒组成，所述水基浆料含有控制胶体油墨的操作特征的有机化学品。这允许分层打印3-D网格状结构，而不会出现无支撑结构元件的下垂或出现最小下垂。
使用这种系统，可以使用x-y-z控制龙门系统的x和y坐标控制系统，通过迫使油墨通过一个小(约50-400μm直径)喷嘴到支撑板上来打印第一层的元件。接着，使用z控制系统将喷嘴向上移动略小于1个喷嘴直径。接着在第一层上打印下一层。如此逐层继续，直至完成整个3-D结构。
整个结构可以在油浴中打印以防止干燥。所述系统可具有3个喷嘴和油墨储库，因此最多可使用三种材料来打印单个结构。易褪色油墨(完全由在烧制过程中烧掉的材料组成的油墨)也可用作打印过程的一部分。这些可用于打印需要临时支撑的复杂零件的支撑结构。
接着将所得结构从油浴中取出，干燥，并在可编程炉中烧制以产生最终陶瓷结构。目前，烧制在大约1100℃下进行约4个小时，大体上会烧掉有机组分，从而将陶瓷颗粒一起烧结成固体结构。这可能引起少量可预测的收缩，所述收缩可计算到打印过程中以产生精确并且可预测的结构。
打印喷嘴可以是常规的圆柱形，从而产生圆柱形杆状打印结构。然而，喷嘴可以被制成成形为产生非圆柱形结构或具有设计用于控制细胞迁移、生长和分化的尺寸的表面条纹的结构。
在一些方面，多种生物材料可用于制造本文所公开的支架。在一些方面，生物材料可以是陶瓷、合成聚合物和/或天然聚合物或其组合。陶瓷的实例包括但不限于羟基磷灰石(HA)和磷酸三钙(TCP)。合成聚合物的实例包括但不限于聚苯乙烯、聚-l-乳酸(PLLA)、聚乙醇酸(PGA)和聚-dl-乳酸-共-乙醇酸(PLGA)。天然聚合物的实例包括但不限于胶原蛋白、各种蛋白聚糖、基于海藻酸盐的底物和壳聚糖。使用天然聚合物的优势是它们具有生物活性并且通常促进优异的细胞粘附和生长。此外，它们也是生物可降解的，并且因此随着时间的推移，使宿主细胞产生它们自己的细胞外基质并替代降解的支架。在一些方面，支架可由生物材料的组合制成。在一些方面，胶原蛋白可与多糖(例如，糖胺聚糖)组合。在一些方面，支架可通过使用化学交联方法来制备。
在一些方面，包括支架和离体血肿的组合物或仿生支架可以配制用于局部施用。在一些方面，本文所公开的组合物(例如，液体形式)或离体血肿(例如，凝胶形式)可与本文所公开的任何载体或支架组合并局部施用或通过手术植入或经皮注射。在一些方面，液体制剂可通过注射器递送至支架。在一些方面，凝胶制剂可植入骨缺损部位中。可使用身体外部的模具来制备凝胶制剂，所述模具对应于植入骨缺损部位中的骨尺寸和形状。在一些方面，制剂可以是介于液体与凝胶之间的中间形式。在一些方面，中间制剂可以应用于固体支架或载体以弥合固体支架本身可能存在的间隙(例如，大间隙)，同时还独立地提供机械支撑。固体支架的实例包括但不限于钛融合器或其他多孔金属植入物。此类支架可用于重建骨骼缺损或实现脊柱融合。考虑到PEEK本身是生物惰性的并且不具有内在的骨愈合能力，当PEEK脊柱融合器用于椎间脊柱融合时，本文所公开的制剂可用于增强愈合。或者，本文所公开的任何制剂均可输注或局部施用于可吸收支架，可用于重建节段或亚节段的骨骼缺损。当与金属多孔植入物或可吸收支架联合使用时，这还将包括(股骨、胫骨或其他长骨的)开放楔形截骨术、牵引关节融合术部位以及与关节成形术相关的骨缺损。此外，本文所公开的任何仿生支架、组合物和离体血肿制剂均可以相同方式应用于具有骨缺损的其他关节融合术部位，诸如踝关节、膝关节、腕关节、肩关节、髋关节或其他较小的关节，包括但不限于Lisfranc关节、手、腕或足部的较小关节，并且扩展到包括用于填充当收获骨移植物以转位至第二解剖位置时产生的骨缺损的应用。
装置
本文公开了用于递送本文所述的任何组合物和/或离体血肿的多隔室装置。在一些方面，多隔室装置可包括两个或更多个室或者两个或更多个注射器，可用于分别递送离体血肿和骨替代物的组分。在一些方面，第一室或注射器可包括预定浓度的凝血剂(例如，钙和凝血酶，或蛇静脉酶)。在一些方面，第二室或注射器可包括单独的全血。在一些方面，第二室或注射器可包括与外源性生长因子(例如，BMP2、PDGF、VEGF)组合的全血。在一些方面，第二室或注射器可包括与骨替代物(例如，DBM、同种异体松质骨碎片)组合的全血。在一些方面，第二室或注射器可包括与外源性生长因子(例如，BMP2、PDGF、VEGF)、骨替代物组合的全血。在一些方面，第三室或注射器可包括外源性生长因子和额外的骨替代物。在一些方面，第三室或注射器可包括外源性生长因子。在一些方面，第三室或注射器可包括一种或多种骨替代物。在一些方面，第四室或注射器可包括一种或多种骨替代物。
方法
本文公开了促进骨愈合的方法。本文还公开了产生骨替代材料的方法。本文还公开了产生植入物或仿生支架或本文所述的任何组合物的方法。在一些方面，包含离体血肿的组合物也可充当支架。在一些方面，包含离体血肿的组合物可与支架组合以形成或产生仿生支架。在一些方面，可组合本文所公开的方法。本文公开了促进骨愈合、产生骨替代材料、产生植入物、包含离体血肿的组合物、仿生支架或其组合的方法。
本文公开了促进骨愈合或产生骨替代材料或植入物的方法。在一些方面，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所公开的任何组合物。在一些方面，所述方法可包括向有需要的受试者施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含本文所公开的离体血肿和一种或多种骨替代物。在一些方面，所述方法包括将本文所述的任何仿生支架植入受试者的相关部位中。在一些方面，所述仿生支架还可包括一种或多种骨替代物。
在一些方面，所述离体血肿可包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿还可包含柠檬酸钠。在一些方面，所述离体血肿可包含具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。在一些方面，蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙可导致形成一种或多种具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。在一些方面，所述离体血肿可包含(a)分离的全血和柠檬酸钠富血小板血浆、单独的血浆、含红细胞血浆(不含血小板)或其他血液制品；以及(b)一种或多种凝血因子。在一些方面，所述离体血肿可包含全血和一种或多种凝血因子。在一些方面，全血可包含一个或多个活细胞。在一些方面，全血可包含一种或多种生物因子。在一些方面，所述离体血肿可包含全血、蛇静脉酶和柠檬酸钠。在一些方面，所述离体血肿可包含全血、氯化钙和柠檬酸钠。在一些方面，所述离体血肿可包含富血小板血浆和蛇静脉酶。在一些方面，所述离体血肿可包含富血小板血浆和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含血浆和蛇静脉酶。在一些方面，所述离体血肿可包含血浆和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含含红细胞血浆和蛇静脉酶。在一些方面，所述离体血肿可包含含红细胞血浆和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含具有奥苏他林的血浆和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿可包含具有凝血酶的血浆和氯化钙。在一些方面，所述离体血肿还可包含骨形态发生蛋白2(BMP-2)。在一些方面，BMP-2可以是重组BMP-2。在一些方面，重组BMP-2可包含人BMP-2。在一些方面，所述组合物还可包含一种或多种生长因子、一种或多种血小板和一种或多种细胞。在一些方面，所述组合物可以配制成凝块或支架。在一些方面，支架可以是趋化性的。在一些方面，支架可吸引有利于骨愈合的内源性生长因子。
在一些方面，所述一种或多种骨替代物可源自生物产品，可以是合成骨替代物或其组合。源自生物产品的骨替代物的实例包括但不限于脱矿骨基质(DBM)、骨形态发生蛋白(BMP)、羟基磷灰石(HA)和珊瑚、同种异体松质骨碎片或骨髓抽吸浓缩物(BMAC)，包括使用扩髓冲洗抽吸器(RIA)从长骨收获的的骨移植物。在一些方面，所述一种或多种骨替代物可源自生物产品，其中所述生物产品可以是骨形态发生蛋白(BMP)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、脱矿骨基质(DBM)、羟基磷灰石(HA)、珊瑚、同种异体松质骨碎片或骨髓抽吸浓缩物(BMAC)，包括使用扩髓冲洗抽吸器(RIA)从长骨收获的骨移植物。在一些方面，骨替代物可以是合成的骨替代物。合成骨替代物的实例可包括但不限于硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙(TCP)陶瓷、双相磷酸钙(羟基磷灰石(HA)和β-TCP陶瓷)、生物活性玻璃和基于聚合物的骨替代物。合成骨替代物的其他实例包括但不限于S硫酸钙骨空隙填充剂、/>Beads、HydroSet可注射骨替代物(磷酸钙)、Ossilix磷酸钙水泥、Syntoss合成β-磷酸三钙骨移植材料、/>磷酸三钙骨移植物、GL1894P/-20 58S生物活性玻璃、UniGraft生物活性玻璃200-600um、BonAlive(BonAlive Biomaterials Ltd,Finland)、Cerament(骨空隙填充剂)和Cerament G(Bonesupport Holding AB,Lund Sweden)。聚合物的实例包括但不限于胶原蛋白、明胶、壳聚糖和合成聚合物，诸如聚(乳酸)(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚己内酯(PCL)-GalaFlexP4HB生物聚合物等。在一些方面，骨替代物可以多种形式获得，包括但不限于干燥的、可模制的或可注射的形式，以及糊剂、粉末、油灰、颗粒、凝胶、海绵或条带。在一些方面，骨替代物可以是市售产品。在一些方面，骨替代物可以是脱矿骨基质(DBX；MTF Biologics,Edison,NJ)、RegenaVate DBM、Puros DBM、StaGraft DBM或FiberStack DBM(ZimmerBiomet；Warsaw,IN)。在一些方面，DBM可以是同种异体移植的松质骨或皮质骨，它已经脱钙以产生胶原蛋白和非胶原蛋白的产物。DBM的实例包括但不限于Grafton DBM(Osteotech,Inc,Eatontown,New Jersey)、Allosource(Denver,Colorado)、Dynagraft II(IntegraLifeSciences,Plainsboro,New Jersey)、DBX(Musculoskeletal Transplant Foundationand Synthes,Paoli,Pennsylvania)、Osteofil(Medtronic Sofamor Danek,Minneapolis,Minnesota)。珊瑚的实例包括但不限于动物界、腔肠动物、石珊瑚目、滨珊瑚科、滨珊瑚物种和角孔珊瑚物种；其中每一者均可用于开发珊瑚羟基磷灰石(CHA)骨替代物。在一些方面，骨替代物不是BMP、rhBMP-2或BMP-2。
在一些方面，受试者可以是人。在一些方面，受试者具有骨骼缺损。在一些方面，骨骼缺损可以是大节段骨缺损。在一些方面，骨骼缺损可以是小节段骨缺损。在一些方面，骨骼缺损可以与缺损的尺寸或体积无关，而不管缺损是完整的或是不完整的。在一些方面，受试者具有牙骨缺损。
在一些方面，受试者具有一处或多处骨折。在一些方面，受试者具有一处或多处骨损伤。
在一些方面，所述组合物可以配制成凝块或支架。在一些方面，所述组合物可以配制用于局部施用并与本文所公开的任何支架组合。在一些方面，所述组合物可以通过载体或支架局部施用。在一些方面，所述组合物可以在无载体或支架的情况下局部施用。在一些方面，所述组合物可以被植入或经皮递送。在一些方面，所述组合物可以被植入。在一些方面，所述组合物可以直接或间接植入。在一些方面，所述组合物可以由外科医生或者由代表人类或机器人/半自主代理发挥作用的任何自主或半自主递送装置递送。在一些方面，所述组合物可以经皮递送。
本文公开了构建植入物的方法。在一些方面，所述方法可包括：a)以促进将储库植入物植入骨缺损中的形状和尺寸中的至少一者确定储库植入物的尺寸；和b)通过引入以下物质使储库植入物结构化为具有支架：(i)分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；(ii)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；以及(iii)骨替代物，以形成支架。在一些方面，支架可具有55％至75％的孔隙率。在一些方面，支架可包括具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。在一些方面，储库植入物的形状可以是圆柱体或球体的形状。在一些方面，支架可以构建成凝块。在一些方面，可以将一种或多种生长因子引入支架中。在一些方面，一种或多种生长因子可以是骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9、BMP-14、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)或其组合。在一些方面，可以将BMP-2引入支架中。在一些方面，支架中存在的蛇静脉酶的量可以是至少0.05U/mL；并且支架中存在的BMP-2的量可以是至少0.01mg。在一些方面，离体血肿与骨替代物的比率可以是1000:1至1:1000。在一些方面，支架可以类似于给定骨缺损的尺寸和形状。在一些方面，支架可以是趋化性的。在一些方面，支架可包括活的血细胞和适当生物因子。在一些方面，骨替代物可以是脱矿骨基质。在一些方面，骨替代物可源自生物产品、合成骨替代物或其组合。在一些方面，生物产品可以是脱矿骨基质、羟基磷灰石或珊瑚。在一些方面，合成骨替代物可以是硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙陶瓷、生物活性玻璃或聚合物。在一些方面，所述一种或多种生长因子不是BMP、rhBMP-2、BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9或BMP-14。
此外，本文公开了构建仿生支架的方法。在一些方面，所述方法可包括：a)以促进将支架植入骨缺损中的形状和尺寸中的至少一者确定支架的尺寸；和b)使a)中的支架与离体血肿组合，所述离体血肿包含：(i)分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(ii)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙，以形成仿生支架。在一些方面，支架可具有55％至75％的孔隙率。在一些方面，支架可包括具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。在一些方面，支架的形状可以是圆柱体或球体的形状。在一些方面，支架的形状可以是理论上可以占据欧几里得空间内的离散子集或体积的任何和所有其他一种或多种几何形状。在一些方面，支架可以是胶原蛋白、几丁质、生物可吸收聚合物、不可吸收聚合物(诸如PEEK)或者钛或金属合金。在一些方面，可以将一种或多种生长因子引入支架或离体血肿中。在一些方面，一种或多种生长因子可以是骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9、BMP-14、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)或其组合。在一些方面，可以将BMP-2引入支架或离体血肿中。在一些方面，所述支架或离体血肿中存在的蛇静脉酶的量可以是至少0.05U/mL；并且所述支架或离体血肿中存在的BMP-2的量可以是至少0.01mg。在一些方面，离体血肿与骨替代物的比率可以是1000:1至1:1000。在一些方面，所述离体血肿可包含活的血细胞和适当生物因子。在一些方面，骨替代物可以是脱矿骨基质。在一些方面，骨替代物可源自生物产品、合成骨替代物或其组合。在一些方面，生物产品可以是脱矿骨基质、羟基磷灰石或珊瑚。在一些方面，合成骨替代物可以是硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙陶瓷、生物活性玻璃或聚合物。在一些方面，支架可以类似于给定骨缺损的尺寸和形状。在一些方面，支架可以是趋化性的。另外，支架可以是生物可降解的，使得它会降解，而无需手术去除。在一些方面，所述一种或多种生长因子不是BMP、rhBMP-2、BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9或BMP-14。
在一些方面，所述组合物可以作为仿生支架的全部或一部分植入。在一些方面，所述组合物可以用注射器注射至载体或支架中。在一些方面，所述组合物中存在的蛇静脉酶的量可以是至少0.05U/mL；并且所述组合物中存在的BMP-2的量可以是至少0.01-5mg或其间任何量。在一些方面，所述组合物中存在的蛇静脉酶的量可以是至少0.05U/mL并且所述组合物中存在的BMP-2的量可以是至少0.01-1μg或其间任何量。在一些方面，离体血肿与骨替代物的比率可以是1000:1至1:1000或其间任何比率。
在一些方面，治疗方案可以是用于治疗任何骨缺损的标准治疗方案。简而言之，可以对缺损伤口进行清创，用内板、外部固定器或髓内钉固定。接着，可以将本文所述的组合物；组合物和支架；以及仿生支架和离体血肿作为一个整体插入骨骼缺损中，之后缝合伤口。在一些方面，接着可以将本文所述的组合物的组分；组合物的组分和支架；以及仿生支架和离体血肿的组分单独插入骨骼缺损中，之后缝合伤口。例如，包括两个或更多个室或者两个或更多个注射器的多隔室装置可用于分别递送离体血肿和骨替代物的组分。在一些方面，第一室或注射器可包括预定浓度的凝血剂(例如，钙和凝血酶，或蛇静脉酶)。在一些方面，第二室或注射器可单独包括全血。在一些方面，第二室或注射器可包括与外源性生长因子(例如，BMP2、PDGF、VEGF)组合的全血。在一些方面，第二室或注射器可包括与骨替代物(例如，DBM、同种异体松质骨碎片)组合的全血。在一些方面，第二室或注射器可包括与外源性生长因子(例如，BMP2、PDGF、VEGF)、骨替代物组合的全血。在一些方面，第三室或注射器可包括外源性生长因子和额外的骨替代物。在一些方面，第三室或注射器可包括外源性生长因子。在一些方面，第三室或注射器可包括一种或多种骨替代物。在一些方面，第四室或注射器可包括一种或多种骨替代物。在一些方面，所述一种或多种生长因子不是BMP、rhBMP-2、BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9或BMP-14。
治疗方案可以是一致的和不变的，前提是不存在感染并且在其他情况下，缺损已准备好进行确定性治疗。本文所公开的组合物或仿生支架(或植入物)可以通过皮肤或通过体腔或解剖学开口进入身体，从而插入骨区域中，以最小化对附近结构的任何额外损害。所述组合物、仿生支架、支架或植入物的类型(包括尺寸和形状)的选择可以基于许多因素，包括但不限于其中待植入所述组合物、仿生支架、支架或植入物的骨的形状和/或尺寸；骨密度的百分比(即，剩余骨的多孔性)；和/或所述支架或植入物扩散至骨中的所需速率和分布；或此类因素的组合。在一些方面，所述组合物、仿生支架、支架或植入物的形状可以被构建为匹配骨或椎体的形状，从而允许所述组合物、仿生支架、植入物或离体血肿或者存在于所述组合物、支架、仿生支架、植入物或离体血肿中的组分的更均匀分布。所述组合物、仿生支架或植入物的应用可以在手术时或以任何其他合适的方式进行。
在一些方面，储库植入物或支架的形状可以是球体或圆柱体的形状。在一些方面，储库植入物或支架的形状可以是球体的形状或者临床紧急情况所规定的任何其他患者特定的几何形状、形式或形状。在一些方面，圆柱体形状的长度可以是至少5mm至约30cm(或更长)。在一些方面，圆柱体形状的直径可以是至少1mm至约60mm(或更长)。在一些方面，圆柱体形状可以是直的和/或弯曲的。在一些方面，圆柱体形状可以是直杆或弯曲杆。圆柱体或杆形状可以是具有纵轴的任何形状，所述纵轴沿着一个方向可以比在其他方向上更长。储库跨纵轴的横截面形状可以是任何形状。在一些方面，横截面形状可以是椭圆形、圆形、三叶形或任何其他形状。在一些方面，储库或支架在此类纵向方向上可以是直的或弯曲的。储库或支架的端面可以成形为平坦、圆形或卷曲的形状。
植入物储库或支架或离体血肿的尺寸可以取决于骨缺损的尺寸和所治疗的解剖部位。在一些方面，支架可以比缺损的实际尺寸长大约20％，使得它紧密配合并完全填充缺失骨的体积。例如，如果骨缺损的尺寸为3cm，并且它是成人股骨中段，则植入物储库或支架或离体血肿将可能需要构建成例如直径为约3-4cm并且长度为3.6cm的尺寸。在一些方面，植入物储库或支架或离体血肿可以类似于给定骨缺损的尺寸和形状。在一些方面，植入物储库或支架可以是趋化性的。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物并将所述组合物与本文所述的任何支架组合以启动或增强骨愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来重建节段性骨缺损的方法。本文还公开了使用本文所述的任何仿生支架和组合物来重建由肿瘤、创伤或感染引起的节段性骨缺损的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成仿生支架或仿生支架，所述仿生支架通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动正常骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗骨折风险(例如，在骨质疏松、糖尿病、老年人或吸烟者中)的方法。本文还公开了使用本文所述的任何仿生支架和组合物来治疗骨折风险的方法，所述方法使用蛇静脉酶通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动正常骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗非典型股骨骨折的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来经皮治疗非典型股骨骨折的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动正常骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗最小移位股骨颈骨折的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来经皮治疗最小移位股骨颈骨折的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动正常骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何仿生支架和组合物来治疗骨质疏松性功能不全骨折(骨盆、脊柱)的方法。本文还公开了使用本文所述的任何仿生支架和组合物来经皮治疗骨质疏松性功能不全骨折(骨盆、脊柱)的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动正常骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物联合支架(诸如脊柱融合器(陶瓷、PEEK或金属合金))来增强脊柱融合手术的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物联合支架(诸如脊柱融合器(陶瓷、PEEK或金属合金))来增强脊柱融合手术的方法，所述支架允许完全立即承重，提供更稳定的固定，并增强术后恢复，所述方法使用蛇静脉酶来诱导局部形成包埋于包括所述融合器(支架)的基底上的离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗长骨骨折的延迟愈合(经皮或开放性)的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗长骨骨折的延迟愈合(经皮或开放性)的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗已建立的长骨骨折不愈合(经皮或开放性)的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗已建立的长骨骨折不愈合(经皮或开放性)的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来改进(例如，加速)长骨骨折的愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来改进(例如，加速)所选候选者(诸如高水平运动员)的长骨骨折的愈合以促进更快速恢复的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来加速所选兽医学候选者(诸如纯种赛马)的长骨骨折的愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来加速所选兽医学候选者(诸如纯种赛马)的长骨骨折的愈合以促进更快速恢复的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来促进更快速和可预测的牙齿和上颌骨面部重建的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来促进更快速和可预测的牙齿和上颌骨面部重建的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨形成级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来逆转导致自发性下颌骨吸收的疾患的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物来逆转导致自发性下颌骨吸收的疾患的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿以使骨局部再生。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗和/或逆转导致自发性骨坏死的疾患的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来逆转导致自发性骨坏死的疾患的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成经皮或开放性递送的离体血肿(诸如金伯克氏病、股骨头无血管性坏死以及包括但不限于股骨髁在内的各种其他解剖位置的骨坏死)。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗和/或逆转导致自发性股骨头无血管性坏死(其中股骨头已塌陷)的疾患的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗和/或逆转导致自发性股骨头无血管性坏死(其中股骨头已塌陷)的疾患的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿在外科髋关节脱位后的开放手术中进行递送。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗由化学疗法、酗酒、吸烟或其他外源剂引起的骨坏死的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来治疗由化学疗法、酗酒、吸烟或其他外源剂引起的骨坏死的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成经皮或开放性递送的离体血肿。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来增强任何标准融合手术的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来增强任何标准融合手术(例如，髋、膝盖、踝、腕、肘、肩、距下关节，腕骨或足中部的任何有限融合，诸如拇趾、拇指或小指(脚趾或手指)的任何较小关节的融合)的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨形成级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来加速舟状骨腰部骨折的愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来加速舟状骨腰部骨折的愈合以促进更快速恢复的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来重建复杂骨骼缺损的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来重建颅骨的复杂骨骼缺损(无论是创伤、肿瘤或是感染所致)的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨形成级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来加速胸骨切开术的愈合的方法。本文还公开了使用本文所述的任何组合物和仿生支架来加速与心内直视手术相关的胸骨切开术的愈合以促进更快速恢复的方法，所述方法使用蛇静脉酶来形成离体血肿，所述离体血肿通过递送催化量的BMP或一种或多种骨替代物来启动骨折愈合级联，接着局部过度激活内源性生长因子。
本文还公开了在关节置换组件中使用本文所述的任何组合物和仿生支架的方法，所述关节置换组件具有用蛇静脉酶增强的经过特殊调整的骨向内生长表面，以诱导局部形成包埋于结构基底上的离体血肿，所述离体血肿更快速地启动骨愈合级联。
本文还公开了将本文所述的任何组合物和仿生支架与骨结合柄和组件一起使用的方法，所述骨结合柄和组件具有用蛇静脉酶增强的经过特殊调整的骨向内生长表面，以诱导局部形成包埋于结构基底上的离体血肿，所述离体血肿更快速地启动骨愈合级联。
在一些方面，所述一种或多种骨替代物不是BMP、rhBMP-2、BMP-2、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9或BMP-14
如本文所用，术语“仿生血肿”可用于指“离体血肿”。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来减少出血或管理出血的方法。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物在外科手术过程中管理广泛静脉出血/渗出的方法。在一些方面，在本文所公开的方法中，本文所述的任何组合物均可以配制成以水性气溶胶的形式进行局部喷洒(使用雾化器将蛇静脉酶分布至受影响的区域)。
本文还公开了在手术中或在紧急伤亡情况下使用本文所述的任何组合物来管理单个受伤血管(例如，大量出血点)的出血或止血的方法。在一些方面，在本文所公开的方法中，本文所述的任何组合物均可在珠粒(例如，磁性珠粒)上施用。在一些方面，在本文所公开的方法中，本文所述的任何组合物均可以夹具/蛤壳形式施加于血管末端，以同时局部地夹紧和递送蛇静脉酶，从而限制施加于特定的受伤血管末端。夹具或夹具元件可以收缩邻近的受伤血管，并且可以消除或最小化所述组合物的全身施用风险。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物作为选择性栓塞的方法。在一些方面，在本文所公开的方法中，本文所述的任何组合物均可经由介入放射科医生递送至一个或多个靶向血管，以使用长的射线照相导向导管来管理或停止盆腔内/腹内/食管/颅内出血，接着选择性地并且高度特异性地施用局限于所指示的离散病理学的蛇静脉酶(例如，类似于使用血管造影线圈进行的方法)。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来治疗月经过多的方法。在一些方面，本文所公开的方法可用于指导将本文所述的任何组合物安装或放置到受影响的女性的子宫中。在一些方面，蛇静脉酶可以配制成作为生物可降解的胶原蛋白珠粒的一部分来递送。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来治疗血友病相关的自发性关节血肿的方法。在一些方面，蛇静脉酶可以配制成作为生物可降解的胶原蛋白珠粒的一部分来递送。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来治疗与抗凝血剂过量(例如，华法林、香豆素等)相关的自发性关节血肿的方法。在一些方面，蛇静脉酶可以配制成作为生物可降解的胶原蛋白珠粒的一部分来递送。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来治疗与抗凝血剂过量(例如，华法林、香豆素等)相关的自发性肌内出血的方法。在一些方面，在本文所公开的方法中，本文所述的任何组合物均可用作选择性栓塞。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来治疗与血友病相关的自发性肌内出血的方法。在一些方面，在本文所公开的方法中，本文所述的任何组合物均可用作选择性栓塞。
本文还公开了在任何选择性全膝关节置换术中使用本文所述的任何组合物来治疗术后关节血肿的方法。在一些方面，蛇静脉酶可以配制成作为生物可降解的胶原蛋白珠粒或纳米颗粒的一部分来递送。在一些方面，所述生物可降解的胶原蛋白珠粒或纳米颗粒可以在伤口缝合之前即刻自由地递送或喷撒至关节中。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来治疗鼻出血的方法。在一些方面，蛇静脉酶可以配制成作为生物可降解的胶原蛋白珠粒的一部分来递送。在一些方面，所述生物可降解的胶原蛋白珠粒可以包埋于织物包装材料中或封闭在织物护套内以限制它们的分布并局部容纳它们。在一些方面，蛇静脉酶可以鼻包的形式进行递送，使得蛇静脉酶被配制成包埋于织物包装材料中或封闭在织物护套内的生物可降解的胶原蛋白珠粒的一部分。
本文还公开了使用本文所述的任何组合物来治疗视网膜出血的方法。在一些方面，在本文所公开的方法中，本文所述的任何组合物均可用作选择性栓塞。在一些方面，蛇静脉酶可以配制成作为生物可降解的胶原蛋白珠粒或纳米颗粒的一部分来递送。在一些方面，生物可降解的胶原蛋白珠粒或纳米颗粒制剂可用于通过创建自粘附几何形状来形成Velcro型效应，以最小化复发风险并积极解决视网膜脱离问题。
在一些方面，“出血(bleeding)”可以是出血(hemorrhage)。在一些方面，血液可能从一个或多个受损的血管中逸出循环系统。在一些方面，出血可以是内部的或外部的。
制品
本文所述的组合物和仿生支架可以包装于贴上标签的合适容器中，例如用作治疗骨缺损的疗法或本文所公开的任何方法。在一些方面，包含本文所述的离体血肿的组合物可以包装于贴上标签的合适容器中，例如用作治疗骨缺损的疗法或本文所公开的任何方法，并且可以与所述仿生支架的支架部分分开包装。因此，如本文所述的包装产品(例如支架、无菌容器，其含有包括本文所述的任何组合物或离体血肿的单独组分并且包装用于以浓缩或即用浓度存储、运输或销售)和试剂盒，至少包括分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙以及使用说明书，也在本公开的范围内。产品可包括含有本文所述的仿生支架或组合物或离体血肿的容器(例如，小瓶、罐、瓶、袋等)。另外，制品还可以包括例如包装材料、使用说明书、注射器、缓冲液或用于治疗或监测需要预防或治疗的疾患的其他控制试剂。产品还可以包括图例(例如，打印标签或插页或描述产品的用途的其他介质(例如，录音带或录像带)。图例可以与容器缔合(例如，贴附于容器)并且可以描述其中的仿生支架、组合物或离体血肿应以何种方式施用(例如，施用的频率和途径)、其适应症以及其他用途。所述仿生支架或组合物或离体血肿可以准备好施用(例如，以剂量适当的单位存在)，并且可以包括药学上可接受的佐剂、载体或其他稀释剂。或者，所述化合物可以浓缩形式与稀释剂一起提供，并附带稀释说明书。
实施例
实施例1：可吸收胶原蛋白支架与凝固的全血和rhBMP-2组合，成功地修复了大鼠的大骨缺损。
自体骨移植的最有前途的替代方案之一是使用可吸收胶原蛋白海绵(ACS)上递送的重组人骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)。然而，成功的骨愈合需要超生理剂量的rhBMP-2，因为它在体内突释并且半衰期很短，一旦胶原蛋白海绵在插入骨缺损区域后被压缩，大部分rhBMP-2就会迅速渗出。这导致增加异位/异位骨化的发生率和严重程度以及许多其他相关副作用，诸如抗体形成、植入物移位、骨吸收和甚至癌症。显然需要一种更合适的载体来治疗这些复杂的骨损伤，并通过显著减少所需剂量来提高BMP的有效性，从而减轻其潜在的危险副作用。
在骨折部位形成的血肿充当内源性支架，它激活一连串的生物事件，所述生物事件并入源自周围组织的分子因子。研究表明，在骨折部位形成的血肿显著影响骨折的愈合方式，并且去除这种血肿会延迟骨折愈合。为了增加ACS的有效性，将它与模拟内源性骨折血肿的固有结构和生物特性的离体血肿组合。与在大鼠股骨5mm大临界尺寸缺损模型中单独使用ACS和BMP-2相比，测试了通过将全血、凝血剂和低剂量的rhBMP-2的混合物与ACS组合而产生的离体血肿是否会显著增强骨的再生能力并减少所需的rhBMP-2剂量。
材料和方法。制备ACS/全血仿生支架。在安乐死时通过终末期出血从麻醉的雄性供体Fisher 344大鼠抽取血液。使用21号针通过心脏穿刺收集血液。将9份血液与1份3.2％柠檬酸三钠溶液混合以防止凝固。为了制作圆柱形仿生支架，将0.55μg rhBMP-2、10mM氯化钙和5U/mL的凝血酶(离体血肿)移液至96孔板的平底孔底部，接着添加柠檬酸盐血。通过上下移液混合溶液，并快速转移至另一个含有圆柱形干燥ACS的孔中。将仿生支架在室温下孵育15分钟，接着植入大鼠的5mm股骨缺损中。无全血ACS用作对照组。
结果。用ACS/WB/BMP2治疗的骨缺损在手术后4周完全弥合。在8周时，骨缺损完全愈合，其中皮质骨几乎完全恢复至其原来形状，并剩余少量髓内骨小梁，表明愈合和重塑已进入后期。相比之下，用ACS/BMP2治疗的骨缺损未能在8周内愈合，始终导致不愈合(图1)。
结论。数据显示，通过将特定浓度的全血和凝血剂的混合物(模拟自然骨折血肿、离体血肿)添加至ACS中，所述仿生支架能够以比单独ACS高得多的效率递送rhBMP-2。此外，这种愈合是使用显著较低剂量的rhBMP-2实现的，而在ACS上递送的相同剂量甚至无法启动骨缺损的愈合。优异的愈合可能是由于仿生支架(biometic scaffold)更紧密地类似于先天骨折血肿，而先天骨折血肿是重要生长因子(诸如VEGF、FGF、TGF)的内源性储库，并且因此比单独ACS更有效地结合rhBMP-2。此外，将离体血肿添加至ACS中的附加益处是，递送的rhBMP-2被安全地容纳于支架内，这可以防止任何异位/异位骨化或其他有害的副作用。使用这种仿生支架能够以显著降低的剂量递送rhBMP-2，而不会影响愈合结果。
实施例2：离体血肿与各种骨替代物的组合。
离体血肿可以与目前市场上可获得的任何源自生物制品的骨替代物混合，诸如DBX、DBM、珊瑚、同种异体松质骨碎片或骨髓抽吸浓缩物(BMAC)，包括使用扩髓冲洗抽吸器(RIA)从长骨收获的骨移植物。此外，离体血肿可以与合成骨替代物混合，诸如硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙(TCP)陶瓷、双相磷酸钙(羟基磷灰石(HA)和β-TCP陶瓷)、生物活性玻璃、基于聚合物的骨替代物。
脱矿骨基质(DBM)是一种松质骨和皮质骨替代物，它可以干燥的、可模制的或可注射的形式获得，并且可以糊剂、粉末、油灰、颗粒、凝胶、海绵或条带形式存在。DBM由同种异体骨通过脱钙制备而成，并且为细胞和基质蛋白粘附提供了框架，并且它还含有诱导新骨生长的成骨物质。DBM的成骨组分是生长因子的混合物，包括来自转化生长因子-β家族(TGF-B)的多种生长因子，诸如BMP-2。DBM几乎不提供生物力学强度，但充当骨传导性材料，并且在较小程度上充当骨诱导性材料。在骨科中，DBM是用作自体骨移植延长剂，虽然它们在可获得有限的自体移植物的情况下用作添加剂(延长剂)是很好的，但作为独立的产品，它们无法启动骨形成。由于加工、供体选择、最终灭菌和添加剂(诸如透明质酸盐、普朗尼克酸、甘油或明胶)，产生的产品具有可变的生物活性，从而导致生物骨诱导性和临床表现难以预测，这在大骨缺损中尤为明显。这同样适用于目前市场上可获得的许多其他骨替代物。
相比之下，离体血肿的开发是为了模拟愈合骨折血肿，并且成功地并有效地将生长因子(诸如rhBMP-2)递送至本身不能自发愈合的大节段骨缺损处。主要概念是使用自体血液与特定浓度的凝血剂的组合，以便模拟内源性骨折血肿，因为在损伤时形成的血肿是身体含有特定的微架构特性，从而激活生物事件的级联，进而启动骨愈合。这种血凝块(血肿)通常含有启动骨愈合级联所需的组分，包括血细胞，诸如红细胞、白细胞和血小板。事实上，血小板通过释放和激活重要的血管生成和成骨生长因子在骨愈合中发挥重要作用。使用离体血肿作为递送媒剂的实验结果在这一模型中使用愈合所必需的BMP-2剂量的一部分成功地治愈了大鼠的临界尺寸缺损。相比之下，可吸收胶原蛋白海绵完全无法使用此类小剂量启动愈合过程。此外，骨质量显著优于在可吸收胶原蛋白海绵上递送BMP-2时。在这些结果的基础上，对离体血肿与一种或多种骨替代物(诸如DBM)的组合进行了测试，以观察这种组合是否会增强血肿的功效，从而在骨缺损再生和愈合方面更有效并且更稳健。例如，图2展示了一种脱矿骨基质产品(DBX)的架构，它清楚地表明固体材料不具有对于细胞募集和渗透很重要的孔隙率。然而，一旦DBM与离体血肿混合，所得支架就会具有模拟内源性愈合骨折血肿的微架构。此外，作为组合产品，离体血肿包含促进骨折愈合的重要成分。此外，添加DBM会增加骨缺损部位可获得的生长因子的量，从而有效地并且稳健地启动骨再生。因此，包含DBM的结构良好组织的离体血肿也可充当用于生长因子的持续释放的临时储库，并且它可提供促进细胞浸润、增殖和从周围组织分化的合适环境。
实施例3：离体血肿与支架的组合。
患者专用的3D打印钛融合器已用于治疗大块节段性骨丢失和脊柱融合(图3和图4)。这些钛融合器用于解决长度超过6cm的节段性骨缺损以及脊柱病变。这些金属植入物或支架不具有骨诱导性，因此无法启动骨再生并且并入这些钛支架的孔隙内。为了启动骨骼愈合和再生，整形外科医生目前通过添加自体骨移植物、骨替代物和生长因子来增强其再生潜力；然而，这些产品均无法启动可靠、一致并稳健的骨再生，尤其是长骨。此外，不幸的是，这些特定选项也有许多缺点。例如，自体骨移植物通常不容易以所需的体积获得，并且存在潜在的供体部位发病率问题。此外，这些移植物对用户并不友好，因为它们必须由外科医生手动压入融合器/支架的空隙/孔隙中(图4)，这耗费时间，并且几乎不可能实现移植物在钛融合器/支架内的均匀并入，例如在融合器的中心。生长因子还必须以高浓度递送，这已显示出与许多有害的副作用(诸如异位骨形成)有关。此外，均匀并入融合器/支架内并不是一个简单的过程，通常需要生长因子与骨替代物组合使用。当然，骨替代物本身也存在与自体骨移植物和生长因子非常相似的各种缺点，主要问题是不可预测的生物骨诱导性和临床表现，以及必须手动压入融合器/支架的空隙/孔隙中。
为了克服这个问题，离体血肿无论是与生长因子或是骨替代物(诸如DBM)组合，均促进更均匀地并入钛融合器/支架内，因为离体血肿以液体形式开始(图3)并且完全渗透，同时还增强骨骼再生的一致性。这种治疗策略得以成功实施，因为骨替代物是在离体血肿自身内递送的，这模拟了内源性愈合骨折血肿的微架构特性。这导致有效地并且稳健地启动骨再生所需的生长因子的量增加。此外，结构良好组织的支架(例如，离体血肿)也将充当用于生长因子的持续释放的临时储库，并且它提供了促进细胞浸润、增殖和从周围组织分化的非常有利的环境。
实施例4：经皮递送离体血肿以治疗延迟愈合、不愈合和骨缺损。
可以经皮递送离体血肿与骨替代物(例如，DBM、骨碎片)和/或生长因子(例如，BMP-2、PDGF)的混合物，以增强延迟骨愈合、不愈合和骨缺损的愈合。
所述方法如下：与关节镜或内窥镜手术类似，外科医生插入窄管(塑料或金属)作为插管，以便通过小切口(大致为扣眼尺寸)引入光纤摄像机。延迟/不愈合或骨缺损内部的视图可以传输到高清晰度视频监视器。制作另一个小切口以引入第二个小管(插管)，通过所述小管插入旋转刀片，当所述旋转刀片进入不愈合部位中时，它会像雨伞一样逐渐展开，并且可以通过荧光透视法监测这一位置。从不愈合的中心扩展约5-10mm，以允许有限的清创术以清除不愈合部位内的纤维化组织，并为注射包括支架的离体血肿准备空间。这一步骤会产生空隙来递送生物制剂以及去除致密的无血管纤维化组织，已知所述组织会干扰成功的骨愈合。可以形成任选的第三个小切口以插入另一个插管/管，从而去除和冲洗由纤维化不愈合组织的清创所产生的碎片。一旦不愈合部位准备好用于递送离体血肿，就可以使用例如具有两个室的注射器(图5)。通过用于去除不愈合纤维化组织的同一个管，可以插入一根长针，连接到两室注射器上。一个室将含有凝血剂(钙和凝血酶，或蛇静脉酶)，并且第二个室将含有单独或与外源性生长因子(例如，BMP2、PDGF、VEGF)和/或骨替代物(例如，DBM、同种异体松质骨碎片)组合的全血。在应用过程中，当它进入针中混合后，这些组合的相互作用形成离体血肿以启动骨愈合过程。将离体血肿递送至不愈合部位后，去除插管，并用缝线缝合切口。这种手术可以减少患者的疼痛，限制感染和其他并发症的风险，最小化手术时间，并减少患者康复和恢复正常活动所需的时间。
实施例5：血肿的结构和生物特性。
一种愈合大节段骨缺损的方法。众所周知，在骨折部位形成的血肿回显著影响骨折愈合的方式。例如，研究表明，血肿的去除会延迟骨折愈合(Schell H,Peters A,DudaGN.Removal of fracture hematoma and replacement with fresh hematoma delaysbone healing in sheep.Bone.2012)。此外，有报道表明，形成的纤维蛋白凝块的结构特性(诸如纤维蛋白纤维的孔隙率和厚度)会影响骨修复(Wang X,Friis TE,Masci PP,Crawford RW,Liao W,Xiao Y.Alteration of blood clot structures by interleukin-1beta in association with bone defects healing.Sci Rep.Nature PublishingGroup；2016；6:35645；和Wang X,Friis T,Glatt V,Crawford R,Xiao Y.J Tissue EngRegen Med.2017；11:2864-2875。)本文所述的结果表明，如与5mm节段性骨缺损(不干预就无法愈合；320±64nm)相比，从0.5mm大鼠股骨缺损(正常愈合的骨折)中分离出的体内血肿的纤维蛋白纤维(209±20nm)在手术后3天变细了35％。此外，与0.5mm相比，在5mm缺损中还观察到多孔网络较少(42.56％对50.03％)，导致两组之间存在16％差异。为了调查在大骨缺损(5mm)和正常愈合的骨折(0.5mm)中形成的血肿之间是否存在生物特性差异，使用RNA测序分析来进行体内研究。
在介导炎症反应的基因(例如Il1b-由激活的巨噬细胞产生；Sdf1-在炎症性骨破坏区域中表达，其中它介导对破骨细胞生成的抑制作用)中发现了主要差异，所述基因主要在5mm对0.5mm缺损中上调。对细胞外基质(ECM)结构成分(例如Col1a1、Col2a1、Col3a1)以及ECM蛋白酶(例如Mmp2)和它们的抑制剂(例如Timp1)重要的基因大多数下调。相反，调节细胞粘附分子(例如Thbs1)的基因则上调。对参与血管生成过程的基因进行的分析发现，新血管形成的有效刺激物血管生成素(Ang)下调，而血管生成细胞因子内皮素(Edn1)则上调，后者是一种有效的血管收缩剂，也会刺激成骨细胞谱系的细胞。与成骨相关的基因的表达表明，有很大一部分下调的基因参与成骨细胞分化(例如Bglap，也称为骨钙素-由成骨细胞分泌以启动骨修复)和骨形成(例如Bmp7-在间充质细胞转化为骨和软骨中发挥关键作用)。
这些结果首次证明了在骨愈合的最早阶段，正常愈合的骨折与大骨缺损之间基因表达的重要差异。最显著的差异出现在参与炎症反应的一组基因中，炎症反应是骨折后的关键事件。炎症基因在5mm对0.5mm缺损中的上调表明，与正常骨折相比，大骨缺损会诱导更强的炎症反应，这导致巨噬细胞、成纤维细胞、MSC和骨祖细胞的募集增加。侵入的炎症细胞还会产生促血管生成细胞因子，这解释了在比较5mm对0.5mm缺损时观察到的上调。同时，许多对骨骼发育、骨矿物质代谢和ECM形成很重要的基因的下调表明，在大骨缺损中存在减少的成骨反应。
还进行了一项体外研究，以确定是否可以使用SVCE、蛇静脉酶来产生具有特定结构特性的离体血凝块，并确定蛇静脉酶是否对干细胞有毒。结果令人信服地表明，血凝块的结构特性随蛇静脉酶的浓度而变化。例如，较高浓度的蛇静脉酶会导致较细的纤维蛋白纤维，平均厚度为93±3nm，而在最低浓度下，纤维蛋白纤维的厚度为173±9nm。随着蛇静脉酶的浓度增加，1至7天的细胞增殖率降低。例如，在最高浓度下增加了4.3±0.7倍，而在最低浓度下增加了13.7±3.1倍，相比之下，在没有蛇静脉酶的情况下增加了14.8±2.6倍。在离体血肿内培养的细胞在7天时期内具有稳定的细胞数目。因此，这些结果表明，蛇静脉酶不会引起毒性，然而，较高的浓度可能导致细胞增殖率较低。
基于这些观察结果，将进行额外的实验来确定在正常骨折(它们会愈合)中形成的血肿的结构和生物特性，并将它们与大骨缺损(不干预就无法愈合)进行比较(参见下文实施例)。例如，将研究良好组织的纤维蛋白凝块通过充当用于生长因子的持续释放的临时储库以及通过提供足够的空间来协助细胞浸润、增殖和分化而增强骨愈合的能力。因此，增强修复过程的主要机会在于模拟愈合骨折血肿的内在特性的血凝块的产生。使用SVCE可以改变离体产生的血肿的结构特性，从而模拟内在的骨折血肿，当植入节段性骨缺损中时，所述骨折血肿将增强和加速骨愈合。各种蛇毒已经成功用于患有心脏病、癌症和中风的患者，以及用于疾病(诸如狼疮)的诊断用途。因此，与添加牛凝血酶相比，这些实验也将首次检验蛇毒酶蛇静脉酶作为替代凝血剂的用途，而牛凝血酶已显示出在临床上使用时具有副作用(Diesen DL,Lawson JH.Vascular.2008；16:S29-36；Ofosu FA,Crean S,ReynoldsMW.Clin Ther.2009；31:679-691；和Sands JJ,Nudo SA,Ashford RG,Moore KD,OrtelTL.Am J Kidney Dis.2000；35:796-801)。这种方法将作为一种改进的治疗策略进行探索，因为它是一种生物支架，可以通过完全消除对诸如BMP的生长因子的需求，或显著最小化增强骨修复过程所需的剂量来更可靠地增强骨愈合。结果是比目前可获得的治疗策略更先天的治疗策略；它将显著节省成本，并且最重要的是，消除与高剂量的BMP相关的许多不良副作用。此外，本文所述的结果可能对普通公众以及服务人员的骨损伤治疗具有重要意义。
实施例6：体内骨折血肿的结构和生物特性。
在雄性SAS Fischer大鼠组(10-12周龄，n＝38；n＝5-8/组)中产生骨缺损，并用外部固定器(RISystem AG；Glatt V,Evans CH,Matthys R.Eur Cell Mater.2012；23:289-98；discussion 299；和Glatt V,Miller M,Ivkovic A,Liu F,Parry N,Griffin D等人JBone Joint Surg Am.2012年11月21日；94(22):2063-73)稳定以表征和比较正常骨愈合(0.5mm)和大节段骨缺损(5mm)过程中形成的血肿的结构和生物特性。为了评估骨折愈合的过程，进行0.5mm截骨术，这也可能用相同的外部固定装置进行。使用截骨术的原因是它们是可重复的，并允许更一致的血肿形成尺寸，这对于表征血肿结构特性很重要。手术后3天处死动物，以评估血凝块成熟后骨折血肿的结构特性。使用扫描电子显微镜(SEM；n＝8/组)和ImageJ软件来评估血肿的结构特性，诸如纤维蛋白纤维的厚度、密度和孔隙率。此外，使用一组不同的样品，使用RNA测序来分析参与骨修复过程的启动的差异表达基因(n＝6/组)。还将进行组织学和免疫组织化学(IHC)(n＝5/组)以表征组织并确认参与修复过程的启动的关键蛋白的存在，诸如巨噬细胞(CD68、CD40和CD206)osterix、PECAM1、vWF、VEGF、I型胶原蛋白和H&E，以获得整体组织形态。结果用于确定3天龄血肿的结构特性与特定基因和蛋白质的表达之间是否存在相关性。
方法。大鼠、大临界尺寸缺损和截骨模型。通过用小型动物蒸发器施用异氟烷(2％；2l/min)来麻醉大约重200-250g(10-12周龄)的雄性SAS Fischer大鼠(CharlesRiver Laboratories,Inc.,Wilmington,MA,USA)。接着，所述动物的左大腿接受20mg/kg的头孢唑林(抗生素)和0.08mg/kg的丁丙诺啡(镇痛剂)的肌肉内注射。可以找到手术过程的详细信息(Glatt V,Matthys R.Adjustable stiffness,external fixator for the ratfemur osteotomy and segmental bone defect models.J Vis Exp.2014)。简而言之，将每只动物的右后腿剃毛，用氯己定消毒，放置在无菌区中并用无菌手术单覆盖，仅暴露右腿。在右股骨表面从大转子到膝盖髁上区的前外侧皮肤上切出大约3.5-4cm的切口。股四头肌与腘绳肌之间的轻柔解剖暴露出股骨轴。首先将外部固定器杆夹在季格利氏线锯导子上，并且接着放置在股骨的前外侧面上，以引导钻头，并允许使用笔式钻头(RISystem AG,Davos Platz,CH)对四个钻孔进行可重复定位。从近端侧开始，将安装销一次一个地插入预钻孔中。在固定器就位后，使用锯导子制作缺损。为此，将季格利氏线锯穿过股骨下方的两个凹槽，通过来回往复运动形成5mm节段性缺损，并使用单线锯形成0.5mm缺损。当缺损形成后，取出锯导子，并分层缝合伤口。手术后每12小时对大鼠给予镇痛药并且每24小时给予抗生素，持续3天。第3天采集血肿进行结构和生物学分析。
扫描电子显微镜。对体内骨折血肿和离体血凝块进行类似处理。将样品在4％多聚甲醛中固定过夜。使用Hitachi SU1510 VP-SEM在100-1,000x放大率下捕获大体形态。为了分析纤维直径和密度，将样品后固定在4％四氧化锇中，并通过乙醇溶液梯度(25-100％)脱水。接着使用Leica EM临界点干燥器干燥血肿和血凝块的切片，安装在硅芯片样本支架上，并溅射镀金-钯，接着进行10,000x成像(Hitachi S5500 SEM/STEM)，以高分辨率显示结构特性。使用ImageJ分析图像。
RNA测序。RNA的平行测序(RNA-Seq)是一种高通量方法，所述方法允许对基因转录本丰度进行全局测量(Wang Z,Gerstein M,Snyder M.RNA-Seq:A revolutionary toolfor transcriptomics.2009.第57-63页)。为了确定骨折血肿中基因的差异表达，将样品收集至微量离心管中，立即在液氮中速冻并存储在-80℃下。使用QIAGEN RNeasy PlusUniversal Tissue Mini(QIAGEN,Inc.,Germantown,MD,USA)根据制造商的方案进行RNA提取。使用纳米液滴分光光度计(ND-1000,Thermo Fisher Scientific,Inc.)测定RNA的浓度和质量，并使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)根据制造商的方案评估RNA完整性。取出的骨圆柱体形成5mm骨缺损，用作对照，代表健康骨的基因表达状态。全局转录组分析用于鉴定在骨修复的启动过程中具有主要影响的上调和/或下调基因。这项工作是使用llumina HiSeq 3000进行的。
组织学和免疫组织化学。样品将用苏木精和伊红染色，以观察大体组织形态。标准免疫组织化学方案将应用于石蜡包埋切片(5μm)。所述切片将用一组抗体标记，以确定蛋白质的空间表达，诸如巨噬细胞(CD68和CD206)、osterix、PECAM1、II型胶原蛋白、X型胶原蛋白(Maes C,Kobayashi T,Selig MK,Torrekens S,Roth SI,Mackem S等人Osteoblastprecursors,but not mature osteoblasts,move into developing and fracturedbones along with invading blood vessels.Dev Cell.Elsevier Ltd；2010；19:329-344)。
为了进行这些实验，使用5和0.5mm股骨骨缺损模型，并用所述的外部固定装置进行稳定。这是一种成熟研究模型。使用的主要结果指标是扫描电子显微镜、RNA测序和组织学/免疫组织化学，这些是常规程序。如本文所公开，使用SEM和RNA测序分析的数据显示，与5mm缺损相比，在0.5mm缺损中形成的血肿之间在结构和生物特性方面存在可辨别的差异。
扫描电子显微镜图像描绘了骨折血肿的结构特性。例如，可以观察到正常愈合的骨折(0.5mm)与大骨缺损(5mm)之间明显的结构差异。更具体地说，正常骨折(0.5mm)显示出较多孔隙、不太致密和较细的纤维蛋白纤维以及较粗糙的表面，而大骨缺损(5mm)则显示出较少孔隙、较致密和较粗的纤维蛋白纤维以及光滑表面。
实施例7：使用蛇毒凝固酶离体形成的血凝块/血肿的结构特性。
使用SVCE(蛇静脉酶)来改变血凝块的结构特性，以模拟使用不同浓度的蛇静脉酶在0.5mm截骨模型中形成的自然血肿的特性。在安乐死时使用21号针通过心脏穿刺从实施例4中使用的相同动物收集全血。每只动物的预期血液产量大约为5-10mL。将血液以1份4％柠檬酸钠溶液:9份血液进行混合以防止凝固。从锯鳞蝰蛇毒液中纯化的酶蛇静脉酶购自Sigma(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO,USA)。诸如pH、离子强度和钙的变量保持恒定，而所应用的促血栓形成酶的最终浓度范围从皮摩尔到纳摩尔。使用氯化钙(CaCl2)和CaCl2+重组人凝血酶作为对照。离体血凝块意图具有圆柱体形状，其高度为5mm以跨越缺损尺寸，并且直径为4mm，与大鼠股骨的平均直径一致。使用高度为0.5mm的血凝块作为对照，以确定添加至较小体积的血液中的相同浓度的SVCE是否在形成的血凝块中产生相同的结构特性。使用SEM来评估结构变化，特别是纤维蛋白纤维的厚度和密度以及整体凝块结构。使用本文所述的方法，可以观察到具有不同结构特性的大鼠中的血凝块。
离体血凝块的制备。为了形成离体血凝块，在安乐死时通过心脏穿刺从麻醉的大鼠中收集5-10mL全血。收集后立即将血液与4％柠檬酸钠溶液以9:1混合以防止凝固。使用一系列不同浓度的蛇静脉酶来诱导血液凝固。将样品在室温下放置2小时以使其完全凝固。随后，将离体血凝块在4℃下在4％PFA中固定过夜，接着进行扫描电子显微镜处理。
扫描电子显微镜。体内骨折血肿和离体血凝块基本上以相同方式进行处理。将样品在4％多聚甲醛中固定过夜。使用Hitachi SU1510 VP-SEM在100-1,000x放大率下捕获大体形态。为了分析纤维直径和密度，将样品后固定在4％四氧化锇中，并通过乙醇溶液梯度(25-100％)脱水。接着使用Leica EM临界点干燥器干燥血肿和血凝块的切片，安装在硅芯片样本支架上，并溅射镀金-钯，接着进行10,000x成像(Hitachi S5500 SEM/STEM)，以高分辨率显示结构特性。使用ImageJ分析图像。如本文所公开，使用SVCE(不同浓度的蛇静脉酶)来改变血凝块(离体血肿)的结构特性，使用全血或富血小板血浆(PRP)来模拟在0.5mm截骨模型中形成的血肿的特性。蛇静脉酶(0.1和0.5U/mL)或CaCl2(10mM)用作凝血剂。本文所公开的结果证明，可以使用全血或PRP，通过不同浓度的蛇静脉酶来形成具有所需结构特性的离体血肿。
扫描电子显微镜图像示出了离体蛇毒诱导的离体血肿的结构特性。这些结果示出，可以使用蛇毒酶或氯化钙来操纵血凝块的形态，这会影响纤维蛋白纤维的厚度和密度，并且与用PRP形成的离体血肿相比，来自用全血形成的那些的离体血肿的结构特性是不同的。
实施例8：确定这种离体血肿是否为间充质干细胞(MSC)提供了可行的环境。
将进行这些实验来确定MSC在存在蛇静脉酶的情况下以及在接种至蛇静脉酶诱导的血凝块中时存活的能力，以评估这些支架的生物相容性。将在2D和3D测定中测量不同浓度的蛇静脉酶的细胞活力和潜在细胞毒性。将在不同浓度的蛇静脉酶存在下培养大鼠骨MSC，以确定细胞活力。将在第1天、第7天、第14天和第21天测量细胞增殖(例如，CyQUANTTM细胞增殖测定试剂盒)和细胞毒性(例如，VybrantTM细胞毒性测定试剂盒)。随后，考虑到细胞存活以及特定结构特性的确定，将蛇静脉酶以先前实验中确定的浓度添加至柠檬酸盐血的混合物中。凝固后，血凝块将被转移至含有生长培养基的24孔板中。
为了测试蛇静脉酶诱导的血凝块的生物相容性，将在第1天、第7天、第14天和第21天(n＝3/组)从培养物中取出样品，以研究接种的细胞的存活率和分化潜力，以及它们形成细胞外基质的能力。此外，还将确定血凝块中最大化骨组织的再生能力所需的细胞数目。将使用细胞活力测定和共聚焦成像来评估血凝块内的细胞活力。
为了测试细胞的分化能力，将在成脂、软骨形成和成骨分化培养基中培养细胞。qRT-PCR将用于确定基因在所选时间点的差异表达。一旦细胞活力确定，将在0.5mm缺损/截骨骨愈合过程中最类似于自然血肿的结构和生物特性的血肿植入体内大鼠5mm股骨缺损模型中，以研究它们愈合大节段骨缺损的能力。基于图5A、B中的结果，预计使用较低浓度的凝固酶(<0.5U/mL)蛇静脉酶将不会对细胞产生毒性。
细胞培养。将根据标准方案培养大鼠骨髓干细胞。每3-4天将更换一次培养基。
2D细胞活力测定。PrestoBlueTM细胞活力试剂(Thermo Fisher Scientific,Inc.,Waltham,MA,USA)将直接添加至在孔板中生长1天、3天和7天的大鼠骨髓干细胞的培养基中。在37℃下孵育20min后，将根据制造商的说明书在多板读数器中读取荧光。
2D细胞毒性测定。将在96孔板中培养大鼠骨髓干细胞。在第1天、第3天和第7天，将收集上清液并根据制造商的说明书(Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒，Thermo FisherScientific AG,Reinach BL,Switzerland)用于测定乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性。使用微板读数器，将在490nm处测量吸光度，并在680nm处减去背景。
3D离体血凝块的活/死染色和共聚焦显微镜。将在3D血凝块内培养大鼠骨髓干细胞。在第1天、第3天和第7天，将从培养基中取出血凝块并矢状切割成两半，接着浸入24孔板中的含有10μM钙黄绿素AM储备液和1μM乙锭同源二聚体-1(Thermo Fisher Scientific,Inc.)的无血清培养基中。在4℃下孵育3小时并在5％CO2和100％湿度下孵育1小时后，将使用共聚焦显微镜对样品进行成像，深度高达200μm(Gantenbein-Ritter B,Sprecher CM,Chan S,Illien-Jünger S,Grad S.Confocal imaging protocols for live/deadstaining in three-dimensional carriers.Methods Mol Biol.2011；740:127-40)。
3D细胞分化测定。将在成脂、软骨形成或成骨培养基(分化试剂盒，Thermo Fisher Scientific,Inc.)中根据制造商的方案培养细胞接种的血凝块。将使用qRT-PCR和定制的/>PCR阵列板(Thermo Fisher Scientific,Inc.)来评估细胞分化。
实时定量PCR(qRT-PCR)。离体血凝块将被收集至微量离心管中，立即在液氮中速冻并存储在-80℃下。将使用QIAGEN RNeasy Plus Universal Tissue Mini(QIAGEN,Inc.,Germantown,MD,USA)根据制造商的方案进行RNA提取。将用纳米液滴分光光度计(ND-1000,Thermo Fisher Scientific,Inc.)测定RNA的浓度和质量，并将使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies,Inc.,Santa Clara,CA,USA)根据制造商的方案评估RNA完整性。将使用TaqManTM高容量RNA-cDNA试剂盒(Thermo Fisher Scientific,Inc.)将1μg提取的RNA逆转录成cDNA，接着将使用定制的PCR阵列板(Thermo FisherScientific,Inc.)来分析炎症、血管生成和成骨相关基因的表达。
如本文所公开，将进一步研究骨髓MSC在存在蛇静脉酶的情况下以及当接种于蛇静脉酶诱导的血凝块内时存活的能力，以评估这些支架的生物相容性。使用不同浓度的源自蛇毒的凝固酶对于添加至离体血凝块中的MSC没有毒性。所述酶蛇静脉酶是高度纯化的。因此，可以预期，一旦将离体血肿植入体内，蛇静脉酶将不会对迁移细胞产生毒性。此外，在大鼠模型中进行体内实验，所述实验表明，2种不同浓度(0.3和0.6U/ml)的蛇静脉酶不会引起毒性。然而，如果由于对人类受试者产生具有特定结构和生物特性的血凝块需要更高的浓度，因此证明蛇静脉酶对细胞有毒，则本文所述的氯化钙或其他凝血因子将被视为凝血剂。如本文所提到，凝血酶先前已经用于激活富血小板血浆中的凝血级联；然而，这种产品在骨修复方面表现不佳(Diesen DL,Lawson JH.Vascular.2008；和Sands JJ,Nudo SA,Ashford RG,Moore KD,Ortel TL.Am J Kidney Dis.2000；35:796-801)。这可能与以下事实有关：向PRP中添加的凝血酶纯粹用作激活剂，而未考虑凝块的结构特性。在一些方面，可以添加小剂量的生长因子，诸如VEGF、PDGF、hFGF-2或BMP-2(其他BMP)。
扫描电子显微镜图像描绘了离体蛇毒诱导的离体血肿的结构特性。这些结果示出，细胞活力并未受到蛇毒酶存在的显著影响，表明生物相容性。
实施例9：研究在大鼠股骨5mm大临界尺寸缺损模型中，将离体产生的离体血肿插入大骨缺损中是否可以增强骨的再生过程。
在雄性SAS Fischer大鼠组(10-12周龄，n＝8-16；初步研究n＝4；离体血肿，BMP-2，PRP)中产生5mm股骨缺损，并用如本文所述的外部固定器稳定。将离体血肿植入骨折间隙中以确定它增强大节段骨缺损的愈合的能力。使用两个对照组与实验组比较骨愈合过程。使用可吸收胶原蛋白海绵上递送的重组人BMP-2增强了第一对照组的愈合，目前临床上使用的也是这种产品(Medtronic plc.,Minneapolis,MN,USA)。这是一种使用BMP-2的成熟研究模型，据报道在8周内愈合(Glatt V,Bartnikowski N,Quirk N,Schuetz M,Evans C.Reverse Dynamization:Influence of Fixator Stiffness on the Mode andEfficiency of Large-Bone-Defect Healing at Different Doses of rhBMP-2.J BoneJoint Surg Am.2016；98:677-87；Yasko AW,Lane JM,Fellinger EJ,Rosen V,Wozney JM,Wang EA.The healing of segmental bone defects,induced by recombinant humanbone morphogenetic protein(rhBMP-2).A radiographic,histological,andbiomechanical study in rats.J Bone Joint Surg Am.The American OrthopedicAssociation；1992；74:659-70；和Gantenbein-Ritter B,Sprecher CM,Chan S,Illien-Jünger S,Grad S.Confocal imaging protocols for live/dead staining in three-dimensional carriers.Methods Mol Biol.2011；740:127-40)，并且因此，使用的动物数目减少(n＝4)。在第二对照组中，使用PRP来确定离体血肿是否比富含高浓度的血小板的纤维蛋白凝块具有更好的愈合结果。在实验组中，使用离体血肿来确定所形成的支架是否具有再生骨缺损的能力。离体血肿的优点如下：(1)骨诱导性-重要的生长因子将持续很长一段时间来刺激新骨形成；和(2)骨传导性-良好组织的纤维蛋白结构将创造有利于MSC迁移和早期矿化的微环境。预计这一概念验证系列实验的成功完成将导致开发出离体血肿，所述离体血肿可以充当自然生长因子储库，以及生物相容性自体支架，这将改进大节段骨缺损的愈合而无需添加生长因子，诸如rhBMP-2。为了评估这一点，通过每周X射线监测动物，并在8周时对其实施安乐死。安乐死后，收获愈合的缺损，通过微型计算机断层摄影(μCT；所有样品)进行评估，并将用于组织学/IHC(n＝4/组；对于BMP-2组，n＝2)和生物力学测试(n＝12/组；对于BMP-2组，n＝6)。
手术。如本文所述进行大鼠手术。
准备用于植入的离体血肿。为了形成离体血凝块，在安乐死时通过心脏穿刺从麻醉的大鼠中收集5-10mL全血。收集后立即将血液与4％柠檬酸钠溶液以9:1混合以防止凝固。以先前确定的0.3和0.6U/ml的浓度使用蛇静脉酶，与0.55μg rhBMP-2组合诱导血液凝固。使样品在22℃(室温)下凝固45min至1h，接着植入5mm大鼠骨缺损中。
富血小板血浆(PRP)制备和BMP-2。为了从大鼠血液中制备PRP，在安乐死时通过心脏穿刺从麻醉的大鼠中收集5-10mL全血。收集后立即将血液与4％柠檬酸钠溶液以9:1混合以防止凝固。将全血在室温下以150x g离心10min，用软制动器使血小板层与血浆和红细胞分离。丢弃下部红细胞层，同时收集中间血小板层和上部血浆层。使用细胞计数室测定全血和PRP中的血小板数目，以检查PRP的质量。添加氯化钙来形成PRP凝胶，将所述凝胶植入缺损间隙中。将重组人BMP-2(5.5μg)以骨缺损的形状施加于可吸收胶原蛋白海绵载体(InfuseTMBone Graft,Medtronic,Minneapolis,MN,USA)上，用作植入物。
骨愈合评估。将通过每周X射线和安乐死后的μCT对每组16只动物的股骨进行体内评估。12个样品将进行生物力学测试并且4个样品将用于组织学。对于初步研究，每组使用4只动物。
X射线。通过每周射线照相监测骨愈合。在如手术过程中所述的全身麻醉下，将大鼠放置于腹侧位置，并且后肢横向旋转，以获得与缺损正交的可重复并且标准的图像。
微型计算机断层摄影(μCT)。将使用配备有10mm焦点微焦点X射线管的台式显微断层成像系统(Bruker Skyscan 1172,Belgium)对股骨进行扫描。将使用16μm各向同性体素尺寸在75keV能量和250ms积分时间下对股骨进行扫描，每个样品大约有600个μCT切片。评估将应用于4mm中央缺损区域中，以确保分析中不包括预先存在的皮质骨。为了评估相关区域，将评估以下变量：缺损的总横截面体积(TV，mm3)和骨体积(BV，mm3)、骨体积分数(BV/TV，％)、骨矿物质密度(BMD，mg HA/ccm)和极惯性矩(pMOI，mm4)。将使用自适应迭代算法对图像进行阈值处理，并且将使用不依赖于关于底层结构的任何先前假设的直接3D技术从二值化图像计算形态计量变量。
机械测试。在非侵入性成像之后，每组12个样本将接受扭转至失败的测试。每个样本的末端将包埋于聚甲基丙烯酸甲酯中，以便为测试模块提供适当并且可重复的夹持界面。样本将在常规变形控制下并且以5rad/min的恒定变形率接受失效测试。将在10Hz下获取角变形和施加的载荷数据。扭矩和旋转数据将用于计算已愈合缺损的扭转刚度和强度。
骨样品的组织学。股骨(n＝4)将在冰冷的4％多聚甲醛中固定48小时，接着在14％EDTA中脱钙长达4周。在包埋和切片之前，将从骨骼中去除销钉。固定和脱钙的组织将在分级乙醇中脱水直至100％，转移至二甲苯中，并包埋于石蜡中。5微米石蜡切片将放置于聚L-赖氨酸涂布的载玻片上，干燥过夜并立即染色，或存储于4℃下。备用切片将用苏木精和伊红或番红O和固绿染色，接着通过光学显微镜进行检查。番红O包括在内以便对软骨进行染色，作为监测软骨内骨化过程的一部分。
功率分析和统计。所有单个组的样品量均基于所收集数据类型的15％变异系数，并使用α水平0.05和80％功率(β＝0.20)。功率分析表明，基于使用学生t检验的效应大小为1.3，每组n＝8-16只动物将允许检测每个结果参数的组间显著性差异。先前使用这些大鼠模型的经验证实，n为10会提供充足的统计功效。体外实验将一式三份进行，并使用ANOVA测试来比较统计显著性。使用nQuery Advice软件程序(Statistical Solutions,Boston,MA)4.0版确定样品量和功效计算。将使用SAS 6.12版软件(SAS Institute,Cary,NC)进行统计分析。双尾p<0.05将被认为具有统计显著性。
确定体外剂量反应的实验对于形成具有特定结构特性的离体血肿非常重要，所述结构特性模拟自然愈合骨折血肿的结构特性。如果单独使用离体血凝块无法实现愈合，则离体血肿将与大鼠骨髓间充质干细胞、与目前在临床上使用的超生理剂量相比显著减少量的rhBMP-2或其他生长因子组合。
如本文所公开，体内研究在8周和4周(0.6U/ml+0.55μg BMP-2组)骨缺损愈合时间结束时的体内结果清楚地表明，全血+蛇静脉酶(0.1U/mL)和富血小板血浆(PRP)+CalCl2(10mM)在所测试的凝血因子浓度下不会增强骨愈合/再生。相比之下，当向缺损处添加0.3U/mL的蛇静脉酶和1.1μg或0.55μg BMP-2时，5mm股骨大鼠缺损会愈合。值得注意的是，在由Medtronic(InfuseTM)销售的使用相同量的BMP-2的胶原蛋白海绵上递送的BMP-2并未启动骨缺损的愈合。有趣的是，当使用0.6U/mL的蛇静脉酶+0.55μg BMP-2时，与用较低浓度的蛇静脉酶观察到的情况相比，愈合好得多。这一结果似乎表明血凝块(离体血肿)的超微结构特性对增强骨缺损的愈合具有很大影响。
实施例10：仿生血肿：与rhBMP-2/ACS相对，凝血剂和rhBMP-2浓度对骨愈合的影响。
对一系列浓度的凝血剂、蛇静脉酶和钙/凝血酶以及BMP-2进行了测试，并证明了启动大节段骨缺损的愈合的能力。所测试的蛇静脉酶浓度包括0.3、0.6和0.75U/mL，并且这些浓度成功地启动了愈合；然而，0.6U/mL的蛇静脉酶浓度显示出所测试剂量的最佳结果。同样，凝血剂、10mM CaCl2和0.5U/mL的凝血酶的组合也以类似于0.6U/mL的蛇静脉酶和0.33μg BMP-2的方式有效地治愈了大骨缺损。在这种大鼠模型中，持续启动5mm骨缺损的愈合的BMP-2浓度为0.33μg。这一剂量比11μg标准剂量低33倍，并且这一剂量比BMP-2/ACS(ACS＝可吸收胶原蛋白海绵)有效愈合5mm股骨缺损大鼠模型的大节段骨的最低有效剂量(5.5μg)低17倍。所测试的另外两个启动骨缺损的愈合的剂量分别为0.165和0.0825μg；然而，与0.33μg相比，这些剂量的反应不太一致，并且分别为75％和50％。

Claims (130)

1.一种组合物，所述组合物包含：
1)离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；和
2)骨替代物。
2.一种组合物，所述组合物包含：
1)离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；和
2)骨替代物。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述离体血肿包含具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。
4.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述骨替代物是脱矿骨基质。
5.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述骨替代物源自生物产品、合成骨替代物或其组合。
6.如权利要求5所述的组合物，其中所述生物产品是脱矿骨基质、羟基磷灰石或珊瑚。
7.如权利要求5所述的组合物，其中所述合成骨替代物是硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙陶瓷、生物活性玻璃或聚合物。
8.如权利要求2所述的组合物，其中所述离体血肿还包含柠檬酸钠。
9.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述离体血肿还包含抗生素。
10.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述离体血肿还包含一种或多种生长因子。
11.如权利要求10所述的组合物，其中所述一种或多种生长因子是骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9、BMP-14、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)或其组合。
12.如权利要求1所述的组合物，其中所述全血包含活细胞和一种或多种生物因子。
13.如权利要求12所述的组合物，其中所述全血中约50％至70％的所述活细胞在所述血肿形成后保持存活。
14.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述离体血肿还包含治疗剂。
15.如权利要求1所述的组合物，其中所述离体血肿包含分离的全血、蛇静脉酶和柠檬酸钠。
16.如权利要求1所述的组合物，其中所述离体血肿包含分离的全血、氯化钙和柠檬酸钠。
17.如权利要求2所述的组合物，其中所述离体血肿包含富血小板血浆和蛇静脉酶。
18.如权利要求2所述的组合物，其中所述离体血肿包含富血小板血浆和氯化钙。
19.如权利要求1所述的组合物，其中所述离体血肿包含分离的全血、柠檬酸钠和凝血酶。
20.如权利要求1所述的组合物，其中所述离体血肿包含分离的全血；氯化钙；或奥苏他林和氯化钙；和柠檬酸钠。
21.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度是至少0.05U/mL。
22.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2U/mL。
23.如前述权利要求中任一项所述的组合物，所述组合物还包含骨形态发生蛋白2(BMP-2)。
24.如权利要求14所述的组合物，其中所述治疗剂是骨形态发生蛋白2(BMP-2)。
25.如权利要求24所述的组合物，其中所述离体血肿中存在的所述BMP-2的剂量是至少0.01mg。
26.如权利要求24所述的组合物，其中所述BMP-2是重组BMP-2。
27.如权利要求26所述的组合物，其中所述重组BMP-2包含人BMP-2。
28.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述离体血肿还包含生长因子、血小板和细胞。
29.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物被配制成凝胶、液体、粉末、糊剂、颗粒或油灰。
30.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是配制用于局部施用。
31.如权利要求23所述的组合物，其中所述离体血肿中存在的所述蛇静脉酶的量是至少0.05U/mL；并且所述离体血肿中存在的BMP-2的量是至少0.01mg。
32.如前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述离体血肿与骨替代物的比率是1000:1至1:1000。
33.一种装置，所述装置包括如前述权利要求中任一项所述的组合物。
34.一种多隔室装置，所述多隔室装置包括第一室，所述第一室包括分离的全血和/或一种或多种生长因子、一种或多种骨替代物或其组合；第二室，所述第二室包括蛇静脉酶或氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。
35.一种仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)分离的全血；(b)柠檬酸钠；和(c)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。
36.一种仿生支架，所述仿生支架包括支架和离体血肿，其中所述离体血肿包含：(a)富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和(b)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙。
37.如权利要求35或36所述的仿生支架，其中所述离体血肿包含具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。
38.如权利要求35或36所述的仿生支架，所述仿生支架还包括骨替代物。
39.如权利要求38所述的仿生支架，其中所述骨替代物是脱矿骨基质。
40.如权利要求39所述的仿生支架，其中所述骨替代物源自生物产品或合成骨替代物。
41.如权利要求40所述的仿生支架，其中所述生物产品是脱矿骨基质、羟基磷灰石或珊瑚。
42.如权利要求40所述的仿生支架，其中所述合成骨替代物是硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙陶瓷、生物活性玻璃或聚合物。
43.如权利要求38-42中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿与骨替代物的比率是1000:1至1:1000。
44.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿还包含柠檬酸钠。
45.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿还包含抗生素。
46.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿还包含一种或多种生长因子。
47.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述一种或多种生长因子是骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9、BMP-14、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)或其组合。
48.如权利要求35所述的仿生支架，其中所述分离的全血包含活细胞和一种或多种生物因子。
49.如权利要求48所述的仿生支架，其中所述分离的全血中约50％至70％的所述活细胞在所述血肿形成后保持存活。
50.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿还包含治疗剂。
51.如权利要求35所述的仿生支架，其中所述离体血肿包含分离的全血、蛇静脉酶和柠檬酸钠。
52.如权利要求35所述的仿生支架，其中所述离体血肿包含分离的全血、氯化钙和柠檬酸钠。
53.如权利要求36所述的仿生支架，其中所述离体血肿包含富血小板血浆和蛇静脉酶。
54.如权利要求36所述的仿生支架，其中所述离体血肿包含富血小板血浆和氯化钙。
55.如权利要求35所述的仿生支架，其中所述离体血肿包含分离的全血、柠檬酸钠和凝血酶。
56.如权利要求35所述的仿生支架，其中所述离体血肿包含分离的全血；氯化钙；或奥苏他林和氯化钙；和柠檬酸钠。
57.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度是至少0.05U/mL。
58.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的浓度是0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2U/mL。
59.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿还包含骨形态发生蛋白2(BMP-2)。
60.如权利要求50所述的仿生支架，其中所述治疗剂是骨形态发生蛋白2(BMP-2)。
61.如权利要求59所述的仿生支架，其中所述离体血肿中存在的所述BMP-2的剂量是至少0.01mg。
62.如权利要求59所述的仿生支架，其中所述BMP-2是重组BMP-2。
63.如权利要求62所述的仿生支架，其中所述重组BMP-2包含人BMP-2。
64.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿还包含生长因子、血小板和细胞。
65.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿被配制成凝胶、液体、糊剂、粉末、油灰或颗粒。
66.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿是配制用于局部施用。
67.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述离体血肿中存在的所述蛇静脉酶的量是至少0.05U/mL；并且所述离体血肿中存在的BMP-2的量是至少0.01mg。
68.如前述权利要求中任一项所述的仿生支架，其中所述支架是胶原蛋白、几丁质、生物可吸收聚合物、不可吸收聚合物诸如PEEK或者钛或金属合金。
69.一种促进骨愈合或产生骨替代材料或植入物的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的如权利要求1至32中任一项所述的组合物。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述分离的全血包含活细胞和一种或多种生物因子。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述离体血肿包含分离的全血、蛇静脉酶和柠檬酸钠；分离的全血、氯化钙和柠檬酸钠；富血小板血浆和蛇静脉酶；或富血小板血浆和氯化钙。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述离体血肿还包含骨形态发生蛋白2(BMP-2)。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述BMP-2是重组BMP-2。
74.如权利要求73所述的方法，其中所述重组BMP-2包含人BMP-2。
75.如权利要求69所述的方法，其中所述还包含生长因子、血小板和细胞。
76.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者是人类。
77.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物被配制成凝块或支架。
78.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物是配制用于局部施用。
79.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物是局部施用、植入或经皮递送。
80.如权利要求69所述的方法，其中所述组合物被植入。
81.如权利要求71所述的方法，其中所述组合物中存在的所述蛇静脉酶的量是至少0.05U/mL；并且所述组合物中存在的BMP-2的量是至少0.01-5mg。
82.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者具有骨骼缺损。
83.如权利要求82所述的方法，其中所述骨骼缺损是小骨骼缺损或大节段骨缺损。
84.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者具有一处或多处骨折。
85.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者具有一处或多处骨损伤。
86.如权利要求69所述的方法，其中所述受试者具有牙骨缺损。
87.如权利要求69-86所述的方法，其中所述骨替代物是脱矿骨基质。
88.如权利要求69所述的方法，其中所述骨替代物源自生物产品、合成骨替代物或其组合。
89.如权利要求88所述的方法，其中所述生物产品是脱矿骨基质、羟基磷灰石或珊瑚。
90.如权利要求88所述的方法，其中所述合成骨替代物是硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙陶瓷、生物活性玻璃或聚合物。
91.如权利要求69所述的方法，其中所述离体血肿和所述骨替代物单独或组合经皮递送。
92.一种构建植入物的方法，所述方法包括：
a)以促进将储库植入物植入骨缺损中的形状和尺寸中的至少一者确定所述储库植入物的尺寸；和
b)通过引入以下物质使所述储库植入物结构化为具有支架：
(i)分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；
(ii)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙；和
(iii)骨替代物，以形成所述支架。
93.如权利要求92所述的方法，其中所述支架具有55％至75％的孔隙率。
94.如权利要求92所述的方法，其中所述支架包括具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。
95.如权利要求92所述的方法，其中所述储库植入物的所述形状是圆柱体或球体的形状。
96.如权利要求92所述的方法，其中所述支架被构建成凝块。
97.如权利要求92所述的方法，所述方法还包括一种或多种生长因子。
98.如权利要求92所述的方法，其中所述一种或多种生长因子是骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9、BMP-14、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)或其组合。
99.如权利要求92所述的方法，其中所述BMP-2被引入所述支架中。
100.如权利要求92所述的方法，其中所述支架中存在的蛇静脉酶的量是至少0.05U/mL；并且所述支架中存在的BMP-2的量是至少0.01mg。
101.如权利要求92所述的方法，其中所述支架类似于给定骨缺损的尺寸和形状。
102.如权利要求92所述的方法，其中所述支架是趋化性的。
103.如权利要求92所述的方法，其中所述支架包括活的血细胞和适当生物因子。
104.如权利要求92所述的方法，其中所述骨替代物是脱矿骨基质。
105.如权利要求92所述的方法，其中所述骨替代物源自生物产品、合成骨替代物或其组合。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述生物产品是脱矿骨基质、羟基磷灰石或珊瑚。
107.如权利要求105所述的方法，其中所述合成骨替代物是硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙陶瓷、生物活性玻璃或聚合物。
108.一种促进受试者的骨愈合的方法，所述方法包括将如权利要求35-68中任一项所述的仿生支架植入所述受试者的相关部位中。
109.如权利要求108所述的方法，其中所述受试者具有骨骼缺损。
110.如权利要求109所述的方法，其中所述骨骼缺损是小骨骼缺损或大节段骨缺损。
111.如权利要求108所述的方法，其中所述受试者具有一处或多处骨折。
112.如权利要求108所述的方法，其中所述受试者具有一处或多处骨损伤。
113.如权利要求108所述的方法，其中所述受试者具有牙骨缺损。
114.一种构建仿生支架的方法，所述方法包括：
a)以促进将支架植入骨缺损中的形状和尺寸中的至少一者确定所述支架的尺寸；和
b)使a)中的所述支架与离体血肿组合，所述离体血肿包含：
(i)分离的全血和柠檬酸钠；或富血小板血浆、血浆或含红细胞血浆；和
(ii)蛇静脉酶；奥苏他林和氯化钙；氯化钙；凝血酶；或凝血酶和氯化钙，以形成所述仿生支架。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述离体血肿具有55％至75％的孔隙率。
116.如权利要求114所述的方法，其中所述离体血肿包含具有至少150-300nm±10％的厚度的纤维蛋白纤维。
117.如权利要求114所述的方法，其中所述支架的所述形状是圆柱体或球体的形状。
118.如权利要求114所述的方法，其中所述支架是胶原蛋白、几丁质、生物可吸收聚合物、不可吸收聚合物诸如PEEK或者钛或金属合金。
119.如权利要求114所述的方法，其中所述离体血肿还包含骨替代物。
120.如权利要求119所述的方法，其中所述骨替代物是脱矿骨基质。
121.如权利要求119所述的方法，其中所述骨替代物源自生物产品或合成骨替代物。
122.如权利要求120所述的方法，其中所述生物产品是脱矿骨基质、羟基磷灰石或珊瑚。
123.如权利要求121所述的方法，其中所述合成骨替代物是硫酸钙、磷酸钙水泥、β-磷酸三钙陶瓷、生物活性玻璃或聚合物。
124.如权利要求114所述的方法，其中所述离体血肿还包含一种或多种生长因子。
125.如权利要求114所述的方法，其中所述一种或多种生长因子是骨形态发生蛋白2(BMP-2)、BMP-7、BMP-4、BMP-6、BMP-9、BMP-14、血小板源性生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)或其组合。
126.如权利要求114所述的方法，其中所述BMP-2被引入所述离体血肿中。
127.如权利要求114所述的方法，其中所述离体血肿中存在的蛇静脉酶的量是至少0.05U/mL；并且所述支架中存在的BMP-2的量是至少0.01mg。
128.如权利要求114所述的方法，其中所述支架类似于给定骨缺损的尺寸和形状。
129.如权利要求114所述的方法，其中所述支架是趋化性的。
130.如权利要求114所述的方法，其中所述离体血肿还包含活的血细胞和适当生物因子。
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