JP2005519067A - トロンビンペプチド誘導体を用いた骨成長および軟骨形成の刺激 - Google Patents

Abstract

骨誘導または軟骨修復を必要とする被験体の部位で骨成長を刺激する方法が開示される。上記方法は、非タンパク質分解性活性化トロンビンレセプターのアゴニストの治療有効量を上記部位に投与することを含む。また、インビトロで軟骨細胞の増殖および拡大を刺激する方法が開示される。上記方法は、ＮＰＡＲアゴニストの刺激量の存在下で軟骨細胞を培養することを含む。

Description

発明の詳細な説明

政府の支援
本発明の全部または一部は、国立衛生研究所から助成金１ Ｒ４３ ＡＲ４５５０８−０１および２ Ｒ４４ ＡＲ４５５０８−０２を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。

発明の背景
哺乳類の骨組織は、再生し、それにより損傷および他の欠損を修復するというすぐれた能力を有する。例えば、骨成長は、一般に、ほとんどの単純骨折および毛髪様骨折からの完全な回復をもたらすには十分である。しかしながら、残念なことに、許容されうる成果を達成するには骨成長が不十分である損傷、欠損または状態が多くある。例えば、大きな空隙または空間内では通常は骨の再生は起こらない。したがって、骨折は、断片が密集するまで治癒しえない。損傷の結果、かなりの量の骨組織が失われた場合、治癒プロセスは不完全となりえ、望ましくない美容的（cosmetic）および／または機械的結果をもたらす。これは、しばしば、非癒合（non-union ）骨折または広範な外傷（massive trauma）に起因する骨損傷を伴う場合である。また、一般に、例えば腫瘍または嚢腫の外科的除去により引き起こされる骨の空隙および分節間隙（segmental gap ）では組織の成長は不十分である。別の場合では、骨が通常では見られない、すなわち異所性の場合に骨成長を刺激するのが望ましいことがある。２個以上の椎骨の融合（fuse）を誘導する腰痛(lower back pain) 緩和のための脊椎固定術は、望ましい異所性骨形成の一例である。現在、かかる間隙または分節欠損は、良好な修復または間隙充填のために骨移植を必要とする。効果的な骨移植片置換体の開発は、移植作業のために第２手術部位から骨を集める必要性を削減しえ、それにより、患者が経験する不快感およびドナー部位の治癒合併症（site healing complications）の危険性がかなり低減される。

未処置で放置した場合はかかる骨成長が通常は起こらない部位で骨成長を刺激または誘導する化合物は、「骨誘導性（osteoinductive）」であるといえる。骨誘導性化合物は、上述の状態を治療するための薬物として重要でありうる。いくつかの骨誘導性タンパク質が、組換え技術を用いて同定、単離および発現されている。例としては、米国特許第５，９０２，７０５号明細書、国際公開第９５／１６０３５パンフレットに開示された骨形成因子（ＢＭＰ）が挙げられる。しかしながら、組換えタンパク質を治療剤として使用することは、一般に、製造コスト、インビボ生分解および短い貯蔵寿命などのいくつかの問題点を有する。その結果、科学者は、上述の短所をもたない新しい骨誘導剤を追求し続けている。

さらに、ほとんどの組織とは異なり、軟骨は損傷後自己修復しない。軟骨は、主として軟骨特異的細胞である、軟骨細胞、特殊な型のコラーゲン、およびプロテオグリカンから構成される無血管性組織である。軟骨が損傷、疾患、または手術後に自己修復できないことは、分解した関節表面および半月状軟骨への損傷のリハビリテーションの主要な制限因子である。体重を軸受けする関節表面の主要な変性疾患である変形性関節炎は、軟骨表面の浸食または損傷により生じ、50歳を超える集団の約25％に存在する。米国では、2000万人を超える人々が変形性関節炎を患っており、年間の保健医療コストは86億ドル以上である。さらに、急性関節傷害（半月板の傷害、膝蓋表面損傷および軟骨軟化症）からの軟骨修復のコストは、年間10億ドルを超える。それ故、変性または急性外傷により引き起こされる軟骨の損傷を治癒するための新規治療アプローチが必要とされている。

発明の概要
非タンパク質分解的トロンビン受容体（non-proteolytical thrombin receptor）を活性化する化合物が骨誘導性であることを、ここに見出した。例えば、非タンパク質分解的トロンビン受容体のアゴニストである化合物ＴＰ５０８は、雄ニュージーランドウサギの尺骨に生じた分節の危険な（critical）大きさの欠損における骨成長を刺激する（実施例２）。ｘ線により示され、組織学および機械試験により確認されたように、未処置の対照と比較すると、１００μｇおよび２００μｇの投薬量でＴＰ５０８により誘導される骨形成が有意に増加した。これらの結果に基づいて、被験体において骨成長を刺激する新規な方法および新規な植込み可能な医薬組成物を本明細書に開示する。

また、関節の軟骨から単離された軟骨細胞は、非タンパク質分解性トロンビン細胞表面レセプター（以下「ＮＰＡＲ」）を活性化させる化合物に応答することが見出された。例えば、軟骨細胞は、約０．１ｎＭ（３０００部位）および２７ｎＭ（２３０，０００部位）の見かけ上の親和性を伴って細胞当たり約２３３０００トロンビン結合部位を発現する（実施例３）。さらに、化合物ＴＰ５０８、非タンパク質分解性トロンビンレセプターのアゴニストは、コ−マイトジェンとしてのトロンビンの存在下で培養液中のウシ軟骨細胞の増殖を刺激し（実施例４Ａ）、それ自身により３次元マトリックス培養物中で培養されたラット軟骨細胞の増殖を刺激する（実施例５Ａ）。この同じＴＰ５０８化合物はまた、ウシ軟骨細胞（実施例４Ｂ）およびラット軟骨細胞の３次元培養物（実施例５Ｂ）の両方における^３５Ｓ硫酸塩の取り込みにより測定されるプロテオグリカン合成を刺激する。これらのインビトロ実験は、ＮＰＡＲアゴニストが関節の軟骨から単離された軟骨細胞の増殖およびマトリックス産生を刺激しうるを示す。さらなるインビボ実験は、持続放出製剤中のＴＰ５０８を、肋軟骨下の骨まで広がるウサギ滑車溝軟骨細胞欠損に送達することにより、肋軟骨下の骨の修復、正常軟骨表面の修復および新規に形成された軟骨と欠損領域の外側の損傷していない軟骨との統合を含む軟骨欠損の修復を生じる（実施例７）ことを示す。

前のパラグラフで報告された結果に基づいて、インビボで軟骨細胞成長および被験体の軟骨修復を刺激する新規方法、ならびに表面修復において補助するため、および関節分解を防止するために関節欠損に医薬組成物を送達するための新規送達方法が本明細書中に開示される。

本発明の一態様は、被験体において骨誘導の必要がある部位で骨成長を刺激する方法である。該方法は、非タンパク質分解的活性化トロンビン受容体のアゴニストの治療有効量を該部位に投与することを含む。

本発明の別の態様は、移植可能な生体適合性担体およびトロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物等のNPARアゴニストを含有してなる医薬用組成物である。

本発明のこれらの方法は、被験体における骨成長を刺激することに関し、自己骨移植片または骨成長因子の投与による処置をせずに、骨成長が起こりえない部位にて用いうる。該方法は、非タンパク質分解的トロンビン受容体のアゴニストの投与を含む。かかるアゴニストには、ヒトプロトロンビンのアミノ酸５０８〜５３０のセグメントに対してホモロジーを有する小ペプチドが含まれる。これらの小ペプチドは、大量調製するのに安価であり、低投薬量で骨誘導性である。また、その凍結乾燥形態は、５℃および相対湿度６０％で保存した場合、少なくとも３０ヶ月間安定である。

別の局面では、本発明は、軟骨成長、修復または再生が必要とされる被験体の部位における軟骨成長、再生または修復の刺激方法に関する。この方法は、トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物等のNPARアゴニストの治療有効量を損傷の部位に投与することを含む。

本発明のさらなる態様は、インビトロでの軟骨細胞の増殖および拡大を刺激する方法に関する。本方法は、NPARアゴニストの刺激量の存在下で軟骨細胞を培養することを含む。

発明の詳細な説明
「骨誘導性」とは、被験体において、未処置のまま放置した場合ではほとんどまたは全く骨成長が起こりえない部位で骨成長を刺激することをいう。骨成長の誘導により治療の恩恵を受け得る部位を「骨誘導が必要」という。例としては、非癒合骨折または他の重症もしくは広範な骨外傷があげられる。骨成長は、単純骨折または毛髪様骨折などの骨損傷部、ならびに全く逆の複雑骨折で間隙が最小限でさらなる治療を必要としないものでは普通に起こることを特記する。かかる損傷は「骨誘導が必要」とみなされない。

単純骨折の修復は、例えば骨腫瘍または嚢腫の除去により引き起こされる非癒合骨折、分節間隙または骨空隙を完全にするのに必要とされる骨形成の誘導とは全く異なるようである。０．５ｃｍよりも大きい分節間隙は、一般に骨誘導が必要であり、一方、０．６ｃｍ、０．７ｃｍ、０．８ｃｍ、０．９ｃｍ、１．０ｃｍまたは１．５ｃｍよりも大きい分節間隙は、典型的には骨誘導が必要である。これらの場合は、通常、骨成長置換体として機能する数種類のマトリックスまたは支持体（scaffolding）を用いる骨移植または新しい骨の成長の誘導を必要とする。誘導された骨成長はまた、被験体において骨移植または骨融合が必要な部位などの骨組織が通常見られえない特定の部位（「異所性」部位という）では治療的に有益でありうる。融合は、１個以上の椎骨を隣接するものと物理的に結合することによって腰痛を治療するのによく用いられる。かかる融合により作り出された骨は、通常は骨組織がない部位に存在する。これらの異所性部位での骨誘導は、「移植置換体」として作用しうるものであり、それにより椎骨間に誘導された骨成長が移植片の代わりをし、移植作業のために骨を集める第２の手術の必要性を回避する。骨成長の誘導はまた、後天性および先天性の脳顔面頭蓋および他の骨格または歯科的異常（例えば、Ｇｌｏｗａｃｋｉら、Ｌａｎｃｅｔ １：９５９（１９８１）参照のこと）の治療のため、下顎骨などの損失骨置換または骨増加が必要とされる部位での歯科的または歯周の再構築を行なうため、ならびに歯の損失を遅延または予防するために歯周病に起因する歯槽骨損失を補うために必要である（例えば、Ｓｉｇｕｒｄｓｓｏｎら、Ｊ．Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ．，６６：５１１（１９９５）を参照）。

さらに、軟骨成長、修復または再生が必要な部位は、変形性関節炎を有する被験体で見出される。変形性関節炎または変形性関節疾患は、疼痛および機能の損失により特徴づけられる、緩徐に進行し、非可逆的であり、しばしば単関節疾患である。疼痛および消耗の根底にある原因は、疾患の主要な徴候の１つである軟骨分解である。硝子軟骨は、骨の末端を被い、膝等の関節間に位置する柔軟な組織である。これはまた、脊髄の周りの骨の間に見出される。軟骨は、平滑であり、安定な、摩擦が最小である柔軟な運動を可能にするが、圧力に対しても耐性であり、適用された負荷を分配することができる。変形性関節炎が進行すると、軟骨および露出した下にある骨の表面は不均等になる。滑らかに滑らせる代わりに、骨関節表面は互いに摩擦し、硬直および疼痛を生じる。これらの関節炎部位での損傷した軟骨の再生および新しい軟骨の成長は、疼痛を軽減し、変形性関節炎に関連する機能の喪失を回復する。

軟骨損傷はまた、傷害または手術から生じる外傷から起こりうる。スポーツ傷害は、特に膝などの関節への、軟骨損傷の一般的な原因である。軟骨への外傷傷害は、同じタイプの機能障害を生じうる。それ故、外傷または疾患により損傷した軟骨を有する被験体の部位は、軟骨の成長を回復または促進する処置が必要である。

出願人らは、ＮＰＡＲ、ＮＰＡＲアゴニストを刺激または活性化する化合物が骨誘導性であることを見出した。出願人らは、ＮＰＡＲを刺激または活性化する化合物が軟骨細胞を増殖するように刺激しうることをさらに見出した。軟骨細胞は、軟骨の約１％の容積を構成し、組織の正確な容積および機械的特性を維持するために分解したマトリックス分子を交換する細胞である。

出願人はまた、ＮＰＡＲを刺激または活性化する化合物が軟骨細胞においてプロテオグリカン合成を刺激することを見出した。プロテオグリカンは主要な軟骨成分である。これらの結果に基づき、出願人らは、持続放出製剤中に調製したＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８をウサギ滑車溝軟骨の欠損に送達し、このペプチドが、正常な軟骨表面を有する新しい軟骨の形成を含む欠損の修復を刺激することを見出した。このペプチドはまた、この新しい軟骨の、近接する未傷害の軟骨への層化および統合ならびに肋軟骨下の骨の回復を刺激した。ＮＲＡＲアゴニストは、軟骨成長および／または修復を必要とする部位に投与された場合、軟骨成長および修復を誘導しうると結論づけられる。

ＮＰＡＲは大半の細胞の表面に存在する高親和性トロンビン受容体である。このＮＰＡＲ成分は主にトロンビン、タンパク質分解的に不活化されるトロンビン、およびトロンビン由来ペプチドの細胞への高親和性結合を担っている。ＮＰＡＲは、トロンビンによりそのタンパク質分解活性とは無関係に開始されるいくつかの細胞性シグナルを媒介するようである。そのようなシグナルの一例は、アネキシンＶおよび差引きハイブリッド形成法によって同定された他の分子のアップレギュレーションである（Ｓｏｗｅｒら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４７：４２２（１９９９）参照）。したがってＮＰＡＲは、以下に述べるように、細胞表面でトロンビンと高親和性相互作用をすること、およびトロンビンのタンパク質分解的に不活化された誘導体およびトロンビン由来ペプチドアゴニストによって活性化されることを特徴とする。ＮＰＡＲの活性化は、米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号ならびにＧｌｅｎｎら、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １：６５（１９８８）に開示されているように、分裂促進濃度未満（submitogenicconcentration）のトロンビンの存在下またはプロテインキナーゼＣを活性化する分子の存在下で線維芽細胞に添加した場合に細胞増殖を刺激するそのアゴニストの能力またはトロンビン受容体との高親和性結合に関して¹²⁵Ｉ−トロンビンと競合する分子の能力に基づいて測定することができる。

ＮＰＡＲは、他のトロンビン結合タンパク質、およびトロンビンのタンパク質分解的活性化受容体のクローン化されたファミリー（ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３およびＰＡＲ４を含む）とは区別されるべきである。ＰＡＲ１は特異的トロンビン切断部位を持ち、その部位がトロンビン切断されることによって新しいアミノ末端ドメインが露出し、そのアミノ末端ドメインが、自分自身に折り返して自らの活性化を誘導する繋留リガンドとして作用する（Ｖｕら、Ｃｅｌｌ．６４：１０５７（１９９１）参照）。ＰＡＲ２は同様の活性化機序を持つが、主にトリプシン様酵素によって活性化される（Ｚｈｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１６９７５（１９９２）参照）。ＰＡＲ３も同様の活性化機序を持ち、血小板において第２のトロンビン受容体として機能するようである（Ｉｓｈｉｈａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ．３８６：５０２（１９９７）参照）。ＰＡＲ４はマウス巨核球中に検出されており、ヒト血小板中でも機能することが示唆されている（Ｋａｈｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３９４：６９０（１９９８）参照）。これらのＰＡＲ受容体とは対照的に、ＮＰＡＲの活性化はタンパク質分解的切断を必要としない。

ＮＰＡＲがＰＡＲ受容体とは異なることは、数系統の証拠が示している。すなわち（１）完全に機能的なＰＡＲ１受容体を発現するが、ＮＰＡＲシグナル伝達経路に欠損があるためトロンビンに対して非反応性である細胞集団が単離されている（Ｋｉｍら、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１６０：５７３（１９９４）参照）；（２）好中球は¹²⁵ Ｉ−トロンビンと高い親和性で結合し、好中球の走化性はタンパク質分解的不活化トロンビンまたはＮＰＡＲアゴニストによって刺激される（ＲａｍａｋｒｉｓｈｎａｎおよびＣａｒｎｅｙ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ４：１９９３（１９９３）参照）にもかかわらず、好中球はＰＡＲ１を発現しない（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１０８：３０５９（１９９５）参照）；（３）ＩＩＣ９線維芽細胞はＰＡＲ１を過剰発現するが、トロンビンと高い親和性では結合しない（Ｋｉｍ，Ｄ．博士論文（テキサス大学医学部ガルベストン校、１９９５年；およびＬｏｗら「癌細胞３／成長因子およびトランスフォーメーション（Cancer Cells 3/Growth Factors and Transformation）」コールドスプリングハーバー研究所、ニューヨークを参照）；（４）ＮＰＡＲアゴニストは遺伝子発現に対してＰＡＲ受容体アゴニストペプチドとは異なる効果を持つ（Ｓｏｗｅｒら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ
Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２４７：４２２（１９９９）参照）。

ＮＰＡＲアゴニストの一例はトロンビンペプチド誘導体、すなわち、アミノ酸数が約５０以下、好ましくはアミノ酸数が約３０以下であって、プロトロンビンアミノ酸５０８〜５３０（配列番号：５）に相当するヒトトロンビンの断片に対して、ＮＰＡＲを活性化するのに十分であるようなホモロジーを持つポリペプチドである。本明細書に記載するトロンビンペプチド誘導体は、好ましくは約１２〜２３個のアミノ酸、より好ましくは約１９〜２３個のアミノ酸を持つ。トロンビンペプチド誘導体の一例は、構造式（Ｉ）：
Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ
（Ｉ）
によって表される部分を含む。Ｒはセリンエステラーゼ保存ドメインである。例えばトリプシン、トロンビン、キモトリプシンなどのセリンエステラーゼは高度に保存された領域を持っている。「セリンエステラーゼ保存ドメイン」は、これら保存領域の一つのアミノ酸配列を持つポリペプチドを指すか、または当該トロンビンペプチド誘導体がＮＰＡＲ活性化能を保つように、これら保存領域の一つに対して十分に相同である。

一実施形態において、セリンエステラーゼ保存配列は配列番号：１のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）または配列番号：１のアミノ酸配列を持つポリペプチドのＣ末端切形型断片を有する。しかし、セリンエステラーゼ保存配列中の０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号：１中の対応するアミノ酸とは異なりうることが理解される。配列番号：１中の対応するアミノ酸と相違するセリンエステラーゼ保存配列中のアミノ酸は好ましくは保存的な（conservative）置換であり、より好ましくは高度に保存的な（highly conservative ）置換である。「Ｃ末端切形型断片」とは、Ｃ末端から１個のアミノ酸または一続きのアミノ酸を除去した後に残っている断片を指し、該断片は少なくとも６個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも９個のアミノ酸を持つ。

より好ましくは、セリンエステラーゼ保存配列は、配列番号：２のアミノ酸配列（Ｃｙｓ−Ｘ₁ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ₂−Ｖａｌ；Ｘ₁ はＧｌｕまたはＧｌｎ、Ｘ₂ はＰｈｅ、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、ＨｉｓまたはＶａｌである）またはアミノ酸数が少なくとも６、好ましくはアミノ酸数が少なくとも９であるそのＣ末端切形型断片を有する。

好ましい一実施形態では、トロンビンペプチド誘導体は、セリンエステラーゼ保存配列と、より特異的なトロンビンアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号：３）を有するポリペプチドとを含む。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ₁ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ₂−Ｖａｌ（配列番号：４）を含む。Ｘ₁ およびＸ₂ は上記の定義に従う。トロンビンペプチド誘導体が配列番号：４を含む場合、該誘導体は、配列番号：５のアミノ酸配列（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）またはそのＮ末端切形型断片を持つことが好ましい。ただし、当該トロンビンペプチド誘導体中の１〜９位にある０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号：５の対応する位置にあるアミノ酸とは異なるものとする。配列番号：５中の対応するアミノ酸と相違するトロンビンペプチド誘導体中のアミノ酸は好ましくは保存的な置換であり、より好ましくは高度に保存的な置換である。「Ｎ末端切形型断片」とは、Ｎ末端から１個のアミノ酸または一続きのアミノ酸、好ましくは６個以下の一続きのアミノ酸、より好ましくは３個以下の一続きのアミノ酸を除去した後に残っている断片を指す。

トロンビン誘導体ペプチドの生理学的に機能的な等価物は、特にＮＰＡＲアゴニストとしてペプチドの機能に影響しないトロンビン誘導体とは異なる分子を含む。かかる粒子は、本明細書中に記載されるように、アミノ酸置換、および修飾、例えば、カルボキシル末端のアミド化、アミノ末端のアシル化、生理学的に不活性な担体分子への上記ポリペプチドの結合、またはセリンエステラーゼ保存配列に従う配列変化を含みうるが、これらに限定されない。

トロンビン誘導体ペプチドの生理学的に機能的な等価物はまた、本発明の範囲内にある。例えば、かかるペプチドは、カルボキシル末端でアミド化されるか、アミノ末端でアシル化されるかまたはその両方である。特定の態様では、配列番号：３のアミノ酸配列は、以下の生理学的に機能的な等価物：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）、Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：７）またはＡｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：８)（「Ac」はアセチル基である)。

カルボキシル末端のアミド化は、当該分野で公知の任意の方法により達成されうる。従って、Ｃ−末端のアミノ酸は構造式（ＩＩ）：
−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）−ＮＲ_１Ｒ_２
（ＩＩ）
式中、Ｒ_１およびＲ_２は、個別にＨ、Ｃ_１〜Ｃ_６アルキルであり、Ｒ_１およびＲ_２はそれらが結合する窒素と共に、ピロリジニル、ピペラジニル、モルフィリニルまたはピペリジニル等の非芳香族複素環を形成する、で表される。Ｒ_１およびＲ_２は好ましくはＨである。「−Ｖａｌ−ＮＨ_２」は、−ＮＨ−ＣＨ［−ＣＨ−（ＣＨ_３）_２］−ＣＯＮＨ_２を意味する。

アミノ末端のアシル化は、当該分野で公知の任意の方法により達成されうる。従って、Ｎ−末端アミノは構造式（ＩＩＩ）：
Ｒ_１−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨＲ−Ｃ（Ｏ）−
（ＩＩＩ）
Ｒはアミノ酸側鎖であり、Ｒ_１はＣ_１〜Ｃ_６アルキル分枝鎖および直鎖である、で表される。Ｒは好ましくはメチル（−ＣＨ_３）である。

ＴＰ５０８はトロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物の一例であり、配列番号：６のアミノ酸配列を持つ。

「保存的な置換」とは、あるアミノ酸を同じ正味の電荷およびほぼ同じ大きさと形状を持つ別のアミノ酸で置き換えることをいう。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数の相違が約４以下であれば、ほぼ同じ大きさを持つ。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の分枝数の相違が１以下であれば、ほぼ同じ形状を持つ。側鎖にフェニルまたは置換フェニル基を持つアミノ酸は、ほぼ同じ大きさと形状を持つとみなされる。以下に５つのアミノ酸群を挙げる。ポリペプチド中のアミノ酸を同じ群から選択した別のアミノ酸で置換すると保存的な置換になる。

Ｉ群：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、システイン、およびＣ１−Ｃ４脂肪族またはＣ１−Ｃ４ヒドロキシル置換脂肪族側鎖（直鎖または一分岐）を持つ非天然アミノ酸。

ＩＩ群：グルタミン酸、アスパラギン酸、およびカルボン酸置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を持つ非天然アミノ酸。

ＩＩＩ群：リジン、オルニチン、アルギニン、およびアミンまたはグアニジノ置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を持つ非天然アミノ酸。

ＩＶ群：グルタミン、アスパラギン、およびアミド置換Ｃ１−Ｃ４脂肪族側鎖（非分岐または一分岐点）を持つ非天然アミノ酸。

Ｖ群：フェニルアラニン、フェニルグリシン、チロシン、およびトリプトファン。

「高度に保存的な置換」とは、あるアミノ酸を、側鎖中に同じ官能基を持ち、かつ、ほぼ同じ大きさと形状を持つ別のアミノ酸で置き換えることをいう。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の炭素およびヘテロ原子の総数の相違が２以下であれば、ほぼ同じ大きさを持つ。脂肪族または置換脂肪族アミノ酸側鎖を持つアミノ酸は、側鎖中の分枝の数が同じであれば、ほぼ同じ形状を持つ。高度に保存された置換の例としては、バリンによるロイシンの置換、スレオニンによるセリンの置換、アスパラギン酸によるグルタミン酸の置換、フェニルグリシンによるフェニルアラニンの置換が挙げられる。高度に保存的な置換ではない置換の例としては、アラニンによるバリンの置換、アラニンによるセリンの置換、アスパラギン酸によるセリンの置換が挙げられる。

他のＮＰＡＲアゴニストには、ＮＰＡＲと結合して活性化する小さい有機分子が含まれる。このタイプのアゴニストは、米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号に開示されているように、ハイスループットスクリーニングによって、例えば分裂促進濃度未満のトロンビンまたはプロテインキナーゼＣを活性化する分子の存在下で線維芽細胞に添加した場合に細胞増殖を刺激する分子の能力を評価するアッセイによって簡便に同定することができる。米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号の全教示は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。

「ＮＰＡＲアゴニスト」という用語は、ＮＰＡＲを活性化することが知られている化合物および化合物の組み合わせも包含する。その例は、米国特許第５，３５２，６６４号および第５，５００，４１２号に開示されており、トロンビン、ＤＩＰ−α−トロンビンおよびＤＩＰ−α−トロンビンとホルボールミリステートアセテートとの組み合せが挙げられる。

本明細書に記載の医薬用組成物における使用のための移植可能な生体適合性担体は、骨成長を刺激するために使用されるＮＰＡＲアゴニストの好適な送達または維持システムとして機能する。生体適合性担体は、無毒性、非炎症性、非免疫原性であり、植込み部位で他の望ましくない反応を起こさないべきである。また、適切な担体は活性成分の放出を提供し、好ましくは植込み部位での長時間にわたる緩徐で持続的放出を提供する。

好適な担体には、内部に骨前駆細胞が移動しうる多孔性マトリックスがあげられる。骨形成性細胞は、多くの場合、かかる多孔性マトリックスに付着することができ、次いでこれは骨および組織の成長のための支持体として機能しうる。ある種の用途のためには、担体は、その三次元構造を維持するため、および互いに癒合または移植している骨セグメントの固定化の支持を補助するために十分な機械的強度を有するべきである。組織成長のための支持体を提供する多孔性マトリックスは、骨成長速度を促進し、「骨伝導性 (osteoconductive) 」であるといえる。骨伝導性担体は、本明細書に記載の医薬組成物における使用のために非常に好ましい。

好適な骨伝導性担体の例には、コラーゲン（例えば、ウシ皮膚コラーゲン）、フィブリン、リン酸カルシウムセラミックス（例えば、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三石灰）、硫酸カルシウム、グアニジン抽出同種異系骨およびその組み合わせが含まれる。いくつかの好適な担体は、ヒドロキシアパタイト、リン酸三石灰および筋原線維性コラーゲンの混合物であるＣＯＬＬＯＧＲＡＦＴ（Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）、ならびに海産サンゴ炭酸カルシウムを結晶性ヒドロキシアパタイトに変換して形成したヒドロキシアパタイトバイオマトリックスであるＩＮＴＥＲＰＯＲＥ（Ｉｎｔｅｒｐｏｒｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｒｖｉｎｅ ＣＡ）などの商品として入手可能である。

多くの合成生分解性ポリマーが徐放特性を持つ骨伝導性担体として役立ちうる。これらのポリマーの記載は、Ｂｅｈｒａｖｅｓｈら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ ３６７：Ｓ１１８ （１９９９）およびＬｉｃｈｕｎら、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｂｏｎｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ−Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｆｕｔｕｒｅ” ＰａｒｋおよびＭｒｓｎｙ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ、ワシントンＤＣ（２０００）に見出し得る。これらの参考文献の全教示は参照によって本明細書に組み入れられるものとする。これらのポリマーの例には、ポリ乳酸／ポリグリコール酸のホモポリマーおよびコポリマーなどのポリα−ヒドロキシエステル、ポリホスファゼン(polyphosphazene) （ＰＰＨＯＳ）、ポリ無水物およびポリ（プロピレンフマレート）がある。

ポリ乳酸／ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）ホモポリマーおよびコポリマーは徐放性ビヒクルとして当技術分野ではよく知られている。当業者はポリ乳酸対ポリグリコール酸比およびポリマーの分子量を変えることによって放出速度を調節することができる（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２８：５（１９９７）参照、この文献の全教示は参照によって本明細書に組み入れられる）。微粒子担体を形成するための配合物としてのポリマーにポリ（エチレングリコール）を含めることにより、活性成分の放出プロフィールをさらに変更することができる（Ｃｌｅｅｋら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ ４８：２５９（１９９７）参照、この文献の全教示は参照によって本明細書に組み入れられる）。リン酸カルシウムおよびヒドロキシアパタイトなどのセラミックスもまた、機械的特性を向上させるために製剤中に含ませうる。

ＰＰＨＯＳポリマーは、ポリマー骨格中に交互に窒素およびリン(phosphorous) を含むが、炭素を含まず、以下の構造式（ＩＶ）：

で示される。ポリマーの性質を、ポリマー骨格に結合する側鎖基ＲおよびＲ’の適切なバリエーションによって調整することができる。例えば、ＰＰＨＯＳの分解および薬物放出を、加水分解に対し不安定な側鎖基の量を変えることによって制御することができる。例えば、イミダゾリルまたはエチルグリコール置換ＰＰＨＯＳのいずれかの組み込みが多いほど、分解速度の増加が認められ（全教示が本明細書中に参照により組み込まれるＬａｕｒｅｎｃｉｎら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．２７：９６３（１９９３）を参照のこと）、それにより薬物放出の速度が増加する。

構造式（Ｖ）に示されるポリ無水物は、様々な量の疎水性または親水性モノマー（セバシン酸および１，３−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）プロパンなど）を含めることによって制御することができる明確な分解および放出特性を持つ（Ｌｅｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１９：９４１（１９８５）、この文献の全教示は参照によって本明細書に組み入れられる）。機械的強度を向上させるために、多くの場合、無水物をイミドと共重合して、ポリ無水物−コ−イミドを形成させる。整形外科用途に適したポリ無水物−コ−イミドの例は、ポリ（トリメリチルイミド−グリシン−コ−１，６−ビス（カルボキシフェノキシ）ヘキサン、およびピロメリチルイミドアラニン：１，６−ビス（ｐ−カルボキシフェノキシ）ヘキサンコポリマーである。

ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）は、注射可能で、インサイチュで重合可能で、生分解性の物質であるので非常に望ましい生体適合性の植込み可能な担体である。「注射可能」とは、ペーストおよびゲルの注射に使用される標準的なニードルを介してシリンジによって物質を注射することができることを意味する。ビニルモノマー（Ｎ−ビニルピロリジノン）および開始剤（ベンゾイルペルオキシド）と組み合わせたＰＰＦにより、インサイチュで重合することができる注射可能溶液が形成される。それは、広範な種々の大きさおよび形状の骨格の欠陥を充填するのに特に適している（それらの全教示が本明細書中に参照により組み込まれる、Ｓｕｇｇｓら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、３０：４３１８（１９９７）、Ｐｅｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙ，．Ｅｄ．１０：３６３（１９９９）およびＹａｓｚｅｍｓｋｉら、Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎｇ．１：４１（１９９５）を参照のこと）。リン酸β−トリカルシウムおよび塩化ナトリウムなどの固相成分の添加は、ＰＰＦポリマーの機械的特性を向上しうる（Ｐｅｔｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．４４：３１４（１９９９）、その全教示は参照によって本明細書に組み入れられるものとする）。

本発明の医薬組成物は、骨誘導の必要がある部位に植込むことにより投与されうる。「植込み」または「部位での投与」とは、ＮＰＡＲアゴニストが医薬組成物から放出されると、処置の必要がある部位で骨誘導が起こる（例えば、ＮＰＡＲアゴニストの存在下で骨成長が起こるが、その非存在下ではほとんどまたは全く成長が起こらない）ように治療の必要がある部位に十分に近いことを意味する。

医薬組成物は手術を想定して望ましい形状にしておくか、手術中に医師または技工士の手で形作ることができる。組織欠損部をまたいで新組織の所望する形状をとるようにマトリックスを形作ることが好ましい。非癒合欠損部の骨修復の場合は、例えば、非癒合部をまたぐ寸法を使用することが望ましい。骨形成の過程では、上記材料は身体にゆっくり吸収され、当該インプラントの形状または当該インプラントの形状に極めて近い形状の骨に置き換わる。あるいはまた、医薬組成物は微粒子またはマイクロスフェアの形態で該部位に投与されうる。微粒子は、外科的に該部位を露出させて微粒子を適用するか、または微粒子を該部位の近傍に塗布、ピペッティング、噴霧、注射などにより適用するかのいずれかにより、骨誘導の必要がある部位に接触または密接して配置される。微粒子はまた、内視鏡検査法または腹腔鏡検査法により該部位に送達しうる。ＰＬＧＡ微粒子の調製および骨成長の刺激のためのその使用を実施例１および２に示す。

さらに別の例では、医薬組成物は、骨誘導の必要がある部位に投与する前に、メッシュ、ワイヤーマトリックス、ステンレススチールケージ、糸状椎体間融合ケージ(threaded interbody fusion cage)などの物理的支持構造体内に部分的に封入されうる。

本発明の医薬組成物の適用に関する別の選択肢は、注射によるものである。注射可能な組成物には、上述のポリ（プロピレンフマレート）コポリマーの溶液およびリン酸カルシウムセラミックスのペースト（Ｓｃｈｍｉｔｚら、Ｊ．Ｏｒａｌ Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃｉａｌ Ｓｕｒｇｅｒｙ ５７：１１２２（１９９９）参照のこと、その全教示は参照によって本明細書に組み入れられるものとする）が含まれる。注射可能な組成物は、骨誘導が必要な部位に直接注射され得、空隙を充填するために簡便に使用され、侵襲性手術の必要なく骨を融合させ得る。

ＮＰＡＲアゴニストはまた、移植以外の手段、例えばＮＰＡＲアゴニストを許容可能な医薬用担体内に含有する溶液を該部位に直接またはその付近に適用することにより投与しうる。所望の部位に対する溶液の投与は例えばシリンジを用いて、外科的開口を介するかまたは非経口的投与によるかのいずれかで簡便に行われうる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載のものなどの標準的な医薬製剤技術を用いうる。非経口投与のための適切な医薬担体には、例えば滅菌水、生理食塩水、静菌生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、乳酸リンゲル液などが含まれる。

本発明のＮＰＡＲアゴニストまたは植込み可能な医薬組成物は、植込み可能な補綴デバイスと組み合わせて使用され得る。例えば、治療有効量の医薬組成物を、骨誘導が必要な部位に植込み可能に隣接する補綴インプラントの表面に配置させることができる。あるいは、補綴デバイスは、植込み可能な医薬組成物またはＮＰＡＲアゴニストが所定の速度で継続的に放出されるように構成される。補綴物は、金属またはセラミックを含有してなる材料から作製されうる。補綴デバイスの例としては、股関節デバイス、スクリュー、ロッドおよび脊椎固定用のチタンケージが挙げられる。

したがって、本発明はまた、被験体の骨誘導が必要な部位に補綴デバイスを植込むことにより骨成長を刺激する方法を提供する。補綴物は、少なくとも部分的に上述の植込み可能な医薬組成物でコートされており、骨誘導の必要がある部位に植込まれ、骨成長の刺激を可能にするのに十分な期間、該部位で維持される。

軟骨の再生に関して本発明の方法で使用されるＮＰＡＲアゴニストは典型的には、軟骨の成長、修復または再生を必要とする部位に、医薬組成物の１成分として投与される。治療を必要とする部位への投与とは、軟骨成長または軟骨再生（例えばＮＰＡＲアゴニスト不在下よりも量的に多い、または質的に高い、ＮＰＡＲアゴニスト存在下での軟骨成長）が当該部位で起こるように、治療を必要とする部位の十分近くに、ＮＰＡＲアゴニストを含有する医薬組成物を投与することを意味する。

投与手段の一つとして、医薬組成物はＮＰＡＲアゴニストと適切な担体とを含む溶液である。溶液は、治療を必要とする部位に直接、または治療を必要とする部位に近接して適用される。溶液の投与は、例えばシリンジによる関節内投与で、または損傷した組織のごく近傍にシリンジで、または外科的切開によって、便利に達成することができる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されているような標準的医薬製剤法を使用することができる。適切な医薬担体としては、例えば生理食塩水、静菌性食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含む生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、乳酸リンゲル液などが挙げられる。

もう１つの投与手段として、医薬組成物は、ＮＰＡＲアゴニストと、移植可能な生体適合性担体とを含む。生体適合性担体は、無毒性、非炎症性、非免疫原性であり、移植部位で他の望ましくない反応を起こさないべきである。適切な担体はまた活性成分の放出を提供し、好ましくは移植部位での長時間にわたる緩徐な持続的放出を提供する。

多くの合成生分解性ポリマーは徐放性を持つ担体として働き得る。これらのポリマーの例には、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーなどのポリα−ヒドロキシエステル、およびポリ無水物がある。

骨組織の再生に関して論じられているポリ乳酸／ポリグリコール酸（ＰＬＧＡ）ホモおよびコポリマーはまた、軟骨を処置するために利用される化合物のための徐放性ビヒクルとしての使用に適切である。同様に、構造式 (V) に示されたポリ無水物は、コラーゲンの処置方法において使用され得る。

医薬組成物は手術を見越して所望通りに形作るか、手術中に医師または技工士の手で形作ることができる。組織欠損部をまたいで所望する新組織の形状をとるようにマトリックスを形作ることが好ましい。大きい欠損部の軟骨修復の場合は、その欠損をまたぐ寸法を使用することが望ましい。移植後に該材料は身体にゆっくり吸収され、インプラントの形状またはインプラントの形状に極めて近い形状の軟骨に置き換わる。

１つの局面において、担体は、内部に前駆細胞が遊走できる多孔性マトリックスである。細胞は多くの場合このような多孔性マトリックスに付着することができ、その場合、多孔性マトリックスは組織成長の足場として機能することにより、骨成長速度を加速することができる。治癒をさらに促進するために、移植に先立って、軟骨細胞をかかるマトリックスに適用することができる。コラーゲンまたはコラーゲンゲルは、適切な多孔性マトリックスの一例である。

別の局面において、担体は、関節内にまたは処置を必要とする部位に注射可能な粘性溶液またはゲルである。ヒアルロン酸はこのタイプの担体の一例である。ヒアルロン酸製品は市販されており、例えばＡｎｉｋａが開発したＯＲＴＨＯＶＩＳＣ、Ｂｉｏｍａｔｒｉｘが開発したＳＹＮＶＩＳＣ、Ｆｉｄｉａが開発したＨＹＡＬＧＡＮ、およびＳｅｉｋａｇａｋｕが開発したＡＲＴＺなどがある。プルロニックゲルはこのタイプの担体のもう１つの例である。プルロニックゲルはエチレンオキシドとプロピレンオキシドの無毒性ブロックコポリマーである。プルロニックゲルは熱硬化性を示すため、室温では粘性液体として存在し、体温ではゲルとして存在することができる。注射可能組成物は処置を必要とする部位に直接適用することができ、侵襲的手術を行う必要はない。ポリ（エチレンオキシド）のポリマーならびにエチレンおよびプロピレンオキシドのコポリマーも、注射可能なマトリックスとして適切である（Ｃａｏら、Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ ９：４７５（１９９８）およびＳｉｍら、Ｐｌａｓｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒ．Ｓｕｒｇ． ９８：８４３（１９６）参照；これらの全教示は参照によって本明細書に援用される）。

ＮＰＡＲアゴニストは、単離された軟骨細胞の成長を促進するために、または単離された軟骨細胞の機能性を維持するために使用することができる。１つの態様において、増殖を刺激してより迅速な増殖を提供するため、および／または初代細胞単離物を培養状態に置いた時にしばしば認められるアポトーシス死または細胞の老化を防止するために、ＮＰＡＲアゴニストを組織培養培地に添加することができる。別の態様において、ＮＰＡＲアゴニストはマトリックス産生を刺激することが明らかなため、培養軟骨細胞の分化した機能性を維持するために、かかるＮＰＡＲアゴニストが使用され得る。ＮＰＡＲアゴニストは標準的に規定された組織培養培地に単独で使用されるか、あるいは軟骨細胞のインビトロでの産生もしくは維持に対する相加的または相乗的効果を得るために、血清または他の成長因子を含有する組織培養培地への補助物質として使用され得る。アゴニストが存在しない場合と比較して、より迅速な軟骨細胞の成長が得られるように、またはより高い軟骨細胞の機能性が維持されるように、十分な量（すなわち 「刺激量」）のＮＰＡＲアゴニストを培養物に添加する。典型的には約０．１μｇ／ｍｌ〜約１００μｇ／ｍｌのＮＰＡＲアゴニストが使用される。

骨成長に関しては、「治療有効量」とは、ＮＰＡＲアゴニストの非存在下ではほとんどまたは全く骨成長が起こりえない場合に骨成長をもたらす該アゴニストの量をいう。典型的には、アゴニストは、所望の治療または美容効果、すなわち十分な骨成長を達成するのに十分な期間にわたって投与される。投与量は、所望する骨成長の量、被験体の健康状態、サイズ、体重、年齢および性別、ならびに当該医薬製剤の放出特性に依存する。典型的には、約１μｇ／日〜約１ｍｇ／日のＮＰＡＲアゴニスト（好ましくは約５μｇ／日と約１００μｇ／日の間）を、継続放出によって、または骨成長が必要である部位への直接適用によって投与する。

軟骨成長に関しては、「治療有効量」とは、ＮＰＡＲアゴニスト存在下でＮＰＡＲアゴニスト非存在下よりも大きい軟骨成長または軟骨修復をもたらすＮＰＡＲアゴニスト（または軟骨細胞）の量をいう。前記に代えて、または前記に加えて、「治療有効量」とは、軟骨損傷に伴う痛みおよび／または機能喪失の緩和をもたらすＮＰＡＲアゴニスト（または軟骨細胞）の量をいう。典型的には、アゴニスト（または軟骨細胞）は、所望の治療または効果を達成するのに十分な期間にわたって投与される。投与量は、所望する軟骨成長の量、被験体の健康状態、サイズ、体重、年齢および性別、ならびに当該医薬製剤の放出特性に依存する。典型的には、約０．１μｇ／日〜約１ｍｇ／日のＮＰＡＲアゴニスト（好ましくは約５μｇ／日〜約１００μｇ／日）を、継続放出によって、または軟骨の成長もしくは修復を必要とする部位への直接適用によって投与する。

ＮＰＡＲアゴニストの存在下で培養した軟骨細胞は、処置を必要とする部位に治療有効量の軟骨細胞を投与することによって軟骨損傷を治療するために使用することもできる。軟骨細胞の場合、「治療有効」とは、治療により、治療を施さない場合よりも大きい軟骨成長または軟骨修復が得られることを意味する。軟骨損傷の処置を目的とする軟骨細胞の投与は、米国特許第４，８４６，８３５号に記載されており、その全教示は参照によって本明細書に援用される。

「被験体」は好ましくはヒトであるが、処置を必要とする動物、例えば伴侶動物（例：イヌ、ネコなど）、家畜（例：ウシ、ブタ、ウマなど）および実験動物（例：ラット、マウス、モルモットなど）であってもよい。

トロンビンペプチド誘導体は固相ペプチド合成（例えばＢＯＣまたはＦＭＯＣ）法、液相合成、または他の適切な技術（前述の方法の組み合わせを含む）によって合成することができる。確立された方法であって広く使用されているＢＯＣ法とＦＭＯＣ法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８８：２１４９（１９６３）；Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｃ．Ｈ．Ｌｉ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８３、４８〜２６７頁；ならびにＢａｒａｎｙおよびＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｅ．ＧｒｏｓｓおよびＪ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ編，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０, ３〜２８５頁に記載されている。固相ペプチド合成の方法は、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１（１９８６）；Ｃａｒｐｉｎｏ，Ｌ．Ａ．およびＨａｎ，Ｇ．Ｙ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，３７：３４０４（１９７２）；ならびにＧａｕｓｐｏｈｌ，Ｈ．ら、Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，５：３１５（１９９２）に記載されている。これら６つの文献の教示は、参照により完全に本明細書に援用される。

本発明は以下の実施例によって例証されるが、これはなんら限定を意図するものではない。

実施例１− ＴＰ５０８のポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー微粒子の調製
二重乳濁液技術を使用して、ＴＰ５０８を含むポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）の微粒子を調製した。簡単に述べれば、基質成分を塩化メチレンに溶解し、ＴＰ５０８を水に溶解した。この２つをボルテックスしながら徐々に混合して、水−油（Ｗ／Ｏ）乳濁液を形成させた。ポリビニルアルコール（０．３％水溶液）を乳濁液に添加し、さらにボルテックスして第２の乳濁液（Ｏ／Ｗ）を形成させ、それにより以下の二重乳濁液が形成される：ＰＬＧＡ小滴からなる（Ｏ／Ｗ）乳濁液、および小滴内のＴＰ５０８水溶液からなる第２の分散相。層分離の際、ＰＬＧＡ小滴は、ＴＰ５０８を保持する空洞を含む分散したマイクロスフェアを形成した。マイクロスフェアを層分離するために、２％イソプロピルアルコール溶液を添加した。粒子を遠心分離によって回収し、凍結乾燥して残りの水分を除去した。基質組成を変化させて異なる放出速度を有するマイクロスフェアを形成した（表１）。

マイクロスフェアの平均直径をＣｏｕｌｔｅｒカウンターで測定し、薬物包括効率を塩化メチレン中のマイクロスフェアの秤量試料の溶解および水への放出薬物の抽出後の２７６ｎｍでの分光光度アッセイによって測定した（表２）。

異なるＰＬＧＡ基質からのＴＰ５０８放出を測定するために、２０ｍｇのマイクロスフェアを１．５ｍｌのポリプロピレン微量遠心分離チューブ中に含まれる１．０ｍｌのＰＢＳに入れた。チューブを３７℃でインキュベートし、６０ｒｐｍで震盪した。種々の測定点で、チューブを遠心分離し、放出ＴＰ５０８を含む上清を除去し、その後の分析用に凍結した。新鮮なＰＢＳをマイクロスフェアに添加し、インキュベーションを継続した。上清中のＴＰ５０８を２７６ｎｍの吸光度によって測定した。各製剤について、４連の放出判定を行った。製剤ＢおよびＤは、３７℃で２８日間のインキュベーションで薬物放出は検出されなかった。残りの製剤は全て検出可能な量のＴＰ５０８を放出した。ただし、全ての場合３〜４日以内で薬物放出量は検出可能限度未満であった（１μｇ／ｍｇ基質／日未満）。製剤ＡおよびＣは、最も大量にＴＰ５０８放出を示し、３〜４日にわたり包括薬物を６０〜８０％放出した。最も速い放出速度を示す製剤Ｃをインビボ研究でのさらなる試験に選択した。

実施例２− ＴＰ５０８を含有するＰＬＧＡマイクロスフェアはウサギ尺骨の大きな（１．５ｃｍ）欠損における骨形成を誘導する
雄ニュージーランドウサギ２０匹の各尺骨に１．５ｃｍの分節欠損を形成した。これらの両側尺骨骨切り術は、振動微小ノコギリの切断刃を指向させるための金属製小ガイドを用いることにより正確に同じ大きさで作製した。各ウサギを自身が対照となるようにした。したがって、左側欠損にはＴＰ５０８を含有しないマイクロスフェアを充填し、右側欠損には１００または２００μｇのＴＰ５０８を含有するマイクロスフェアを充填した（１０匹／群）。マイクロスフェアを実施例１に記載のようにして調製した。両側尺骨骨切り術を受けたウサギを無作為に２群に分けた。第１群には１００μｇのＴＰ５０８を含有するマイクロスフェア（３０ｍｇ）を右脚に与え、左脚にはマイクロスフェアのみを与えた。第２群も同様に処理したが２００μｇのＴＰ５０８を投与した。これらの種々の投薬量は、ＴＰ５０８含有マイクロスフェアおよびＴＰ５０８無含マイクロスフェアを種々の比率で混合することにより達成した。動物に、第３週から始めて２週間隔でX線をあて、第９週に屠殺した。

１００μｇのＴＰ５０８は、術後第３および第５週で欠損における鉱化作用を刺激した。第７および第９週でのＸ線は、第５週に得られたものと類似しているようであった。動物を術後第９週に屠殺し、尺骨−橈骨を取り出し、写真撮影した。ほとんどの場合、対照の脚では尺骨に大きな欠損がなお見られたが、対照的に、ＴＰ５０８処理した脚では欠損の大部分が良好に塞がっていた。

術後第９週での屠殺後、ねじり試験（ＭＴＳ−８５８ Ｍｉｎｉｂｉｏｎｉｘ機）により修復強度を測定した。結果を表３および４に示す。

１００μｇでは、ＴＰ５０８は、測定した欠損治癒の機械的強度は試験したすべてのパラメータで２倍を越えていた（表３）。より強度の修復は、２００μｇ群で認められ（表４）、ほとんどのパラメータは、低用量処置群でみられたものより約５０％大きかった。

実施例３ ラット軟骨細胞へのトロンビン結合
確立された方法を用いて、ラット関節軟骨細胞の初代培養物を単離し、インビトロ分析用に調製した（Ｋｕｅｔｔｎｅｒ，Ｋ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ９３：７４３−７５０，１９８２参照）。簡単に述べると、軟骨片をラットの肩から切り取り、その軟骨片を３７℃の組織培養培地（ＤＭＥＭ）中、トリプシンで１時間、コラゲナーゼで３時間、撹拌しながら消化した。細胞を高密度（５０，０００細胞／ｃｍ^２）でフラスコに入れ、抗生物質とアスコルビン酸を含むＤＭＥＭ中、５％ＣＯ₂の雰囲気下、３７℃で培養した。

米国特許第５，３５２，６６４号ならびにＣａｒｎｅｙ，ＤＨおよびＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ＤＤ，Ｃｅｌｌ １５：１３４１−１３４９，１９７８に開示されている確立されたトロンビンレセプター結合アッセイを用いて、軟骨細胞への^１２５Ｉ トロンビンの特異的結合を行った。簡単に述べると、高度に精製したヒトトロンビンをヨウ素化し、非特異的結合について補正するために非標識トロンビンと共にまたは非標識トロンビンなしで、軟骨細胞の培養物に添加した。細胞を様々な濃度の標識トロンビンと共にインキュベートし、細胞に結合したトロンビンの量および培地中の遊離トロンビンの量を測定することにより、１細胞あたりのレセプターの数と、当該結合部位に対するトロンビンの親和性を評価することができる。

３つの独立した実験から得た標識トロンビン結合のスキャッチャード解析により、ラット軟骨細胞は平均３０００の超高親和性結合部位（親和性１００ｐＭ）と、２３０，０００の高親和性部位（２７ｎＭ）を発現することが示唆される。

実施例４Ａ ウシ軟骨細胞増殖のＮＰＡＲアゴニスト刺激
実施例１にラット軟骨細胞に関して記載した手順を用いて、ウシ軟骨細胞の初代培養物を調製した。その培養物を２４ウェルプラスチック培養皿に低密度で継代して、１％血清中においた。これらの培養物に濃度１．０または１０μｇ／ｍｌのＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８を単独で添加したところ、細胞増殖は刺激されなかった。これに対し、これらの濃度のＴＰ５０８を少量のトロンビン共同分裂促進因子と共に添加すると、培養３日後に、トロンビン単独の場合に認められた細胞数と比較して小さいが有意な（ｐ＜０．０５）細胞数の増加が起こった。

実施例４Ｂ ウシ軟骨細胞プロテオグリカン合成のＮＰＡＲアゴニスト刺激
プロテオグリカン合成に対するＮＰＡＲアゴニストの効果を決定するために、ウシ軟骨を２×１０５細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、１０％ウシ胎仔血清を含むＤＭＥＭ中で培養した。これらの多層培養物を確立した後、培地を１％血清と１〜１００μｇ／ｍｌの表示した濃度のＴＰ５０８（表５）とを含むＤＭＥＭに毎日交換した。ＴＰ５０８を含むまたは含まない培養培地を毎日交換しながら６日間培養した後、^３５Ｓ 硫酸塩を培地に添加し、さらに２４時間培養を続けた。表５に示すように、高濃度のＴＰ５０８（１００μｇ／ｍｌ）による処理は未処理の細胞と比較して^３５Ｓ 硫酸塩の取込みを１０倍以上増加させた。

実施例５Ａ 培養ラット関節軟骨細胞における増殖合成のＮＰＡＲアゴニスト刺激
ラット関節軟骨細胞を、実施例３に記載したようにトリプシンおよびコラゲナーゼ消化を利用して、ラット関節肩軟骨の切片から単離した。軟骨細胞「３次元」アルギネートビーズ培養物の調製は、Ｇｕｏらが記載した確立された技術（Ｃｏｎｎ．Ｔｉｓｓ．Ｒｅｓ．１９：２７７−２９７，１９９８）を用いて行った。トリプシンを用いて組織培養フラスコから細胞を取り出した後、それらの細胞をアルギネートゲル（１．２％ｗ／ｖ）に懸濁し、２２ゲージ針を通して１０２ｍＭ ＣａＣｌ_２中にゆっくり滴下した。液滴がＣａＣｌ_２と接触すると、ほとんど即座にアルギネートの重合が起こり、ゲルビーズを形成する。次にそのビーズをＤＭＥＭ培養培地で３回洗浄し、３５ｍｍ培養皿に移し、２日毎に培養培地を補給することにより、５％ＣＯ_２雰囲気下、３７℃で培養維持した。

３日間の３次元アルギネート培養後に、３５ｍｍ培養皿からビーズを取り出し、そのビーズを０．９％食塩水で洗浄し、１ｍｌの５５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌを加えることで３７℃で１０分間アルギネートビーズを溶解することにより、軟骨細胞増殖に対するＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８の効果を決定した。溶解したビーズ１ｍｌをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１：１０に希釈し、ＺシリーズＣｏｕｌｔｅｒカウンターで細胞を数えることにより、細胞数を決定した。表６に示すように、ＴＰ５０８は３次元培養における軟骨細胞の増殖を単独で刺激した。

実施例５Ｂ 培養ラット関節軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成のＮＰＡＲアゴニスト刺激
プロテオグリカン合成に対するＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８の効果を決定するために、３次元アルギネート培養物を上述のように調製し、［^３５Ｓ］−硫酸塩の取込みについて測定した。ビーズ培養物を、培地を毎日交換しながら表示した濃度のＴＰ５０８ならびに［^３５Ｓ］−硫酸塩（２０μＣｉ／ｍｌ）に曝露し、［^３５Ｓ］−硫酸塩取込みに関して、７日目に収集した。各時点で５〜１０個のビーズを取り出し、０．９％生理食塩水で３回洗浄し、上記のように０．５ｍｌの５５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌを３７℃で１０分間添加することによって溶解し、液体シンチレーションカウンターで計数した。［^３５Ｓ］−硫酸塩取込み量は、各試料内で、添加したビーズの数について標準化した。表７に示すように、濃度３００ｎＭ（約０．７μｇ／ｍｌ）でのＴＰ５０８処理は単独で［^３５Ｓ］−硫酸塩の取込みを対照に対して約５０％刺激した。３０μＭ ＴＰ５０８（約７０μｇ／ｍｌ）でも大きな刺激が認められたが、この濃度での測定値には大きな相対標準偏差があった。

実施例６ ＴＰ５０８のポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーマイクロスフェアの調製
二重乳化法を使って、ＴＰ５０８を含有するポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマー（ＰＬＧＡ）のマイクロスフェアを調製した。簡単に述べると、マトリックス成分を塩化メチレンに溶解し、ＴＰ５０８を水に溶解した。両者をボルテックスしながら徐々に混合して、水−油型（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを形成させた。さらにボルテックスしながら、そのエマルジョンにポリビニルアルコール（０．３％水溶液）を加えて第２のエマルジョン（Ｏ／Ｗ）を形成させることにより、二重エマルジョン（すなわちＰＬＧＡ液滴と、その液滴内のＴＰ５０８水溶液からなる第２分散相とから構成されるＯ／Ｗ型エマルジョン）を形成させた。相分離により、ＰＬＧＡ液滴は、ＴＰ５０８を保持する空洞を含有する分離したマイクロスフェアを形成した。マイクロスフェアの相分離を引き起こすために、２％イソプロピルアルコール溶液を加えた。粒子を遠心分離によって集めた後、凍結乾燥して残留水分を除去した。マトリックスの組成を変えることにより、様々な放出速度を持つマイクロスフェアを形成させた（表８）。

マイクロスフェアの平均直径をＣｏｕｌｔｅｒカウンターで測定し、薬物捕捉効率は、マイクロスフェアの秤量試料を塩化メチレンに溶解し、放出された薬物を水に抽出した後、２７６ｎｍでの分光光度測定法によって測定した（表９）。

種々のＰＬＧＡマトリックスからのＴＰ５０８放出を測定するために、１．５ｍｌポリプロピレン製微量遠心管に入った１．０ｍｌのＰＢＳに、２０ｍｇのマイクロスフェアを入れた。遠心管を３７℃でインキュベートし、６０ｒｐｍで振とうした。様々な時点で、遠心管を遠心分離し、放出されたＴＰ５０８を含む上清を取り出し、後の分析に備えて凍結した。新しいＰＢＳをマイクロスフェアに加え、インキュベーションを続けた。上清中のＴＰ５０８は、２７６ｎｍでの吸光度によって測定した。各製剤について４つ組で放出測定を行った。製剤ＢおよびＤは３７℃で２８日間のインキュベーション中に検出可能な薬物放出を示さなかった。残りの製剤は全て検出できる量のＴＰ５０８を放出した。ただし、いずれの場合も放出される薬物量は３〜４日以内に検出限界未満（＜１μｇ／ｍｇ−マトリックス／日）になった。製剤ＡおよびＣは最大のＴＰ５０８放出量を示し、捕捉された薬物の６０〜８０％を３〜４日間で放出した。製剤Ｃは最も速い放出速度を示し、これを実施例７に記載するウサギ軟骨欠損モデルでの試験に選択した。

実施例７ ＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８はウサギモデルにおける軟骨成長を刺激する
若い雄ニュージーランドウサギ（２〜３キログラム）（ｎ＝１５）を麻酔し、両側内側縦膝蓋周囲関節切開術を施した。出血を最小限に抑えるために電気メスを使って皮膚、皮下組織および関節嚢を切開した。膝蓋の横転位によって関節面を露出させた。手術用ドリルと尖ったステンレス鋼製ドリルビットとを使って、大腿骨の滑車溝に直径３ｍｍ、深さ１〜２ｍｍの全層欠損を作った。軟骨下骨を突き刺さずに欠損を軟骨下板内に到達させることを目的とした。

ウサギを３群に分割した。各ウサギについて、右および左滑車溝欠損部を同じ治療剤で満たした。この試験では、実施例６で記載されたように調製したＰＬＧＡ制御放出マイクロスフェア中にＴＰ５０８を製剤化した（製剤Ｃ）。このマイクロスフェアを十分量のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８ゲル（５％ｗ／ｖ）と混合して、欠損部に容易に充填できるペースト状の堅さを持つように、マイクロスフェアを固めた。対照群には、ＴＰ５０８を含まないＰＬＧＡマイクロスフェアを両欠損部に与えた。治療群には１欠損あたり１０または５０ｍｇのＴＰ５０８を含有するマイクロスフェアを与えた。各群のウサギ１匹を４週間後に屠殺し、各群の２匹を６週間後に屠殺し、残りのウサギを９週間後に屠殺した。標本を固定し、組織学的解析用の処理を施した。

屠殺の時点で、対照欠損部にはかなりの線維性肉芽組織が認められ、白色軟骨様物質の証拠は見られなかった。これに対し１０μｇ処置群および５０μｇ処置群の欠損部はほぼ均一で密な白色物質で満たされていた。手術後６週間までは、治療欠損部と対照欠損部の間の肉眼的相違はそれほど顕著ではなかった。

４週間試料の組織学的検査から、実際に対照欠損部は炎症細胞および線維芽細胞を含む初期肉芽組織に相当すると思われるもので満たされていることが明らかになった。これに対し、１０および５０μｇ処置欠損部は、多数の軟骨細胞および軟骨形成の初期徴候を持っているように見えた。この効果は６週間目にはさらに劇的に観察された。対照は、少量の結合組織を持つものの、軟骨修復を示す証拠はほとんどなかった。これに対し、１０μｇおよび５０μｇ処置欠損部では、どちらにおいても、欠損部上に形成された硝子軟骨との良好な統合および広範な肋軟骨下修復が起こっているようだった。

９週間ＴＰ５０８処置した欠損部は大部分が硝子様マトリックスを示し、かなりのアグリカン含量を示す証拠が、陽性のサフラニンＯ染色によって明らかになった。ほとんどの例では、修復部位と元からある組織の間にアグリカン含量の相違はなかった。組織学的検査結果は、Ｏ’Ｄｒｉｓｃｏｌｌら、Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇ． １２６：１４４８−１４５２（２０００）のスキームに由来してＦｒｅｅｄら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓ． ２８：８９１−８９９（１９４４）が作った分類方法を使用し、正常な関節軟骨を２５の最高スコアとして、定量的に評価した。実験的ＴＰ５０８処置欠損は対照欠損より有意に高い平均スコアを記録した（表１０）。

ペプチド処置欠損部は滑らかな関節面を伴って修復し、修復組織と元からある組織との接合部分は、典型的には十分に接合されていた。対照修復組織の質はほとんど線維軟骨であり、関節面の質も良くないと判断された。修復組織と元からある組織の間の接合部での統合状態は通常不十分だった。総合的にみて、ＴＰ５０８を使って修復された軟骨の質は、対照未治療欠損部よりも有意に改善された。この修復組織の質の改善は、関節バイオメカニクスの耐久性と機能性の向上、および外傷性軟骨傷害を負った患者における変形性関節症の発生率の低下につながるはずである。

まとめると、ＮＰＡＲアゴニストＴＰ５０８含有マイクロスフェアで処置した尺骨骨切り術部は、骨鉱化作用および骨成長の証拠を示したが、骨伝導性マイクロスフェアを投与した対照骨切り術部のほとんどにおいて、骨成長はなく、および／または空隙領域の充填は良好でなかった。機械的強度および剛性の機械試験により、このモデルにおいてＴＰ５０８の骨形成に対する有意な効果が確認された。ＴＰ５０８は、ＴＰ５０８無しでは骨形成が起こらない部位において骨形成を誘導したため、この骨誘導の発見は、ＴＰ５０８なしで治癒しうる骨折または小間隙欠損における通常の骨折治癒の速度をＴＰ５０８が加速するというこれまでの研究とは異なるものである。

本発明を具体的に示し、その好ましい実施態様について説明したが、本願特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その形態と詳細に様々な改変を施しうることは、当業者には理解されるだろう。

好ましい一実施形態では、トロンビンペプチド誘導体は、セリンエステラーゼ保存配列と、より特異的なトロンビンアミノ酸配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ（配列番号：３）を有するポリペプチドとを含む。このタイプのトロンビンペプチド誘導体の一例はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｘ₁ −Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｘ₂−Ｖａｌ（配列番号：４）を含む。Ｘ₁ およびＸ₂ は上記の定義に従う。トロンビンペプチド誘導体が配列番号：４を含む場合、該誘導体は、配列番号：５のアミノ酸配列（Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ）またはそのＮ末端切形型断片を持つことが好ましい。ただし、当該トロンビンペプチド誘導体中の１〜９位にある０、１、２または３個のアミノ酸は、配列番号：５の対応する位置にあるアミノ酸とは異なるものとする。配列番号：５中の対応するアミノ酸と相違するトロンビンペプチド誘導体中のアミノ酸は好ましくは保存的な置換であり、より好ましくは高度に保存的な置換である。「Ｎ末端切形型断片」とは、Ｎ末端から１個のアミノ酸または一続きのアミノ酸、好ましくは６個以下の一続きのアミノ酸、より好ましくは３個以下の一続きのアミノ酸を除去した後に残っている断片を指す。

トロンビン誘導体ペプチドの生理学的に機能的な等価物はまた、本発明の範囲内にある。例えば、かかるペプチドは、カルボキシル末端でアミド化されるか、アミノ末端でアシル化されるかまたはその両方である。特定の態様では、配列番号：３のアミノ酸配列は、以下の生理学的に機能的な等価物：Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（配列番号：６）、Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：７）またはＡｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ₂（配列番号：８)（「Ac」はアセチル基である)。

Claims (44)

1. 骨誘導が必要な被験体の部位で骨成長を刺激する方法であって、トロンビン誘導体ペプチドの生理学的に機能的な等価物の治療有効量を該部位に投与することを含む方法。
2. 前記部位が骨移植の必要な部位である請求項１記載の方法。
3. 前記部位が、骨の分節間隙、骨空隙、または非癒合骨折部にある請求項１記載の方法。
4. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物が、以下の構造式：
   Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ；
   式中、Ｒはセリンエステラーゼ保存配列である
   で表されるポリペプチドを含有する請求項１記載の方法。
5. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物が約１２〜約２３個のアミノ酸を有する請求項４記載の方法。
6. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物がアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有する請求項５記載の方法。
7. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物がアミノ酸配列Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：７）を有する請求項５記載の方法。
8. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物がアミノ酸配列Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：８）を有する請求項５記載の方法。
9. トロンビンペプチド誘導体が、移植可能な生体適合性担体をさらに含有する医薬組成物で投与される請求項６記載の方法。
10. 移植可能な生体適合性担体が骨誘導性マトリックスである請求項６記載の方法。
11. 担体がポリ乳酸／ポリグリコール酸ホモポリマーまたはコポリマーを含有する請求項６記載の方法。
12. 移植可能な生体適合性担体およびトロンビン誘導体ペプチドの生理学的に機能的な等価物を含有してなる医薬組成物。
13. 担体が骨誘導性である請求項１２記載の医薬組成物。
14. トロンビンレセプターアゴニストの生理学的に機能的な等価物がトロンビンペプチド誘導体であり、以下の構造式：
    Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ；
    式中、Ｒはセリンエステラーゼ保存配列である
    により表されるポリペプチドを含有してなる請求項１３記載の医薬組成物。
15. 担体が生分解性合成ポリマーである請求項１２記載の医薬組成物。
16. 生分解性合成ポリマーがポリ乳酸／ポリグリコール酸ホモポリマーまたはコポリマーである請求項１５記載の医薬組成物。
17. 担体が、コラーゲン、フィブリン、リン酸カルシウム塩、硫酸カルシウム、グアニジン抽出同種異系骨またはその組み合わせを含有してなる請求項１２記載の医薬組成物。
18. 担体が注射可能である請求項１２記載の医薬組成物。
19. 担体がポリ（プロピレンフマレート）溶液またはリン酸カルシウムセラミックペーストである請求項１２記載の医薬組成物。
20. 医薬組成物が微粒子として投与される請求項１２記載の医薬組成物。
21. 医薬組成物が骨誘導を必要とする部位に適用される前に予め形成される請求項１２記載の医薬組成物。
22. トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有してなる請求項１４記載の医薬組成物。
23. トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：７）を有してなる請求項１４記載の医薬組成物。
24. トロンビンペプチド誘導体がアミノ酸配列Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：８)を有してなる請求項１４記載の医薬組成物。
25. 骨誘導を必要とする被験体の部位で骨成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む、方法。
26. 被験体の骨移植を必要とする部位で骨誘導を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む、方法。
27. 被験体の分節骨間隙、骨空隙または非癒合骨折で骨成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有するペプチドの治療有効量を骨間隙、骨空隙または非癒合骨折に投与することを含む、方法。
28. 軟骨成長または修復を必要とする被験体の部位で軟骨成長または修復を刺激する方法であって、トロンビン誘導体ペプチドの生理学的に機能的な等価物の治療有効量を該部位に投与することを含む、方法。
29. 前記部位が関節炎の関節である請求項２８記載の方法。
30. 前記部位が軟骨損傷または損失について処置される請求項２８記載の方法。
31. 前記部位が外傷性傷害による軟骨損傷または損失について処置される請求項２８記載の方法。
32. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物が以下の構造式：
    Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｒ；
    式中、Ｒはセリンエステラーゼ保存配列である
    により表されるポリペプチドを含有する請求項２８記載の方法。
33. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物が約１２〜約２３アミノ酸を有する請求項３２記載の方法。
34. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物がアミノ酸配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有する請求項３３記載の方法。
35. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物がアミノ酸配列Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ（配列番号：７）を有する請求項３３記載の方法。
36. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物がアミノ酸配列Ａｃ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：８）を有する請求項３３記載の方法。
37. トロンビンペプチド誘導体の生理学的に機能的な等価物が、移植可能な生体適合性担体をさらに含有する医薬組成物で投与される請求項３４記載の方法。
38. 担体がポリ乳酸／ポリグリコール酸ホモポリマーまたはコポリマーを含有する請求項３４記載の方法。
39. 軟骨成長または修復を必要とする被験体の部位で軟骨成長または修復を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む、方法。
40. 被験体の関節炎の関節で軟骨成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む、方法。
41. 被験体の軟骨損失の処置対象の部位で軟骨成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む、方法。
42. 被験体の外傷傷害による軟骨損失の処置対象の部位で軟骨成長を刺激する方法であって、配列Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｙ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−ＮＨ_２（配列番号：６）を有するペプチドの治療有効量を該部位に投与することを含む、方法。
43. トロンビン誘導体ペプチドの生理学的に機能的な等価物の刺激量の存在下で軟骨細胞培養する工程を含む改良を有する、インビトロで軟骨細胞を培養する方法。
44. 治療有効量の培養軟骨細胞を軟骨の修復または成長を必要とする被験体の部位に投与することをさらに含む請求項４３記載の方法。