CN1622826A - 用凝血酶肽衍生物刺激骨生长和软骨形成 - Google Patents

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Abstract

这项发明揭示一种在患者需要骨诱导或软骨修复的部位刺激骨生长的方法。该方法包括对该部位施用有效治疗量的非蛋白水解激活的凝血酶受体促效药的步骤。此外，揭示了一种刺激chrondroxytes在生物体外增殖和扩充的方法。该方法包括在存在刺激数量的NPAR促效药的情况下培养软骨细胞。

Description

用凝血酶肽衍生物刺激骨生长和软骨形成
政府支持
本发明全部或部分地得到来自国家健康研究院按合同1 R43AR45508-01和2 R44 AR45508-02授予的基金支持。政府在本发明中有某些权利。
本发明的背景
哺乳动物骨组织具有再生并借此修复损伤和其它缺陷的非凡能力。例如，骨生长通常足以致使最简单的和细微的骨折完全恢复。但是，不幸的是，存在骨生长不能恰如其分地获得可接受的结果的许多损伤、缺陷或症状。例如，骨再生通常不在大的空洞或空间中发生。所以，骨折不能愈合，除非这些碎片靠得很近。如果损伤的结果造成大量的骨组织丢失，愈合过程可能是不完全的，从而导致不如意的外观和/或机械的结果。这经常是骨折不愈合或严重外伤造成的骨损伤的情况。组织生长通常在例如外科手术手术切除肿瘤或囊肿引起的骨中空洞或区段性裂隙中也是不适当的。在其它情况中，可能需要刺激骨不正常的，即异位的生长。当两个或多个椎骨诱导融合时，脊骨融合减轻较低的背部疼痛是一个需要的异位骨形成的例子。通常，这样的裂隙和区段性缺陷需要骨移植来成功地修复或填充裂隙。开发有效的骨移植取代方法将消除在移植过程中从第二外科手术部位收获骨的需要，从而明显地减少患者经受的不适和发生供体部位愈合综合症的危险。
在那些如果未经处理这样的骨生长就不会正常地发生的部位刺激或诱导骨生长的化合物被称为“骨诱导”性的。骨诱导化合物作为处理上述症状的药物具有巨大的价值。许多骨诱导蛋白质已经利用重组技术鉴定，分离和表达。例子包括在美国专利第5,902,705号和WO95/16035中公开的骨形态蛋白质(BMP)。但是，利用重组蛋白质作为治疗试剂通常具有许多缺点，包括生产费用，体内生物降解和半衰期短。因此，科学家连续地研究没有前面提到的缺点的新的骨诱导剂。
进而言之，与其他大多数组织不同，软骨在受伤后不会自己修复。软骨是一种非肌肉性组织，其主要组成是软骨特异性细胞，即软骨细胞，特殊的胶原蛋白，以及蛋白聚糖。软骨的这种在受伤、患病和手术后无法自行修复的特性，是关节表面的受损以及半月板受伤之后的恢复的主要限制因素。骨关节炎，这种承重关节表面的主要退化疾病，主要起因于软骨表面的损伤和腐蚀，并且在50岁以上的人群中的25％中存在。在美国，有超过2000万的人患有骨关节炎，每年的医疗花费超过86亿美元。此外，对于急性关节受伤(半月板损害、膝关节表面损伤、以及软骨软化)后的软骨修复，每年的花费都超过10亿美元。因此，在由于软骨退化和急性损伤后的软骨损伤部位的康复，就需要新的治疗途径。
本发明的概述
现在已经发现，激活非蛋白质凝血酶受体的化合物是骨诱导的。例如，化合物TP508，非蛋白质水解凝血酶受体的促效药刺激在雄性新西兰兔子的尺骨中产生的区段性关键大小缺陷中的骨生长(实施例2)。如同用X射线显示和用组织学和机械测试证明的那样，在与未处理的对照比较时，在用剂量为100μg和200μg的TP508所诱导的骨形成方面有明显的增加。根据这些结果，在本文中揭示刺激患者骨生长的新方法和新的可移植药物组合物。
现在已经发现，从关节的软骨分离出来的软骨细胞响应激活非蛋白水解的凝血酶细胞表面受体(在下文中用“NPAR”表示)的化合物。例如，软骨细胞用大约0.1nM(3000个部位)和27nM(230,000个部位)的表观亲合性表示每个细胞大约233,000个凝血酶粘合部位(实施例3)。此外，化合物TP508，非蛋白水解的凝血酶受体的促效药在用凝血酶作为共有丝分裂原的情况下进行培养时刺激牛的软骨细胞的增殖(实施例4A)而且它本身刺激在三维基质培养物中培养的大鼠软骨细胞的增殖(实施例5A)。这同一的TP508化合物还如同通过并入35S硫酸盐实测的那样刺激在牛的软骨细胞(实施例4B)中和大鼠软骨细胞的三维培养物(实施例5B)中的蛋白多糖合成。这些生物体外的实验证明NPAR促效药在从关节软骨分离的软骨细胞方面能刺激增殖和基质生产。附加的体内实验证明以持续不变的释放处方把TP508递送到兔的延伸到软骨下的骨骼中的滑车状的树丛软骨缺损导致软骨缺损的修复，包括软骨下的骨骼的修复，正常软骨表面的恢复和新形成的软骨与缺损区域中未受伤害的软骨外侧的整合(实施例7)。
根据在前面段落中报告的结果，在本文中揭示了刺激体内软骨细胞生长和患者的软骨修复的新方法和用来把药物组合物递送到关节的缺损处以帮助表面修复和防止关节恶化的新递送方法。
本发明的一个实施方案是在患者需要骨诱导的部位刺激骨生长的方法。该方法包括对该部位施用治疗有效量的非蛋白水解激活的凝血酶受体的促效药的步骤。
本发明的另一个实施方案是包括可植入的生物兼容的载体和诸如凝血酶肽衍生物的生理功能等价物之类NPAR促效药的药物组合物。
本发明的这些方法指向刺激患者的骨生长，而且能被用在骨生长将不发生、缺乏用自体骨移植或骨生长素给药处理的部位。该方法涉及非蛋白水解的凝血酶受体的促效药的给药。这样的促效药包括与人类凝血素的氨基酸508和530之间的区段有同源性的小肽。这些小肽大批量制备费用并不高，而且在低剂量时也是骨诱导的。此外，它们的冻干形式在5℃和60％相对湿度下储存时至少稳定30个月。
另一方面，本发明指向在患者需要软骨生长、修复或再生的部位刺激软骨生长、再生或修复的方法。该方法包括对受伤部位施用治疗有效量的诸如凝血酶肽衍生物的生理功能等价物之类的NPAR促效药的步骤。
本发明进一步的实施方案指向刺激软骨细胞在生物体外的增殖和扩充的方法。该方法包括在存在刺激量的NPAR促效药的情况下培养软骨细胞。
本发明的详细描述
“骨诱导”指的是在如果部位保持未被处理将很少或不发生骨生长的患者体内的部位刺激骨生长。可能从骨生长的诱导得到治疗益处的部位被称为“需要骨诱导的”部位。例子包括不愈合的骨折或其它严重的或大面积的骨损伤。应该注意到，骨生长正常地发生在骨损伤处，例如简单的或细微的骨折和只有小裂隙不需要进一步治疗的对接好的复杂的骨折。这样的损伤不认为是“需要骨诱导的”。
简单的骨折修复似乎完全不同于填充不愈合的骨折、区段性裂隙或因除去骨肿瘤或囊肿造成的骨空腔所必需的骨形成的诱导。大于0.5厘米的区段性裂隙通常是需要骨诱导的，然而大于0.6厘米、0.7厘米、0.8厘米、0.9厘米、1.0厘米或1.5厘米的区段性裂隙通常是需要骨诱导的。这些情况需要骨移植或通常使用某种类型的基质或支架作为骨生长替代品的新的骨生长的诱导。诱导的骨生长诱导的骨生长也可以在患者的某些部位具有治疗优势，这些部位被称为“异位的”部位，在那里通常没有发现骨组织，例如，需要骨移植或骨融合的部位。融合通常用来通过使一个或几个椎骨和其相邻部分物理地结合治疗较低的背疼痛。这样的融合产生的骨骼位于未被骨组织正常占据的部位。在这些异位部位的骨诱导可作为“移植的替代”，借此在椎骨之间诱导的骨生长取代移植而且避免了需要二次手术采集用于移植过程的骨骼。骨生长的诱导对于治疗后天的和先天的颅面的和其它骨骼的或牙齿的畸形(参见，例如，Glowacki等人，Lancet 1：959(1981))；完成需要替换失去的骨骼或增大骨骼(例如颌骨)的牙齿和牙周重建；补充因牙周疾病造成的牙槽骨的损失，以推迟或防止掉牙(参见，例如，Sigurdsson等人，J.periodontal.，66：511(1995))也是需要的。
此外，需要软骨生长、修复或再生的部位是在患骨关节炎的患者身上发现的。骨关节炎或变性的关节疾病是以疼痛和失去功能为特征的进展缓慢的不可逆的往往单关节的疾病。疼痛和软弱无力的根本原因是作为疾病的主要症状之一的软骨退化。透明的软骨是覆盖骨骼末端的平放在关节(例如，膝关节)中间的柔韧性组织。沿着脊骨在骨骼中间也已经发现它。软骨是平滑的，从而为摩擦最小的稳定的柔性运动创造条件，而且是抵抗压缩的和能够分散外加的载荷的。随着骨关节炎逐渐发展，软骨的表面和暴露的下层骨骼变成不规则的。代替流畅的，骨关节表面相互摩擦而不是平稳地滑行，从而导致僵硬和疼痛。被损坏的软骨的再生和新的软骨的生长在这些患关节炎的部位将减轻疼痛和恢复与骨关节炎相关的功能缺损。
软骨损伤还能因受伤或外科手术造成的损伤发生。运动损伤是软骨损伤的共同原因，尤其是关节，例如膝关节。外伤对软骨的损伤能导致同样类型的功能损害。所以，患者身上因外伤或疾病已损坏的有软骨的部位是需要治疗的，以便恢复或促进软骨的生长。
申请人已经发现，刺激或激活NPAR、NPAR促效药的化合物是骨诱导的。申请人已经进一步发现，刺激或激活NPAR的化合物能刺激软骨细胞增殖。软骨细胞是构成大约1％体积的软骨和取代退化的基质分子以维持组织的正确的体积和机械性质的细胞。
申请者还发现，刺激或激活NPAR的化合物刺激软骨细胞中的蛋白多糖合成。蛋白多糖是主要的软骨成分。根据这些结果，申请者曾把按持续释放的处方制备的NPAR促效药TP508递送到兔子的滑车状树丛软骨中的缺损处，并且发现肽刺激缺损的修复，这包括软骨表面正常的新软骨的形成。肽还刺激这种新软骨的成层和进入邻近的未受损伤的软骨的整合和软骨下骨骼的重建。结论是NPAR促效药在对需要软骨生长和/或修复的部位给药的时候能诱导软骨生长和修复。
NPAR是出现在大多数细胞的表面上的高亲合性的凝血酶受体。这个NPAR成分主要是负责凝血酶、不通过蛋白水解激活的凝血酶和凝血酶衍生的肽对细胞的高亲合性的粘合。NPAR似乎居中调停许多凝血酶发起的不依赖其蛋白水解活性的细胞信号。一个这样的信号的实例是用扣除杂交法识别的膜联蛋白V和其它分子的上调(参阅Sower等人，Experimental Cell Reseach 247：422(1999))。所以，NPAR是用它在细胞表面与凝血酶的高亲合性的交互作用和它被凝血酶的无蛋白水解活性的衍生物和凝血酶衍生肽促效药活化为特征的，下面将予以描述。NPAR的活化能根据它的促效药当有亚促分裂浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的或与用于对凝血酶受体高亲合性粘合的125I-凝血酶竞争的分子存在时加到纤维原细胞中的时候刺激细胞增殖的能力进行化验，如同在美国专利第5,352,664和5,500,412号中和在Glenn等人，J.Peptide Reseach 1：65(1988)中描述的那样。
NPAR区别于其它的凝血酶粘合蛋白质和用于凝血酶的通过蛋白水解激活的受体的克隆家族，包括受体PAR1、PAR2、PAR3和PAR4。PAR1具有特异的凝血酶裂解部位，该部位允许凝血酶裂解暴露出充当折回自身诱导它的激活的系留配体的新的氨基末端区(参见，Vu等人，Cell 64：1057(1991))。PAR2具有相似的激活机制，但原则上是被类似于胰蛋白酶的酶激活的(参见，Zhong，等人，J.Biol.Chem.，267：16975(1992))。PAR3也具有相似的激活机制，并且似乎是作为血小板中的第二个凝血酶受体起作用的(参见，Ishihara，等人，Nature 386：502(1997))。PAR4已在小鼠的巨核细胞中检测到，而且研究表明它在人类血小板中也起作用(参见，Kahn，等人，Nature，394：690(1998))。与这些PAR受体相反，NPAR的激活不需要蛋白质水解的裂解。
几条线的证据表明，NPAR不同是与PAR受体截然不同的：(1)细胞的群体已被分离，完全表达了功能性PAR1受体，但由于在NPAR信号转导途径中有缺陷，所以对凝血酶没有反应(参见，Kim，等人，J.Cell Physiol，160：573(1994))；(2)亲和力高的嗜中性粒细胞粘合125I凝血酶和它们的趋化性是受不通过蛋白质水解激活的凝血酶或NPAR促效药刺激的(参见，Ramakrishnan和Carney，Mol.Biol.Cell 4：1993(1993))，但是它们不表达PAR1(参见Jenkins，等人，J.Cell Sci.，108：3059(1995))；(3)IIC9纤维原细胞过度表达PAR1，但不以高亲和力粘合凝血酶(参见，Kim，D.Ph.D.Dissertation.Galveston，The University of TexasMedical Branch at Galveston，1995；和Low等人，“Cancer Cell3/Growth Factors and Transformation(癌症细胞3/生长因子和转化)”，Cold Spring Harbor Laboratory，New York)；和(4)NPAR促效药对来自那些PAR受体促效药肽的基因表达有截然不同的影响(参见，Sower等人，Experimental Cell Research 247：422(1999)。
NPAR促效药的一个例子是凝血酶肽衍生物，即氨基酸不超过大约50个的优选地氨基酸不超过大约30个的对于人类凝血酶与凝血酶原氨基酸508-530(SEQ ID NO.5)相对应的片断具有足够的同源性的多肽，它能激活NPAR。本文所述的凝血酶肽衍生物优选具有大约12-23个氨基酸，更优选具有大约19-23个氨基酸。凝血酶肽衍生物的一个例子包括结构式(I)代表的成分：
Asp-Ala-R      (I)
R是丝氨酸酯酶保守区域。丝氨酸酯酶，例如，胰蛋白酶、凝血酶胰凝乳蛋白酶等等，具有高度保守的区域。“丝氨酸酯酶保守区域”指的是具有这些保守区域之一的氨基酸序列的多肽，或者是与这些保守区域之一充分同源的，以致凝血酶肽衍生物保持激活NPAR的能力。
在一个实施方案中，丝氨酸保守序列具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或有SEQ IDNO.1的氨基酸序列的多肽的C末端截断的片段。但是，应该理解，在丝氨酸保守序列中的0、1、2或3个氨基酸可以不同于在SEQ ID NO.1中对应的氨基酸。优选的是，在不同于SEQ ID NO.1中相对应的氨基酸的丝氨酸保守序列中的氨基酸是保守置换，而且更优选地是高度保守置换。“C末端截断的片段”指的是在从C末端除去一个氨基酸或一批氨基酸后剩余的片段，所述的片段具有至少6个，更优选至少9个氨基酸。
更优选的是，丝氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO.2(Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val)的氨基酸序列；X1是Glu或Gln，X2是Phe，Met，Leu，His或Val，或其具有至少6个氨基酸，优选具有至少9个氨基酸的C末端截断的片段。
在优选的实施方案中，凝血酶肽衍生物包括丝氨酸酯酶保守序列和具有多个特异凝血酶氨基酸序列Arg-Gly-Asp-Ala(SEQID NO：3)的多肽。这个类型的凝血酶肽衍生物的一个例子包括Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val(SEQID NO.4)。X1和X2如上定义。当凝血酶肽衍生物包括SEQ ID NO.4时，它优选地具有SEQ ID NO.5的氨基酸序列(Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)，或其N末端截断的片段，只要在凝血酶肽衍生物中在位置1-9的0、1、2或3个氨基酸不同于在SEQ ID NO.5的对应位置的氨基酸即可。优选地，在不同于SEQ ID NO.5中对应的氨基酸的凝血酶肽的衍生物中的氨基酸是保守置换，更优选是高度的保守置换。“N末端截断的片段”指的是在从N末端除去一个氨基酸或一组氨基酸之后剩余的片段，优选一组不超过6个氨基酸，更优选一组不超过3个氨基酸。
凝血酶衍生肽的生理功能等价物包括在细节方面不同于不影响作为NPAR促效药的肽的功能的凝血酶衍生物的分子。这样的细节可能包括但不限于本文中描述的氨基酸置换和调整，例如，羧基末端的酰胺化，氨基末端酰化，多肽对生理上惰性的载体分子的共扼缀合，或按照丝氨酸酯酶保存序列的序列变更。
凝血酶衍生肽的生理功能等价物也在本发明的范围之内。例如，这样的肽能在羧基末端被酰胺化，在氨基末端被酰化或两者。在特定的实施方案中，SEQ ID NO.3的氨基酸序列是表现为下面的生理功能等价物：Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO.6)，Ac-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-AlaCys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO.7)或Ac-Ala-Gly-TryLys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO.8)(“Ac”是乙酰基)。
羧基末端的酰胺化能用技术上已知的任何方法来实现。因此，C-末端氨基酸是用结构式(II)表达的：
-NH-CHR-C(O)-NR1R2        (II)，
其中R1和R2都单独选自H、C1-C6烷基，而且R1和R2与氮结合一起形成非芳香族的杂环，例如吡咯烷基、哌嗪基、吗啡灵基(morphilinyl)或piperdinyl。R1和R2优选是H。“-Val-NH2”意思是-NH-CH[-CH-(CH3)2]-CONH2。
氨基末端的酰化能用技术上已知的任何方法得以实现。因此，N-末端氨基是用结构式(III)表达的：
R1-C(O)-NH-CHR-C(O)-        (III)，
其中R是氨基酸支链和R1是形成支链和直链的C1-C6烷基。R优选是甲基(-CH3)。
TP508是凝血酶肽衍生物的生理功能等价物的例子，并且具有SEQ ID NO.6的氨基酸序列。
“保守置换”是用另一个具有同样的净电荷和近似相同的大小和形状的氨基酸取代某个氨基酸。当在它们的侧链中的碳数目和杂合原子的区别不超过约4个，具有脂肪族的或取代脂肪族的氨基酸侧链的氨基酸当在它们的侧链中碳和杂原子的总数相差不超过大约4的时候具有近似相同的大小。当在它们的侧链中支链的数目相差不超过1的时候，它们具有近似相同的形状。在它们的侧链中具有苯基或取代苯基的氨基酸认为具有近似相同的大小和形状。下面列出的是5组氨基酸。用来自同一组的另一个氨基酸取代多肽中的氨基酸导致保守置换：
组I：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸，和具有C1-C4脂肪族的或C1-C4羟基取代的脂肪族侧链(直链的或有单支链的)的非天然存在的氨基酸。
组II：谷氨酸、天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族侧链(无支链或有一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组III：赖氨酸、鸟氨酸、精氨酸和具有胺或胍基取代的C1-C4脂肪族侧链(无支链或有一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组IV：谷氨酸、天冬氨酸和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族侧链(无支链或有一个分支点)的非天然存在的氨基酸。
组V：苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。
“高度保守置换”是用在侧链中具有相同的官能团而且具有几乎相同的大小和形状的另一个氨基酸取代某个氨基酸。有脂肪族的或取代脂肪族的氨基酸侧链的氨基酸当在它们的侧链中碳和杂原子的总数相差不超过两个时几乎具有相同的大小。当它们在它们的侧链中具有相同的分支数目的时候，它们几乎具有相同的形状。高度保守置换的例子包括：缬氨酸取代亮氨酸、苏氨酸取代丝氨酸、天冬氨酸取代谷氨酸、苯基甘氨酸取代苯基丙氨酸。非高度保守置换的例子包括丙氨酸取代缬氨酸、丙氨酸取代丝氨酸和天冬氨酸取代丝氨酸。
其它的NPAR促效药包括与NPAR结合并激活NPAR的小的有机分子。这种类型的促效药能方便地用高通过量筛选予以识别，例如，如同在美国专利第5,352,664和5,500,412号中揭示的那样，采用当存在亚有丝分裂原浓度的凝血酶或激活蛋白质激酶C的分子时加到纤维原细胞中的时候评估分子刺激细胞增殖的能力的化验。美国专利第5,352,664和5,500,412号的全部内容在此通过引证被并入。
术语“NPAR促效药”还包括已知激活NPAR的化合物和化合物的组合。例子是在美国专利第5,352,664和5,500,412号中揭示的并且包括DIP-α-凝血酶和DIP-α-凝血酶与乙酸肉豆蔻酸佛波酯的组合。
用于本文描述的药物组合物的可移植的生物兼容的载体作为适合用来刺激骨生长的NPAR促效药的递送或支持系统起作用。生物兼容的载体应该是无毒的、不引起炎症的、不产生免疫性的，和在移植部位没有不需要的反应的。适当的载体用于释放活性成分，优选在移植部位随着时间的推移缓慢地、持续地释放。
适当的载体包括骨始祖细胞可以在其中迁移的多孔基质。成骨细胞经常可以附着在这样的多孔基质上，然后可以作为骨和组织生长的支架。在某些应用中，载体应该具有足够的机械强度以维持其三维结构和帮助支持正在结合或嫁接到一起的骨节的固定。为组织生长提供支架的多孔基质可以加速骨生长的速度，而且被说成是“骨传导的”。骨传导载体是非常优选供本文描述的药物组合物使用的。
适当的骨传导载体的例子包括胶原(例如，小牛皮胶原)、纤维蛋白、磷酸钙陶瓷(例如，羟磷灰石和磷酸三钙)、硫酸钙、萃取掉胍的同种异体骨和它们的组合。许多适当的载体是买得到的，例如，作为羟磷灰石、磷酸三钙和纤维状胶原的混合物的COLLOGRAFT(Collagen Corporation，Palo Alto，CA)和作为通过海洋中的珊瑚碳酸钙转化成结晶的羟磷灰石形成的羟磷灰石生物基质INTERPORE(Interpore International，Irvine CA)。
许多合成的可生物降解的聚合物可以作为具有持续释放特征的骨传导载体。关于这些聚合物的描述可以在下述参考文献中找到：Behravesh等人，Clinical Orthopaedics 367：S118(1999)，和Lichun等人，Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth Factorsin“Contolled Drμg Delivery-Designing Technologies for Future”Park and Mrsny eds.，American Chemical Society，Washington，DC(2000)。这些参考文献的全部内容在此通过引证被并入。这些聚合物的例子包括聚α羟基酯，例如，聚乳酸/聚乙醇酸的均聚物和共聚物、polyphosphazene(PPHOS)、聚酸酐和聚(富马酸丙二酯)。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)的均聚物和共聚物是技术上已知的持续释放载体。释放速度可以通过技术人员改变聚乳酸与聚乙醇酸的比例和聚合物分子量来调整(参见，Anderson，等人，Adv.Drμg Deliv.Rev.28：5(1997)，其全部内容在此通过引证被并入)。聚(乙二醇)并入聚合物作为掺混物形成微粒载体进一步允许改变活性成分的释放方案(参见，Cleek等人，J.Control Release，48：259(1997)，其全部内容在此通过引证被并入)。诸如磷酸钙和羟磷灰石之类陶瓷制品也可以掺入该配方以提高机械性能。
PPHOS聚合物在聚合物骨架中含有替代碳的氮和磷，如下面的结构式(IV)所示：
Figure A0282856800211
聚合物的特性可以通过适当地改变与聚合物骨架结合的侧基R和R’来调整。例如，PPHOS的降解和释放药物可以通过改变水解时不稳定的侧基的数量来控制。例如，较多地掺入咪唑基和乙二醇取代的PPHOS，可以观察到降解速度的增加(参见Laurencin等人，J Biomed Mater.Res.27：963(1993)，其全部内容在此通过引证被并入)，从而提高药物的释放速度。
结构式(V)所示的聚酸酐具有明确限定的降解和释放特性，这些特性可以通过包括不同数量的疏水的或亲水的单体(例如，葵二酸和1，3-双(p-羧基苯氧基)丙烷)来控制(参见Leong等人，J.Biomed.Mater.Res.19：941(1985)，其全部内容在此通过引证被并入)。为了改善机械强度，酸酐往往与酰亚胺共聚，形成酸酐/酰胺的共聚物。适合整形外科应用的酸酐/酰胺共聚物的例子是聚(苯三酰亚氨-甘氨酸-共-1，6-双(羧氧苯氧基)己烷和苯四酰亚胺丙氨酸：1，6-双(p-羧氧苯氧基)己烷的共聚物。
Figure A0282856800221
聚富马酸丙二酯(PPF)是非常合意的生物兼容的可移植的载体，因为它们是可注射的可原位聚合的可生物降解的物质。“可注射”意味着物质可以通过用于标准的注射糊状物和凝胶的针头用注射器注射。PPF与乙烯基单体(N-乙烯吡咯烷酮)和引发剂(过氧化苯甲酰)合并形成可以原位聚合的注射液。它特别适合填充多种大小和形状的骨骼缺陷(参见Sμggs等人，Macromolecules30：4318(1997)，Peter等人，J.Biomater.Sci.Poly.Ed.10：363(1999)和Yaszemski等人，Tissue Eng.1：41(1995)，它们的全部内容在此通过引证被并入)。
本发明的药物组合物可以通过在需要骨诱导的部位移植完成给药。“移植”或“在某个部位给药”意思是足够接近需要治疗的部位，以致当NPAR促效药从药物组合物中释放出来的时候在该部位发生骨诱导(例如，在有NPAR促效药存在时有骨生长，而在它不存在时很少有或没有生长)。
药物组合物在需要时可以在外科手术之前塑造成形，或者由医生或技术人员在外科手术期间塑造成形。优选的是使基质横越组织缺陷塑造成形并且采取新组织预期的形状。例如，在修复不愈合的骨骼缺陷的情况下，需要的是利用横越不愈合的缺陷尺寸。在骨形成过程中，该物质被人体缓慢地吸收并且按植入片的形状或其非常接近的形状被骨骼替代。作为替代，药物组合物可以以微粒或微珠的形式对该部位给药。微粒可以通过外科手术把需要骨诱导的部位暴露出来然后借助涂抹、吸移、喷洒，注射等方法将微粒施加到该部位上或其附近使之与该部位接触或放在该部位附近。微粒也可以用内窥镜或腹腔镜递送到该部位。PLGA微粒的制备和它们刺激骨生长的用途在实施例1和2中予以描述。
在又一个替代方案中，药物组合物可以在对需要骨诱导的部位给药之前部分地封装在诸如网、线形基质、不锈钢骨架、线形内体融合骨架之类的支承物理结构中。
应用本发明的药物组合物的另一个替代方案是注射。可注射的组合物包括上述的聚(富马酸丙二酯)的共聚物溶液和磷酸钙陶瓷糊(参见Schmitz等人，J.Oral Maxillofacial Surgery57：1122(1999)，其全部内容在此通过引证被并入)。可注射的组合物可以直接注射到需要骨诱导的部位，并且可以方便地用来填充空隙和融合骨，而不需要侵入性的外科手术。
NPAR促效药也可以借助非移植的方法给药，例如，将包括在可接受的药物载体中的NPAR促效药的溶液直接应用于该部位或其附近。溶液的给药可以按常规完成，例如，通过注射器、通过外科手术打开或通过肠胃外给药到需要的部位。标准的药物配方技术可以利用，例如，在Remington的Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，Easton，PA.)中描述的那些。适合肠胃外给药的药物载体包括，例如，无菌水、生理盐水、无菌盐水(含大约0.9％mg/ml的苯甲醇的盐水)、磷酸缓冲盐水、Hank溶液，Ringer乳酸盐等等。
本发明的NPAR促效药或可移植的药物组合物可以连同可移植的假体装置一起使用。例如，治疗有效量的药物组合物可以放在可植入的假体移植物与需要骨诱导的部位邻接的表面区域上。作为替代，假体装置有这样的构造，以致它能够按预定的速度连续地释放可移植的药物组合物或NPAR促效药。假体可以用包含金属或陶瓷的材料制作。假体装置的例子包括适合脊柱融合的髋骨装置、螺钉、杆和钛骨架。
因此，这项发明还提供通过把假体装置植入患者需要骨诱导的部位来刺激骨生长的方法。假体至少部分地涂上一层本文描述的可植入的药物组合物，然后被植入需要骨诱导的部位并且在该部位维持足以刺激骨生长的时间周期。
在本发明的方法中使用的指向软骨再生的NPAR促效药通常是作为药物组合物中的一个成分对需要软骨生长、修复或再生的部位给药的。对需要治疗的方法部位给药意味着把包括NPAR促效药的药物组合物递送到足够接近需要治疗的部位，以致软骨生长或软骨再生在该部位发生(例如，与没有NPAR促效药的情况相比，在有NPAR促效药的情况下软骨生长的数量和软骨生长的质量将更大或更好)。
在一种给药方法中，药物组合物是包括NPAR促效药和适当的载体的溶液。溶液被直接应用于需要治疗的部位或非常接近该部位的地方。溶液的给药可以正常地完成，例如，用注射器注射到关节内、用注射器注射到非常接近受损组织的地方、或通过外科手术打开。标准的药物配方技术可以利用，例如，在Remington的Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，Easton，PA.)中描述的那些。适当的药物载体包括，例如，无菌水、生理盐水、无菌盐水(含大约0.9％mg/ml的苯甲醇的盐水)、磷酸缓冲盐水、Hank溶液，Ringer乳酸盐等等。
在另一种给药方法中，药物组合物包括NPAR促效药和可植入的生物兼容的载体。生物兼容的载体应该是无毒的、不引起炎症的，不产生免疫性的和在植入部位没有其它不想要的反应的。适当的载体还准备在植入部位释放活性成分，优选随着时间的推移缓慢地持续不变地释放。
许多合成的生物降解的聚合物能充当有持续释放特征的载体。这些聚合物的实例包括聚α-羟酯，例如，聚乳酸/聚乙醇酸的共聚物和聚酸酐。
关于骨组织再生前面曾讨论过的聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)的均聚物和共聚物也适合作为持续释放的赋形剂用于处理软骨的化合物。同样地，在结构式(V)中展示的聚酸酐能在处理胶原的方法中使用。
药物组合物在需要的时候能在外科手术前塑造成形或在外科手术期间由医师或技师塑造成形。优选的是使基质横越组织缺陷塑造成形并且采取新组织预期的形状。在大缺陷的软骨修复的情况下，需要的是利用横跨缺陷的尺寸。在植入之后，该物质被人体缓慢地吸收并且按植入片的形状或其非常接近的形状被软骨替代。
一方面，载体是始祖细胞可以在其中迁移的多孔基质。细胞往往能附着到这样的多孔基质上，然后，该基质能充当用于组织生长的支架并因此加速骨生长的速度。软骨细胞能为了进一步加速康复在植入之前被应用于这样的基质。胶原或胶原凝胶体是适当的多孔基质的实例。
另一方面，载体是可往关节内或在需要治疗的部位注射的粘性的溶液或凝胶。透明质酸是这个类型的载体的实例。透明质酸产品是市场上买得到的而且包括Anika研制的ORTHOVISC、Biomatrix研制的SYNVISC、Fidia研制的HYALGAN和Seikagaku研制的ARTZ。聚丙二醇和环氧乙烷的加聚物凝胶是这个类型的载体的另一个实例。聚丙二醇和环氧乙烷的加聚物凝胶是环氧乙烷和环氧丙烷的无毒的嵌段共聚物。它们呈现允许它们在室温下作为粘性液体但在体温下作为凝胶存在的热固性特性。可注射的组合物能直接应用于需要治疗的部位，而不需要侵入性的外科手术。聚(环氧乙烷)的聚合物和环氧乙烷与环氧丙烷的共聚物也适合作为可注射的基质(参见，Cao等人，J.Biomater.Sci.9：475(1998)和Sims等人，Plast Reconstr.Surg.98：843(196)，它们的全部内容在此通过引证被并入)。
NPAR促效药能用来加速生长或维持分离的软骨细胞的机能。在一个实施方案中，可以把NPAR促效药加到组织培养介质中，以刺激增殖和提供更迅速的增殖和/或防止当主要的细胞隔离种群被放在培养介质中的时候经常遇到的细胞的编程性死亡或衰老。在另一个实施方案中，因为NPAR促效药似乎刺激基质生产，所以，这样的NPAR促效药可能被用来在培养中维持的软骨细胞适应个别差异的机能。NPAR促效药可以被单独用在标准定义的组织培养介质中或作为对包含血清或其它生长要素的组织培养介质的补充，以便对软骨细胞的体外生产或维护产生附加的或协同的影响。足够量的NPAR促效药被加到培养介质中，以便与缺乏促效药(即，“刺激量”)时相比提供更迅速的生长或维持更强大的软骨细胞机能。通常，使用介于大约0.1μg/ml和大约100μg/ml之间的NPAR促效药。
就骨生长而言，“治疗有效量”是导致在缺乏促效药时只有少许或没有骨生长的地方发生骨生长的NPAR促效药的量。通常，促效药是在足以达到预期的治疗或整容效果(即，充分的骨生长)的时间周期里给药的。给药量将取决于预期的骨生长的数量、患者的健康状况、大小、体重、年龄和性别以及药物配方的释放特性。通常，每天大约1μg到每天大约1mg(优选每天大约5μg到每天大约100μg)的NPAR促效药是通过连续释放或直接应用于需要骨生长的部位给药的。
就软骨生长而言，“治疗有效量”是导致在有NPAR促效药的情况下与缺乏它的情况相比软骨生长或修复更快的NPAR促效药(或软骨细胞)的数量。作为替代或补充，“治疗有效量”是导致与软骨损伤相关的疼痛和/或机能不足减轻的NPAR促效药(或软骨细胞)的量。通常，促效药(或软骨细胞)是在足以实现预期的治疗或效果的时间周期里给药的。给药量将取决于预期的软骨生长量、患者的健康状况、大小、体重、年龄和性别以及药物配方的释放特性。通常，每天大约0.1μg到每天大约1mg(优选每天大约μg到每天大约100μg)的NPAR促效药是通过连续释放或直接应用于需要软骨生长或修复的部位给药的。
在有NPAR促效药的情况下培养的软骨细胞还能用来通过对需要治疗的部位施用治疗有效量的软骨细胞治疗软骨损伤。就软骨细胞而言，“治疗有效”也意味着导致与缺乏治疗的情况相比在有治疗的情况下软骨生长或修复更快。为了治疗软骨损伤而施用软骨细胞是在美国专利第4,846,835号中描述的，其全部内容在此通过引证被并入。
“患者”优选是人，但也可以是需要治疗的动物，例如，宠物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、猪、马等等)，和实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
凝血酶肽衍生物可以用固相肽合成(例如，BOC或FMOC)的方法、溶液相合成、或包括前面提到的方法的组合的其它适当的技术来合成。已建立起来并且广泛使用的BOC和FMOC方法是在下述文献中描述的：Merrifield，J.Am.Chem.Soc.88：2149(1963)；Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，C.H.Li，Ed.，Academic Press，1983，48-267页；和Barany and Merrifield，ThePeptides，E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，Academic Press，NewYork，1980，3-285页。固相肽的合成方法是在下面的文献中描述的：Merrifield，R.B.，Science，232：341(1986)；Carpino，L.A.and Han，GY，J.Org.Chem.，37：3404(1972)；和Gauspohl，H.等人，Synthesis，5：315(1992)。这六篇文章的全部内容在此通过引证都被并入。
本发明通过下面的不倾向于以任何方式受到限制的实施例予以进一步的说明。
实施例
    实施例1-制备TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微珠
利用双乳化技术制备含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)的微珠。简要地说，基质成分被溶解在二氯甲烷中，而TP508被溶解在水中。当涡旋形成油包水(W/O)的乳液时，两者逐步混合在一起。聚乙烯醇(3％的水溶液)加到乳液中，进一步涡旋形成二次乳液(O/W)，借此形成双乳液：O/W乳液由PLGA液滴组成，而且在那些液滴内，第二分散相由水中的TP508组成。在相分离之时，PLGA液滴形成包含保存TP508的空腔的离散的微珠。为了引起微珠的相分离，加入2％的异丙醇溶液。通过离心收集颗粒，然后冻干以除去残留的水分。可以改变基质的组成以形成释放动力学不同的微珠(表1)。
                 表1：不同的微珠配方的组成
配方    PLA∶PGA 聚合物分子量 ％TP508 ％聚乙二醇
  A     50∶50     46,700     5     0
  B     50∶50     7,200     5     0
  C     50∶50     46,700     5     5
  D     50∶50     46,700     5     0
  E     75∶25     120,000     5     0
在Coulter计数器中测量微珠的平均直径并且在将已称重的微珠样品溶解在二氯甲烷中，再用水萃取释放的药物之后用光谱测试在276nm下测量药物的包埋效率(表2)。
       表2：配方直径和药物包埋效率
  配方     直径，μm     TP508包埋率，％
    A     26.0     53.8
    B     16.2     27.1
    C     17.6     58.9
    D     23.9     42.6
    E     25.8     36.2
为了测量从不同的PLGA基质中TP508释放，将20mg微珠置于装在1.5ml的聚丙烯微型离心试管中的1.0ml的PBS中。这些试管在37℃下孵化并且以60rpm的速度摇动。在不同的时间，把试管放进离心机离心，然后倒出含有释放出来的TP508的上清液并冷冻，随后分析。新鲜的PBS被添加到微珠中，然后继续连续地孵化。借助在276nm的吸光度测量上清液中的TP508。对于每个配方，完成一式四份的释放测定。配方B和D在37℃下孵化28天的过程中没有表现出可检测的药物释放。剩余的配方都释放出可检测数量的TP508，虽然在所有的情况下，药物释放量在3-4天内都落在可检测限度以下(＜1μg/mg基质/天)。配方A和C表现出最大的TP508释放，在3-4天内释放60-80％被包埋的药物。释放动力学最快的配方C被选中进行体内测试研究。
   实施例2-含有TP508的PLGA微珠诱导兔子尺骨中的
              大的缺陷(1.5cm)中的骨形成bb
在20个雄性新西兰兔子的每个尺骨中产生1.5cm的区段性缺陷。通过利用小的金属尺引导微型摆锯的切割刀刃使这些双侧尺骨截骨手术准确地形成相同的尺寸。每个兔子都可以作为其自身的对照物；因此用不含TP508的微珠填充左侧缺陷，而用含有100或200μg TP508的微珠填充右侧缺陷(10个动物/组)。如实施例1所述制备微珠。将做过双侧尺骨截骨术的兔子随机地分成两组。第一组在右侧肢体中接受微珠(30mg)中的100μg TP508，在左侧肢体中只接受微珠。同样地处理第二组，但接受200μg的TP508。这些不同的剂量是通过按不同的比例将含TP508的和不含TP508的微珠混合获得的。这些动物从第3周开始每两周拍一次X-片，在第9周被杀死。
100μg的TP508在外科手术后的3到5周刺激缺陷处矿化。在第7和9周时的X衍射似乎是和第5周时得到的那些是一样的。在外科手术后第9周，杀死动物，取出尺骨-跷骨，并且拍照。在大多数情况下，在来自对照肢体的尺骨中大的缺陷仍然可见。反之，在用TP508处理的肢体中，大多数缺陷已经成功地愈合。
在外科手术后第9周杀死动物之后，通过扭转测试(MTS-858 Minibionix机器)测量修复强度。结果展示在表3和4中。
         表3：用100μg TP508处理的区段性缺陷的扭转测试
    参数     对照     SEM  TP508，100μg     SEM
    最终转矩     0.107     0.034     0.255+     0.041
    破坏转矩     0.103     0.032     0.239+     0.042
    最终能量     0.815     0.365     1.916^     0.398
    破坏能量     0.940     0.436     2.604^     0.421
    坚硬系数     0.013     0.004     0.028^     0.006
^p＜0.05，+p＜0/01
          表4：用200μg TP508处理的区段性缺陷的扭转测试
    参数   对照    SEM   TP508，200ug      SEM
  最终转矩   0.095   0.042     0.322*     0.046
  破坏转矩   0.093   0.041     0.306*     0.046
  最终能量   0.534   0.355     2.947*     0.543
  破坏能量   0.641   0.374     3.433*     0.701
  坚硬系数   0.016   0.006     0.033^     0.004
^p＜0.05，*p＜0/01
在100μg组中，如同用所有的测试参数测量的那样，TP508使愈合后缺陷的机械强度增加两倍以上(表3)。在200μg组中甚至强度更高的修复被注意到(表4)，大多数参数比在低剂量处理组中看到的高大约50％。
          实施例3-凝血酶对大鼠软骨细胞的粘合
大鼠关节软骨细胞的主要培养物被分离和制备，以便使用已建立的方法进行生物体外分析(参见，Kuettner，K.E.等人，J.CellBiology 93：743-750，1982)。简要地说，多块软骨从大鼠的肩部切下来，然后在37℃下在组织培养介质(DMEM)中边搅拌边用胰蛋白酶消化一小时再用胶原酶消化三小时。细胞以高密度(50,000细胞/平方厘米)沉积在烧瓶中，然后在包含抗生素抗坏血酸的DMEM中在37℃下在5％CO2的气氛中培养。
125I凝血酶对软骨细胞特有的粘合是使用在美国专利第5,352,664号和Carnny，DH和Cunningham，DD，Cell 15：1341-1349，1978中揭示的已建立的凝血酶受体粘合化验完成的。简要地说，高度纯化的人类凝血酶先用碘处理，然后加到有或没有未加标记的凝血酶的软骨细胞培养物中，以便校正非特有的粘合。通过用不同浓度的带标记的凝血酶孵化细胞和测量介质中与细胞粘合的凝血酶数量和游离凝血酶数量，估计每个细胞的受体数和凝血酶对那个粘合部位的亲合性是可能的。
来自三个独立实验的带标记的凝血酶粘合的Scatchard分析建议大鼠软骨细胞表达3000个亲合性非常高的粘合部位(100pM亲合性)和230,000个高亲合性部位(27nM)的平均值。
      实施例4A-NPAR促效药刺激牛的软骨细胞增殖
牛的软骨细胞的主要培养物是使用在实施例1中针对大鼠软骨细胞描述的程序制备的。培养物被放进24井的塑料盘中以低密度进行次培养，然后放在1％血清中。将NPAR促效药TP508以1.0或10μg/ml的浓度单独添加到这些培养物中不刺激细胞增殖。反之，将这些浓度的TP508与少量的凝血酶共有丝分裂原的一起添加导致三天后在培养物中细胞数相对于在独自的凝血酶中看到的那个有小的但有意义的增加(p＜0.05)。
实施例4B-NPAR促效药刺激牛的软骨细胞的蛋白多糖合成
为了确定NPAR促效药对蛋白多糖合成的影响，牛的软骨细胞以每个井2×105细胞的密度播种到96井的盘子中，然后在含10％胎牛血清的DMEM中孵化。在这些多层培养物建立起来之后，介质每天都用标明TP508的浓度从1到100μg/ml(表5)的含有1％血清的DMEM替换。
在每天改变有或没有TP508的培养介质的情况下培养6天之后，把35S硫酸盐添加到介质中，再继续孵化24小时。如表5所示，用高浓度(100μg/ml)的TP508处理相对于未经处理的细胞使35S硫酸盐掺入增加10倍以上。
          表5.在小牛软骨细胞培养中，NPAR促效药TP508
                   对35S硫酸盐掺入的影响
    处理   平均CPM1％血清   平均值的标准差
    对照     4975     3552
 TP508(1ug/ml)     4701     2692
 TP508(10ug/ml)     6960     3265
 TP508(100ug/ml)     81946     13783
   实施例5A-NPAR促效药刺激培养的大鼠关节软骨细胞的
                       增殖合成
如实施例3所述，利用胰蛋白酶和胶原酶消化，从数片大鼠肩关节软骨中分离大鼠关节软骨细胞。利用Guo等人(Conn.Tiss.Res.19：277-297，1998)描述的已确定的技术确定软骨细胞“3维”藻酸盐珠状培养物的制备。在用胰蛋白酶从组织培养烧瓶中取出细胞之后，细胞悬浮在藻酸盐凝胶(1.2％w/v)中，并且用22号针以逐滴的方式进入102mM CaCl2中被缓慢地表达。当液滴接触CaCl2的时候，在那里出现几乎瞬间的藻酸盐聚合，形成凝胶珠。然后，在DMEM培养介质中将这些珠子洗涤3次，转移到35mm的盘中并且通过每两天用培养介质饲喂一次来维持在37℃下、在5％CO2的气氛中的培养。
在3维藻酸盐培养物中培养3天之后，NPAR促效药TP508对软骨细胞增殖的影响是通过从35mm的盘中取出珠子，用0.9％的盐水洗涤，然后通过在37℃下用10分钟添加1ml的55mM的柠檬酸钠、0.15M的NaCl使藻酸盐珠子溶解确定的。然后通过用磷酸缓冲盐水(PBS)按1∶10稀释1ml已溶解的珠子并且用Z-系列Coulter计数器计数细胞来确定细胞数。如表6所示，TP508本身刺激三维培养物中的软骨细胞的增殖。
   表6.NPAR促效药TP508对三维培养物中的大鼠软骨细胞
                   的增殖的影响
    处理 3天后细胞数   标准偏差 对照增长％
    对照     6238     688
 TP508 30nM     7463     167     19.7
 TP508 300nM     8882     148     42.4
 TP508 3μM     8866     4     42.1
 TP508 30μM     7772     258     24.6
   实施例5B在培养的大鼠关节软骨细胞中，NPAR促效药
                   刺激糖蛋白的合成
为了确定NPAR促效药TP508对糖蛋白合成的影响，如同前面描述的那样制备了三维藻酸盐培养物，并且[35S]-硫酸盐的掺入进行化验。珠形培养物被暴露在标明浓度的TP508以及[35S]硫酸盐(20μCi/ml)中，每天改变培养介质，并且在掺入[35S]硫酸盐之后第7天被采集。在每个时间点，取出5-10个珠子，用0.9％的盐水洗涤3次，然后如上所述通过在37℃下添加0.5ml的55mM的柠檬酸钠、0.15M的NaCl使之溶解10分钟，再用液体闪烁计数器计数。每个样品中的[35S]硫酸盐的掺入都对加入的珠子数目归一化。如表7所示，在300nM(大约0.7μg/ml)的浓度下单独用TP508处理刺激[35S]硫酸盐掺入超过对照物50％。另外，存在因30μM的TP508(大约70μg/ml)产生的大的刺激，但是，在这个浓度下在测量结果中存在大的相对标准偏差。
  表7.NPAR促效药TP508对[35S]硫酸盐掺入糖蛋白的影响
    处理     细胞数   标准偏差 对照增长％
    对照     665     24
  TP508 30nM     829     87     24.7
  TP508 300nM     1008     29     51.6
  TP508 3μM     827     9     24.1
  TP508 30μM     1153     519     73.3
  实施例6-TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物微球体的制备
利用双乳化技术制备含有TP508的聚乳酸/聚乙醇酸共聚物(PLGA)的微球体。简要地说，基质成分被溶解在二氯甲烷中而TP508被溶解在水中。两者当涡旋形成油包水(W/O)的乳液时逐步混合在一起。聚乙烯醇(0.3％的水溶液)伴随着进一步的涡旋被添加到乳液中，形成第二乳液(O/W)，借此形成双乳液：由PLGA小滴组成的O/W乳液，在这些小滴之内，第二分散相由TP508水溶液组成。在相分离之时，PLGA小滴形成包含保存TP508的空腔的离散的微球体。为了引起微球体的相分离，添加2％的异丙醇溶液。通过离心收集颗粒，然后冻干以除去残余的水分。改变基质的组成，以形成释放动力学不同的微球体(表8)。
                  表8：不同微球体配方的组成
 配方    PLA∶PGA  聚合物分子量 TP508的％ 聚乙二醇的％
  A     50∶50     46,700     5     0
  B     50∶50     7,200     5     0
  C     50∶50     46,700     5     5
  D     50∶50     46,700     5     0
  E     75∶25     120,000     5     0
用Coulter计数器测量微球体的平均直径，并且在称重的微球体样品溶解在二氯甲烷中和释放的药物被萃取到水中之后，用276nm下的光谱实验测量药物包埋效率(表9)。
    表9：配方、直径和药物包埋效率
   配方   直径，μm    TP508包埋，％
    A     26.0     53.8
    B     16.2     27.1
    C     17.6     58.9
    D     23.9     42.6
    E     25.8     36.2
为了测量TP508从不同的PLGA基质的释放，将20mg微球体放置在装在1.5ml的聚丙烯微型离心管中的1.0ml PBS中。这些试管在37℃孵化，并且以60rpm的速度摇动。在各种不同的时间，这些试管被离心，包含释放出来的TP508的上清液被移取和冷冻，用于随后的分析。新鲜的PBS被添加到微球体中，继续孵化。上清液中的TP508是借助在276nm的吸光率测量的。对于每个配方，完成一式四份的释放测定。配方B和D在28天的37℃孵化过程中没有表现出可检测的药物释放。其余的配方都释放出可检测量的TP508，虽然在所有的情况中在3-4天内，释放的药物量都落在可检测界限以下(＜1ug/mg基质/天)。配方A和C表现出TP508的最大释放，在3-4天内释放包埋药物的60-80％。配方C表现出最快的释放动力学，于是被选中用来检验实施例7描述的兔子软骨缺陷模型。
  实施例7在兔子模型中，NPAR促效药TP508刺激软骨的生长
年轻的雄性新西兰兔子(2-3kg)(n＝15)被麻醉后，接受双侧的膝旁纵向居中的关节切开术。皮肤、皮下组织和关节囊是使用电灼术切开的，以使出血最少。通过髌骨的横向离位将关节表面暴露出来。使用外科手术钻和锐利的不锈钢钻头在股骨的滑车沟中制作一个3mm直径、1-2毫米深的全厚度缺陷。目的是使缺陷延伸到软骨下的平板，但不刺穿软骨下的骨骼。
将兔子分成3组。对于每个兔子，左右两侧的滑车沟缺陷都用同样的处理来填充。在这一研究中，TP508被配制成如同在实施例6(配方C)中描述的那样制备的PLGA控制释放的微球体。将微球体与足够的聚丙二醇与环氧乙烷的加聚物F68凝胶(5％w/v)混合，把球体粘合在一起，达到容易填充缺陷的糊状的稠度。对照组在两个缺陷处接受没有TP508的PLGA微球体。处理组接受包含每个缺陷10或50mg TP508的微球体。在第4周从每组取出一个兔子杀死，在第6周从每组取出2个兔子杀死，剩下的动物在第9周杀死。样品被固定和处理，以便进行组织学分析。
在杀死的时候，在对照缺陷中，似乎有相当多的纤维颗粒组织，而没有白色的类似软骨的物质。反之，在来自10μg处理组和50μg处理组的缺陷中，缺陷有近乎均匀的浓密的白色的物质填充。在外科手术后6周，在处理组和对照组的缺陷之间，显微镜观察没有那么明显的差异。
4周的样品组织学分析表明，对照缺陷确实被似乎代表包括炎性纤维原细胞的早期颗粒组织填充。反之，10和50微克处理组的缺陷似乎具有大量的软骨细胞和软骨形成的早期迹象。这个效果在6周时更明显。对照组有少量的结缔组织，但软骨修复的迹象微乎其微。反之，在10ug和50ug两个处理组的缺陷中，似乎存在与在缺陷顶部正在形成的透明的软骨很好的整合，和大范围的软骨下的骨骼修复。
用TP508处理9周的缺陷呈现以玻璃质为主的基质，如同通过正藏红(safranin)-O染色显示的那样有相当大的聚集蛋白聚糖含量的证据。在大多数情况下，聚集蛋白聚糖含量在修复部位和天然组织之间没有差异。组织学分析结果是使用Freed等人(J.Biomed.Materials Res.，28：891-899(1944))依据O’Driscoll等人的方案(J.Bone Joint Surg.，126：1448-1452(2000))改编的分级系统定量评估的，用于正常的关节软骨的最低评分为25。用TP508处理的实验缺陷的平均得分明显地高于对照缺陷(表10)。
         表10-关节缺陷研究的组织学评分
TP508的毫克数                  修复得分±SE
    0                             9.4±1.6
    10                            18.6±1.4
    50                            19.8±1.0
肽处理的缺陷修复后有光滑的关节表面，而且通常在修复组织和天然组织之间有粘合很好的连接。对照修复组织的质量的特征为大多数纤维化软骨有质量很差的关节表面。在修复组织和天然组织之间接合部的整合通常是很差的。全面地说，用TP508修复的软骨的质量比未处理的对照缺陷明显增强。修复组织质量的这种改善应该导致恢复更耐久的关节生物力学机能和减少遭受创伤性软骨损伤痛苦的患者的骨关节炎的发病率。
总之，用包含NPAR促效药TP508处理的尺骨截骨术表现出明显的骨骼矿化和生长，而在大多数接受骨传导微球体的对照截骨术中，没有骨生长和/或无法填充挖空的区域。对机械强度和硬度的力学性能测试证实在这个模型中TP508对骨形成有显著影响。因为TP508在没有TP508时不发生骨形成的部位诱导骨形成，所以，骨诱导的这一发现截然不同于先前关于在没有TP508时将痊愈的骨折或小间隙缺陷中TP508加速正常骨折痊愈速度的研究。
尽管这项发明已参照其优选的实施方案予以明确的展示和描述，但是本领域的技术人员应该理解在不脱离权利要求书所囊括的本发明的范围的情况下在形式和细节方面可以有各种各样的变化。

Claims (44)

1.一种在患者需要骨诱导的部位刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该部位施用有效治疗量的凝血酶衍生肽的生理功能等价物的步骤。
2.根据权利要求1的方法，其中部位在需要骨移植物的地方。
3.根据权利要求1的方法，其中部位是骨中的区段性裂隙、骨空洞或在不愈合的骨折处。
4.根据权利要求1的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物包括用下面的结构式表达的多肽：
Asp-Ala-R；
其中R是丝氨酸酯酶保存序列。
5.根据权利要求4的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有大约12个到大约23个氨基酸。
6.根据权利要求5的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO 6)。
7.根据权利要求5的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有氨基酸序列Ac-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO7)。
8.根据权利要求5的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有氨基酸序列Ac-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO8)。
9.根据权利要求6的方法，其中凝血酶肽衍生物是用加之包括可植入的生物兼容的载体的药物组合物给药的。
10.根据权利要求6的方法，其中可植入的生物兼容的载体是骨传导基质。
11.根据权利要求6的方法，其中载体包括聚乳酸/聚乙醇酸的均聚物或共聚物。
12.一种包括可植入的生物兼容的载体和凝血酶衍生肽的生理功能等价物的药物组合物。
13.根据权利要求12的药物组合物，其中载体是骨传导的。
14.根据权利要求13的药物组合物，其中生理功能当量的凝血酶受体促效药是包括用下面的结构式表达的多肽的凝血酶肽衍生物：
Asp-Ala-R；
其中R是丝氨酸酯酶保存序列。
15.根据权利要求12的药物组合物，其中载体是能生物降解的合成的聚合物。
16.根据权利要求15的药物组合物，其中能生物降解的合成聚合物是聚乳酸/聚乙醇酸的均聚物或共聚物。
17.根据权利要求12的药物组合物，其中载体包括胶原质、纤维蛋白、磷酸钙盐、硫酸钙、萃取胍的异体骨或其组合。
18.根据权利要求12的药物组合物，其中载体是可注射的。
19.根据权利要求12的药物组合物，其中载体是聚富马酸丙二酯溶液或磷酸钙陶瓷坯泥。
20.根据权利要求12的药物组合物，其中药物组合物是作为微粒给药的。
21.根据权利要求12的药物组合物，其中药物组合物是在应用于需要骨诱导的部位之前预先成形的。
22.根据权利要求14的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)。
23.根据权利要求14的药物组合物，其中凝血酶肽衍生物有氨基酸序列Ac-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO7)。
24.根据权利要求的药物组合物14，其中凝血酶肽衍生物有氨基酸序列Ac-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO 8)。
25.一种在患者需要骨诱导的部位刺激骨生长的方法，所述的方法包括对部位施用治疗有效量的有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)的肽的步骤。
26.一种在患者需要骨移植物的部位刺激骨生长的方法，所述的方法包括对该部位施用治疗有效量的有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)的肽的步骤。
27.一种在患者的骨裂隙、骨空洞或不愈合骨折部位刺激骨生长的方法，所述的方法包括对骨裂隙、骨空洞或不愈合骨折部位施用治疗有效量的有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)的肽的步骤。
28.一种在患者需要这样的生长或修复的部位刺激软骨生长或修复的方法，所述的方法包括对该部位施用治疗有效量的凝血酶衍生肽的生理功能等价物的步骤。
29.根据权利要求28的方法，其中部位是患关节炎的关节。
30.根据权利要求28的方法，其中部位正在对软骨损伤或缺损进行治疗的部位。
31.根据权利要求28的方法，其中部位正在对外伤造成的软骨损伤或缺损进行治疗的部位。
32.根据权利要求28的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物包括用下面的结构式表达的多肽：
Asp-Ala-R；
其中R是丝氨酸酯酶保存序列。
33.根据权利要求32的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有大约12个到大约23个氨基酸。
34.根据权利要求33的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有氨基酸序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)。
35.根据权利要求33的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有氨基酸序列Ac-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO7)。
36.根据权利要求33的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物有氨基酸序列Ac-Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO8)。
37.根据权利要求34的方法，其中凝血酶肽衍生物的生理功能等价物是用加之包括可植入的生物兼容的载体的药物组合物给药的。
38.根据权利要求34的方法，其中载体包括聚乳酸/聚乙醇酸的均聚物或共聚物。
39.一种在患者需要这样的生长或修复的部位刺激软骨生长或修复的方法，所述的方法包括对该部位施用治疗有效量的有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)的肽的步骤。
40.一种在患者患关节炎的关节刺激软骨生长的方法，所述的方法包括在该部位施用治疗有效量的有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)的肽的步骤。
41.一种在正在对患者的软骨缺损进行治疗的部位刺激软骨生长的方法，所述的方法包括对该部位施用治疗有效量的有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)的肽的步骤。
42.一种在正在对患者因外伤造成的软骨缺损进行治疗的部位刺激软骨生长的方法，所述的方法包括对该部位施用治疗有效量的有序列Ala-Gly-Try-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO6)的肽的步骤。
43.一种用来在生物体外培养软骨细胞的方法，改进包括在有刺激量的凝血酶衍生肽的生理功能等价物的情况下培养软骨细胞。
44.根据权利要求43的方法，进一步包括在患者需要软骨修复或生长的部位施用步骤治疗有效量的培养出来的软骨细胞。
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