CN116549732A - 一种双组分骨诱导胶原蛋白膜及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种双组分骨诱导胶原蛋白膜及其制备方法，该胶原蛋白膜为猪或牛的皮肤或肌腱组织提取的胶原蛋白与骨形态发生蛋白‑2共混交联后注入预制的模具冻干而成，具体制备方法是将动物组织切成薄片进行酶解、过滤、析出获得胶原蛋白，然后将其复溶，分批加入EDC交联剂和NHS交联剂，再与骨形态发生蛋白‑2共混，最后注模冻干后辐照灭菌，获得骨形态发生蛋白+胶原双组分结构膜，该胶原蛋白膜不仅空间维持能力优异，而且能够控制BMP加入量和产品降解时间，具有良好的医疗及实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物修复材料领域，具体涉及一种双组分骨诱导胶原蛋白膜及其制备方法。
背景技术
口腔用胶原膜是一种薄膜状的材料，主要由胶原蛋白组成，被用作口腔医学中的一种填充材料。它是一种天然的材料，可以被人体完全吸收，不会产生免疫排斥反应。口腔胶原膜的主要作用是促进口腔软组织的愈合和再生。在口腔手术中，医生可以使用它来填补牙槽骨或牙周组织缺损，以促进骨组织的再生和修复。它还可以用于种植牙手术中，作为种植体周围软组织的支撑材料，促进软组织的再生和固定。口腔胶原膜的优点是安全可靠，使用方便，能够有效促进口腔软组织的再生和愈合，减少手术并发症的发生。同时，口腔胶原膜的成本相对较低，可以满足不同患者的需求。
目前市面上主要使用的口腔胶原膜是脱细胞基质膜。脱细胞膜（decellularizedmembrane）是一种制备过程中去除细胞成分的生物医用材料，通常是通过化学、物理或生物学方法去除组织中的细胞和细胞外基质成分，保留细胞外基质的三维结构、生物活性和机械特性，从而减少免疫排斥和降低感染风险，提高材料的生物相容性和生物活性。然而，脱细胞膜缺乏空间维持能力，通常需要进行交联处理，以增强其机械强度和稳定性，例如与自体骨或其他骨增量材料交联联合使用，这种产品难以控制和预测降解时间，给后续应用增加难度；且交联剂用量还会影响其生物活性、机械强度和稳定性，例如交联过量使用产生大量的可能产生大量的对生物分子具有毒性和免疫原性的副产物和交联产物，这将影响胶原膜产品的再生效果，使得胶原膜成骨性能不佳，对骨再生不利。
骨形态发生蛋白（BMP）是一种分泌性多功能蛋白，可由多种细胞分泌产生，具有促进成骨细胞生长、增值作用，能在体内外诱导未分化的间充质细胞分化成软骨细胞，通过骨诱导作用促进新骨快速生成。研究表明，BMP与胶原膜的复合可以用于骨组织工程、骨缺损修复等领域。例如美国专利文献US20050074459A1文献公布的大肠杆菌O157：H7上皮粘附素，涉及将骨形态发生蛋白-2（BMP-2）与胶原膜复合来制备复合材料。具体方法为：从动物皮肤中提取胶原蛋白，通过酸处理、盐析、冷冻干燥等步骤制备成胶原膜；采用生物可降解聚合物聚乳酸（PLA）作为BMP-2载体；将BMP-2均匀分散在PLA溶液中，通过溶液共混的方法制备BMP-2载体；将BMP-2载体与胶原膜通过物理吸附的方式复合在一起，制备成BMP-2与胶原膜的复合材料。将该复合材料用于大鼠颅骨缺损的修复，可以促进骨细胞的黏附和增殖，加速骨组织的形成和修复。然而，这种方法至少存在如下的问题：1）PLA作载体生物降解速率较慢，同样难以控制和预测降解时间；2）通过物理吸附与胶原膜复合，结合力较弱，且BMP吸附在胶原膜表面量有限，无法长久促进骨再生，修复的效果有限；3）BMP吸附在胶原膜表面对胶原膜的机械支撑性能改善有限，且产品结构取决于胶原膜结构，应用场景受限。
因此，如何兼顾材料的生物相容性、机械性能，同时能控制其降解速率，并进一步提高胶原膜成骨性能，仍是亟待及解决的技术问题。
发明内容
针对上述存在的现有脱细胞膜及其与骨形态发生蛋白结合存在的问题，本发明提供一种可骨诱导的胶原蛋白膜的制备方法，将胶原蛋白和骨形态发生蛋白分别制成溶液，采用合适交联剂使其二者交联后注塑冻干，获得所需的骨形态发生蛋白+胶原双组分结构膜，不仅空间维持能力优异，而且能够控制BMP加入量和产品降解时间。具体技术方案如下：
首先，本发明提供一种双组份骨诱导胶原蛋白膜，该胶原蛋白膜为猪或牛的皮肤或肌腱组织提取的胶原蛋白与骨形态发生蛋白-2共混交联后注入预制的模具冻干而成。
该双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤：
1）切片：将猪或牛的皮肤或肌腱组织清洗后切成一定厚度的薄片，获得动物组织薄片；
2）酶解：将获得的动物组织薄片置入乙酸或盐酸溶液中，加入蛋白酶进行酶解，获得粗蛋白溶液；
3）过滤：将粗蛋白溶液中的颗粒物滤除，获得蛋白溶液；
4）析出：往蛋白溶液中加入氢氧化钠溶液，进行蛋白析出，获得胶原蛋白；
5）复溶：将获得的胶原蛋白溶于乙酸中，获得胶原蛋白溶液；
6）交联：搅拌条件下，将EDC交联剂和NHS交联剂分批加入胶原蛋白溶液，得到胶原蛋白-EDC中间体；
7）共混：将骨形态发生蛋白-2缓慢加入胶原蛋白-EDC中间体中，搅拌共混，获得骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液；
8）注模：将得到的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液注入预先制好的模具中；
9）冻干：将注模后的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液连同模具一起送入冻干机进行冻干成型，形成胶原蛋白膜；
10）灭菌：将冻干成型的胶原蛋白膜进行辐照灭菌，获得胶原蛋白膜成品。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤1）中的动物组织薄片厚度为1～3mm。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤2）中的乙酸或盐酸溶液的浓度为0.1%～5%；加入的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和/或无花果酶，加入的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和/或无花果酶，加入量为动物组织薄片重量的8%～15%，酶解条件为：2～8℃条件下搅拌6～36h。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤3）中的过滤为采用20～40目不锈钢网滤除颗粒物。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤4）中的析出加入的氢氧化钠溶液浓度为0.5～4mol/L。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤5）中的复溶，析出的蛋白与乙酸料液比为1～50:1～100。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤6）中的交联过程如下：
6-1）交联剂准备：分别取EDC交联剂和NHS交联剂，其二者的质量比为1:1；将EDC交联剂等分成6份，将NHS交联剂等分成3份，备用；
6-2）第一重激活：将胶原蛋白溶液加入搅拌机，调节其pH为6.0，控制搅拌转速400rpm搅拌10min，然后边搅拌边依次加入3份EDC交联剂，并且每份EDC交联剂加入后均以400rpm搅拌10min后再加入另一份，将胶原蛋白上的羧酸能团与EDC进行酰胺键结合，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ；
6-3）第一重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.2，将搅拌转速控制为300rpm，边搅拌边依次加入2份NHS交联剂，第一份NHS交联剂加入搅拌10min后再加入另一份，保护胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的稳定，获得胶原蛋白-EDC/NHS中间体Ⅱ；
6-4）第二重激活：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅱ的pH为6.5，保持搅拌转速为300rpm，加入剩余的3份EDC交联剂，每份EDC交联剂加入后均以300rpm搅拌20min后再加入另一份，将胶原蛋白上的未反应的羧酸能团激活，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅲ；
6-5）第二重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.0，将搅拌转速控制为200rpm，将剩余的1份NHS交联剂加入，并继续搅拌20min，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅳ，以备与骨形态发生蛋白-2共混。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤7）中的共混，骨形态发生蛋白-2与胶原蛋白-EDC中间体料液比为1～2:2.8～6.8；共混转速为200rpm～600rpm，搅拌时间为3～5h。
前述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，步骤10）中的灭菌计量为15.2～25KGY。
本发明的有益效果是：
1）本发明将胶原蛋白和骨形态发生蛋白分别制成溶液，采用合适交联剂使其二者交联后注塑冻干，获得所需的骨形态发生蛋白+胶原双组分结构膜，不仅空间维持能力优异，而且能够控制BMP加入量和产品降解时间。
2）本发明将胶原蛋白和骨形态发生蛋白分别制成溶液进行交联，胶原蛋白和骨形态发生蛋白混合均匀，蛋白复合充分，有效提高其机械强度和稳定性。
3）本发明将胶原蛋白和骨形态发生蛋白分别制成溶液混合交联，可分别控制胶原蛋白和骨形态发生蛋白的复合量，可较好的控制其支撑效果和降解时间。
4）本发明采用EDC与NHS联合使用，EDC能够将活性羧酸和胺官能团直接进行酰胺键结合，而NHS则可以使反应生成的活性酯在水中更稳定，从而避免水解，通过双重激活保护的方式提高反应的效率和特异性；同时由于EDC和NHS联用的反应生成的中间体是可逆的，因此使交联反应步骤具有可控性，有利于控制药品用量，控制交联剂的用量及交联程度；此外EDC与NHS联用可提高反应速度且反应条件温和，有助于实验操作。
5）本发明细化交联步骤，将EDC与NHS分批加入，控制EDC与胶原蛋白和NHS的反应条件，使胶原蛋白与EDC键合均匀，保证生成的活性酯的浓度，保证后期与骨形态发生蛋白-2共混交联的效果，同时避免过多的EDC和NHS反应生成有毒性和免疫原性的副产物。
6）本发明所制备的胶原膜可根据其作用预制胶原膜模具制备合适形式的胶原膜，同时根据胶原膜预期的支撑强度及降解时间酌量加入交联剂和骨形态发生蛋白，获得兼顾机械性能和降解速度的特用胶原膜，具有良好的推广应用前景及市场经济价值。
附图说明
图1为本发明产品2双组份骨诱导胶原蛋白膜降解0天、5天、10天，15天情况；
图2为本发明产品2双组份骨诱导胶原蛋白膜降解20天、25天、30天，35天情况。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例及附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1
本实施例是一种双组份骨诱导胶原蛋白膜，该胶原蛋白膜为猪或牛的皮肤或肌腱组织提取的胶原蛋白与骨形态发生蛋白-2共混交联后注入预制的模具冻干而成。该双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤：
1）切片：将猪或牛的皮肤或肌腱组织清洗后切成1～3mm厚度的薄片，获得动物组织薄片；
2）酶解：将获得的动物组织薄片置入浓度为0.1%～5%的乙酸或盐酸溶液中，加入胰蛋白酶、胃蛋白酶和/或无花果酶进行酶解（加入量为动物组织薄片重量的8%～15%），2～8℃条件下搅拌6～36h，获得粗蛋白溶液；
3）过滤：采用20～40目不锈钢网将粗蛋白溶液中的颗粒物滤除，获得蛋白溶液；
4）析出：往蛋白溶液中加入浓度为0.5～4mol/L的氢氧化钠溶液，进行蛋白析出，获得胶原蛋白；
5）复溶：将获得的胶原蛋白溶于乙酸中，蛋白与乙酸料液比为1～50:1～100，获得胶原蛋白溶液；
6）交联：搅拌条件下，将EDC交联剂和NHS交联剂分批加入胶原蛋白溶液，得到胶原蛋白-EDC中间体；所述EDC交联剂和NHS交联剂的浓度均为5mol/L，其用量均为占胶原蛋白溶液质量的0.5%～2%。交联过程如下：
6-1）交联剂准备：分别取EDC交联剂和NHS交联剂，其二者的质量比为1:1；将EDC交联剂等分成6份，将NHS交联剂等分成3份，备用；
6-2）第一重激活：将胶原蛋白溶液加入搅拌机，调节其pH为6.0，控制搅拌转速400rpm搅拌10min，然后边搅拌边依次加入3份EDC交联剂，并且每份EDC交联剂加入后均以400rpm搅拌10min后再加入另一份，将胶原蛋白上的羧酸能团与EDC进行酰胺键结合，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ；
6-3）第一重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.2，将搅拌转速控制为300rpm，边搅拌边依次加入2份NHS交联剂，第一份NHS交联剂加入搅拌10min后再加入另一份，保护胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的稳定，获得胶原蛋白-EDC/NHS中间体Ⅱ；
6-4）第二重激活：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅱ的pH为6.5，保持搅拌转速为300rpm，加入剩余的3份EDC交联剂，每份EDC交联剂加入后均以300rpm搅拌20min后再加入另一份，将胶原蛋白上的未反应的羧酸能团激活，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅲ；
6-5）第二重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.0，将搅拌转速控制为200rpm，将剩余的1份NHS交联剂加入，并继续搅拌20min，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅳ，以备与骨形态发生蛋白-2共混。
7）共混：将骨形态发生蛋白-2缓慢加入胶原蛋白-EDC中间体中，骨形态发生蛋白-2与胶原蛋白-EDC中间体料液比为1～2:2.8～6.8；搅拌共混，共混转速为200rpm～600rpm，搅拌时间为3～5h，获得骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液；
8）注模：将得到的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液注入预先制好的模具中；
9）冻干：将注模后的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液连同模具一起送入冻干机进行冻干成型，形成胶原蛋白膜；
10）灭菌：将冻干成型的胶原蛋白膜进行辐照灭菌，灭菌计量为15.2～25KGY，获得胶原蛋白膜成品。
实施例2
本实施例是根据实施例1的制备方法制备一种双组份骨诱导胶原蛋白膜，该胶原蛋白膜为猪或牛的皮肤或肌腱组织提取的胶原蛋白与骨形态发生蛋白-2共混交联后注入预制的模具冻干而成。该双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，包括如下步骤：
1）切片：将猪皮肤组织清洗后切成1～3mm厚度的薄片；
2）酶解：将猪皮薄片置入浓度为1.5%的乙酸或盐酸溶液中，加入猪皮薄片质量10%的胰蛋白酶粉，在4℃条件下搅拌32h，获得粗蛋白溶液；
3）过滤：采用36目不锈钢网将粗蛋白溶液中的颗粒物滤除，获得蛋白溶液；
4）析出：往蛋白溶液中加入浓度为2.5mol/L的氢氧化钠溶液，进行蛋白析出，获得胶原蛋白；
5）复溶：将获得的胶原蛋白溶于乙酸中，蛋白与乙酸料液比为20:68，获得胶原蛋白溶液；
6）交联：搅拌条件下，将EDC交联剂和NHS交联剂分批加入胶原蛋白溶液，EDC交联剂和NHS交联剂的浓度均为5mol/L，其用量均为胶原蛋白溶液的质量的0.75%，得到胶原蛋白-EDC中间体；交联过程如下：
6-1）交联剂准备：分别取EDC交联剂和NHS交联剂，其二者的质量比为1:1；将EDC交联剂等分成6份，将NHS交联剂等分成3份，备用；
6-2）第一重激活：将胶原蛋白溶液加入搅拌机，调节其pH为6.0，控制搅拌转速400rpm搅拌10min，然后边搅拌边依次加入3份EDC交联剂，并且每份EDC交联剂加入后均以400rpm搅拌10min后再加入另一份，将胶原蛋白上的羧酸能团与EDC进行酰胺键结合，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ；
6-3）第一重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.2，将搅拌转速控制为300rpm，边搅拌边依次加入2份NHS交联剂，第一份NHS交联剂加入搅拌10min后再加入另一份，保护胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的稳定，获得胶原蛋白-EDC/NHS中间体Ⅱ；
6-4）第二重激活：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅱ的pH为6.5，保持搅拌转速为300rpm，加入剩余的3份EDC交联剂，每份EDC交联剂加入后均以300rpm搅拌20min后再加入另一份，将胶原蛋白上的未反应的羧酸能团激活，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅲ；
6-5）第二重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.0，将搅拌转速控制为200rpm，将剩余的1份NHS交联剂加入，并继续搅拌20min，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅳ，以备与骨形态发生蛋白-2共混。
7）共混：将骨形态发生蛋白-2缓慢加入胶原蛋白-EDC中间体中，骨形态发生蛋白-2与胶原蛋白-EDC中间体料液比为1:5；搅拌共混，共混转速为300rpm，搅拌时间为4.5h，获得骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液；
8）注模：将得到的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液注入预先制好的模具中；
9）冻干：将注模后的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液连同模具一起送入冻干机进行冻干成型形成胶原蛋白膜；预冻阶段温度设定为-45℃，预冻时间至少保持7h，升华段温度设定为-20℃，升华时间至少保持50h；干燥阶段最终温度20℃，保持时间8h。经验证，本实施例制备的，口腔胶原膜的共晶点为-15℃，冻干过程影响冻干效果的关键因素主要有（1）预冻阶段的最终温度及时间，预冻时间至少保持7h，若低于7h胶原膜中间部分仍将存在液态水部分；（2）共晶点的处理温度和时间升华时间若低于50h，升华结束后样品仍有湿润区域；（3）干燥阶段最终温度。本实施例中，具体的冻干参数如表1所示。
表1：骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液注模后冻干程序
10）灭菌：将冻干成型的胶原蛋白膜进行辐照灭菌，灭菌计量为20KGY，获得胶原蛋白膜成品。
实施例3
本实施例是考察骨形态发生蛋白-2的加入量对制备的双组份骨诱导胶原蛋白膜的空间维持能力的影响。本实施例中考察对象包括单纯胶原蛋白膜和加入不同组分骨形态发生蛋白-2的双组份骨诱导胶原蛋白膜，各胶原膜中除了加入的骨形态发生蛋白-2量不同，其余均与实施例2制备方法一致。具体配比含量见表2，由于过量的BMP，将引起性多发骨化纤微发育不良，造成结缔组织骨化等负面影响，本实施例中骨形态发生蛋白-2最高添加量为75%。
表2：骨形态发生蛋白-2的加入量
本实施例采用①牙槽骨高度及牙槽骨宽度；②垂直向、唇腭向骨吸收量；③种植体周围骨吸收情况；三大维度作为指标，评估胶原蛋白膜的空间维持能力。
考察过程具体如下：征集需要拔除前牙患者40例，平均分成五组，控制每组患者性别、年龄、牙位比较等情况差异无统计学意义（P＞0.05）。所有患者根据需求于术前2周完成牙周基础治疗，并均获得满足植入膜片的条件。然后分别植入产品1-5，术后2周拆线，6个月后待牙窝愈合之后实施种植手术。比较五组患者术后拔牙位点愈合情况，并比较术前、术后6个月牙槽骨高度、牙槽骨宽度，术前、术后进行CBCT检查，通过软件对拔牙前后牙槽骨的高度、宽度进行测定；记录两组患者术前、术后6个月牙槽骨密度、垂直向骨吸收量、唇腭向骨吸收量等指标，测量重复3次，取平均值。记录各组实验的结果，计算其平均值，见表3。
表3：骨形态发生蛋白-2加入量对产品空间维持能力的影响
结果显示，本发明双组份骨诱导胶原蛋白膜植入可减缓拔牙后牙槽骨高度、宽度及骨密度的下降，在保留骨量方面具有一定的临床价值，能够有效改善患者牙槽的修复效果。
实施例4
本实施例是EDC交联剂和NHS交联剂的加入量对制备的双组份骨诱导胶原蛋白膜的空间维持能力的影响。本实施例中各胶原膜中除了加入的EDC交联剂和NHS交联剂量不同，其余均与实施例2制备方法一致。具体配比含量见表4。
表4：EDC交联剂和NHS交联剂的加入量
本实施例同样采用①牙槽骨高度及牙槽骨宽度；②垂直向、唇腭向骨吸收量；③种植体周围骨吸收情况；三大维度作为指标，评估胶原蛋白膜的空间维持能力。
本实验中征集需要拔除前牙患者25例，平均分成五组，具体实验过程与实施例3一致，各组患者植入的膜片为产品6-10。各组患者的具体检验结果见表5。
表5：EDC交联剂和NHS交联剂加入量对产品空间维持能力的影响
实施例5
本实施例是对不同骨形态发生蛋白-2含量的胶原蛋白膜的降解性能进行考察，本实施例考察的对象为对实施例3中产品1-5。降解实验方法如下：
1. 配制缓冲液（磷酸盐缓冲液）：由18.2％溶液a）和81.8％溶液b）（体积分数）混合而成；a）1/15mol/L磷酸二氢钾，b）1/15mol/L 磷酸二氢钠。
2. 配置Ⅰ型胶原酶浓度为0.02mg/mL的磷酸盐缓冲液；
3. 根据磷酸盐缓冲液用量计算所需酶用量加入到磷酸盐缓冲液中，缓慢搅拌使酶溶解；
4. 分别多个取产品1-5，分别置于洁净的30×50称量瓶中，并做好标记，每个称量瓶中加入20mlⅠ型胶原酶浓度为0.02mg/mL的磷酸盐缓冲液，轻压使其完全浸没样品，盖上称量瓶盖子置于37℃培养箱中降解。分别于降解后第5天、第10天、第15天、第20天、第25天、第30天和第35天，随机取一个样品在每个时间节点在实验组中进行观察记录其降解情况，如图1和图2所示为产品2的降解过程，并随机取一个样品进行测量降解率，结果如表6所示。
表6：不同骨形态发生蛋白-2含量的胶原蛋白膜的降解率
结果显示，随着骨形态发生蛋白-2含量的增加，所制得的胶原膜的降解时间得以延长，在骨形态发生蛋白-2与胶原蛋白-EDC中间体料液比小于15%时，其降解时间达不到35天，难以满足牙槽骨修复时间及支撑需求，骨形态发生蛋白-2含量的增加降解时间得以延长，但骨形态发生蛋白-2的加入量需要加以限制，以免产生副作用，综合来看，将骨形态发生蛋白-2与胶原蛋白-EDC中间体料液比控制在1～2:2.8～6.8较为合适。
总体而言，本发明将胶原蛋白和骨形态发生蛋白分别制成溶液，采用合适交联剂使其二者交联后注塑冻干，获得所需的骨形态发生蛋白+胶原双组分结构膜，不仅空间维持能力优异，而且能够控制BMP加入量和产品降解时间。通过将胶原蛋白和骨形态发生蛋白分别制成溶液进行交联，胶原蛋白和骨形态发生蛋白混合均匀，蛋白复合充分，可有效提高其机械强度和稳定性，并可通过控制胶原蛋白和骨形态发生蛋白的复合量，可较好的控制其支撑效果和降解时间。
另外，本发明采用EDC与NHS联合使用，EDC能够将活性羧酸和胺官能团直接进行酰胺键结合，而NHS则可以使反应生成的活性酯在水中更稳定，从而避免水解，通过双重激活保护的方式提高反应的效率和特异性；同时由于EDC和NHS联用的反应生成的中间体是可逆的，因此使交联反应步骤具有可控性，有利于控制药品用量，控制交联剂的用量及交联程度；此外EDC与NHS联用可提高反应速度且反应条件温和，有助于实验操作。在制备过程中，细化交联步骤，将EDC与NHS分批加入，控制EDC与胶原蛋白和NHS的反应条件，使胶原蛋白与EDC键合均匀，保证生成的活性酯的浓度，保证后期与骨形态发生蛋白-2共混交联的效果，同时避免过多的EDC和NHS反应生成有毒性和免疫原性的副产物。
此外，本发明所制备的胶原膜可根据其作用预制胶原膜模具制备合适形式的胶原膜，同时根据胶原膜预期的支撑强度及降解时间酌量加入交联剂和骨形态发生蛋白，获得兼顾机械性能和降解速度的特用胶原膜，具有良好的推广应用前景及市场经济价值。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的。此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非只包含一个的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种双组份骨诱导胶原蛋白膜，其特征在于：该胶原蛋白膜为猪或牛的皮肤或肌腱组织提取的胶原蛋白与骨形态发生蛋白-2共混交联后注入预制的模具冻干而成。
2.一种双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
1）切片：将猪或牛的皮肤或肌腱组织清洗后切成一定厚度的薄片，获得动物组织薄片；
2）酶解：将获得的动物组织薄片置入乙酸或盐酸溶液中，加入蛋白酶进行酶解，获得粗蛋白溶液；
3）过滤：将粗蛋白溶液中的颗粒物滤除，获得蛋白溶液；
4）析出：往蛋白溶液中加入氢氧化钠溶液，进行蛋白析出，获得胶原蛋白；
5）复溶：将获得的胶原蛋白溶于乙酸中，获得胶原蛋白溶液；
6）交联：搅拌条件下，将EDC交联剂和NHS交联剂分批加入胶原蛋白溶液，得到胶原蛋白-EDC中间体；
7）共混：将骨形态发生蛋白-2缓慢加入胶原蛋白-EDC中间体中，搅拌共混，获得骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液；
8）注模：将得到的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液注入预先制好的模具中；
9）冻干：将注模后的骨形态发生蛋白/胶原蛋白共混溶液连同模具一起送入冻干机进行冻干成型，形成胶原蛋白膜；
10）灭菌：将冻干成型的胶原蛋白膜进行辐照灭菌，获得胶原蛋白膜成品。
3.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤1）中的动物组织薄片厚度为1～3mm。
4.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤2）中的乙酸或盐酸溶液的浓度为0.1%～5%；加入的蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶和/或无花果酶，加入量为动物组织薄片重量的8%～15%，酶解条件为：2～8℃条件下搅拌6～36h。
5.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤3）中的过滤为采用20～40目不锈钢网滤除颗粒物。
6.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤4）中的析出加入的氢氧化钠溶液浓度为0.5～4mol/L。
7.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤5）中的复溶，析出的蛋白与乙酸料液比为1～50:1～100。
8.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤6）中的交联过程如下：
6-1）交联剂准备：分别取EDC交联剂和NHS交联剂，其二者的质量比为1:1；将EDC交联剂等分成6份，将NHS交联剂等分成3份，备用；
6-2）第一重激活：将胶原蛋白溶液加入搅拌机，调节其pH为6.0，控制搅拌转速400rpm搅拌10min，然后边搅拌边依次加入3份EDC交联剂，并且每份EDC交联剂加入后均以400rpm搅拌10min后再加入另一份，将胶原蛋白上的羧酸能团与EDC进行酰胺键结合，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ；
6-3）第一重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.2，将搅拌转速控制为300rpm，边搅拌边依次加入2份NHS交联剂，第一份NHS交联剂加入搅拌10min后再加入另一份，保护胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的稳定，获得胶原蛋白-EDC/NHS中间体Ⅱ；
6-4）第二重激活：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅱ的pH为6.5，保持搅拌转速为300rpm，加入剩余的3份EDC交联剂，每份EDC交联剂加入后均以300rpm搅拌20min后再加入另一份，将胶原蛋白上的未反应的羧酸能团激活，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅲ；
6-5）第二重保护：调节胶原蛋白-EDC中间体Ⅰ的pH为7.0，将搅拌转速控制为200rpm，将剩余的1份NHS交联剂加入，并继续搅拌20min，获得胶原蛋白-EDC中间体Ⅳ，以备与骨形态发生蛋白-2共混。
9.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤7）中的共混，骨形态发生蛋白-2与胶原蛋白-EDC中间体料液比为1～2:2.8～6.8；共混转速为200rpm～600rpm，搅拌时间为3～5h。
10.根据权利要求2所述的双组份骨诱导胶原蛋白膜的制备方法，其特征在于：步骤10）中的灭菌计量为15.2～25KGY。
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